EM PLANTAS DE CAFEEIRO CONTRA FERRUGEM
S.D. Guzzo1, R.M. de Castro2, K. Kida1, E.M.F. Martins1
1 Centro de Sanidade Vegetal, Instituto Biológico, CP 12.898, CEP 04010-970, São Paulo, SP, Brasil.
RESUMO
Plantas de café (Coffea arabica cv. Mundo Novo) suscetíveis à ferrugem, causada por Hemileia vastatrix, mostraram-se protegidas contra a doença quando tratadas com diferentes concentrações do composto acibenzolar-S-methyl, BTH, (10, 50, 100, 200 e 400 ppm do produto comercial, que contém 50% do princípio ativo), 72 h antes da inoculação com o patógeno. O produto induziu proteção local (66 a 97 %), sistêmica (83 a 94 %), e o efeito protetor persistiu até 10 semanas. Nos intervalos de 8 a 10 semanas entre a aplicação do produto e a inoculação com o patógeno, a área foliar com lesões esporulantes foi mais próxima daquela apresentada pelas plantas-controle, do que nos outros intervalos semanais de tempo. Estudos, através de microscopia de fluorescência, sobre o desenvolvimento do patógeno em folhas tratadas e controles, indicaram que a germinação e a formação de apressórios de H. vastatrix não foram afetadas pelo tratamento com o BTH. PALAVRAS-CHAVE: Hemileia vastatrix, indução de resistência, BTH, Coffea arabica.
ABSTRACT
PROTECTION OF COFFEE PLANTS AGAINST COFFEE LEAF RUST BY ACIBENZOLAR-S-METHYL. Susceptible coffee plants (Coffea arabica cv. Mundo Novo) were protected against coffee leaf rust caused by Hemileia vastatrix, when treated with different concentrations of the compound acibenzolar-S-methyl, BTH, (10, 50, 100, 200 and 400 ppm of the commercial product, that contains 50 % of active ingredient, w/w), 72 h prior inoculation with pathogen. The product induced local (66 to 97 %), systemic protection (83 to 94 %), and the protection persisted for at least 10 weeks. At time intervals from 8 to 10 weeks between treatments and challenge inoculations, the foliar area with sporulating lesions were closer to control plants, than others intervals of time. Fluorescent microscopic studies of pathogen development in protected and control leaves indicated that neither the germination nor the appressoria formation were affected by treatment with BTH.
KEY WORDS: Hemileia vastatrix, induced resistance, BTH, Coffea arabica.
2 Syngenta., São Paulo, SP INTRODUÇÃO
A cafeicultura representa um importante papel na economia nacional constituindo cerca de 6,18% da receita das exportações. Apesar da redução da área cafeícola nas últimas décadas, o Brasil ainda ocupa uma posição dominante no mercado mundial como produtor (contando com 2,410 milhões de hectares plantados) e como exportador (20%) (ANUÁRIO ESTATÍSTICODO CAFÉ,
1997). O potencial competitivo do país, no entanto, poderá crescer ainda mais com a redução de custos de produção através do aumento da produtividade.
Doenças e pragas constituem fatores restritivos para o alcance de uma produção ideal. Entre outras está a ferrugem alaranjada do cafeeiro, causada pelo fungo biotrófico Hemileia vastatrix Berk. et Br. (MATIELLO, 1991).
Atualmente, a ferrugem atinge todas as regiões cafeicultoras do Brasil e se não for devidamente controlada pode causar queda na produção de até 45% (MATIELLO,
1991). O controle químico da ferrugem tem se mostrado eficiente e econômico, porém, além de representar 10 a 20% do custo total da produção (MATIELLO et al., 1985; VEGRO
& FERREIRA, 2000), pode levar ao agravamento de outras
doenças e pragas do cafeeiro, pelo seu efeito na microbiota, eliminando inimigos naturais, além de possibilitar, por pres-são de seleção, o surgimento de raças resistentes aos fungicidas aplicados.
