Universidade do Vale do Paraíba Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento
PATRÍCIA ELISA DO COUTO CHIPOLETTI ESTEVES
ESTUDO MORFOLÓGICO
DO CICLO CELULAR DO Trypanosoma rangeli EM MEIO DE CULTURA AXÊNICO
São Jose dos Campos, SP 2009
Universidade do Vale do Paraíba Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento
PATRÍCIA ELISA DO COUTO CHIPOLETTI ESTEVES
ESTUDO MORFOLÓGICO
DO CICLO CELULAR DO Trypanosoma rangeli EM MEIO DE CULTURA AXÊNICO
Dissertação apresentada ao programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas, como complementação dos créditos necessários para obtenção do título de Mestre em Ciências Biológicas.
Orientador: Prof. Dr. Marco Antonio de Oliveira
São Jose dos Campos, SP 2009
Esfudo nnrfohgb do cido celuÌar do Trypaaasama rengeli ern rneio de rultra axênlm.f Fa&icb Ellsa & Couüo CfÌipoffii Esteves"
Orbntadon Frrof-Dr"Marco Antolrio de Oliveira; S..rosé dre Campos, 20@.
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COU:61S.4
Autorizo, exclusivamente para fins acadêmicos e cientÍficos, a reprodução total ou pmcial desta dissertração? pCIr pr"ocesso fotocopiadores ou transmissão eletrônica.
Assinatura da aluna:
Data: 3o la S f
*ESTUDO MORFOLóGICO DO CICLO CELULAR DO TRYPANOSOMA RANGELI EM MEIO DE CTILTURA AXÊNICO'
Dissertação aprovada como requisito parcial à obtenção do grau de Mestre em Ciências Biológicas, do Programa de Pós-Graduação ern Ciências Biológicas, do Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento da Universidade do Vale do Paraíba, São José dos Campos, SP, pela seguinte banca examinadora:
Prof. Prof. Prof.
Dra. CRISTINA PACHECO SOARES (LTNIVAP) Dr. MARCO ANTONIO DE OLIVEIRA (UNIVAP) Dr. RENATO AUGUSTO DA MATTA (UENF)
Prof. Dra. Sandra Maria Fonseca da Costa Diretor do IP&D - UniVap
São José dos Campos, 30 de juúo de 2009.
',4,*,
Dedico este trabalho a minha família: ao meu esposo e filhos que sempre estiveram ao meu lado,
AGRADECIMENTOS
Agradeço ao Prof. Dr. Marco Antonio de Oliveira por ter podido compartilhar de seus conhecimentos; agradeço, ainda, pelas orientações e ponderações que me ajudaram a construir e concluir este trabalho.
A Profª. Dra. Josane Mittmann, pela costumeira gentileza e orientações recebidas. A Profª. Dra. Cristina Pacheco Soares, pela constante atenção que me dedicou e por todas as orientações recebidas.
A Profª. Dra. Maricília Silva Costa que se disponibilizou a auxiliar sempre que
solicitado.Ao Prof. Dr. Newton Soares da Silva, meus agradecimentos.
Aos funcionários do IP&D que gentilmente nos atenderam: Ivone P. Vilela Monteiro,
Neusa de Moraes M. Delgado, Valéria Maeda, Vanessa A. de Oliveira, Rosangela Regis Cavalvanti e Rúbia Gravito C. Gomes.Agradeço, especialmente, aos amigos do laboratório: Aline Helena Araujo Machado, Andreza Cristina de Siqueira, Cristiano de Cristo Gomes, Davi Bernes Pereira, Juliana Guerra Pinto, Juliana Mangolin, Maíra Maftoum Costa, Natália Mazini Ribeiro, Quênia Yoko de Paula Matsui. A todos vocês, minha sincera gratidão.
Agradeço ao Samuel de Freitas Esteves por sua valiosa contribuição na formatação
das imagens.Agradeço a UNIVAP, ao IP&D e a CAPES pelo apoio recebido, sem o qual não
poderia realizar este trabalho.
CHIPOLETTI ESTEVES, Patrícia Elisa do Couto. Estudo Morfológico do ciclo celular do Tripanosoma rangeli em meio de cultura axênico. 2009. 61f. 1 CD-ROM. Dissertação (Mestrado em Ciências Biológicas) - Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento, Universidade do Vale do Paraíba, São José dos Campos, 2009.
RESUMO
Os organismos pertencentes à ordem Kinetoplastida são caracterizados pela presença de um ou dois flagelos originados de uma estrutura na membrana celular em forma de depressão, denominada bolso flagelar. O corpo celular destes organismos possui um arcabouço de microtúbulos estabilizados por ligações cruzadas e associados com a membrana celular, denominados de microtúbulos subpeliculares. Possuem, ainda, uma única e longa mitocôndria que se diferencia em uma organela típica, abundante em DNA e que dá nome à ordem. No gênero Trypanosoma destaca-se o Trypanosoma rangeli, protozoário não patogênico para seu hospedeiro vertebrado e que apresenta simpatria com o Trypanosoma
cruzi, agente causador da Doença de Chagas. Existem algumas características biológicas do T. rangeli que permitem diferenciá-lo do T. cruzi, como a sua provável incapacidade de
invadir células de mamíferos, o seu desenvolvimento na hemolinfa e nas glândulas salivares dos triatomíneos e a sua transmissão ao hospedeiro vertebrado através da picada – via inoculativa. O objetivo deste trabalho é investigar as mudanças ocorridas no protozoário T.
rangeli mantido em meio de cultura axênico e submetido ao tratamento com hidroxiureia
(HU), uma droga utilizada para sincronizar o ciclo celular de organismos pertencentes a ordem Kinetoplastida. Num primeiro ensaio, foram utilizadas culturas em crescimento exponencial com inóculos de 3,0x106 parasitas/mL e tratadas por 24 horas com 10 mM, 20 mM e 30 mM de HU. Num segundo ensaio foi utilizada uma cultura em crescimento exponencial com inóculo de 1,0x106 parasitas/mL e tratada por 24 horas com 20 mM de HU. Uma cultura controle em crescimento exponencial, contendo 3,0x106 parasitas/mL foi mantida por 24 horas sem HU. Após a retirada da HU e durante 24 horas, em períodos de tempo previamente determinados, foram colhidas alíquotas dessas culturas para análises. Foram observados os seguintes parâmetros: quantidade total de parasitas; forma geral do parasita; aspecto do cinetoplasto e aspecto do núcleo; quantidade de células com 1 núcleo, 1 cinetoplasto e 1 flagelo (1N1K1F); quantidade de células com 1 núcleo, 1 cinetoplasto e 2 flagelos (1N1K2F); quantidade de células com 2 núcleos, 2 cinetoplastos e 2 flagelos (2N2K2F) e quantidade de células em citocinese. Os resultados do presente estudo sugerem que: (a) a sincronização do ciclo celular do T. rangeli, cepa SC-58, foi mais efetiva quando foram utilizados 1,0x106 parasitas/mL tratados com 20 mM de HU; (b) a HU inibe a multiplicação celular; (c) a HU é capaz de sincronizar o ciclo celular de organismos filogeneticamente próximos, porém, a concentração da droga é espécie-específica; (d) o novo flagelo aparece em células com um núcleo e um cinetoplasto; (e) a citocinese ocorre em torno de 18 a 20 horas após o início do ciclo celular.
CHIPOLETTI ESTEVES, Patrícia Elisa do Couto. Morphologic study of the cell cycle of the Tripanosoma rangeli in axenic medium. 2009. 61f. 1 CD-ROM. Dissertação (Mestrado em Ciências Biológicas) - Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento, Universidade do Vale do Paraíba, São José dos Campos, 2009.
ABSTRACT
The organisms belong to the Kinetoplastida order are characterized by the presence of one or two flagella originated of a structure in the cellular membrane in form of depression, called flagellar pocket. The cellular body of these organisms possesses microtubules stabilized for crossed linkings and associates with the cellular membrane, called of internal subpellicular corset of microtubules. They possess, still, an only mitochondrion long e that if it differentiates in one typical organelle, abundant in DNA and that of the name to the order. In the Trypanosoma genus is distinguished the Trypanosoma rangeli, not pathogenic protozoa for its vertebrate host and that it presents sympatric with the Trypanosoma cruzi, causative agent of the Chagas’disease. Some biological characteristics of the T. rangeli exist that allow to differentiate it of the T. cruzi, as its probable incapacity to invade cells of mammals, its development in hemolymph and the salivary glands of the triatominae and its transmission to the vertebrate host through the bite - inoculative saw. The objective of this work is investigate the changes in the cell cycle of axenic culture in exponential growth of T. rangeli, SC-58 strain, treated with hydroxyurea (HU), an used drug to synchronize the cell cycle of organisms belong the Kinetoplastida order. In a first assay, cultures in exponential growth with of 3,0x106 parasites/mL had been used and treated by 24 hours with 10 mM, 20 mM and 30 mM of HU. In second assay was used a culture in exponential growth with 1,0x106 parasites/mL and treated by 24 hours with 20 mM of HU. A culture has controlled in exponential growth, contends 3,0x106 parasites/mL was kept by 24 hours without HU. After the withdrawal of the HU and during 24 hours, in periods of time previously determined, had been harvested aliquot of these cultures for analyses. The following parameters had been observed: total amount of parasites, forms generality of the parasite, aspect of kinetoplast, aspect of the nucleus, amount of cells with 1 nucleus, 1 kinetoplast and 1 flagellum (1N1K1F), amount of cells with 1 nucleus, 1 kinetoplast and 2 flagella (1N1K2F), amount of cells with 2 nuclei, 2 kinetoplasts and 2 flagella (2N2K2F); and amount of cells in cytokinesis. The results of the present study suggest that: (a) the synchronization of the cellular cycle of the T. rangeli, SC-58 strain was more effective when they had been used 1,0x106 parasites/mL treated with 20 mM to HU; (b) the HU inhibits the cellular multiplication; (c) the HU is able to synchronize the cycle cellular of phylogenetics associates organisms, however, the concentration of the drug is species-specific; (d) the new flagellum appears in cells with a nucleus and one kinetoplast; (e) the cytokinesis occurs around 18 the 20 hours the beginning of the cellular cycle.
