DIAGNÓSTICO LABORATORIAL DA AMEBÍASE:
Detecção e Diferenciação Simultânea da
Entamoeba histolytica e Entamoeba dispar por
Ensaio Imunoenzimático (ELISA) e Multiplex-PCR
Niterói
2005
DIAGNÓSTICO LABORATORIAL DA AMEBÍASE:
Detecção e Diferenciação Simultânea da
Entamoeba histolytica e Entamoeba dispar por
Ensaio Imunoenzimático (ELISA) e Multiplex-PCR
Orientadores : Prof
aDr
aRegina Helena Saramago Peralta
Prof oDr. José Mauro Peralta
Niterói
2005
Dissertação apresentada ao Curso de Pós-Graduação em Patologia da Universidade Federal Fluminense, como requisito parcial para obtenção do Grau de Mestre.
DIAGNÓSTICO LABORATORIAL DA AMEBÍASE:
Detecção e Diferenciação Simultânea da Entamoeba
histolytica e Entamoeba dispar por Ensaio Imunoenzimático
(ELISA) e Multiplex-PCR
Aprovado em Março de 2005.
BANCA EXAMINADORA
Prof
aDra. Heloisa Werneck de Macedo
Universidade Federal Fluminense
Prof
oDr. Walter Oelemann
Universidade Federal Rio de Janeiro
Profª. Dra. Leda Maria Da Costa Macedo
Universidade Estadual do Rio de Janeiro
Niterói 2005
Dissertação apresentada ao Curso de Pós-graduação em Patologia da Universidade Federal Fluminense, como requisito parcial para obtenção do Grau de mestre. Área de concentração: Patologia Experimental.
Multiplex-PCR / Helena Lúcia C. Santos. Niterói, 2005. 87 p.
Dissertação (Mestrado em Patologia Experimental
Curso de Pós-Graduação em Patologia - Universidade Federal Fluminense).
I. DIAGNÓSTICO LABORATORIAL II. Multiplex-PCR
III. Entamoeba histolytica 1. Universidade Federal Fluminense 2. Título
objetivo. E, sim, um hábito”.
Aristóteles (384-322 a.c)
À Deus, meu grande amigo que em todos os momentos me guia pelos melhores caminhos, restabelece minhas esperanças e sonhos, dá vida a minha vida e está sempre presente em meus problemas, necessidades, nos meus desafios e nas minhas alegrias. Tu és maravilhoso.
À minha família, em especial a minha mãe, pelo seu amor, apoio e dedicação incondicional que dela recebi durante toda minha vida. A minha irmã América, minha maior torcida e pela sempre disposição em me ajudar;
À Profa. Dra. Regina Helena Saramago Peralta e ao Profo. Dr. José Mauro Peralta
cujas orientações, paciência, confiança, convivência e etc. tornaram este período, muito mais construtivo e agradável;
Ao Profo. Dr. José Mauro Peralta, por ter me acolhido tão bem em seu
laboratório;
À Profa Heloisa Werneck de Macedo pelo constante apoio, amizade e
compreensão;
Ás amigas: Laura Maria, Margareth, Diva, Tiana, Maria José, Adriana Sudre e Adriana Neves pelas fervilhante troca de idéias, por me fazerem sentir sempre “em casa” e por tornarem meu cotidiano muito mais divertido;
Á todos os colegas do curso de pós-graduação, pela amizade e carinho. Em especial aos componentes do grupo de estudo (Irina Borges, Patrícia Xavier, Marcos e Priscila Guedes), pelos momentos de alegrias e stress compartilhados; Ao Carlos, pelo apoio técnico realizado nos bastidores, mas crucial para o andamento da pesquisa;
Aos professores, coordenadores e a secretária do Curso de Pós-graduação em Patologia;
A todos que ajudaram, de qualquer forma, mas não foram citados aqui por falha minha;
E por fim, às amebas. “Meninas”, foi muito bom conhecer vocês!
“ Cada pessoa que passa em nossas vida, passa sozinha, mas não vai só, nem nos deixa só; leva um pouco de nós mesmos, deixa um pouco de si mesma”. Muito obrigada.
ÍNDICE DE FIGURAS E TABELAS...09 ABREVIATURAS...11 RESUMO...12 ABSTRACT...13 1. INTRODUÇÃO ...14 1.1 Revisão de literatura...17 1.1.1 Histórico ...17 1.1.2 O Parasito ...21
1.1.3 Entamoeba histolytica X Entamoeba dispar...25
1.1.4 Ciclo Evolutivo...26 1.1.5 Patogenia e Sintomatologia ...29 1.1.6 Diagnóstico ...31 1.1.6.1 Clínico...31 1.1.6.2 Laboratorial ...31 1.1.7 Distribuição geográfica...40 2. OBJETIVOS...44
2.2 Secundários...44
3. MATERIAL E MÉTODOS...45
3.1 Amostragem...45
3.2 Exame Parasitológico de fezes...46
3.3 Pesquisa de Coproantígeno...47
3.4 Reação em Cadeia da Polimerase (Multiplex-PCR)...48
3.4.1 Extração de DNA...48
3.4.2 Reação de Amplificação...49
3.4.3 Detecção do Produto Amplificado...50
3.5 Padronização de Multiplex-PCR...51
4. RESULTADOS...53
5. DISCUSSÃO...62
6. CONCLUSÕES...77
Figura 2 - Trofozoítos de E. histolytica e do complexo
E. histolytica/E.dispar...24 Figura 3 - Ciclo Evolutivo da E. histolytica...28 Figura 4- Esquema do Multiplex-PCR...39 Figura 5 - Produtos amplificados através de Multiplex-PCR com Primer
EDP1/P2 e EHP1/P2. Avaliação da sensibilidade da Multiplex-PCR utilizando
amostras de fezes contaminadas com diferentes concentrações (50 a 5
trofozoítos /100ul de fezes) de E. histolytica...54 Figura 6 - Produtos amplificados através de Multiplex-PCR com Primer
EDP1/P2 e EHP1/P2. Avaliação da sensibilidade da Multiplex-PCR
utilizando DNA de cepa padrão de trofozoítos de E. histolytica...55 Figura 7 - Produtos amplificados através de Multiplex-PCR com Primer
EDP1/P2 e EHP1/P2. Diferentes concentrações de DNA de E. histolytica e
E. dispar foram utilizados simultaneamente na mesma reação...56
Figura 8 - Produtos amplificados através de Multiplex-PCR com Primer EDP1/P2 e EHP1/P2. Detecção de substância inibidoras utilizando 800 pg de DNA de cepa padrão de E. histolytica em amostras de fezes com
comunidades do Estado do Rio de Janeiro ... 60 Tabela 1 - Resultados do Exame Parasitológico de Fezes, da Pesquisa de
Antígeno (ELISA) e da Multiplex-PCR em 127 amostras de fezes obtidas
duas comunidades do Estado do Rio de Janeiro...58 Tabela 2 – Comparação dos resultados do Exame Parasitológico de Fezes, e da Multiplex-PCR em 127 amostras de fezes obtidas duas comunidades do Estado do Rio de Janeiro...60 Tabela 3 - Comparação entre os resultados do Exame Parasitológico de
Fezes e da Detecção de Antígeno (ELISA) em 86 amostras obtidas de
C3a Componente do sistema complemento C5a Componente do sistema complemento Con A Concanavalina A
DNA Deoxyribose Nucleic Acid dATP Deoxidenosine triphosphate dCTP Deoxicytidine triphosphate dGTP Deoxiguanosine triphosphate dTTP Deoxithymidine triphosphate
E. coli Entamoeba coli E. dispar Entamoeba dispar E. hartmanii Entamoeba hartmanii E. histolytica Entamoeba histolytica E. moshkoviskii Entamoeba moshkoviskii
ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay EPF Exame parasitológico de fezes
fg femtograma g Gravidade
HAI Hemoaglutinação indireta IgA Imunoglobulina A
IgG Imunoglobulina G KDa Quilodalton ml Mililitro nm Nanomêtro
OMS Organização mundial de Saúde pb Pares de base
PBS “ Phosphate-buffered saline” PCR “Polymerase chain reaction”
PCR-SHELA “Polymerase chain reaction -solution hybridization
enzyme-linked immunoassay”
pg Picograma pmoles Picomoles
RIFI Reação de imunofluorescência indireta RNA “Ribonucleic acid”
rDNA “ribosomal Desoxyribonucleic Acid” rpm Rotação por minuto
U Unidade µg Micrograma µl Microlitro µm Micromêtro
A amebíase é uma infecção causada pela Entamoeba histolytica. Entretanto, a diferenciação entre a E. histolytica e a Entamoeba dispar, espécies morfologicamente semelhantes, é fundamental para a conduta terapêutica, prevenção da doença invasiva e para a saúde pública. O propósito desde trabalho foi avaliar a Multiplex-PCR na detecção e diferenciação entre a E. histolytica e a
E. dispar.
Foi feita uma comparação entre os métodos de exame microscópico das fezes usando o conjunto diagnóstico Coprotest, a detecção de antígenos nas fezes usando um ensaio imunoenzimático comercial e o Multiplex-PCR padronizado no laboratório, para o diagnóstico da amebíase. A Multiplex-PCR foi padronizada usando amostras com parasitos obtidos de culturas padrões. Posteriormente, 127 amostras de fezes provenientes de duas comunidades do Estado do Rio de Janeiro, foram testadas e os resultados comparados.