Um dos maiores desafios para os pesquisadores tem sido determinar métodos eficientes, porém de baixo impac-to ambiental. Uma das abordagens consiste na utilização de cultivares resistentes para o controle da ferrugem do cafeeiro (BERGAMIN FILHO, 1976; CARVALHO, 1982). Existe
ainda a perspectiva promissora do controle da doença pela ativação dos mecanismos de defesa inerentes das plantas
através da aplicação, prévia à inoculação com patógenos, de produtos bióticos ou abióticos, não tóxicos, que atuam como indutores de resistência (MARTINS, 1991; MORAES,
1992; RYALS et al., 1996). Indução de resistência em
plantas de café suscetíveis à ferrugem pode ser obtida pelo tratamento com filtrado de suspensão de urediniosporos de H. vastatrix inativados termicamente (MORAES et al.,
1976); polissacarídeos extracelulares ricos em β-mananas, provenientes de urediniosporos de H. vastatrix (GUZZO et al., 1987); bactérias e fungos não patogênicos ao cafeeiro
(MARTINS et al., 1985); Thuricide-HP (Bacillus
thuringiensis, Sandoz) (ROVERATTI et al., 1989); extrato de
levedura (MARTINS et al., 1986); exopolissacarídeos de
células bacterianas de Xanthomonas campestris pv.
manihotis e X. campestris pv. campestris ou com goma
xantana (GUZZO et al., 1993).
O composto derivado do benzotiodiazol (BTH) (aciben-zolar-S-methyl) tem sido citado como um agente ativador dos mecanismos de defesa de plantas, protegendo-as sistemica-mente contra uma larga gama de doenças causadas por fungos e bactérias, sem mostrar efeito tóxico direto e signi-ficativo contra estes fitopatógenos (RUESS et al., 1995). O
BTH na maioria dos casos estudados não apresenta ativida-de antimicrobiana direta sobre o patógeno, o que praticamen-te elimina o risco de seleção de raças resispraticamen-tenpraticamen-tes ao produto. Além disso, é um composto de baixo impacto pois apresenta baixa toxicidade (DL50 oral em ratos > 2.000 mg/kg), e nenhum efeito carcinogênico, mutagênico ou teratogênico (RUESS et al., 1996). Neste trabalho foi verificada a ação do composto
benzo[1,2,3]tiodiazol-7-ácido carbotióico-S-metil éster (BTH) como indutor de proteção em cafeeiros contra ferrugem.
MATERIAL E MÉTODOS Planta e patógeno
Plantas de café (Coffea arabica cv. Mundo Novo), obtidas a partir de sementes fornecidas pela Cooperativa GARCAFÉ, Garça, SP, foram utilizadas quando atingiram 8 pares de folhas totalmente expandidas.
Urediniosporos de Hemileia vastatrix Berk. et Br., raça II, foram coletados a partir de plantas de café naturalmente infectadas, peneirados e mantidos em nitrogênio líquido até o uso.
Preparo do indutor de proteção e do inóculo
Soluções aquosas do produto comercial, benzo[1,2,3]tiodiazol-7-ácido carbotióico S-metil éster (acibenzolar-S-methyl, BTH), que contém 50% do prin-cípio ativo, foram utilizadas nos testes biológicos.
Urediniosporos de H. vastatrix, retirados do nitrogê-nio líquido, foram submetidos a um choque térmico (40°C, 10 min) e misturados com água destilada (2 mg/mL). A suspensão, agitada por 10 min e submetida a ultra-som (50 Hz, 30 s), foi mantida sob agitação constante durante a inoculação das plantas.
Indução de proteção local e sistêmica
Os experimentos foram realizados em condições de casa de vegetação, utilizando-se grupos de 10 plantas por tratamento. Para avaliação do efeito do BTH na indução de proteção local de plantas de café contra a ferrugem, soluções aquosas do produto nas concen-trações de 10, 50, 100, 200 e 400 ppm do produto comercial foram aspergidas nas superfícies abaxiais dos 2os, 3os e 4os pares de folhas a partir do ápice, 0,5 mL de solução por folha, usando como propelente, nitro-gênio gasoso (0,20 bars). As plantas-controle foram aspergidas com água destilada. Após 72 h, os mesmos pares de folhas foram aspergidos com a suspensão do inóculo. As plantas inoculadas foram mantidas no escuro (24 °C, UR 85%) por 48 h e, em seguida, transferidas para casa de vegetação até o aparecimento de sintomas.