LISTA DE FIGURAS E TABELAS
Figura 1 - Representação simplificada de um protozoário pertencente à Ordem Kinetoplastida... 17
Figura 2 - Desenhos esquemáticos das formas da Família Trypanosomatidae. A- amastigota; B-promastigota; C-coanomastigota; D-epimastigota; E-tripomastigota;
F- opistomastigota...19 Figura 3 - Forma tripomastigota de Trypanosoma cruzi. Seta preta - cinetoplasto; vermelha - núcleo; azul - membrana ondulante; verde - flagelo...19
Figura 4 - (A) Panstrongylus megistus; (B) Rhodnius prolixus; (C) Triatoma
infestans...20
Figura 5 - Glossina sp., conhecida popularmente como mosca tsé-tsé...21 Figura 6 - Trypanosoma rangeli (Cepa SC-58) cultivado em meio LIT, suplementado com 20% de SFB e mantido a 28oC...22
Figura 7 - Mapa das Américas Central e do Sul mostrando a sobreposição da distribuição da doença de Chagas Humana até 1992 (sombreado) segundo a OMS, e os registros da presença comprovada do Trypanosoma rangeli em humanos, triatomíneos ou animais silvestres (•)...22
Figura 8 - Esquema do ciclo biológico do T. rangeli no hospedeiro invertebrado...25 Figura 9 - Esquema geral de forma epimastigota do Trypanosoma cruzi mostrando as principais estruturas celulares...30
Figura 10 - Representação esquemática das alterações morfológicas durante o ciclo celular de formas epimastigotas de Trypanosoma cruzi...32
Figura 11 - Esquema geral da reação catalisada pela enzima ribonucleotídeo redutase...33 Figura 12 - Curvas de crescimento apresentadas por culturas de T. rangeli, cepa SC-58, com inóculo de 3,0x106 parasitas/mL e tratadas com diferentes concentrações de hidroxiureia
(Sigma®) por 24 horas e acompanhadas em diferentes intervalos de tempo a partir da retirada da HU...39
Figura 13 - Curvas de crescimento apresentadas por culturas de T. rangeli, cepa SC-58, com inóculo de 1,0x106 parasitas/mL e 3,0x106 parasitas/mL e tratadas com 20 mM de hidroxiureia (Sigma®) por 24 horas e acompanhadas em intervalos de tempo a partir da retirada da HU...40
Figura 14 - Formas com 1N1K1F encontradas em culturas de T. rangeli, cepa SC-58, tratada por 24 horas com HU. Fotos tiradas 0 e 6 horas após a retirada da HU. Seta grossa: cinetoplasto; seta fina: núcleo; seta tracejada: flagelo...43
Figura 15 - Porcentagem de formas encontradas em cultura de T. rangeli, cepa SC-58, com inóculo de 1,0x106 parasitas/mL, tratada com 20 mM de hidroxiureia (Sigma®) por 24 horas e acompanhadas nos tempos de 0, 6, 12, 18, 19, 20, 21, 22, 23 e 24 horas após a retirada da HU...44
Figura 16 - Formas com 1N1K1F encontradas em cultura de T. rangeli, cepa SC-58, tratada por 24 horas com HU. Fotos tiradas 12 horas após a retirada da HU. Observar o cinetoplasto (setal) com formato de bastão...45
Figura 17 - Formas com 1N1K2F encontradas em cultura de T. rangeli, cepa SC-58, tratada por 24 horas com HU. Foto tirada 12 horas após a retirada da HU. Observar o novo flagelo (seta), emergindo próximo ao antigo...45
Figura 18 - Formas com 2N2K2F encontradas em cultura de T. rangeli, cepa SC-58, tratada por 24 horas com HU. Foto tirada 18 horas após a retirada da HU...45
Figura 19 - Células em processo de divisão celular com 2N2K2F, encontradas em cultura de
T. rangeli, cepa SC-58, tratada por 24 horas com HU, evidenciando o início da divisão do
citoplasma (seta). Fotos tiradas 18 e 19 horas após a retirada da HU...46
Figura 20 - Células em citocinese encontradas em cultura de T. rangeli, cepa SC-58, tratada por 24 horas com HU. Fotos tiradas 19 horas após a retirada da HU...46
Tabela 1 - Concentração de células em culturas de T. rangeli, cepa SC-58, com inóculo de 3,0x106 parasitas/mL, tratadas com diferentes concentrações de hidroxiureia (Sigma®) por 24 horas e acompanhadas em intervalos de tempo a partir da retirada da HU...38
Tabela 2 - Quantidade de parasitas (x106) encontrados em culturas de T. rangeli, cepa SC-58, com inóculo de 1,0x106 parasitas/mL e 3,0x106 parasitas/mL tratadas com 20 mM de hidroxiureia (Sigma®) por 24 horas e acompanhadas em intervalos de tempo a partir da
retirada da HU...40
Tabela 3 - Porcentagem de células com 1 núcleo, 1 cinetoplasto e 1 flagelo (1N1K1F) nas culturas de T. rangeli, cepa SC-58 com inóculo de 3,0x106 parasitas/mL e tratadas com diferentes concentrações de HU e acompanhadas em 0, 6, 12, 18 e 24 horas após a retirada da HU...41
Tabela 4 - Porcentagem de células com 1 núcleo, 1 cinetoplasto e 2 flagelos (1N1K2F) nas culturas de T. rangeli, cepa SC-58 com inóculo de 3,0x106 parasitas/mL, tratadas com diferentes concentrações de HU e acompanhadas em 0, 6, 12, 18 e 24 horas após a retirada da HU...41
Tabela 5 - Porcentagem de células com 2 núcleos, 2 cinetoplastos e 2 flagelos (2N2K2F) nas culturas de T. rangeli, cepa SC-58 com inóculo de 3,0x106 parasitas/mL, tratadas com diferentes concentrações de HU e acompanhadas em 0, 6, 12, 18 e 24 horas após a retirada da HU... 42
Tabela 6 - Porcentagem de células em citocinese nas culturas de T. rangeli, cepa SC-58 com inóculo de 3,0x106 parasitas/mL, tratadas com diferentes concentrações de HU e acompanhadas em 0, 6, 12, 18 e 24 horas após a retirada da HU. ...42
Tabela 7 - Porcentagem de formas esferomastigotas em culturas de T. rangeli, cepa SC-58 com inóculo de 3,0x106 parasitas/mL, tratadas com diferentes concentrações de HU e acompanhadas em 0, 6, 12, 18 e 24 horas após a retirada da HU... 43
Tabela 8 - Porcentagem de formas em cultura de T. rangeli, cepa SC-58, com inóculo de 1,0x106 parasitas/mL e tratada com 20 mM de hidroxiureia (Sigma®) por 24 horas nos tempos de 0, 6, 12, 18, 19, 20, 21, 22, 23 e 24 horas após a retirada da HU...44
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS CCB – Centro de Ciências Biológicas
DNA - Ácido Desoxirribonucléico F – Flagelo
G1 – Intervalo1 da interfase G2 – Intervalo 2 da interfase HU – Hidroxiureia
LIT – Liver Infusion Tryptose mM – milimolar
M – Mitose M – Molar
MIP – Departamento de Microbiologia e Parasitologia N – Núcleo
NEUBAWER – Neubawer Improved Chamber OMS - Organização Mundial da Saúde
SC-58 – Cepa de Tripanosoma rangeli isolada no Estado de Santa Catarina - Brasil SFB – Soro Fetal Bovino
S – Síntese
TAH - Tripanossomíase Africana Humana UFSC – Universidade Federal de Santa Catarina WHO – World Health Organization
µg - Micrograma µL – Microlitro
SUMÁRIO
1 Introdução...14
2 Revisão da Literatura...16
2.1 A Ordem Kinetoplastida e a Família Trypanosomatidae...16
2.1.1 O Trypanosoma rangeli...21
2.2 Ciclo Biológico do Gênero Trypanosoma...24
2.3 Morfologia e Ciclo Celular do Gênero Trypanosoma...28
2.4 Hidroxiureia...32 3 Objetivos...34 3.1 Objetivo Geral...34 3.2 Objetivos Específicos...34 4 Material e Métodos...35 4.1 Parasitas...35
4.2 Cultivo e manutenção do T. rangeli (Cepa-58)...35
4.3 Condições experimentais...35
4.4 Curva de crescimento e análise morfológica dos parasitas...36
5 Resultados... ...38
5.1 Curvas de crescimento das culturas de T. rangeli, cepa SC-58, com inóculo de 3,0x106 parasitas/mL e tratadas com diferentes concentrações de HU...38
5.2 Curvas de crescimento das culturas de T. rangeli, cepa SC-58, com inóculo de 1,0x106 parasitas/mL e 3,0x106 parasitas/mL, tratadas com 20 mM de HU...39
5.3 Alterações morfológicas detectáveis nas culturas de T. rangeli ...40
6 Discussão...47
7 Conclusão...51
1 Introdução
Os organismos pertencentes à Ordem Kinetoplastida são caracterizados pela presença de um ou dois flagelos originados de uma estrutura na membrana celular em forma de depressão, denominada bolso flagelar. Possuem, ainda, uma única e longa mitocôndria que se diferencia em uma organela típica, abundante em DNA e que dá nome à Ordem: o cinetoplasto. O corpo celular destes organismos possui um arcabouço de microtúbulos estabilizados por ligações cruzadas e associados com a membrana celular, denominados de microtúbulos subpeliculares Das duas subordens, Diplomonadina e Trypanosomatina, esta última com todos seus representantes na Família Trypanosomatidae é de grande importância para a parasitologia (REY, 2001). Nesta Família estão compreendidos doze Gêneros de protozoários flagelados, parasitas de um amplo espectro de organismos compreendidos nos Reinos Protista, Animal e Vegetal (SOUTO-PADRÓN, 2002). No Gênero Trypanosoma, incluem-se três Espécies que infectam o homem:
Trypanosoma cruzi e Trypanosoma rangeli na América Latina e Trypanosoma brucei na
África (WHO, 2007; 2009). O ciclo de vida destes parasitas envolve passagens por hospedeiros vertebrados e invertebrados (STEINDEL, 1993; STEVENS, 2001; MAIA DA SILVA et al, 2007).