A análise de 127 amostras de fezes pelo exame parasitológico de fezes demonstrou que 27 (21%) amostras foram positivas para o complexo E.
histolytica/E. dispar. Dessas amostras, 12 foram positivas pelo Multiplex-PCR,
sendo que nove apresentaram o padrão de E. dispar (96 bp) e três o padrão E.
histolytica (132 bp). Entre as amostras negativas detectadas pelo exame
microscópico, três foram positivas para E. dispar e uma foi positiva para E.
histolytica pelo Multiplex-PCR. Esse fato mostrou que a PCR foi mais eficiente do
que o exame parasitológico realizado com uma amostra de fezes. Os resultados obtidos pelo ensaio de detecção de antígeno de E. histolytica foram concordantes com o do Multiplex-PCR. A análise estatística comparando os resultados do ELISA coproantígeno com o Multiplex-PCR, não pode ser feita devido ao baixo número de casos de E. histolytica. Os resultados acima indicam a necessidade do uso de métodos mais sensíveis para o diagnóstico da amebíase e a importância de se usar técnicas específicas na diferenciação entre E. histolytica e E. dispar.
However, precise differentiation between E. histolytica and Entamoeba dispar, which are morphologically identical species, is essential for treatment decision, prevention of the invasive disease and public health. The purpose of the present study was to evaluate a Multiplex-PCR for detection and differentiation of E.
histolytica from E. dispar.
Microscopic examination of stools using the coprotest kit, detection of stool antigen using a commercial enzyme-linked immunosorbent assay kit and a home made Multiplex-PCR, were compared for the diagnosis of amebiasis infection. The Multiplex-PCR was standardized using stool samples with parasites obtained from standard cultures. Afterwards, 127 stool samples obtained from individuals living in two villages of the state of Rio de Janeiro were tested and the results were compared.
Analysis of the 127 stools samples by microscopy examination demonstrated that only 27 (21%) samples were positive for E. histolytica /E. dispar complex. Among these stool samples, 12 were positive by Multiplex-PCR, with nine presenting the diagnostic fragment characteristic of E. dispar (96 bp) and three presenting diagnostic fragment of E. histolytica (132 bp). Among the negative samples detected by microscopic examination, three were positive for E.
dispar and one was positive for E. histolytica by Multiplex-PCR. This denotes that
Multiplex-PCR was more efficient than microscopic examination when single stool samples were analyzed. The results obtained by detection of E. histolytica antigen were in agreement with those obtained by the multiplex-PCR. Statistical analyses comparing coproantigen ELISA with Multiplex-PCR results were not done because of the low number of E. histolytica cases. The overall results indicate the need to use more sensitive methods for the diagnosis of amebiasis infection and the importance of using specific techniques for the differentiation between E.
1. INTRODUÇÃO
O Brasil, por ser um país em desenvolvimento, possui contrastes sócio-econômicos, precárias condições sanitárias e um grande número de indivíduos com desnutrição, fatores que favorecem o desenvolvimento de doenças parasitárias. As parasitoses intestinais representam um grande problema médico-sanitário à sociedade em geral, em decorrência das inter-relações entre o agente etiológico da doença, o hospedeiro e fatores sanitários que contribuem para a disseminação da doença (Rey, 2001).
A amebíase é uma infecção de ampla distribuição geográfica, que atinge cerca de 10% da população mundial. A taxa anual de mortalidade em nível mundial é de 40 a 110 mil pessoas, constituindo um sério problema de saúde pública, principalmente nas áreas endêmicas (Carvalho et al., 1994; Gomes et al., 1997; Gatti
et al., 2000; Shamsuzzama et al., 2000).
A Organização Mundial de Saúde (OMS) consolidou o conceito da amebíase como uma infecção causada por Entamoeba histolytica com ou sem manifestações clínicas (WHO, 1997). Embora várias espécies de protozoários que
Entamoeba dispar e Entamoeba histolytica) possam parasitar o intestino grosso
do homem, apenas E. histolytica é reconhecidamente capaz de desenvolver atividade patogênica, invadir tecidos e causar doença (Tanyuksel & Petri, 2003). Entretanto, estas espécies apresentam características análogas, quando analisadas por microscopia óptica.
Durante muitos anos E. histolytica e E. dispar foram consideradas como uma única espécie. Entretanto, várias pesquisas acumuladas nas últimas três décadas confirmaram a existência de duas espécies de amebas morfologicamente
idênticas por microscopia ótica. E. histolytica, considerada a espécie patogênica e
E. dispar como a não patogênica (Diamond & Clark, 1993). No entanto, possuem
diferenças bioquímicas, antigênicas e genéticas que possibilitam diferenciá-las, através de análise isoenzimática (Pillai & Keystone, 1999), anticorpos monoclonais (Gozalez-Ruiz et al., 1992; Haque et al., 1995; Tachibana et al., 1999) e técnicas de biologia molecular (Polymerase Chain Reaction-PCR e sondas de DNA) (Aguirre et
al., 1995; Bracha et al., 1990; Tannich & Burchard, 1991; Troll et al., 1997). A
diferenciação entre estas espécies, é essencial para a prevenção da doença invasiva, conduta terapêutica e para a saúde pública.
O diagnóstico da amebíase é feito rotineiramente através do exame parasitológico das fezes com a identificação morfológica de cistos e trofozoítos (Aquino, 2001). Entretanto, este método não é capaz de diferenciar morfologicamente E. histolytica de E. dispar, exceto, quando se observa a presença de hemácia fagocitada no interior do trofozoíto de E. histolytica (Stanley, 2003).
Em 1997, a OMS reconheceu a existência de E. dispar e propôs o desenvolvimento de métodos de diagnóstico que apresentassem sensibilidade,
especificidade e fossem capazes de diferenciar E. dispar de E. histolytica (WHO, 1997).
Com a premente necessidade do desenvolvimento de novos métodos de diagnóstico para a amebíase, o ensaio imunoenzimático em suporte sólido
(Enzyme-linked Immunosorbent Assay – ELISA) e a técnica molecular da reação em cadeia
da polimerase vêm sendo estudados com o intuito de complementar o diagnóstico parasitológico de fezes. A pesquisa de antígenos nas fezes através do ELISA utiliza anticorpos monoclonais específicos contra uma lectina, específica para resíduo de galactose e N-acetil galactosamina presente na superfície do trofozoíto de E.
histolytica (Carvalho et al., 1994; Tellez-Sierra et al., 1992; Jackon & Ravdin,1996;
Garcia et al., 2000). A PCR é uma técnica que permite a amplificação de regiões específicas do DNA de E. histolytica e de E. dispar, conseqüentemente é um instrumento para a diferenciação das espécies. É um método extremamente sensível que pode detectar poucas moléculas de DNA na amostra. Deste modo, a PCR pode contribuir para o avanço qualitativo do diagnóstico da amebíase, detectando e diferenciando a espécie patogênica (Mirelman et al., 1997; Riviera et al., 1998; Evangelopoulos et al., 2000; Verweij et al., 2000; Nuñez et al., 2001; Zindrou et al., 2001; Gonin & Trudel, 2003).
É necessário enfatizar a importância do diagnóstico diferencial entre E.
histolytica e E. dispar com o objetivo de prevenir quadros graves e letais,
principalmente nos indivíduos assintomáticos com eminência de desenvolver a forma invasiva da doença.
Todas as pessoas infectadas por E. histolytica devem ser tratadas, mesmo que assintomáticas (WHO, 1997). Desta forma, após o diagnóstico e tratamento
nos índices de mortalidade.
A aplicação de novas metodologias para o diagnóstico específico de E.
histolytica, facilitará a determinação da prevalência de portadores assintomáticos,
que participam no estabelecimento e na manutenção do ciclo do parasito nas regiões endêmicas, podendo levar ao maior controle desta parasitose, já que o homem é o principal reservatório.
Como relatado anteriormente, E. histolytica é responsável por um grande número de mortes no mundo e o diagnóstico da amebíase apresenta várias dificuldades. É evidente, portanto, o interesse no desenvolvimento de técnicas sensíveis e específicas, na tentativa de oferecer subsídios para o diagnóstico diferencial entre E. histolytica e E. dispar. A análise e avaliação de metodologia como a PCR, é muito importante e pode conduzir a alternativas interessantes para o diagnóstico da amebíase humana.