O efeito sistêmico do produto e/ou seu possível efeito indutor de resistência à distância do ponto de aplicação, foram avaliados aspergindo-se, em outro lote de plantas, soluções aquosas do BTH nas concentrações de 10 e 400 ppm do produto comercial, nos 3os pares de folhas a partir do ápice. Os 2os e 4os pares de folhas foram protegidos com papel de alumínio para não receberem o produto. O lote de plantas-controle foi tratado com água. Após 72 h, os 2os, 3os e 4os pares de folhas das plantas tratadas e controles, foram inoculados com o patógeno. Após a inoculação, todas as plantas foram submetidas às mesmas condições ambien-tes descritas anteriormente.
O tempo de persistência do efeito protetor do produto foi verificado aspergindo uma solução aquosa de BTH (400 ppm) nos 2os, 3os e 4os pares de folhas de cafeeiro, nos intervalos de tempo de 1 a 10 semanas antes da inoculação com o patógeno.
A avaliação dos sintomas em todos os experimen-tos foi feita 21-24 dias após a inoculação, determinan-do-se a média do número de lesões por 10 cm2 de folha. A proteção foi calculada como redução do número de lesões por folha e expressa como porcentagem do controle (MORAES et al., 1976). A porcentagem de área
esporulante foi avaliada 60 dias após a inoculação segundo uma escala diagramática variando de 0 a 100 %.
Efeito do BTH sobre a germinação e formação de apressórios in vivo de H. vastatrix
O efeito biocida do produto foi verificado sobre a germinação e formação de apressórios dos urediniosporos de H. vastatrix, 16 h após a inoculação do patógeno em folhas de plantas de café previamente tratadas com as diferentes concentrações do BTH (10, 50, 100, 200 e 400 ppm). O produto foi aspergido nas superfícies abaxiais dos 3os pares de folhas e após 72 h as mesmas foram inoculadas com o patógeno. As folhas permaneceram no escuro por 16 h. As superfícies abaxiais das folhas foram então asper-gidas com formaldeído 37% e logo após a evaporação deste, discos de folhas foram retirados e os urediniosporos
corados com dietanol fluorocromo (MARTINS et al., 1988).
Em microscópio de fluorescência foram avaliadas as por-centagens de germinação e de tubos germinativos apre-sentando apressórios.
RESULTADOS
Plantas de café tratadas com BTH, 72 h antes da inoculação do patógeno, apresentaram menor número de lesões de ferrugem alaranjada do cafeeiro do que as plantas-controle. Todas as concentrações de BTH utilizadas, de 10 a 400 ppm (24 - 950 µM), foram efetivas em promover essa redução no número de lesões. Na concentração de 10 ppm a redução foi de 66,5% e a partir de 50 ppm ficou acima de 86%, atingindo 97% na concentração de 400 ppm (Figs.1 e 2).
O número de lesões de H.vastatrix nos pares de folhas imediatamente acima e abaixo das folhas que receberam o tratamento com BTH, 72h antes da inoculação dos urediniosporos, também foi reduzido em comparação com os respectivos pares de folhas das plantas-controle. Essa redução foi respectivamente 92 e 94 % na concentração de 400 ppm e 82 e 88% na concentração de 10 ppm (Fig. 3).
Na concentração de 400 ppm, a aplicação do produto até 10 semanas antes da inoculação do patógeno induziu uma redução significativa do número de lesões da ferru-gem em relação ao controle, variando de 86 a 93 % (Fig. 4). A redução da área foliar com lesões esporulantes em relação ao controle, após os intervalos de 1 a 6 semanas entre a aplicação do produto e a inoculação do patógeno, foi da ordem de 99%. Quando 7 semanas decorreram entre a aplicação do BTH e a inoculação do fungo, a redução de lesões esporulantes foi de 94%, nos intervalos de 8 a 9 semanas ficou na ordem de 75% e no intervalo de 10 semanas caiu para 50% (Figs. 4 e 5).
Nenhum efeito fitotóxico nos tecidos foliares foi obser-vado, nas condições experimentais utilizadas (Figs. 2 e 5). Em todas as concentrações do BTH utilizadas, a germi-nação dos urediniosporos de H. vastatrix e a formação de apressórios foram significativamente semelhantes à teste-munha (Figs. 6 e 7).
DISCUSSÃO E CONCLUSÕES
Todas as plantas possuem um potencial genético para resistência a fitopatógenos e a diferença entre resistência e suscetibilidade está na velocidade e mag-nitude de expressão desse potencial. Foi demonstrada, experimentalmente, a possibilidade da expressão des-ses genes ser manipulada alterando o estado de suscetibilidade para resistência por vários agentes bióticos ou abióticos (KÚC, 1995), fenômeno conhecido
por RSA (resistência sistêmica adquirida) (STICHER et al., 1997).