O Trypanosoma rangeli é a segunda espécie de tripanossoma que infecta seres humanos na América Latina. É um parasita especialmente interessante porque não é patogênico para seu hospedeiro vertebrado, como o Trypanosoma cruzi, mas o é para o hospedeiro invertebrado (AÑEZ,1987). Seus hospedeiros invertebrados são triatomíneos da Família Reduvidae, sendo especialmente sensíveis aqueles do Gênero Rhodnius (AÑEZ,1987; TOVAR; URDANETA-MORALES; TEJERO, 1989; STEINDEL, 1993; STEVENS, 2001; MAIA DA SILVA et al, 2007; VALLEJO et al, 2007); seus hospedeiros vertebrados estão distribuídos, principalmente, entre cinco Ordens de mamíferos: Edentata, Marsupialia, Carnivora, Rodentia e Primata (HOARE, 1972).
A distribuição geográfica do Trypanosoma rangeli sobrepõem-se a do Trypanosoma
cruzi, agente etiológico da Doença de Chagas (GUHL; VALLEJO, 2003 ; MAIA DA
SILVA et al, 2007), enfermidade que segundo relatório da Organização Mundial da Saúde, afeta cerca de 16 a 18 milhões de pessoas (GUHL et al; 1987; WHO, 2007, 2009). Estes dois parasitas compartilham hospedeiros e reservatórios (STEINDEL, 1993; VALLEJO et
al, 2007). Além disso, tem sido demonstrado que estes tripanossomas são antigenicamente
anticorpos que produzem reação cruzada com os antígenos do Trypanosoma cruzi, representando, por isso, um dificultador no diagnóstico da Doença de Chagas (MARINKELLE, 1982; GUHL et al, 1987; SALDAÑA; SOUSA, 1996; SALDAÑA, 1997; VASQUEZ et al, 1997; CUBA-CUBA, 1998; GRISARD et al, 1999; SALDAÑA et al, 2005; ZÚÑIGA et al, 2007; SOUSA et al, 2008;).
O ciclo celular dos tripanossomas tem sido estudado por diferentes autores que buscam compreender os eventos envolvidos neste processo com vistas ao desenvolvimento de novas drogas que possam impedir e/ou controlar o processo de diferenciação desses parasitas e, ao mesmo tempo, tenham baixos impactos sobre as células dos mamíferos hospedeiros (HAMMARTON; MOTRAM; DOERIG, 2003). Através de vários estudos tem-se buscado compreender as particularidades do ciclo do T. cruzi e do T. brucei (ELIAS
et al, 2002, 2007; ABSALON et al, 2007; HAMMARTON, 2007; SIEGEL; HEKSTRA;
CROSS, 2008), porém, pouco se conhece acerca dos eventos relacionados ao ciclo celular do T. rangeli. Por outro lado, nas últimas décadas o Trypanosoma rangeli tem sido um modelo de estudo para vários grupos de pesquisadores: os aspectos relacionados à sua biologia e seu ciclo de vida, fazem deste parasita um organismo singular para o estudo das relações parasita-hospedeiro.
2 Revisão da Literatura
2.1 A Ordem Kinetoplastida e a Família Trypanosomatidae
As características que reúnem os organismos na Ordem Kinetoplastida são as seguintes: presença de um ou dois flagelos emergindo de uma depressão na membrana celular denominada de bolso flagelar; presença de uma organela típica, denominada cinetoplasto, que corresponde a uma condensação de DNA localizado no interior da única mitocôndria que é ramificada por todo o corpo celular e tem sua membrana contínua à membrana do cinetoplasto e, presença de um arcabouço de microtúbulos estabilizados por ligações cruzadas e associados com a membrana celular, denominado de microtúbulos subpeliculares (GULL, 1999; LANDFEAR; IGNATUSHCHENKO, 2001). O cinetoplasto é capaz de auto-replicação. Nesta Ordem há duas subordens, Trypanosomatina e Diplomonadina, porém, somente a Trypanosomatina é de interesse parasitológico, reunindo todas as Espécies na Família Trypanosomatidae, conforme descrito abaixo (REY, 2001).
- Reino: Protista - Sub-Reino: Protozoa - Filo: Sarcomastigophora - Subfilo: Mastigophora - Classe: Zoomastigophorea - Ordem: Kinetoplastida - Subordem: Trypanosomatina - Família: Trypanosomatidae
Abaixo (Figura 1), representação simplificada de um protozoário pertencente à Ordem Kinetoplastida, mostrando a disposição de algumas de suas organelas.
Figura 1: Representação simplificada de um protozoário pertencente à Ordem Kinetoplastida.
Os membros da Família Trypanosomatidae se caracterizam por apresentar uma diversidade de estágios morfológicos que se relacionam com a fase do ciclo biológico e as interações com o meio em que se encontram. Dos doze Gêneros pertencentes a esta Família, sete completam seu ciclo de vida em um só hospedeiro, por isso são ditos monoxênicos (Angomonas, Blastocrithidia, Crithidia, Herpetomonas, Leptomonas, Rhynchoidomonas e
Wallaceina) e outros cinco Gêneros (Endotrypanum, Leishmania, Phytomonas, Sauroleishmania e Trypanosoma), ditos heteroxênicos, completam seu ciclo biológico em
mais de um hospedeiro, sendo que seus hospedeiros definitivos podem pertencer a várias Espécies. Por isso, esses parasitas são também classificados como eurixenos (REY, 2001).
A caracterização morfológica desses parasitas é feita com base na disposição e aspectos de algumas de suas organelas, como o flagelo, o bolso flagelar, o cinetoplasto e o núcleo. A posição do flagelo em relação ao corpo celular, considerando-se seu ponto de partida em relação ao cinetoplasto, seu ponto de emergência em relação à membrana celular e sua posição distal livre, são as principais características levadas em conta para caracterizar os estágios morfológicos destes organismos. Utilizada por Hoare (1972), esta classificação é aceita por todos os autores:
a) Amastigota: forma arredondada ou ovóide. O corpo celular tem pouco citoplasma, enquanto o núcleo é grande, redondo e excêntrico. O cinetoplasto é bem visível e o flagelo se restringe à porção intracelular e, por isso, o parasita é imóvel.
b) Esferomastigota: forma arredondada, com flagelo mais longo que se exterioriza e permite movimento. Representa, em verdade, um estágio transitório entre as formas amastigotas e epimastigotas.
c) Promastigota: corpo celular alongado com um cinetoplasto localizado próximo à extremidade anterior, por onde se exterioriza o flagelo, que nasce a partir de um corpúsculo basal que se encontra próximo ao cinetoplasto. O flagelo se exterioriza por entre um canal denominado bolso flagelar. O núcleo está localizado na região mediana.
d) Opistomastigota: estágio chamado de "tripanomórfico" e representado (somente no Gênero Herpetomonas) por formas alongadas com cinetoplasto pós-nuclear. O flagelo localiza-se próximo ao cinetoplasto, passa através do corpo celular e emerge no final da extremidade anterior.
e) Epimastigota: Distingui-se da forma promastigota porque o cinetoplasto fica localizado próximo ao núcleo e o bolso flagelar abre-se lateralmente. O flagelo emerge longe da extremidade anterior.
f) Tripomastigota: estágio representado por formas alongadas com cinetoplasto pós-nuclear. O flagelo surge próximo ao cinetoplasto e emerge ao lado do corpo celular, ligando-se a este através de uma membrana ondulante. As formas tripomastigotas têm, tipicamente, forma de lança; o corpo celular é alongado e achatado. Ao corte transversal apresenta-se elíptico ou oval e suas extremidades são afiladas. A extremidade pela qual avança durante a locomoção é descrita como extremidade anterior. Esta termina em um fino ponto, enquanto a extremidade posterior varia na forma, mas geralmente é mais larga, afilando abruptamente ou apresentando a ponta arredondada.
g) Coanomastigota: Forma pequena, com corpo celular curto, geralmente com cinetoplasto localizado próximo ao núcleo e excêntrico. O flagelo surge de um bolso flagelar maior, com formato de funil e emerge no final da extremidade anterior do corpo celular (restrito ao Gênero Crithidia). Em geral, o cinetoplasto é grande.