1.1.
Revisão de Literatura
1.1.1 Histórico
Em 1875, E. histolytica, foi descrita por Lösh, médico Russo de São Petersburgo, que observou o parasito nas fezes de um indivíduo com disenteria recidivante. Porém, não a considerou como uma espécie patogênica e a nomeou como Amoeba coli, (Lösh, 1875 apud Jackson, 1998).
Em 1883, Koch, observou cinco casos de disenteria no Egito, dois dos
quais complicados com abscesso hepático, onde foram encontradas numerosas amebas, idênticas às amebas observadas por Lösh (Koch, 1883 apud Clark, 1998).
Em 1886, Kartullis, publicou um artigo em que descrevia 150 casos de disenteria no Egito, nos quais demonstrou a presença de ameba em sua forma vegetativa e atribuiu-as como causa da “disenteria tropical” e do “abcesso tropical do fígado” (Kartullis, 1886 apud Cunha & Ferrari, 1994).
Em 1891, Councilman & Lafleur, fizeram um estudo detalhado do quadro clínico de 15 pacientes com amebíase intestinal e hepática. Foram eles os primeiros autores a empregar a denominação de disenteria amebiana e abscesso hepático amebiano e também a sugerir a denominação Amoeba dysenteriae para o parasito (Councilman & Lafleur, 1891 apud Cunha & Ferrari, 1994).
Em 1896, Farjado, no Brasil, estudou casos de colite amebiana humana. Conseguiu reproduzir experimentalmente a enfermidade em gatos (Farjado, 1896 apud Cunha & Ferrari, 1994).
Em 1903, Shaudinn reconheceu a existência de duas espécies de amebas no intestino humano: uma patogênica, E. histolytica e outra não patogênica, E. coli (Shaudinn 1903 apud Jackon, 1998).
Em 1913, Walker & Sellards confirmaram a hipótese de Shaudinn ao obterem experimentalmente a disenteria amebiana, após infectarem voluntários humanos com cistos de E. histolytica isolados de portadores assintomáticos.
homem, com descrições morfológicas e biológicas bastantes precisas (Dobell, 1919 apud Clark, 1998).
Em 1925, Brumpt propôs, baseado em aspecto clínico-epidemiológico, a existência de duas espécies de amebas morfologicamente idênticas, porém biologicamente diferentes, habitando o intestino humano, sendo que, uma considerada a espécie patogênica (E. histolytica) e a outra postulada como a espécie não patogênica (E. dispar).
Em 1925, Boeck & Drbohlav cultivaram pela primeira vez E. histolytica possibilitando assim novos estudos sobre o parasito. Entretanto, maiores avanços foram obtidos a partir do desenvolvimento do cultivo axênico por Diamond em 1961.
Em 1973, Martinez-Palomo & Gonzáles-Robles demonstraram que as cepas patogênicas (E. histolytica) aglutinavam na presença de uma lectina, a concanavalina A (Con. A), formando um grande aglomerado, ao passo que outras espécies de Entamoeba não patogênicas apresentavam capacidade limitada de aglutinação.
Em 1978, Sargeaunt et al. demonstraram diferenças bioquímicas usando como parâmetro o perfil de isoenzimas (zimodemas) entre as culturas de amebas provenientes de indivíduos sintomáticos e assintomáticos.
Em 1989, Garfinkel et al. obtiveram sondas que hibridizavam seletivamente com isolados de zimodemos de cepas patogênicas (sonda P 145) e não patogênicas (sonda B 133).
Em 1990, Petri et al. estudaram a subunidade de 170 kDa de uma lectina galactose específica envolvida na aderência “in vitro” de trofozoítos a células de linhagem intestinal. Os autores obtiveram anticorpos monoclonais para diferentes epítopos daquela lectina, permitindo distinguir cepas patogênicas das não patogênicas.
Em 1991, Clark & Diamond encontraram perfis de restrição diferentes entre genes ribossomais dos tipos isolados e mostraram que os iniciadores específicos para rDNA de cepas patogênicas não amplificavam genes de cepas não patogênicas
(Clark & Diamond, 1991a).
De 1988 a 1993, várias pesquisas demonstraram diferenças antigênica e genética entre a espécie patogênica (E. histolytica) e não patogênica (E. dispar) (Clark, 1998).
Em 1993, Diamond & Clark relataram que existiam evidências suficientes baseadas em aspectos bioquímicos, imunológicos e genéticos para a existência de duas espécies, E. histolytica e E. dispar, como postulara Brumpt em 1925.
De acordo com a sugestão de Sargeaunt (1992) e a redescrição de Diamond & Clark (1993), a OMS e os pesquisadores presentes no Seminário sobre Amebíase realizado no México em 1997, anuíram que E. histolytica e E. dispar eram duas espécies morfologicamente idênticas por microscopia óptica e que formam o complexo E.histolytica/E.dispar (WHO, 1997).
E. histolytica será citada com mais freqüência nesta revisão em decorrência da mesma ser a espécie mais estudada no campo da amebíase. Entretanto, E. dispar será mencionada quando os estudos forem pertinentes à mesma.
1.1.2.
O Parasito
De acordo com o Comitê de Sistemática da Sociedade Internacional de Protozoologia, a classificação para E. histolytica é: Filo Sarcomastigofora, Subfilo Sarcodina, Superclasse Rhizopoda, Classe Lobosea, Subclasse Gymnamoebia, Ordem Amoebida, Subordem Tubulina e Família Endamoebidae (Levine et al., 1980). A resolução do comitê, que classificou E. histolytica, não mencionou E.
dispar, porque naquela época E. dispar não era considerada uma entidade biológica.
A descrição das espécies de Entamoeba depende das características morfológicas do parasito tais como: tamanho do trofozoíto, número de núcleo e estruturas nucleares do cisto (Tanyuksel & Petri, 2003).
E. histolytica apresenta duas formas evolutivas, uma forma móvel
denominada trofozoíto e uma forma resistente cística.
Os trofozoítos são formas vegetativas dinâmicas e pleomórficas que apresentam tamanhos variados, medindo geralmente de 12 a 60 µm de tamanho, com média de 25 µm. O citoplasma é dividido em ectoplasma mais hialino e endoplasma mais granuloso contendo abundantes vesículas, vacúolos e o núcleo. Caracteriza-se, quando observado por microscopia eletrônica, pela ausência de organelas diferenciadas como: mitocôndria, aparelho de Golgi, retículo endoplasmático rugoso, centríolos (Huber et al., 1989; Lohia, 2003) as quais, estão presentes nas células eucariontes típicas. O núcleo mede em torno de 3 a 4 µm, apresenta cromatina fina e delicada, aderida à membrana nuclear. Na região central do núcleo, observamos grânulos puntiformes, centrais ou ligeiramente excêntricos, denominados cariossomos. O trofozóito é um organismo anaeróbico ou aeróbico
facultativo que vive na luz do intestino grosso humano, onde se locomove por pseudópodes grossos e digitiformes, se alimenta de partículas como: bactérias, fungos, células etc. através dos processos de pinocitose, fagocitose e transporte de membrana. O processo de reprodução ocorre por divisão binária. São incapazes de viver no ambiente externo e se ingeridos são destruídos pela secreção gástrica (Figura 2).
O pré-cisto é a forma intermediária entre o trofozoíto e o cisto. É uma estrutura arredondada ou oval, menor que o trofozoíto, geralmente apresenta um núcleo, e no citoplasma amiúde se encontram corpos cromatóides (Figura 1 B).
Os cistos medem cerca de 10 a 20 µm de diâmetro e possuem até quatro núcleos esféricos com uma distribuição variável de cromatina periférica, possuem um vacúolo de glicogênio e corpos cromatóides em forma de bastões, constituídos por agregados de ribonucleoproteínas. A parede cística é rígida composta por quitina e proteínas fibrilares. É a forma responsável pela transmissão da amebíase. Os cistos são resistentes à acidificação, cloração, dessecação e são capazes de viver em ambiente úmido por várias semanas (Stanley, 2003; Tanyukel & Petri, 2003) (Figura 1 A e C).