Os dados apresentados neste trabalho demonstram que o BTH conferiu proteção local e sistêmica altamente
significativas (97 % e 94%, respectivamente, para uma concentração de 950 µM) contra a ferrugem do cafeeiro em plantas previamente tratadas. Proteção com o referido produto também foi obtida em plantas de fumo (70 a 97% para uma concentração de 1200 µM) contra o vírus TMV, os fungos Cercospora nicotianae, Peronospora tabacina,
Phytophthora parasitica e a bactéria Pseudomonas syringae (FRIEDRICH et al., 1996); em plantas de trigo (87 %
para uma concentração de 300 µM) contra o fungo Erysiphe
graminis f.sp. tritici (GÖRLACH et al., 1996).
Como verificado para essas outras interações acima citadas, o BTH conferiu, também para cafeeiro-Hemileia
vastatrix, proteção sistêmica, isto é, efeito protetor à
distância do ponto de aplicação do produto, a níveis estatisticamente iguais à proteção conferida no local de aplicação do produto (teste Tuckey, 5%). Esse fato pode ser devido à difusão eqüitativa do produto a partir do ponto de aplicação e/ou pela ativação de mecanismos de defesa da planta (RSA- resistência sistêmica adquirida).
Em plantas de trigo (GÖRLACH et al., 1996), fumo
(FRIEDRICH et al., 1996) e Arabidopsis (LAWTON et al., 1996)
foi observado que o BTH induz as mesmas alterações bioquímicas que caracterizam a resistência sistêmica ad-quirida (RSA) ativadas por agentes bióticos ou abióticos, como o acúmulo de mRNAs de proteínas relacionadas à patogênese (FRIEDRICH et al., 1996) ou alterações
estrutu-rais, como o depósito de calose nas paredes celulares nos sítios de penetração do patógeno (BENHAMOU & BÉLANGER,
1998).
O fato do efeito protetor do BTH em cafeeiro contra ferrugem alaranjada persistir, a níveis de 90%, até 10 semanas após sua aplicação, revela um potencial de uso prático do produto no manejo da ferrugem do cafeeiro, o que requer ensaios sob condições de campo para ser confirmado.
Experimentos em campos de centeio e trigo mostraram que o BTH conferiu proteção significativa contra Erysiphe
graminis por um período de 4 e 10 semanas,
respectiva-mente, após um único tratamento (RUESS et al., 1996).
Contra outros patógenos como Septoria spp. e Puccinia spp., o efeito protetor em plantações de trigo foi menos acentuado, promovendo um retardamento no desenvolvi-mento das doenças (RUESS et al., 1996).
O produto não inibiu o desenvolvimento do fungo
H. vastatrix, nas fases de pré-penetração (germinação
e formação de apressórios), porém, mesmo assim a infecção foi quase totalmente suprimida, decrescendo mais de 95%, em relação às plantas não tratadas, para as maiores dosagens do BTH. Esse fato indica a possi-bilidade do efeito protetor ter sido conseqüência da ativação do mecanismo de resistência induzida (RSA) da planta. É conhecido que agentes indutores de RSA não apresentam ação antimicrobiana direta sobre patógenos, mas induzem a expressão de genes de defesa das plantas, ativando, nas mesmas, a produção de com-postos que impedem ou dificultam o estabelecimento e/ou
Fig. 1 - Efeito de diferentes concentrações de BTH na proteção de mudas de café contra H. vastatrix. Controle: 0 ppm de BTH. Médias seguidas por letras distintas diferem significativamente entre si pelo teste de Tukey, ao nível de 5 % (C.V. = 32,03 %; D.M.S. = 10,83).
Fig.2- Redução, acima de 90%, do número de lesões de H. vastatrix em plantas de café “Mundo Novo” protegidas pela aplicação prévia de BTH, em relação às plantas-controle aspergidas com H2O, 72hs antes da inoculação do patógeno.