As formas amastigotas, epimastigotas e tripomastigotas são as mais facilmente identificadas através de microscopia óptica (Figura 2).
Figura 2 - Desenhos esquemáticos das formas da Família Trypanosomatidae. A- amastigota; B- promastigota; C- coanomastigota; D- epimastigota; E- tripomastigota; F- opistomastigota. Fonte: Rey (2001)
No Gênero Trypanosoma, destacam-se os tripanossomas americanos e africanos, por terem grande impacto na saúde humana e animal (GULL, 1999; SOUTO-PADRÓN, 2002; WHO, 2007, 2009).
O Trypanosoma cruzi (Figura 3) é o protozoário causador da Tripanossomíase Americana ou Doença de Chagas, enfermidade presente em 21 países das Américas Central e do Sul. De acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS), existem 100 milhões de pessoas nas áreas de risco e de 16 a 18 milhões de pessoas afetadas pela enfermidade (WHO, 2007, 2009).
Figura 3 – Forma tripomastigota de Trypanosoma cruzi. Seta preta - cinetoplasto; vermelha - núcleo; azul -
membrana ondulante; verde - flagelo. Fonte: Atlas Eletrônico de Parasitologia (2009).
Os hospedeiros invertebrados do Trypanosoma cruzi são insetos hematófagos conhecidos popularmente como barbeiros, pertencentes à Subfamília Triatominae, Família Reduviidae, Ordem Hemíptero. Destacam-se como Espécies de importância epidemiológica aquelas agrupadas nos Gêneros Triatoma, Panstrogylus e Rhodnius (Figura 4). Alguns de
seus hospedeiros vertebrados silvestres (reservatórios naturais) são mamíferos distribuídos principalmente entre cinco Ordens: Edentata, Marsupialia, Carnivora, Rodentia, Chiroptera,
Logomorpha, Artiodactila e Primate (HOARE, 1972; BARRETO; RIBEIRO, 1979;
STEINDEL, 1993; REY, 2001; YVES, 2002; WHO, 2005, 2007).
Figura 4: (A) Panstrongylus megistus; (B) Rhodnius prolixus; (C) Triatoma infestans Fontes: SUCEN (2009); Uniprot (2009); Atlas Eletrônico de Parasitologia (2009).
Em cerca de vinte países da África subsaariana, o Trypanosoma brucei gambiense e o
Trypanosoma brucei rhodesiense são os causadores da Tripanossomíase Africana Humana
(TAH) ou Doença do Sono. Segundo estimativas da OMS, no ano de 2000 cerca de 50 a 60 milhões de pessoas estavam em áreas de risco e perto de 300.000 pessoas foram afetadas pela TAH no continente Africano, dados esses superiores aos 27.000 casos notificados, diagnosticados e tratados naquele ano. Em 2006, o número de casos foi estimado em 70.000 e em 2007, o número de casos notificados diminuiu para 10.769 (WHO, 2007, 2009).
Na Tripanossomíase Africana Humana, os hospedeiros invertebrados são insetos hematófagos, pertencentes ao Gênero Glossina e conhecidos popularmente como moscas tsé-tsé (Figura 5). Alguns de seus hospedeiros vertebrados silvestres (reservatórios naturais) são impalas (Aepyceus sp.), vacas-do-mato ou bubalo (Alcelaphus sp.), imbabala (Tragelaphus sp.) e outros, que suportam a infecção sem nenhuma patogenia (REY, 2001; WHO, 2007, 2009). Como esses tripanossomatídeos estabeleceram-se com sucesso em diversas regiões, numa diversidade de animais invertebrados e vertebrados, incluindo o homem, o impacto dessas parasitoses é muito grande (WHO, 2009).
Figura 5 – Glossina sp., conhecida popularmente como mosca tsé-tsé. Fonte: WHO (2009).
2.1.1 O Trypanosoma rangeli
Cita-se no Gênero Trypanosoma o Trypanosoma rangeli (Figura 6), um protozoário hemoflagelado, heteroxênico que infecta seres humanos e animais domésticos e silvestres, estando presente em vários países da América Central e da América do Sul, portanto, vivendo em simpatria com o T. cruzi (AÑEZ,1987; TOVAR; URDANETA-MORALES; TEJERO, 1989; STEVENS, 2001; MAIA DA SILVA et al, 2007; VALLEJO et al, 2007), (Figura 7). Embora esses dois protozoários compartilhem os mesmos hospedeiros invertebrados e vertebrados, o T. rangeli não é patogênico para os hospedeiros vertebrados, causando danos aos hospedeiros invertebrados, ao contrário do T. cruzi (AÑEZ,1987).
Os hospedeiros invertebrados do T. rangeli são triatomíneos da Família Reduvidae, (AÑEZ,1987; TOVAR; URDANETA-MORALES; TEJERO, 1989; STEVENS, 2001; MAIA DA SILVA et al, 2007; VALLEJO et al, 2007), sendo que as Espécies do Gênero
Rhodnius são seus principais vetores naturais e experimentais. Entretanto, outras Espécies
como Triatoma dimidiata, T. patagonica, T. protracta e T. infestans também são capazes de transmitir o T. rangeli em condições experimentais (D’ALESSANDRO, 1976; TOVAR, URDANETA-MORALES; TEJERO, 1989; STEINDEL et al., 1991; D’ALESSANDRO; SARAVIA, 1992; STEINDEL, 1993).
Figura 6 – Trypanosoma rangeli (Cepa SC-58) cultivado em meio LIT, suplementado com 20% de SFB e
mantido a 28o C.
Figura 7 – Mapa das Américas Central e do Sul mostrando a sobreposição da distribuição da Doença de
Chagas Humana até 1992 (sombreado) segundo a OMS, e os registros da presença comprovada do
Trypanosoma rangeli em humanos, triatomíneos ou animais silvestres (•). Fonte - Neves (2004).
O T. rangeli foi isolado pela primeira vez em 1920 por Tejera, quando este trabalhava com a Doença de Chagas na Venezuela e encontrou no intestino de R. prolixus um parasita morfologicamente diferente do T. cruzi (STEINDEL, et al, 1991).
O primeiro relato de infecção humana por T. rangeli foi feito por De Leon (1942), quando estudava a Doença de Chagas na Guatemala.
Durante um inquérito epidemiológico realizado no Panamá por Sousa e Johnson (1971) para analisar a presença de tripanossomíase humana, foram examinados 12.975
amostras de sangue em nove províncias das áreas rurais do país. Deste total, foram encontrados 17,25% pacientes com o T. cruzi e 91,87% infectados com o T. rangeli, correspondendo a 80% da população.
Mais recentemente, Saldanha et al (2005), realizaram um estudo epidemiológico na província de La Chorrera no Panamá. O inquérito foi realizado no ano de 2004 em quatro comunidades rurais reconhecidamente endêmicas para a Doença de Chagas. Foram analisadas amostras de sangue de 206 crianças entre 3 a 14 anos. Deste total, seis (2,9%) estavam contaminadas com T. cruzi e 14 (6,8%) com T. rangeli. Dessas 14 crianças, cinco tinham menos de oito anos.
Além desses relatos, outros autores têm reportado a presença do T. rangeli e/ou parasitas semelhantes a T. rangeli em vários triatomíneos e mamíferos (LUCENA; VERGETTTI, 1973; MILES et al, 1983; STEINDEL, et al, 1991; RAMIREZ et al, 2002; GURGEL-GONÇALVES et al, 2004; SALDAÑA, et al 2005; STEHLING-DIAS et al, 2007).
No Brasil, o primeiro caso de infecção humana pelo T. rangeli foi descrito por Lucena e Marques (1954) em um paciente cardíaco, mas este achado não é considerado por alguns autores (GRISARD et al, 1999; MILETTI et al, 2006), que creditam o primeiro relato de infecção humana a Coura (1996) que reportou a infecção em três pacientes no Estado do Amazonas, em 1996. Steindel et al (1991), afirmam que “no Brasil, parasitas semelhantes ao T. rangeli foram observados em fezes de Panstrongylus megistus usados em xenodiagnóstico humano em um paciente do estado de Alagoas”, referindo-se ao achado de Lucena e Marques (1954). Por outro lado, Ramirez et al (1998), relatam em seus trabalhos que o primeiro achado do T. rangeli no Brasil deveu-se a Deane (1958) que encontrou o parasita no marsupial Metachirops opossum opossum no estado do Pará.
Em estudo recente Sousa et al (2008) isolaram o T. rangeli, através de hemocultura, em dois pacientes em fase crônica da Doença de Chagas, atendidos no ambulatório do Instituto de Pesquisas Clínicas Evandro Chagas (IPEC-FIOCRUZ), no Estado da Bahia.
Maia da Silva et al (2009) confirmaram através de diagnóstico biológico, morfológico e molecular a contaminação de mamíferos da Ordem Chiroptera por T. rangeli. Os parasitas foram encontrados na região central do Brasil, infectando duas espécies de morcegos:
Platyrrhinus lineatus e Artibeus planirostris. Os autores afirmam, ainda, que os parasitas
encontrados em P. lineatus pertencem a uma nova linhagem de T. rangeli.