A – Cisto maduro B – Cisto imaturo
C – Cisto maduro
Figura 1 - Cistos do Complexo E. histolytica/ E. dispar
www.dpd.cdc.gov/HTML/Imagelibrary/Amebiasis em 20/6/2003
A - Trofozoíto de B - Trofozoíto de E. histolytica/E.dispar E. histolytica/E.dispar
C - Trofozoítos de E. histolytica Seta indica eritrócitos fagocitados
Figura 2 – Trofozoítos do complexo E. histolytica /E. dispar e de E. histolytica.
www.biosci.ohio-state.edu/edu~parasite/ehistolytica.html em 15/7/2003
www.dpd.cdc.gov/HTML/Imagelibrary/Amebiasis em 20/06/2003
morfologicamente idênticas. Uma seria capaz de causar doença invasiva, enquanto que a outra espécie era comensal e foi designada de E. dispar. Como não existiam recursos elucidativos para distinguir as duas espécies, a proposta de Brumpt foi ignorada até a década de 70. Porém, várias pesquisas nas áreas de bioquímica, imunologia e biologia molecular deram suporte para o aceite da proposta do pesquisador Brumpt. Estudos comparativos entre as espécies E. histolytica e E.
dispar foram realizados e demonstraram diferenças significativas em vários
aspectos.
A análise do perfil de isoenzimas foi um dos primeiros critérios utilizados na diferenciação entre as duas espécies. Blanc & Sargeaunt (1991), relataram uma diversidade entre o perfil de isoenzima das espécies patogênica e não patogênica e demonstraram que o perfil da hexoquinase era um marcador de patogenicidade. Ainda assim, algumas controvérsias foram geradas em torno do perfil isoenzimático. Estas controvérsias foram causadas em conseqüência de que algumas cepas cultivadas em meio poliaxenico originalmente consideradas não patogênica, apresentaram um perfil de isoenzimas idênticos ás cepas patogênicas quando foram cultivadas em meio axênico. Em virtude disto, outros parâmetros foram utilizados na tentativa de corroborar a existência de duas espécies morfologicamente idênticas. A análise de DNA genômico foi realizada por Clark & Diamond (1991a), que demonstram uma diferença de 2,2% entre as seqüências de genes do rRNA de E.
histolytica e de E. dispar.
Ademais, alguns aspectos biológicos abordados têm evidenciado que a E.
histolytica adere a eritrócitos humanos, através de uma lectina de 260 kDa presente
N-acetil-galactosamina, expostos na superfície da célula hospedeira. Por outro lado,
E. dispar também pode aderir a eritrócitos e a leucócitos polimorfonucleares
humanos, mas através de um processo independente da lectina de 260 kDa (Dodson et al., 1997). Todavia, em relação ao efeito citopático, Espinosa-Cantellano
et al., (1998), descrevem que tanto E. histolytica como E. dispar têm a capacidade
de destruir a monocamada de células epiteliais “in vitro”. Entretanto, o trofozoíto de
E. dispar possui uma capacidade restrita de destruir a monocamada do que o
trofozoíto de E. histolytica. Além disso, os autores mencionam que E. dispar apresenta limitações na capacidade de aglutinação perante a concanavalina A e na resistência a lise pelo sistema complemento. Bhattacharya et al. (2000), relatam a ausência de moléculas de glicoconjugado na membrana de E. dispar. No entanto, estas classes de moléculas parecem ter um importante papel na patogenia da amebíase. Diante destas evidências, a literatura tem sido unânime quanto ao aceite de E. dispar como uma nova espécie. Entretanto, ainda pairam dúvidas no que diz respeito a patogenicidade de E. dispar.
1.1.4.
Ciclo Evolutivo
E. histolytica apresenta um ciclo biológico monoxênico relativamente
simples. A infecção do ser humano ocorre a partir das mãos sujas ou da ingestão de
alimentos e de água contaminados com as formas císticas maduras. Os cistos passam incólumes pelo estômago e na porção terminal do intestino delgado ocorre a liberação de pequenas amebas (metacistos) pelo processo denominado desencistamento, em meio a presença de enzimas intestinais, bactérias anaeróbias e a uma baixa tensão de oxigênio. As pequenas amebas (metacistos) sofrem
trofozóitos metacísticos. Estes migram para o intestino grosso onde se estabelecem, crescem e se multiplicam aderidos ao muco intestinal. Os trofozoítos colonizam o epitélio intestinal através da aderência e contato com a camada de mucinas na superfície epitelial, via uma proteína de adesão (lectina específica para resíduos de galactose e de N-acetilgalactosamina). Por um mecanismo ainda não muito bem elucidado, os trofozoítos são capazes de invadir a mucosa intestinal, multiplicando-se ativamente no interior de úlceras, podendo chegar a circulação porta, atingir órgãos como o fígado e posteriormente pulmão, cérebro, rim e pele causando a amebíase extra-intestinal (Huston et al., 1999; Haque et al., 2003 Tanyuksel & Petri, 2003) (Fig. 3).
Figura 3 – Ciclo Evolutivo de E. histolytica
www.dpd.cdc.gov/html/Imagelibrary/Amebiasis em 20/6/2003
1.1.5. Patogenia e Sintomatologia
Existem inúmeras variáveis envolvidas na patogenicidade e na virulência de E. histolytica, as quais estão influenciadas por fatores intrínsecos do hospedeiro, do parasito e do meio ambiente. A invasão do trofozoíto pode estar relacionada a fatores nutricionais e imunológicos do hospedeiro, bem como ao desequilíbrio da flora bacteriana intestinal, localização geográfica e as passagens sucessivas do parasito em diversos hospedeiros, dentre outros aspectos responsáveis pelo grau de patogenicidade (Silva, 2003). Apesar dos inúmeros trabalhos realizados, algumas questões sobre a patogenicidade deste parasito não foram elucidadas até o momento.
Quando ocorre a quebra do equilíbrio parasito-hospedeiro, os trofozoítos invadem a mucosa intestinal. O processo de invasão inicia com a ruptura da camada de muco. Os trofozoítos, então, aderem às células epiteliais do intestino, através de receptores galactose-lecitina específicos e posteriormente produzem uma série de proteínas que exercem uma ação lítica sobre outras células do hospedeiro, facilitando assim a sua penetração na mucosa intestinal. A atividade lítica do parasito parece ser o resultado da secreção de uma série de enzimas como: cisteína proteases, hialuronidase, mucopolissacaridase que atuam nas células e na matriz extracelular do hospedeiro facilitando a invasão do tecido pelo parasito. As cisteína proteases têm a capacidade de degradar colágeno do tipo I e III, fibronectina e laminina além de degradar também IgA, IgG e os componentes do complemento C3a e C5a (Petri, 2002; Haque et al., 2003; Huston, 2004). Os leucócitos polimorfonucleares em contato com os trofozoítos morrem e desintegram-se liberando enzimas lisossomais, contribuindo também para intensificar a lesão no tecido (Reed, 1995).
Uma vez invadida a mucosa e a submucosa, os trofozoítos se multiplicam e prosseguem penetrando no tecido e causando pequenas micro-ulcerações. As úlceras podem variar de tamanho, forma e se estenderem a grandes proporções no intestino grosso. Os trofozoítos presentes nas úlceras disseminam-se por via hematogênica ou linfática para outros órgãos como: fígado, pulmão, cérebro e em certas circunstâncias, a região anal ou vaginal (períneo) (Reed, 1995; Stauffer & Ravdin, 2003; Huston, 2004).
A amebíase apresenta uma diversidade de manifestações clínicas. Em torno de 90% das infecções são assintomáticas, constituindo, o hospedeiro, um vasto reservatório do parasito. Nestes casos, E. histolytica na luz intestinal se comporta como um simples comensal, não existindo nenhuma evidência de infecção,
a não ser a eliminação de cistos nas fezes. As formas clínicas freqüentemente
observadas na amebíase variam de colite não disentérica, disenteria amebiana e amebíase extra-intestinal (Tanyuksel & Petri, 2003).
A colite não disentérica apresenta sintomas vagos que quase passam despercebidos. Manifesta-se por evacuações diarréicas ou não, podendo conter sangue ou muco. Cólicas e desconforto abdominal podem surgir e raramente observa-se febre. Esta infecção é caracterizada por alternância entre períodos silenciosos e manifestação clínica (Haque et al., 2003; Tanyuksel & Petri, 2003).
Na disenteria amebiana o quadro clínico geralmente se instala de forma insidiosa, com dor abdominal, flatulência, diarréia com evacuações muco sangüinolentas e febre moderada. Pode haver oito a dez evacuações diárias. As complicações da amebíase intestinal resultam da confluência das úlceras e necrose do cólon e são muito variáveis, podendo atingir cerca de 4% dos casos. As mais
pós-única, formada por massas granulomatosas que podem ser confundidas com neoplasia (Haque et al., 2003).
Na amebíase extra-intestinal a manifestação clínica mais comumente encontrada é a necrose coliquativa ou liquefativa do fígado (abscesso hepático). O lobo direito do fígado é freqüentemente mais afetado do que o esquerdo. O parasito provoca um processo inflamatório difuso, degeneração celular e necrose coliquativa do parênquima em conseqüência da ação enzimática dos trofozoítos. O indivíduo apresenta dor no hipocôndrio direito, febre intermitente e irregular, hepatomegalia, e fraqueza geral. Se houver infecção bacteriana concomitante ocorre o agravamento do quadro clínico (Tanyuksel & Petri, 2003).