Fig. 3 - Proteção local e sistêmica de folhas de cafeeiro contra H. vastatrix, após o tratamento com BTH (0, 10 e 400 ppm). O produto foi aplicado nas superfícies abaxiais dos 3°s pares de folhas, 72 h antes
da inoculação com o patógeno nos 2°s, 3°s e 4°s pares de folhas. Médias
seguidas por letras distintas diferem significativamente entre si pelo teste de Tukey, ao nível de 5 %. 2o Par: C.V. = 33,32 %; D.M.S. =
1,92; 3o Par: C.V. = 22,11 %; D.M.S. = 1,03; 4o Par: C.V. = 27,33
%; D.M.S. = 1,82.
Fig. 4 - Persistência do efeito protetor do BTH (400 ppm) em mudas de café contra H. vastatrix. O produto foi aplicado nos intervalos de tempo de 1 a 10 semanas antes da inoculação com o patógeno. Controle: plantas não aspergidas com BTH (0 semanas). Médias seguidas por letras distintas diferem significativamente entre si pelo teste de Tukey, ao nível de 5 %. Lesões/10 cm2: C.V. = 31,36
Fig. 7 - Germinação e formação de apressórios de urediniosporos de H. vastatrix em folhas de cafeeiro previamente tratadas com 950
µM (400 ppm do produto comercial) de BTH. AP = apressório; TG = tubo germinativo, ES = urediniosporo.
o desenvolvimento de patógenos. Assim, o BTH aplicado em plantas de café 72 h antes da inoculação com o patógeno, pode ter ativado esses genes e, dessa forma, suprimido a infecção.
O BTH é comprovadamente um produto de baixa toxicidade (RUESS et al., 1996). Experimentos realizados in vitro demonstraram que o BTH e seus metabólitos, na
concentração de 1,4 mM, não afetam significativamente o desenvolvimento dos fungos: Alternaria brassicae, A.
brassicicola, Botrytis cinerea, Ceratocystis ulmi, Cladosporium cucumerinum, Fusarium culmorum, Helminthosporium oryzae, H. teres, Mucor hiemalis, Penicillium digitatum, P. expansum, P. italicum, Phytophthora infestans, Pyricularia oryzae, Rhizoctonia solani, Septoria nodorum, Ustilago maydis e Verticillium dahliae (FRIEDRICH et al., 1996). Entretanto, foi verificado
um efeito fungistático in vitro do BTH em Colletotrichum
graminicola (PASCHOLATI et al., 1998).
Foi demonstrado que o BTH é rapidamente absorvido e translocado através das plantas de trigo e ativa o meca-nismo de resistência das mesmas, interferindo nos diferen-tes estágios do ciclo de desenvolvimento do fungo
Erysiphe graminis f.sp. tritici. A taxa de penetração do
fungo, bem como a formação de haustórios foram signifi-cativamente inibidas, sendo que a germinação e a formação de apressórios não foram alteradas (GÖRLACH et al., 1996).
Esse composto parece atuar como um clássico indutor do conhecido fenômeno da RSA (GÖRLACH et al. 1996;
RUESS et al., 1996; FRIEDRICH et al., 1996), no qual o estado
de suscetibilidade das plantas é alterado, decorrido um intervalo de tempo após o contato com o agente indutor, tornando-as temporariamente resistentes a um grande espectro de patógenos (KÚC, 1995; RYALS et al., 1996;
STICHER et al., 1997). O BTH também apresenta um efeito
sinergístico, quando utilizado com diferentes fungicidas (MOLINA et al., 1998; RUESS et al.,1996).
Fig.5- Persistência do efeito protetor do BTH em plantas de café “Mundo Novo”. A- Aplicação do produto 5 semanas antes da inoculação do patógeno. Setas indicam lesões não esporulantes nas folhas tratadas e lesões esporulantes nas folhas da planta-controle. B- Aplicação do produto 8 semanas antes da inoculação do patógeno. Setas indicam lesões esporulantes nas folhas tratadas e nas folhas da planta controle.
Fig. 6 - Efeito de diferentes concentrações do BTH na germinação de urediniosporos de H. vastatrix e no desenvolvimento de apressórios. Controle: 0 ppm de BTH. Porcentagem de tubos germinativos: médias dos tratamentos não diferem significativa-mente entre si pelo teste de Tukey, ao nível de 5 % (C.V. = 17,89 %; valor de F =1,13). Porcentagem de apressórios: médias dos tratamentos não diferem significativamente entre si pelo teste de Tukey, ao nível de 5 % (C.V. = 23,24 %; valor de F = 0,33).
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