A sobreposição na distribuição geográfica do T. rangeli e do T. cruzi tem sido um complicador para os programas de saúde que procuram fazer o controle e o combate da
Doença de Chagas, por isso, o impacto epidemiológico causado pelo T. rangeli vem sendo registrado por vários autores há alguns anos, pois há registros de que cerca de 2.500 pessoas foram infectadas pelo T. rangeli concomitantemente ou não com o T. cruzi em vários países da América Latina (YVES, 2002; GUHL; VALLEJO, 2003); apesar de não ser patogênico para seus hospedeiros vertebrados, as infecções com o T. rangeli induzem uma resposta imune humoral com aumento no número de anticorpos circulantes (SALDAÑA; SOUSA; ÖRN, 1995; SALDAÑA; SOUSA, 1996), as infecções mistas de T. rangeli e T. cruzi podem causar reação sorológica cruzada em função da similaridade de seus antígenos de superfície, ocasionando um falso positivo para o T. cruzi (ANTHONY; JOHNSON; SOUSA, 1979; GRÖGL; KUHN, 1984; GUHL et al, 1985; GUHL et al, 1987; D’ ALESSANDRO; SARAVIA, 1992).
2.2 Ciclo Biológico do gênero Trypanosoma
O ciclo de vida dos parasitas reunidos no Gênero Trypanosoma é complexo, ocorrendo diferentes estágios de desenvolvimento que são caracterizados por alterações estruturais e metabólicas nas células desses protozoários. Essas alterações são conseqüências de adaptações por que passam os parasitas nos diferentes organismos que lhes servem de hospedeiros: invertebrados e vertebrados (SOUTO-PADRÓN, 2002).
De acordo com os hospedeiros em que se encontrem e em cada fase do ciclo celular, os tripanossomatídeos apresentam uma diversidade de formas que lhes conferem, em cada caso, capacidade infectiva e/ou reprodutiva. Este fato está relacionado com a necessidade que estes parasitas têm de sobreviver no ambiente em que estão inseridos; a troca de ambiente implica, portanto, em drásticas mudanças morfológicas. As formas infectivas para o hospedeiro vertebrado são as chamadas tripomastigotas metacíclicas, enquanto as formas reprodutivas são as amastigotas e epimastigotas (REY, 2001; SOUTO-PADRÓN, 2002), (Figura 8).
Figura 8 – Esquema do ciclo biológico do T. rangeli no hospedeiro invertebrado. 1. Tripomastigota
sangüíneo é ingerido durante o repasto sangüíneo; 2 – Presença de formas multiplicativas no intestino médio anterior; 3 – Passagem dos parasitas do intestino médio posterior para a hemolinfa através de uma rota intracelular; 4 – Possível transmissão através de via contaminativa; 5 – As formas epimastigotas se multiplicam livres na hemolinfa; 6 – Invasão da glândula salivar; 7 – Infecção de hemócitos; 8 – Liberação dos parasitas intracelulares; 9 – Reinfecção de hemócitos ou invasão das glândulas salivares.
Fonte: Adaptado de D’Alessandro e Saraiva (1992) e modificado por Moreto (2007).
Embora o T. rangeli compartilhe hospedeiros vertebrados e invertebrados com o T. cruzi (HOARE, 1972; CUBA-CUBA, 1998; GRISARD et al, 1999; YVES, 2002;
D’ALESSANDRO; SARAVIA, 1992), há importantes diferenças nos ciclos biológicos desses dois protozoários:
- No hospedeiro vertebrado: o ciclo biológico do T. rangeli no hospedeiro vertebrado é pouco conhecido (D’ALESSANDRO; SARAVIA, 1992) e não há comprovação de que ele possa infectar e multiplicar-se nas células dos mamíferos infectados, como faz o T. cruzi (YVES, 2002).
O ciclo biológico do T. cruzi no hospedeiro vertebrado se dá da seguinte forma: durante o repasto sanguíneo, o triatomíneo evacua e junto com suas fezes e urina, as formas tripomastigotas metacíclicas penetram pelo local da picada, interagindo com as células do sistema fagocítico mononuclear da pele ou da mucosa do hospedeiro. Chegando à corrente sanguínea, os tripomastigotas metacíclicos transformam-se em tripomastigotas sanguíneos. No sangue, os flagelados não sofrem divisão e podem ser fagocitados ou invadir diversos tipos celulares do hospedeiro: fibras musculares estriadas esqueléticas e cardíacas, fibras musculares lisas e células nervosas. Nessas células, os protozoários sofrem nova transformação, agora para formas amastigotas que recuperam a capacidade reprodutiva e através de sucessivas divisões binárias, produzem um número crescente de novas células amastigotas. Então, uma nova transformação ocorre: as formas amastigotas transformam-se em formas tripomastigotas, que rompem a célula hospedeira para invadirem outras células, dando continuidade ao ciclo. (BITTENCOURT, 2000; REY, 2001; YVES, 2002).
No vertebrado, a parasitemia causada pelo T. rangeli é geralmente baixa e de curta duração, aproximadamente de duas a três semanas (STEINDEL, 1993), não constituindo consenso entre os autores a maneira pela qual o parasita possa se reproduzir. Poucas observações de formas tripomastigotas sangüíneas que parecem estar em divisão foram realizadas em seres humanos e roedores (STEINDEL, 1993). Segundo D’ Alessandro (1976), estas observações geralmente são feitas em indivíduos recentemente infectados, sendo que estas formas podem ser provenientes das glândulas salivares do inseto e não uma conseqüência da multiplicação do parasita. Além disso, várias tentativas de infecção experimental de células in vitro pelo T. rangeli revelaram uma baixa infectividade e nenhuma evidência de multiplicação intracelular (EGER-MANGRICH et al, 2001).
O tripomastigota sanguíneo é a única forma do T. rangeli detectável no hospedeiro vertebrado (D’ALESSANDRO; SARAVIA, 1992), e é caracterizada pela ausência de patogenicidade, ausência de formas em divisão nos tecidos e no sangue e pela limitada duração da parasitemia (YVES, 2002). De acordo com Añez (1983), nos primeiros dias após a infecção os parasitas são visualizados na circulação, e durante a primeira semana, há um pequeno aumento na parasitemia que vai decaindo lentamente; a partir do décimo quinto dia, os parasitas só são detectados através de métodos indiretos, como xenodiagnóstico e hemocultura.
Diferentemente do que ocorre com o T. cruzi, cuja transmissão ocorre exclusivamente pelas fezes e urina infectadas (via contaminativa), o T. rangeli é transmitido pela picada de triatomíneos infectados (via inoculativa). A transmissão do T. rangeli através de formas
presentes nas fezes é considerada possível, porém, deve ocorrer com uma freqüência muito menor do que a transmissão pela picada, em condições naturais (D’ ALESSANDRO; SARAVIA, 1992).
- No hospedeiro invertebrado: o ciclo biológico do T. rangeli no hospedeiro invertebrado é bem conhecido: quando chegam ao intestino médio do triatomíneo, as formas epimastigotas do T. rangeli sofrem divisão por fissão binária; no intestino médio posterior, as formas epimastigotas podem invadir a hemocele usando uma rota intracelular através do epitélio intestinal (DE OLIVEIRA; SOUZA, 2001); chegam, então, na hemocele, onde são encontrados livres na hemolinfa em processo de divisão ou no interior de hemócitos, principalmente plasmatócitos, onde são encontrados em degeneração, dentro de vacúolos digestivos, evidenciando que estas células são capazes de destruir os parasitas e que o processo de diferenciação e multiplicação dos parasitas ocorre na hemolinfa (DE OLIVEIRA; SOUZA, 2003). Através da hemolinfa, chegam às glândulas salivares, onde penetram para sofrerem nova transformação em formas tripomastigotas metacíclicas. Nas glândulas salivares estão aptas a infectarem novos hospedeiros vertebrados, quando estes são picados pelo inseto triatomíneo (MEIRELLES, 2003). Neste ponto, faz-se importante distinção: no caso do T. cruzi, o hospedeiro vertebrado é infectado por formas tripomastigotas metacíclicas presentes nas fezes e urina do triatomíneo, daí, dizer-se que o parasita tem desenvolvimento posterior e a transmissão é do tipo contaminativa; as formas tripomastigotas metacíclicas do T. rangeli são introduzidas no hospedeiro vertebrado através da saliva no momento da picada, por isso, dizer-se que a transmissão se dá de maneira inoculativa e o parasita é considerado de desenvolvimento anterior (REY, 2001).
A via de transmissão das formas tripomastigotas metacíclicas para o hospedeiro vertebrado tem servido para classificar os organismos do Gênero Trypanosoma em duas Seções: Stercoraria (tripanossomas transmitidos pelas fezes) e Salivaria. (tripanossomas transmitidos pela saliva). A Seção Stercoraria está subdividida em três subgêneros:
Schizotrypanum, Herpetosoma e Megatrypanum. A Seção Salivaria está subdividida em
quatro subgêneros: Duttonela, Nannomonas, Trypanozoom e Pycnomonas. O T. rangeli está classificado junto com o T. cruzi na Seção Stercoraria, o que tem causado controvérsia entre os autores. Estudando as seqüências de mini-exons, alguns autores mostraram uma estreita relação evolutiva entre o T. rangeli e o T. cruzi e uma menor relação entre o T. rangeli e outros tripanossomas transmitidos através da saliva, sugerindo que a rota de transmissão não deve ser uma característica evolutiva importante para o estabelecimento da posição
taxonômica dos membros do Gênero Trypanosoma, que deve ser revista (STEVENS; GIBSON, 1999; STEVENS et al, 1999).