Outros órgãos já descritos que são acometidos por abscesso causado por
E. histolytica são: cérebro, pulmão, mucosa perineal e pele (Stanley, 2003).
1.1.6. Diagnóstico
1.1.6.1. Clínico
É meramente sugestivo, pois os sintomas clínicos não permitem corroborar a etiologia da doença, visto que, os mesmos podem ser confundidos com outras doenças intestinais.
O diagnóstico laboratorial é feito rotineiramente pelo exame parasitológico de fezes (EPF) que se baseia na morfologia de cistos e trofozoítos presentes nas fezes. Os trofozoítos são encontrados principalmente em fezes diarréicas e os cistos em fezes pastosas.
Para a demonstração direta de E. histolytica pelo EPF, o método utilizado é o exame direto , onde as fezes diarréicas recém emitidas são diluídas em salina e examinadas ao microscópio. O método a fresco deve ser feito em curto prazo (20 a 30 minutos) após as evacuações (Ackers, 2002), o que possibilita a visualização da forma trofozoíto ainda viva e com motilidade característica. Os trofozoítos são estruturas frágeis e que se deterioram facilmente no ambiente externo (Tanyuksel & Petri, 2003). Atualmente, as fezes recém imitidas tem sido colocadas em conservantes com o intuito de evitar a degeneração das formas trofozoítos.
Os métodos de concentração são utilizados principalmente para a pesquisa das formas císticas encontradas em fezes pastosas. Estes métodos estão baseados em dois princípios: a flutuação em solução de alta densidade, como a solução de sulfato de zinco, ou a sedimentação espontânea ou por centrifugação.
Os métodos coproscópicos são incapazes de diferenciar E. histolytica de
E. dispar, exceto, quando se evidencia a presença de eritrócitos fagocitados no
interior do trofozoítos, característica esta, restrita E. histolytica (Petri & Singh,1999; Stanley, 2003). Entretanto, esse achado é extremamente raro.
Outros fatores que limitam a eficácia destes métodos são: a inexperiência técnica, a eliminação e a dificuldade na diferenciação morfológica entre o complexo
E. histolytica/E.dispar e outras amebas comensais (Tanyuksel & Petri, 2003). A
diferenciação é possível, mas nem sempre fácil. Entretanto, a utilização de métodos de concentração por centrifugação, associados a técnicas de coloração permanente
complexo E histolytica/E. dispar e outras amebas comensais. E. hartmanni e E.
moshkosvskii são espécies comensais e morfologicamente semelhantes ao
complexo E. histolytica/E.dispar. E. hartmanni pode ser distinguida do complexo E.
histolytica/E. dispar por biometria, pois possuem tamanhos diferenciados (Tanyuksel
& Petri, 2003). Entretanto, não existem métodos de diagnóstico laboratorial capazes de diferenciar a E. moshkovskii do complexo E. histolytica/E. dispar.
A caracterização de padrões isoenzimáticos é um método bioquímico pioneiro para diferenciar E. histolytica de E. dispar. Este método é considerado “padrão ouro”, cujo princípio reside na mobilidade eletroforética das isoenzimas da via glicolítica (hexoquinase, fosfoglicomutase, malato desidrogenase e fosfoisomerase) de trofozoítos de cultura destas amebas (Sargeaunt et al.,1978; Otner, et al.,1997). Estas isoenzimas foram agrupadas em padrões eletroforéticos (zimodemas) que diferenciam as espécies. O comportamento eletroforético da isoenzima hexoquinase é considerado marcador de patogenicidade (Blanc & Sargeaunt, 1991; Ackers, 2002). No entanto, a eficácia deste método apresenta certas restrições, como a necessidade de uma cultura prévia por um período de 7 a 14 dias, que não positivam em aproximadamente 30% das amostras fezes positivas para cisto (Ackers, 2002), tornando assim, o método inviável para a rotina laboratorial.
O diagnóstico de certeza de um processo infeccioso é a demonstração do patógeno nos tecidos ou fluidos biológicos do hospedeiro. Porém, nem sempre isso é possível, quer pela ausência do agente infeccioso, quer pela falta de sensibilidade dos métodos utilizados, ou por falhas técnicas (Ferreira & Ávila, 2001). No diagnóstico laboratorial da amebíase, os métodos imunológicos têm sido utilizados
para a pesquisa antígeno e de anticorpos. As técnicas de imunodiagnóstico mais utilizadas no diagnóstico da amebíase são: reação de hemaglutinação indireta (HAI), a imunofluorescência indireta (RIFI) e o teste imunoenzimático (ELISA).
Na amebíase a detecção de anticorpo no soro pode ser útil no diagnóstico de doença extra-intestinal, como no abscesso hepático, onde altos títulos de anticorpos são encontrados nestes indivíduos (Guillén et al., 2002). O índice de positividade dos testes sorológicos varia de acordo com o método utilizado e com a forma da doença. Os testes sorológicos detectam anticorpos específicos para E.
histolytica em aproximadamente 95% dos pacientes com amebíase extra-intestinal,
70% dos pacientes com amebíase intestinal invasiva e em 5% dos portadores assintomáticos (Petri & Singh, 1999; Aquino, 2001). A HAI tem sido utilizada como teste sorológico padrão por apresentar uma elevada sensibilidade e especificidade (Salles et al., 1998; Tanyuksel & Petri, 2003). No entanto, a RIFI é um teste específico e sensível com a desvantagem de ocasionar títulos baixos em todas as fases da doença (Goldman, 1966; Salles et al.,, 1998). O teste ELISA tem sido proposto como um método alternativo por ser rápido, prático e por apresentar uma sensibilidade similar a HAI (Rosenblatt, et al.,, 1995).
Kraoul et al., (1997), realizaram um estudo comparativo entre testes sorológicos para a detecção de anticorpos anti-E. histolytica. Em seu estudo utilizaram 143 amostras de soro oriundas de indivíduos com quadro de abscesso hepático amebiano, de indivíduos com outras doenças hepáticas e de indivíduos saudáveis. Os autores mencionaram que a HAI possui uma sensibilidade de 97,6% e uma especificidade de 97%, enquanto que o ELISA possui uma sensibilidade de 93% e uma especificidade de 100%.
indicativos de doença amebiana. Entretanto, nas áreas endêmicas um dos maiores problemas encontrados nos métodos que detectam anticorpo é a incapacidade de distinguir entre os indivíduos portadores de infecção recente ou passada, porque os títulos de anticorpos permanecem positivos por vários meses após a infecção (Petri & Singh, 1999). Mas é preciso salientar que o indivíduo de área endêmica é exposto ao risco contínuo de re-infecções.
A pesquisa de antígenos nas fezes fundamenta-se na diferenciação antigênica de lectinas presentes na superfície dos trofozoítos de E. histolytica e E.
dispar não dependendo da integridade física dos trofozoítos. Lectina é uma classe
de proteínas que possui a capacidade de se ligar especificamente e reversívelmente a estrutura de carboidratos que se encontram ligados a proteínas e lipídeos de superfícies celulares (Tse & Chadee, 1991). Esta interação específica entre os carboidratos e a lectina, proporcionou a elaboração de ensaios imunoenzimáticos (ELISA) que diferenciam as espécies (Mann & Petri, 1991).
Haque et al. (1995), desenvolveram um ELISA de captura de antígenos nas fezes onde utilizaram anticorpos policlonais que reconheciam os epítopos 1 e 2 comuns às lectinas de E. histolytica e E. dispar além de anticorpos monoclonais marcados com peroxidase que reconheciam os epítopos 3 e 6 existentes apenas em
E. histolytica. Atualmente, esta técnica é comercialmente utilizada (“ELISA - Kit Entamoeba histolytica II”).
Povoa et al. (2000), realizaram um estudo comparativo de métodos de diagnóstico para E. histolytica em amostras da população de Belém do Pará. Os métodos empregados foram exame direto com lugol, a técnica de Faust e cols., a
coloração pela hematoxilina férrica, a pesquisa de coproantigenos nas fezes (ELISA) e a reação de imunofluorescência indireta (RIFI) para a detecção de anticorpos IgG. O teste de ELISA mostrou ser mais sensível como método de diagnóstico nos casos suspeitos de infecção por E. histolytica.
Ensaios imunoenzimáticos qualitativos rápidos tem sido desenvolvidos para a detecção concomitante de antígeno do complexo E. histolytica/E. dispar, Giardia
lamblia e Cryptosporidium parvum nas fezes. Estes testes utilizam anticorpos
monoclonais imobilizados num suporte sólido específicos para os antígenos de superfície do complexo E. histolytica/E. dispar e dos demais parasitos (Pillai & Kain, 1999; Garcia et al., 2000; Sharp et al., 2001).
A diferenciação entre as espécies também pode ser realizada através de técnicas de biologia molecular que são capazes de determinar seqüências específicas de nucleotídeos em genes evolutivamente conservados nas espécies. A PCR tem mostrado ser especifica e sensível para o diagnóstico das doenças infecto-parasitárias (Singh,1997). É um método que reside na amplificação “in vitro” de uma seqüência específica de um DNA alvo, que pode ser um simples gen ou uma parte dele. A técnica fundamenta-se em ciclo repetitivo de três etapas (desnaturação das fitas do DNA, anelamento dos iniciadores e a extensão de uma novo fragmento alvo) que ocorrem em diferentes temperaturas de incubação, em um mesmo microtubo de reação e com reagentes termoestáveis. Em condições ótimas, a reação ocorre na presença de uma seqüência alvo que será amplificada, iniciadores (pequenas seqüências de DNA sintetizadas), desoxirribonucleotídeo trifosfato (dATP, dCTP, dGTP e dTTP), enzima termoestável (DNA polimerase) e solução tampão contendo magnésio.
de extração de DNA simples e rápido e que se obtenha DNA altamente purificado. A extração de DNA em material fecal é um processo complexo, em decorrência da co-extração de substâncias inibidoras e da presença dos resíduos contaminantes oriundos do processo de extração, tais como: sais biliares, bilirrubina, etanol, complexos de polissacarídeos, etc. Essas substâncias interferem na ação da enzima DNA polimerase ou causam a degradação do DNA (Deuter el al, 1995; Monteiro et al., 1997; Wilson, 1997; Vandenberg & Oorschot, 2002). A remoção total das substâncias inibidoras nem sempre é fácil, porem é possível identificar a presença destes inibidores na amostra, introduzindo na reação controles de amplificação ou mesmo realizando a reação de amplificação em duplicata, contaminando propositalmente umas das amostras com DNA de cepa padrão.
A detecção do produto amplificado pode ser realizada através de eletroforese em gel de agarose que consiste na migração de moléculas ionizadas, de acordo com suas cargas elétricas e pesos moleculares em campo elétrico. A sua aplicação em análise de DNA é possível porque a molécula de DNA possui cargas negativas decorrente de seus grupamentos fosfato (Walker & Rapley, 1999).
A Multiplex-PCR é uma variação da PCR clássica, que utiliza ao mesmo tempo mais de um par de iniciadores dirigidos a diferentes fragmentos de DNA alvos, ocorrendo portanto, uma co-amplificação de dois ou mais alvos de tamanhos diferenciados (Henegariu et al., 1997). É uma técnica que permite a amplificação, em várias cópias, de uma região específica do DNA de E. histolytica e E. dispar, conseqüentemente é um instrumento de diagnóstico, espécie específico. Este método tem sido empregado em laboratórios de pesquisas e utilizado experimentalmente para o diagnóstico diferencial entre as espécies. (Fig. 4).
Seqüência alvo
É importante salientarmos que diferentes tipos de PCR têm sido alvos de várias pesquisas, objetivando desenvolver uma metodologia alternativa para a detecção e a diferenciação entre E. histolytica e E. dispar (Mirelman et al., 1997; Riviera et al., 1998; Evangelopoulos et al., 2000; Verweij et al., 2000; Nuñez et al., 2001; Zindrou et al., 2001; Gonin & Trudel, 2003; Verweij et al., 2004). Estes trabalhos vêm denotando que este método é sensível e específico, no entanto, apresenta algumas dificuldades no processo de extração devido às peculiaridades do material fecal. Rivera et al. (1999), mencionaram em seu estudo que a PCR é sensível o suficiente para detectar pouco menos de cinco cistos do complexo E. histolytica/E.dispar em amostras de fezes. Em Cuba, Nuñez et al. (2001), descreveram um Multiplex-PCR capaz de detectar e diferenciar o complexo E.
histolytica/E. dispar em amostras fecais e relataram que a sensibilidade deste teste
foi de 94% e a especificidade de 100%. Gonin & Trudel (2003), relatam em seu estudo que a PCR pode ser útil como um teste de referência pela sua sensibilidade na diferenciação das amebas, evitando assim o tratamento desnecessário nos casos de indivíduos infectados com E. dispar.
Figura 4 - Multiplex-PCR
1.1.7. Distribuição Geográfica
94° C 55° C 72°CDesnaturação
EDP1 EDP2 EHP1 EHP2 Seqüência E. histolytica Seqüência E. disparAnelamento
Polimerização
DNA polimerase30 ciclos
A amebíase é uma infecção cosmopolita, sendo observada uma maior prevalência nas regiões tropicais e subtropicais.
Em 1986, Walsh relatou que, em escala mundial, cerca de 500 milhões de indivíduos estão parasitados por E. histolytica. Destes, 50 milhões apresentam a forma invasiva da doença, determinando de 40 a 110 mil mortes anuais. Estes dados fazem com que a amebíase, seja a terceira causadora de mortes entre as doenças parasitárias, sendo somente ultrapassada pela malária e esquistossomose.
Em relação à prevalência da amebíase, algumas regiões da África, Ásia, América Central e do Sul se destacam no cenário mundial, devido aos baixos níveis sócio-econômicos e higiênico-sanitários da população (Tanyuksel & Petri, 2003).
O México é um dos países do mundo que mais sofre com a enfermidade amebiana, onde 15% dos casos de disenteria aguda em crianças que requerem hospitalização, estão associados E. histolytica (Gutierrez, 1986). Em 1997, Sanchez
et al. realizaram um estudo epidemiológico na cidade de Chihuahua no México e
observaram uma freqüência de 16% quando utilizaram a pesquisa de antígenos de
E. histolytica nas fezes.
Em 1997, Haque et al. realizaram um estudo na cidade de Bangladesh com 1049 crianças com diarréia e 987 crianças assintomáticas, e observaram que a prevalência de E. histolytica e de E. dispar era quase a mesma nas crianças com diarréia. Entretanto, nas crianças assintomáticas da área rural, a infecção por E.
dispar foi sete vezes mais comum.
Em 2003, Verweij et al. encontraram alta prevalência do complexo E.
histolytica/ E. dispar pelo EPF em amostras fecais oriundas de uma área rural de
Ghana, porém quando utilizou a “PCR em tempo real”, identificaram somente um caso de E. histolytica e uma alta freqüência de dispar .
na Etiopia quando compararam seus resultados obtidos pela PCR com os do EPF (Kebede, et al., 2000 a).
No Brasil, a prevalência e a gravidade da amebíase não é tão elevada quanto no México, entretanto, apresenta grande diversidade no número de indivíduos infectados ou com sintomatologia da doença, variando de região para região. No sul e sudeste a prevalência é de 2,5 % a 11 %, na região Amazônica de até 19% e nas demais regiões, de aproximadamente 10%, provavelmente em função das condições sanitárias e socioeconômicas da população, principalmente em relação às condições de habitação, presença de esgotos e água tratada (Silva, 2003).
Um estudo realizado em Manaus por Menezes em 1986, identificou vários casos de amebíase hepática e demonstrou a predominância de casos sintomáticos (65,2%) sobre os assintomáticos. Porém, as formas de colite não disentérica foram mais comuns entre os indivíduos sintomáticos.
Em 1998, Braga e colaboradores realizaram um estudo em uma favela no Estado de Fortaleza, Nordeste do Brasil, através de EPF, pesquisa de anticorpos no soro e detecção de antígenos nas fezes (ELISA). Observaram que 20% das amostras eram positivas para o complexo E.histolytica/E.dispar e 10,6% foram positivas somente para E. histolytica, pela pesquisa de antígeno nas fezes.
Em 2004, Pinheiro e colaboradores, realizaram um estudo sobre a prevalência de E. histolytica em Pernambuco e observaram somente a presença de
E. dispar quando utilizaram a PCR e a pesquisa de antígeno nas fezes.
Existe uma carência de dados epidemiológicos da amebíase no Brasil. Os dados disponíveis podem não refletir a real situação desta parasitose, pois apresentam percentuais bastante variáreis nos diversos pontos do país, talvez em
decorrência da utilização de métodos parasitológicos não padronizados que possuem baixa sensibilidade e são incapazes de diferenciar E. histolytica de E.
dispar (Rey, 2001).