2.3 Morfologia e Ciclo Celular do Gênero Trypanosoma
O ciclo celular dos tripanossomas tem sido objeto de vários estudos que buscam elucidar os eventos biológicos envolvidos neste processo com vistas ao desenvolvimento de novas drogas que possam impedir e/ou controlar o processo de diferenciação desses parasitas e, ao mesmo tempo, tenham baixos impactos sobre as células hospedeiras dos mamíferos (HAMMARTON; MOTRAM; DOERIG, 2003).
Embora estes estudos já tenham conseguido elucidar algumas particularidades do ciclo do T. cruzi e do T. brucei (ELIAS et al, 2002, 2007; ABSALON et al, 2007; HAMMARTON, 2007; SIEGEL; HEKSTRA; CROSS, 2008), pouco se conhece acerca dos eventos relacionados ao ciclo celular do T. rangeli.
Com organização típica de um eucarioto, esses parasitas apresentam uma organização celular típica que se altera enormemente ao longo do ciclo biológico. Algumas de suas particularidades estruturais são: (a) presença de organelas como o cinetoplasto, reservosomo, acidocalcisomo, glicosomo e citóstoma; (b) presença de somente uma copia por célula do complexo de Golgi e da mitocôndria; (c) microtúbulos com organização subpelicular característica; (d) presença de um flagelo que emerge de uma depressão chamada bolso flagelar e que, além de permitir movimento, possibilita a adesão do parasita à célula do hospedeiro (Figura 9) e finalmente, (e) ciclo celular com características próprias (WEBSTER; RUSSELL, 1993; DE SOUZA, 1999, DE SOUZA et al, 2000; MOREIRA-LEITE et al, 2001; MORGAN et al, 2002 - I e II; ELIAS et al, 2002, 2007; FIGUEIREDO
et al, 2004; ABSALON et al, 2007; CORRÊA, 2007; HAMMARTON, 2007; SIEGEL;
HEKSTRA; CROSS, 2008).
O cinetoplasto é uma organela única que apresenta coloração violácea quando corado com Giemsa (REY, 2001). Esta organela é típica da Ordem Kinetoplastida e se apresenta envolvida por uma membrana que tem continuidade com a membrana da única mitocôndria. No interior do cinetoplasto há filamentos formados por DNA, chamados de kDNA e que contêm cerca de 30% do DNA celular na forma de milhares de minicírculos e cerca de 20 a 50 maxicírculos, que codificam RNAr, RNAt e RNAm, permitindo a síntese de proteínas envolvidas na cadeia respiratória da membrana mitocondrial (REY, 2001;
DOCAMPO et al, 2005). Quando tratados com enzimas de restrição, os minicírculos apresentam-se como seqüências polimórficas, podendo servir como marcador para diferenciar cepas e populações entre as espécies (SOUTO; VARGAS; ZINGALES, 1999; VALLEJO et al, 2002). Estudando o polimorfismo dos minicírculos de DNA (kDNA), Vallejo et al (2002) reconheceram dois grupos geneticamente distintos e que formam duas grandes sub-populações, denominadas de KP1+ e KP1-. De acordo com Vallejo et al (2007), a análise morfológica e molecular destas duas sub-populações isoladas a partir de diferentes triatomíneos foi capaz de fornecer uma correlação entre as cepas de T. rangeli e as espécies de Rhodnius, “confirmando que cada espécie de Rhodnius transmite ao hospedeiro vertebrado populações do parasita com claras diferenças fenotípicas e genotípicas”.
A localização e o aspecto do cinetoplasto são utilizados como indicadores da morfologia na Ordem Kinetoplastida: amastigota, epimastigota, tripomastigota, etc., (HOARE, 1972). Em todas as formas assumidas pelos parasitas, cinetoplasto e corpúsculo basal do flagelo (blefaroplasto) estão sempre próximos, graças a filamentos que unem estas duas estruturas (DE SOUZA, 1999); além disso, a posição do cinetoplasto se altera ao longo do ciclo celular do parasita, o que constitui interessante marcador das fases do ciclo (ELIAS et al, 2007; SIEGEL; HEKSTRA; CROSS, 2008).
A membrana plasmática dos tripanossomatídeos apresenta-se apoiada sobre um arranjo de microtúbulos denominado de microtúbulos subpeliculares. Este arcabouço de microtúbulos dificulta a invaginação da membrana plasmática em quase toda a superfície do protozoário, impossibilitando a internalização e exteriorização de partículas. No entanto, os microtúbulos são descontinuados na região anterior do parasita, onde há uma invaginação da membrana, denominada de bolso flagelar. No T. brucei a endocitose e a exocitose ocorrem neste local, mas no T. cruzi esses processos de troca de substâncias com o meio ocorrem, principalmente, através do citóstoma e da citofaringe (MOREIRA-LEITE
et al, 2001; MORGAN et al, 2002 – I e II; FIGUEIREDO et al, 2004; DOCAMPO et al,
Figura 9 - Esquema geral de forma epimastigota do Trypanosoma cruzi mostrando as principais estruturas
celulares. Fonte: Docampo et al (2005).
O reservosomo é descrito como sendo uma organela esférica, acídica, envolvida por uma única membrana e que se localiza na região posterior do parasita, em quantidade que varia de algumas unidades por célula (FIGUEIREDO et al, 2004; CORRÊA. 2007). Ele é encontrado nas formas amastigota e epimastigota e está ausente nas formas tripomastigotas. Estas organelas representam cerca de 6% do volume total da célula (SOARES; DE SOUZA, 1988) e contêm na sua matriz, cisteína proteinase, enzima envolvida no ciclo biológico dos tripanossomas (DE SOUZA et al, 2000 FIGUEIREDO et al, 2004).
Funcionalmente, tem sido sugerido pelos autores que o reservosomo é um compartimento pré-lisossomal que participa da via de endocitose. Os nutrientes acumulados em seu interior são utilizados na produção de energia, que é consumida pelo parasita durante o processo de metaciclogênese que ocorre das formas tripomastigotas e amastigotas para as formas epimastigotas, daí, não estarem presentes nestas últimas formas (FIGUEIREDO et al, 2004).
A citóstoma/citofaringe é descrita como sendo uma invaginação que penetra profundamente no citoplasma terminando próximo ao núcleo. A depressão, chamada de citofaringe, se abre para o meio externo (citóstoma), lateralmente ao corpo celular, na região anterior do parasita, próximo à região do bolso flagelar (SOARES; DE SOUZA, 1991; REY, 2001;). No caso do T. cruzi, as partículas que adentram o parasita são eficientemente internalizadas através desta região (SOARES; DE SOUZA, 1991).
De Souza et al (2000), descrevem o acidocalcissomo como sendo uma organela
esférica, acídica, encontrada preferencialmente na periferia do citoplasma de vários tripanossomatídeos e que varia em quantidade, dependendo da espécie em questão e em cada espécie, do estágio de desenvolvimento do parasita. De acordo com os trabalhos revisados por De Souza et al (2000), os acidocalcissomos podem estar envolvidos em quatro processos biológicos (não excludentes) de singular importância: (a) representar um importante reservatório de íon Ca+; (b) representar um reservatório de energia, em função da quantidade de fósforo inorgânico encontrado em seu interior; (c) ser um regulador de pH; (d) atuar na osmorregulação celular.
O glicossomo é uma organela que concentra enzimas que participam do metabolismo da glicose, o que possibilita um aumento na eficiência deste processo (DE SOUZA, 1999).
O flagelo é uma estrutura multifuncional que emerge a partir de uma estrutura denominada de corpúsculo basal do flagelo através de uma invaginação da membrana celular denominada de bolso flagelar. Funcionalmente, o flagelo é responsável pela movimentação celular, além de possuir importante papel nos processos de quimiotaxia, sinalização celular e adesão do parasita à célula do hospedeiro (GULL, 2003; DE SOUZA, 1999; SOARES; DE SOUZA, 1991; FRIDBERG; BUCHANAN, 2007; HILL, 2003).
Além da citóstoma/citofaringe, as partículas internalizadas pelo T. cruzi o fazem, também, através do bolso flagelar. Estas duas estruturas funcionariam, portanto, como “portas de entrada” para as substâncias que devem adentrar a célula (WEBSTER; RUSSELL, 1993). No T. brucei não há citóstoma/citofaringe e a internalização de partículas ocorre por invaginação da membrana plasmática na região do bolso flagelar (WEBSTER; RUSSELL, 1993; CORRÊA, 2007).
O ciclo celular do T. cruzi é complexo, ocorrendo alterações morfológicas e fisiológicas ao longo das passagens pelos hospedeiros invertebrados e vertebrados o que se justifica pela necessidade de o parasita se adaptar a diferentes ambientes (CORRÊA, 2007). Elias et al (2007) trabalharam com formas epimastigotas da cepa Y do T. cruzi para
analisarem os eventos morfológicos ocorridos durante o ciclo celular deste tripanossoma. De acordo com estes autores, a duração do ciclo celular foi de 24 horas; o novo flagelo emerge do bolso flagelar na fase G2 do ciclo celular, quando a síntese do DNA foi completada e a célula ainda contém 1 núcleo e 1 cinetoplasto. Ao final da fase G2 do ciclo celular ocorre a separação do cinetoplasto; a mitose ocorre nas células em que os cinetoplastos já foram duplicados e separados; o novo flagelo compartilha o mesmo bolso flagelar com o antigo flagelo, enquanto um novo bolso flagelar é originado na região do cinetoplasto (Figura 10).