A presença de E. histolytica nos países desenvolvidos está confinada a agregados populacionais, sendo que os principais grupos de risco acometidos são os viajantes de áreas endêmicas, imigrantes, homossexuais masculinos e indivíduos internados em instituições coletivas (asilos, orfanatos e manicômio) (Tanyuksel & Petri, 2003). O contato direto entre o indivíduo infectado por E. histolytica e o indivíduo sadio, certamente constitui, a mais importante fonte de infecção em agregados populacionais com elevado grau de promiscuidade e baixo nível higiênico. Segundo Evangelopous et al. (2000), a detecção e diferenciação entre E.
histolytica e E. dispar é de grande importância tanto para o diagnóstico quanto
para os estudos epidemiológicos. Inúmeros estudos têm sido realizados depois do reconhecimento de E. dispar como uma nova espécie de Entamoeba morfologicamente semelhante E. histolytica, visando à distinção entre as espécies e o melhor entendimento da incidência e prevalência da doença.
Na Grécia, Evangelopoulos et al. (2001) realizaram um estudo epidemiológico para estimar a prevalência de E. histolytica e E. dispar através da análise por técnicas de microscopia, ELISA para detecção de antígenos e PCR. Os resultados mostraram uma baixa prevalência destes parasitos na Grécia. E a PCR foi preconizada pelos autores como método de escolha para o diagnóstico da amebíase quando comparado com o ELISA.
Antoniou et al. (2002) realizaram um estudo epidemiológico utilizando métodos sorológicos e observaram uma soroprevalência de 2,5 % na Grécia.
E. histolytica isoladas são autóctones. Entretanto, no Japão, a amebíase é
prevalente somente em populações restritas: homossexuais masculinos e residentes de instituições mentais (Haghighi et al., 2002).
Tanyuksel & Petri (2003), relataram que nos países desenvolvidos como a Itália, Japão e estados Unidos, a prevalência de E. histolytica na população de homossexuais masculino está entre 4 a 21%, mas a maioria das infecções é devida
E. dispar, a qual não requer tratamento.
Diante destes fatos, nos pareceu importante analisar a PCR como uma nova metodologia a ser utilizada no diagnóstico diferencial entre E. histolytica e E.
2. OBJETIVOS
2.1. Geral
Avaliar metodologia sensível e específica (PCR) para o diagnóstico laboratorial da amebíase.
2.2. Secundários
Padronizar a técnica “Multiplex-PCR” para detecção e diferenciação de E.
dispar e E. histolytica.
Comparar a técnica de “Multiplex PCR” e o ensaio imunoenzimático (ELISA), na detecção e diferenciação simultânea destas espécies em amostras de fezes humana.
3. Material e Métodos
3.1 Amostragem
Para avaliar a aplicação da Multiplex-PCR na detecção e diferenciação entre E. histolytica e E. dispar em material fecal, foram obtidas amostras de fezes frescas de duas comunidades situadas no Estado do Rio de Janeiro. Essas comunidades participam de projetos de pesquisa desenvolvidos pela Universidade Federal Fluminense e pela Fundação Oswaldo Cruz e possuem como característica em comum o baixo nível sócio-econômico, com a maioria dos indivíduos vivendo em precárias condições sanitárias.
A comunidade do Tronco, localizada no bairro do Jóquei no Município de São Gonçalo, está inserida no projeto de pesquisa “Diagnóstico laboratorial das Parasitoses Humanas”, coordenado pela professora Heloisa Werneck de Macedo do Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina da Universidade Federal Fluminense. Nesta comunidade foram obtidas 12 amostras de fezes frescas de indivíduos que apresentaram previamente o EPF positivo para o complexo
A comunidade de Soledade localizada no Município de Sumidouro está inserida no projeto “Controle das Verminoses Intestinais”, coordenado pelo Departamento de Biologia da Fundação Oswaldo Cruz (Fiocruz). Foram obtidas 115 amostras de fezes colhidas em recipientes próprios para o método de sedimentação por centrifugação modificado utilizado no exame parasitológico de fezes e 115 amostras de fezes frescas (colhidas em recipiente próprio sem conservante) para os métodos de Multiplex-PCR e para a detecção de antígeno nas fezes, oriunda dos moradores da comunidade de Soledade. Entretanto, na etapa inicial da padronização da Multiplex-PCR foram utilizadas 11 amostras de fezes frescas, de moradores do Município de Sumidouro de outra localidade.
As amostras de fezes frescas, obtidas para o presente estudo foram
conservadas a -20o C até o momento do uso.
3.2 Exame parasitológico de fezes
Foi utilizado o método de Coprotest (COPROTEST – NL Comércio Exterior Ltda – SP) baseado no princípio de sedimentação por centrifugação.
As fezes contidas no frasco coletor contendo formol a 10% foram inicialmente homogeneizadas, sendo sete ml do homogenato transferidos para tubo cônico de plástico, onde foram adicionadas uma gota de detergente doméstico e três ml de acetato de etila. O tubo foi arrolhado e agitado vigorosamente por dez segundos. O tubo foi então centrifugado a 1.500 rpm (centrífuga de sorologia, Fanem Sp, Brasil) por dois minutos. O sobrenadante foi cuidadosamente desprezado e o sedimento ressuspenso em sete ml de água destilada. O material foi novamente centrifugado a 1.500 rpm (centrífuga de sorologia, Fanem) por dois minutos e o
uma gota de solução fisiológica. Após homogeneizar bem o sedimento, foram preparadas duas lâminas para a visualização dos cistos e trofozoítos, assim como ovos e larvas de helmintos intestinais.
3.3 Pesquisa de Coproantígenos
Foi utilizado o método imunoenzimático comercial (ELISA, E. histolytica II - TecLab Inc., Blacksburg, VA, USA) baseado na detecção da lectina galactose específica presente na superfície de E. histolytica, seguindo os procedimentos descritos pelo fabricante.
As amostras de fezes de cada paciente foram diluídas em 400 µl de solução tampão com 0,02% de timerosal. Para as fezes formadas foi utilizado 0,15 a 0,20 grama de amostra fecal para cada tubo de diluição. Para as fezes líquidas, a transferência foi realizada com auxílio de uma pipeta automática em um volume de 400 µl para cada tubo. Para toda a placa, as duas primeiras e as duas últimas cavidades ficaram reservadas para o controle negativo e para o controle positivo, que consiste de lectina galactose específica de E. histolytica diluídas em tampão de diluição.
Uma gota do conjugado (anticorpo monoclonal específico para adesina de
E. histolytica) marcado com peroxidase foi adicionada a cada cavidade, e em
seguida foram adicionados 200µl das amostras de fezes diluídas e dos controles positivo e negativo à cada cavidade. A incubação foi feita à temperatura ambiente por duas horas e em seguida as cavidades foram lavadas para posterior adição de
2 gotas de substrato (tetrametilbenzidina e peróxido de hidrogênio). Foi realizada uma nova incubação por 10 minutos à temperatura ambiente e então adicionada 1 gota de solução bloqueadora (ácido sulfúrico 1M) à cada cavidade. A leitura das amostras foi efetuada no comprimento de onda de 450nm em espectrofotômetro para placa de ELISA (Bio-Rad - modelo 3550 UV). Segundo as instruções do fabricante, é possível fazer a interpretação visual do resultado baseada na comparação da intensidade de cor entre o teste, controle negativo e positivo.
3.4 REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (Multiplex-PCR)
3.4.1 Extração do DNA
A extração do DNA nas amostras de fezes foi realizada segundo Picher et
al. (1989), com ligeiras modificações. Cerca de 1g de fezes foi dissolvida em água
destilada e filtrada em gaze. O filtrado foi lavado três vezes por centrifugação 1.500 a rpm (centrífuga de sorologia, Fanem) e o sedimento ressuspenso em 1,0 ml de água destilada. A uma alíquota de 100µl das fezes adicionou-se 500µl da solução de tiocianato de guanidina 5M, seguido por agitação manual por inversão e incubação a temperatura ambiente por 10 minutos. O lisado foi resfriado no gelo por 2 minutos e adicionou-se 250µl de acetato de amônio 7,5 M. Após agitação do tubo por inversão várias vezes, este foi novamente incubado no gelo por 10 minutos. O volume de 500µl de uma solução de clorofórmio-álcool isoamílico (24:1 v/v) foi adicionado e após agitação manual por inversão, centrifugou-se a amostra a 13.800 X g (centrífuga Eppendorf - 5415 C) por dez minutos. A fase aquosa foi transferida
para precipitação do DNA. O tubo foi invertido várias vezes, para misturar as soluções e depois centrifugado a 3.448 X g por um minuto. Seguiu então a lavagem do DNA com etanol 70% (v/v) por 5 vezes. Após secagem do tubo em estufa a 37°C, o DNA foi ressuspenso em 50 µl de tampão Tris-EDTA pH 8,0 (TE). O DNA ressuspenso em TE foi colocado na estufa a 56° C por 1 hora.