Figura 10 – Representação esquemática das alterações morfológicas durante o ciclo celular de formas
epimastigotas de Trypanosoma cruzi. Os estágios do ciclo celular são indicados como G1, S, G2, M (mitose) e C (citocinese). F – flagelo; Fp – bolso flagelar; K – cinetoplasto; K-Div – divisão do cinetoplasto.
Fonte: Elias et al (2007).
2.4 Hidroxiureia
A hidroxiureia (HU) é uma droga que tem ação inibitória sobre o ciclo celular, atuando na passagem da fase G1 para S, impedindo a progressão do ciclo e conseqüentemente a duplicação celular. Seu mecanismo de ação deve-se a capacidade de inibir a enzima ribonucleotídeo redutase, responsável pela redução dos ribonucleotídeos a desoxirribonucleotídeos, monômeros essenciais para a síntese do DNA (YARBRO, 1992),
(Figura 11). Por ter ação especifica sobre ciclo celular, diferentes concentrações de HU tem sido testada e utilizada na terapêutica de diversos tipos de cânceres (GWILT; TRACEWELL, 1998). Seu potencial citotóxico também tem sido testado (LIMA DE LIMA
et al, 2003; MELO; BEIRAL, 2003).
Figura 11 – Esquema geral da reação catalisada pela enzima ribonucleotídeo redutase. Fonte: UFMG (2009).
Galanti et al (1994) investigaram a ação da hidroxiureia em cepas de T. cruzi e
descreveram um método para sincronizar o ciclo celular nestes protozoários. Utilizando esta droga Elias et al (2007), sincronizaram o ciclo celular de formas epimastigotas em crescimento exponencial de cepas Y de T. cruzi. Outros autores têm utilizado concentrações específicas de hidroxiurea para sincronizar o ciclo celular de Leishmania tarentole (SIMPSON; BRALY, 1970), Leishmania major (ZICK et al, 2005) e Leishmania infantum (SOTO et al, 2000). Por outro lado, a utilização da hidroxiurea para sincronizar o ciclo celular do T. brucei é controversa entre os autores (CHOWDHURY; ZHAO; ENGLUND, 2008; FORSYTHE; MCCULLOCH; HAMMARTON, 2009). Células infectadas com
Toxoplasma gondii, Leishmania amazonensis e T. cruzi têm sido estudadas para testar a
capacidade da hidroxiureia na inibição da multiplicação intracelular destes protozoários (MELO; BEIRAL, 2003).
3 Objetivos
3.1 Objetivo Geral
O objetivo deste trabalho foi analisar o ciclo celular do T. rangeli em meio de cultura axênico.
3.2 Objetivos Específicos
Investigar as mudanças ocorridas no protozoário Trypanosoma rangeli mantido em meio axênico e submetido ao tratamento com HU, analisando a forma geral do parasita e as seguintes estruturas celulares: flagelo, cinetoplasto e núcleo.
Determinar o tempo de duração das etapas diagnosticáveis da mitose no
4. Material e Métodos
4.1 Parasitas
Cepa SC-58 de T. rangeli, isolada por hemocultura do roedor Echimys dasythrix, naturalmente infectado na ilha de Santa Catarina – Estado de Santa Catarina, Brasil (STEINDEL et al., 1991) e gentilmente cedidas pelo laboratório de Protozoologia do Departamento de Microbiologia e Parasitologia, Centro de Ciências Biológicas - Universidade Federal de Santa Catarina (MIP/CCB/UFSC).
4.2 Cultivo e manutenção do T. rangeli (Cepa SC-58)
Os parasitas foram cultivados em meio LIT (Liver Infusion Tryptose), pH 7,2 (CAMARGO, 1964) acrescido de 20% de soro fetal bovino (SFB) e 0,4 mg/L de hemina em estufa bacteriológica a 28º C. A cada sete dias as cepas eram sub-cultivadas no mesmo meio de cultura e os inóculos eram constituídos de 10% da cultura original.
4.3 Condições experimentais
A fim de identificar as alterações morfológicas ocorridas durante o ciclo celular do T.
rangeli, cepa SC-58, sob tratamento com hidroxiureia (Sigma®, CAS 127-07-01), foram preparados dois ensaios.
Num primeiro ensaio, culturas em crescimento exponencial inoculadas com 3,0x106 parasitas/mL foram tratadas com 10 mM, 20 mM e 30 mM de HU durante 24 horas, a fim de se testar a concentração da droga na sincronização do ciclo celular deste parasita. Uma cultura foi mantida como controle. A concentração de protozoários foi determinada utilizando-se um hemocitômetro (câmara de Neubawer). Após 24 horas, as culturas foram submetidas à centrifugação de 300 g por 5 minutos. O sobrenadante foi retirado. Em seguida, acrescentou-se solução de NaCl a 0,85% e repetiu-acrescentou-se o procedimento de centrifugação como descrito anteriormente; este procedimento foi realizado por mais duas vezes. Um novo volume de meio LIT, pH 7,2 acrescido de 20% de SFB e 0,4 mg/L de hemina foi acrescentado.
Este ensaio foi realizado duas vezes.
Num segundo ensaio e com o objetivo de ajustar a concentração de parasitas à concentração da droga, foram utilizados 20 mM de HU para tratar uma cultura em crescimento exponencial de T. rangeli, cepa SC-58, inoculada com 1,0x106 parasitas/mL. Após 24 horas de tratamento, a cultura foi submetida ao mesmo protocolo das culturas do ensaio anterior: 300 g por 5 minutos. O sobrenadante foi retirado, acrescentando-se solução salina. A cultura foi centrifugada e lavada com solução salina por mais duas vezes. Um novo volume de meio foi acrescentado.
Este ensaio foi realizado duas vezes.
4.4 Curva de Crescimento e análise morfológica dos parasitas
A concentração de protozoários nas culturas com inóculo de 3,0x106 parasitas/mL foi determinada através da contagem em câmara de Neubawer nos tempos de 0, 6, 12, 18 e 24 horas após a retirada da HU.
Para a análise morfológica, foram preparados esfregaços em lâmina de vidro para cada tempo descrito acima. Em lâminas previamente lavadas, foram depositados 20 µL de meio, o qual foi distendido sobre a lâmina de modo a formar um filme delgado, que foi seco ao ar. Em seguida, o esfregaço foi fixado com metanol puro por 1 minuto. O excesso de fixador foi dispensado e adicionou-se sobre o mesmo 3,0 mL de corante Giemsa. Após 20 minutos, o corante foi desprezado e a lâmina lavada em água corrente. O corante Giemsa foi preparado adicionando-se 2 gotas de corante para cada 1 mL de tampão fosfato misto (44% de Na2HPO4 e 56% de KH2PO4) 0,1M, pH 7,2.
Os parasitas foram analisados através de microscopia óptica, utilizando-se um microscópio Leica, modelo DMLB e fotografados com câmera fotográfica acoplada ao microscópio, modelo Leica MPS 30 e com aumento de 100X. O filme fotográfico foi revelado e digitalizado em laboratório comercial. Os dados foram transferidos para um
Personal Computer (PC), onde foram geradas tabelas e gráficos, através do programa
EXCEL®
A concentração de parasitas nas culturas com inóculo de 1,0x106 parasitas/mL foi determinada como descrita anteriormente. Os parasitas foram quantificados, utilizando-se a câmara de Neubawer imediatamente após a retirada da HU nos tempos de 0, 6, 12, 18, 19, 20, 21, 22, 23 e 24 horas após a retirada da HU. Para a análise morfológica e fotografia,
foram preparados esfregaços em lâmina de vidro para cada um dos tempos acima indicados, conforme protocolo descrito no primeiro ensaio.
5 Resultados
5.1 Curvas de crescimento das culturas de T. rangeli, cepa SC-58, com inóculo de 3,0x106 parasitas/mL e tratadas com diferentes concentrações de HU.
A curva de crescimento das culturas inoculadas com 3,0x106 parasitas/mL e tratadas com 10 mM, 20 mM e 30 mM de HU, evidenciou que as mesmas apresentaram diferenças na quantidade de parasitas ao longo de 24 horas de observação, se comparado à cultura controle (Tabela 1).
Tabela 1: Concentração de células em culturas de T. rangeli, cepa SC-58, com inóculo de 3,0x106
parasitas/mL, tratadas com diferentes concentrações de hidroxiureia (Sigma®) por 24 horas e acompanhadas
em intervalos de tempo a partir da retirada da HU.
Tempo
Quantidade de células em diferentes concentrações de HU
Controle 10 mM 20 mM 30 mM 0 h 12,75 5,00 5,25 3,25 6 h 22,00 6,50 6,00 4,75 12 h 38,50 14,50 13,75 5,75 18 h 20,25 19,75 7,75 7,75 24 h 23,50 21,00 9,75 9,75
Até 12 horas após a retirada da HU, as três culturas tratadas com HU apresentaram curvas de crescimento com valores inferiores à da cultura controle. Dezoito horas após a retirada da HU, a cultura tratada com 10 mM de HU apresentou uma quantidade de células próxima à da cultura controle: 19,75% na cultura tratada com 10 mM de HU e 20,25% na cultura controle. A taxa de crescimento da cultura tratada com 10 mM de HU continuou próxima à da cultura controle 24 horas após a retirada da HU (Tabela 1, Figura 12).