3.4.2 Reação de amplificação
A reação de amplificação foi realizada seguindo os procedimentos descritos por Nuñez et al. (2001), com algumas modificações. Segundo os autores, os oligonucleotídeos iniciadores foram desenhados a partir de seqüências polimórficas altamente repetitivas, localizadas na subunidade menor do rRNA. As seqüências alvo foram amplificadas utilizando um par de oligonucleotídeos iniciadores específicos para cada espécie. Para E. dispar foi utilizado o EDP1 (5 ’ATGGTGAGGTTGTAG CAGA GA 3’) e EDP2 (5’ CGATATTGACCTAGTACT 3’), sendo gerado um produto de 96 pares de bases (pb). Para E. histolytica foi utilizado EHP1 (5’ CGATTTTCCCAGTAGAAATTA 3’) e EHP2 (5’CAAAATGGTCGT CTAGGC 3’), sendo gerado um produto de 132 bp. O volume final da mistura da reação foi de 50 µl, contendo: tampão 20mM Tris-HCl pH 8,4; 50 mM KCl; 1,5 mM
MgCl2; 40 pmoles de cada oligonucleotídeos iniciadores específicos (“primer”); 250
µM de cada nucleotídeo (dNTPs) e 1,25 U de Taq DNA polimerase (Invitrogen Life technologies, USA), 0,1% de albumina de soro bovino (BSA – Sigma Chem. Co., USA) e 2 µl de DNA extraído.
A etapa de amplificação foi realizada em 30 ciclos, onde cada ciclo apresentou uma fase de desnaturação 94°C por 30 segundos, uma fase de
anelamento a 55oC por 30 segundos e uma fase de extensão a 72oC por 30
segundos. Antes do primeiro ciclo, ocorreu uma fase de pré-desnaturação a 94°C por três minutos, e após o último ciclo ocorreu a fase de extensão final a 72°C por seete minutos. Foi utilizado o termociclador geneAmp PCR System 2400 (Applied -Biosistems, CA, USA).
Foram utilizados os seguintes controles na reação de amplificação: controles positivos (DNA extraído de cepa padrão HM1-IMSS de E. histolytica de cultura e controle DNA extraído de cepa de E. dispar), controle branco (todos os reagentes da mistura de reação, exceto o DNA que foi substituído por água ultra pura), uma mistura de DNA padrão de E. histolytica e E. dispar e o controle negativo (DNA extraído de amostra fecal negativa para o complexo E. histolytica e E.
dispar).
3.4.3 Detecção do Produto Amplificado
Foram utilizados 10 µl dos produtos de amplificação obtidos na
Multiplex-PCR para a análise por eletroforese (cuba de eletroforese, modelo HE33 - Hoefer Scientific Instruments, USA) em gel de agarose a 2% (Invitrogen Life Technologies, USA). Como marcador de peso molecular foram utilizados 5 µl do “100 pb ladder” (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, SE) para estimar os tamanhos dos produtos amplificados. O gel a 2% foi preparado em tampão TBE (1M Tris- borato,
2 horas. Após a corrida , o gel foi corado com brometo de etídio numa concentração de 0,5 µg/ml (Sambrook et al., 1998) por 10 minutos e lavado em água destilada por 30 minutos. A inspeção visual do gel foi feita no transiluminador (Sigma Chem. Co., USA, modelo T1201) de luz ultravioleta, seguida da análise automatizada realizada com o auxilio do sistema de imagem (“Image Analysis System”) empregando o programa Molecular Analyst, versão 1.12 (Bio-Rad).
3.5 Padronização de “Multiplex-PCR”
Na etapa inicial da padronização da Multiplex-PCR foram utilizadas amostras de fezes experimentais que foram elaboradas a partir de fezes comprovadamente negativas (100 µl) contaminadas com 1000, 200, 100, 50, 25, 15, 10, 5, 2 trofozoítos de cepa padrão de E. histolytica, além de utilizar a estratégia de quantidades (32 ng, 16 ng, 8 ng, 16 ng, 32 ng, 6,4 ng, 1,2 ng, 256 picogramas (pg), 51 p, 10 p, 400 femtogramas (fg), 80 fg, 40 fg, 4 fg e 1fg) de DNA de cepa padrão de cultura de E. histolytica para estabelecer o limite de detecção de DNA da Multiplex-PCR.
Foram elaboradas diferentes concentrações de DNA de E. histolytica e E.
dispar, simultaneamente na mesma mistura de reação de amplificação, com o
propósito de verificar qualquer interferência no processo de amplificação. Os graus de variações das concentrações de DNA das espécies nestas reações foram as seguintes: 9,2 ng/ml de DNA de E. dispar adicionados em 4 amostras a serem
amplificadas, posteriormente, acrescentados 16 ng/ml, 8 ng/ml, 1,6 ng/ml e 0,8 ng/ml de DNA de E. histolytica respectivamente.
Com o objetivo de verificar a reprodutibilidade do Multiplex-PCR foram testadas dez amostras de fezes em duplicatas. Anteriormente, foram efetuadas análises das 11 amostras de fezes oriundas da comunidade de Sumidouro sem prévia identificação. Entretanto, posteriormente foi observado que entre estas amostras, duas amostras foram enviadas em duplicata e uma outra em triplicata. Este fato, só foi evidenciado após análise dos resultados. Restando portanto, amostras de fezes de oito indivíduos.
Para avaliar melhor os resultados das amostras e, sobretudo em relação a presença de inibidores oriundos do processo de extração, foi realizada uma nova reação de amplificação da Multiplex-PCR em 20 amostras que apresentaram resultados negativos. O objetivo destas análises foi detectar a presença de resultados falso negativos. Foi utilizado nesta nova reação 1 µl (800 pg) de DNA de cepa padrão de E. histolytica concomitantemente com 1µl de DNA das amostras negativas.
Foram utilizadas 16 amostras de fezes diluídas em água destilada e filtrada em gaze no processo de extração de DNA com o intuito de verificar uma possível perda de DNA no material fecal quando utilizamos o processo de lavagem por centrifugação na preparação das amostras fecais utilizadas no processo de extração.
4.0 Resultados
Na fase inicial da padronização da Multiplex-PCR foram utilizados materiais biológicos (fezes) de moradores do Município de Sumidouro, onde estudos prévios mostraram através do exame parasitológico de fezes uma alta prevalência (10%) do complexo E. histolytica/E.dispar (dados não publicados). Nesta fase foram utilizadas 11 amostras de fezes de oito indivíduos desta comunidade. Destas amostras, dez foram positivas para o complexo E. histolytica/E.dispar pelo EPF, sendo que, somente seis amostras foram positivas para E. dispar pela PCR. Não foram encontradas amostras positivas para E. histolytica pela Multiplex-PCR. Entretanto, entre as 11 amostras analisadas, duas foram enviadas em duplicata e uma em triplicata. Este fato só foi verificado após a análise dos resultados. Entre estas amostras os resultados foram semelhantes, indicando que o teste foi reprodutível.
A avaliação da reprodutibilidade intra-teste da Multiplex-PCR foi determinada testando-se dez amostras de fezes em duplicatas, sendo que destas,
quatro eram amostras positivas e seis negativas. A avaliação da reprodutibilidade inter-teste foi determinada quando utilizamos a amostra A2 positiva para o padrão de E. dispar em 15 testes realizados em dias diferentes. Visualmente os resultados da Multiplex-PCR se mostraram reprodutíveis, permitindo assim, observar uma boa reprodutibilidade do ensaio.
A avaliação da sensibilidade da Multiplex-PCR, foi estabelecida utilizando amostras fecais contaminadas com diferentes concentrações de E. histolytica de cepa padrão, variando entre 1000 a 2 trofozoítos/100µl de fezes. Estas amostras foram submetidas à Multiplex-PCR e foi possível observar o fragmento amplificado de 132 pb em gel de agarose do DNA extraído de amostras fecais contaminadas com até 5 trofozoítos de E. histolytica (Fig. 5).
Figura 5 - Produtos amplificados através de Multiplex-PCR com Primer EDP1/P2 e EHP1/P2. Avaliação da sensibilidade da Multiplex-PCR, utilizando amostras de
fezes contaminadas com diferentes quantidades (50 a 5 trofozoítos/100ul de
fezes) de cepa padrão de E. histolytica. Eletroforese em gel de agarose a 2% corado com brometo de etídio. PM – padrão de peso molecular 100 bp, 1 -controle positivo (E. dispar – 96 bp) 2 - -controle positivo (E. histolytica – 132 pb), 3 - controle negativo 4- controle positivo (E. histolytica/E. dispar), 5 – 50 trofozoítos de cepa padrão de E. histolytica, 6 – 25 trofozoítos de cepa padrão de E. histolytica, 7 – 15 trofozoítos de cepa padrão de E. histolytica, 8 – 5 trofozoítos de cepa padrão de E. histolytica.
PM 1 2 3 4 5 6 7 8