Se comparadas à cultura controle, as curvas de crescimento das culturas tratadas com 20 mM e 30 mM de HU cresceram lentamente desde a retirada da HU e continuaram assim até 24 horas após a retirada da HU. Doze horas após a retirada da HU, a concentração de células nas culturas tratadas com 10 mM e 20 mM de HU era de 14,5% e 13,75%, respectivamente (Tabela 1, Figura 12).
23,50 38,50 20,25 21,00 19,75 14,50 0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33 36 39
0 hora 6 horas 12 horas 18 horas 24 horas
horas Q u an ti d ad e d e célu las ( x10 6) Controle 10 mM 20 mM 30 mM
Figura 12: Curvas de crescimento das culturas de T. rangeli, cepa SC-58, com inóculo de 3,0x106
parasitas/mL e tratadas com diferentes concentrações de hidroxiureia (Sigma®) por 24 horas e
acompanhadas em diferentes intervalos de tempo a partir da retirada da HU.
5.2 Curvas de crescimento das culturas de T. rangeli, cepa SC-58, com inóculos de 1,0x106 parasitas/mL e 3,0x106 parasitas/mL tratadas com 20 mM de HU.
Imediatamente após a retirada da HU, a cultura inoculada com 3,0x106 parasitas/mL apresentava 5,25x106 parasitas/mL enquanto a cultura inoculada com 1,0x106 parasitas/mL apresentava 1,75x106 parasitas/mL. Doze horas após a retirada da HU, a cultura inoculada com 1,0x106 parasitas/mL apresentava 4,58x106 parasitas/mL enquanto a cultura inoculada com 3,0x106 apresentava 13,75x106; 24 horas após a retirada da HU, essas duas culturas apresentavam, respectivamente, 7,40x106 parasitas/mL e 9,75x106 parasitas/mL (Tabela 2, Figura 13).
Tabela 2: Quantidade de parasitas (x106) encontrados em culturas de T. rangeli, cepa SC-58, com
inóculo de 1,0x106 parasitas/mL e 3,0x106 parasitas/mL tratadas com 20 mM de hidroxiureia (Sigma®)
por 24 horas e acompanhadas em intervalos de tempo a partir da retirada da HU.
Tempo Quantidade de células (x10
6) em intervalos de tempo 20 mM HU em 1x106 cel/mL 20 mM HU em 3x106 cel/mL 0 h 1,75 5,25 6 h 2,00 6,00 12 h 4,58 13,75 18 h 5,98 7,75 24 h 7,40 9,75 7,40 4,58 9,75 13,75 0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33 36 39
0 hora 6 horas 12 horas 18 horas 24 horas
Horas Q u an ti da de de C él u la s ( x1 0 6 ) 20 HU mM 1x106 20 HU mM 3x106
Figura 13: Curvas de crescimento apresentadas por culturas de T. rangeli, cepa SC-58, com inóculo de
1,0x106 parasitas/mL e 3,0x106 parasitas/mL e tratadas com 20 mM de hidroxiureia (Sigma®) por 24
horas e acompanhadas em intervalos de tempo a partir da retirada da HU.
5.3 Alterações morfológicas detectáveis nas culturas de T. rangeli
Nas culturas inoculadas com 3,0x106 parasitas/mL tratadas com 10 mM, 20 mM e 30 mM de HU, houve uma predominância de formas com 1 núcleo, 1 cinetoplasto e 1 flagelo (1N1K1F) em todos os tempos acompanhados (Tabela 3).
Tabela 3: Porcentagem de células com 1 núcleo, 1 cinetoplasto e 1 flagelo (1N1K1F) nas culturas de T. rangeli, cepa SC-58 com inóculo de 3,0x106 parasitas/mL e tratadas com diferentes concentrações de HU e
acompanhadas em 0, 6, 12, 18 e 24 horas após a retirada da HU
Porcentagem de células com 1N1K1F Concentração de HU
0 hora 6 horas 12 horas 18 horas 24 horas
Controle 95,0% 89,5% 91,5% 95,5% 90,0%
10mM 98,0% 95,5% 92,5% 92,5% 88,5%
20mM 98,0% 96,5% 94,5% 91,5% 82,0%
30mM 97,5% 97,5% 85,0% 88,5% 81,5%
A quantidade de células com 1 núcleo, 1 cinetoplasto e 2 flagelos (1N1K2F) foi menor em todos os tempos e culturas. A cultura tratada com 20 mM de HU apresentou 12% de células com 1N1K2F 24 horas após a retirada da HU e neste mesmo tempo, a cultura tratada com 30 mM de HU apresentou 10,5% de células com 1N1K2F (Tabela 4).
Tabela 4: Porcentagem de células com 1 núcleo, 1 cinetoplasto e 2 flagelos (1N1K2F) nas culturas de T. rangeli, cepa SC-58 com inóculo de 3,0x106 parasitas/mL, tratadas com diferentes concentrações de HU e
acompanhadas em 0, 6, 12, 18 e 24 horas após a retirada da HU.
Porcentagem de células com 1N1K2F Concentração de
HU
0 hora 6 horas 12 horas 18 horas 24 horas
Controle 1,0% 2,0% 3,00% 0,05% 5,00%
10mM 1,0% 1,5% 2,50% 2,00% 5,5%
20mM 1,0% 1,0% 4,50% 2,50% 12,0%
30mM 0,5% 2,0% 6,00% 2,50% 10,5%
A cultura tratada com 30 mM de HU apresentou 9,0% de células com 2 núcleos, 2 cinetoplastos e 2 flagelos (2N2K2F) 12 horas após a retirada da HU, a maior porcentagem entre todas as culturas (Tabela 5).
Tabela 5: Porcentagem de células com 2 núcleos, 2 cinetoplastos e 2 flagelos (2N2K2F) nas culturas de T. rangeli, cepa SC-58 com inóculo de 3,0x106 parasitas/mL, tratadas com diferentes concentrações de HU e
acompanhadas em 0, 6, 12, 18 e 24 horas após a retirada da HU.
Porcentagem de células com 2N2K2F Concentração de HU
0 hora 6 horas 12 horas 18 horas 24 horas
Controle 3,5% 8,5% 3,45% 2,30% 3,95%
10mM 1,0% 2,5% 2,88% 3,16% 4,86%
20mM 1,0% 2,5% 0,58% 5,50% 4,74%
30mM 1,5% 0,5% 9,00% 6,24% 6,32%
As maiores porcentagens de células em citocinese foram encontradas 18 horas após a retirada da HU: 2,34% na cultura tratada com 10 mM de HU e 2,76% na cultura tratada com 30 mM de HU (Tabela 6).
Tabela 6: Porcentagem de células em citocinese nas culturas de T. rangeli, cepa SC-58 com inóculo de
3,0x106 parasitas/mL, tratadas com diferentes concentrações de HU e acompanhadas em 0, 6, 12, 18 e 24
horas após a retirada da HU.
Porcentagem de células em citocinese Concentração de HU
0 hora 6 horas 12 horas 18 horas 24 horas
Controle - - 1,55% 1,70% 1,05%
10mM - - 2,12% 2,34% 1,14%
20mM - - 0,42% 0,50% 1,26%
30mM - - - 2,76% 1,68%
As formas esferomastigotas estavam presentes nas culturas em pequenas quantidades e somente nos tempos de 0, 6 e 12 horas (Tabela 7).
Tabela 7: Porcentagem de formas esferomastigotas em culturas de T. rangeli, cepa SC-58 com inóculo de
3,0x106 parasitas/mL, tratadas com diferentes concentrações de HU e acompanhadas em 0, 6, 12, 18 e 24
horas após a retirada da HU.
Porcentagem de formas esferomastigotas Concentração
de HU
0 hora 6 horas 12 horas 18 horas 24 horas
Controle 0,5% - 0,5% - -
10mM - 0,5% - - -
20mM - - 0,5% - -
30mM 0,5% - 2,5% - -
Na cultura inoculada com 1,0x106 parasitas/mL e tratada com 20 mM de HU, a porcentagem de formas com 1 núcleo, 1 cinetoplasto e 1 flagelo (1N1K1F) foi maior que as outras formas. Em todos os tempos analisados, a quantidade de células com 1N1K1F sempre foi superior a 60,0%. Seis horas após a retirada da HU, a quantidade de células com esta morfologia era de 94,0%. Dezenove horas após a retirada da HU as células com 1N1K1F atingiram a menor porcentagem, 60,5%. O cinetoplasto apresentava-se bem visível e próximo ao núcleo (Figura 14).
Figura 14: Formas com 1N1K1F encontradas em culturas de T. rangeli, cepa SC-58, 19 horas após a retirada
da HU. Cultura tratada por 24 horas com HU. Seta grossa: cinetoplasto; seta fina: núcleo; seta tracejada: flagelo.
Em 0 hora, foi observado que 3,5% das células tinham 1N1K2F e 6,0% apresentavam 2N2K2F. Dezenove horas após a retirada da HU, a porcentagem de células com 2N2K2F foi a maior entre todos os tempos analisados, 21,5% (Tabela 8, Figura 15).
