UNIVERSIDADE TECNOLÓGICA FEDERAL DO PARANÁ
ÁREA DE AGRÁRIAS
CURSO DE ZOOTECNIA
LETÍCIA WLODARSKI
PROTOZOÁRIOS CILIADOS EM OVINOS SUPLEMENTADOS COM
GORDURA PROTEGIDA
TRABALHO DE CONCLUSÃO DE CURSO
DOIS VIZINHOS
2015
UNIVERSIDADE TECNOLÓGICA FEDERAL DO PARANÁ
CURSO DE ZOOTECNIA
LETÍCIA WLODARSKI
PROTOZOÁRIOS CILIADOS EM OVINOS SUPLEMENTADOS COM
GORDURA PROTEGIDA
TRABALHO DE CONCLUSÃO DE CURSO
DOIS VIZINHOS
2015
LETÍCIA WLODARSKI
PROTOZOÁRIOS CILIADOS EM OVINOS SUPLEMENTADOS COM
GORDURA PROTEGIDA
Trabalho de Conclusão de Curso, apresentado ao Curso de Zootecnia da Universidade Tecnológica Federal do Paraná, Câmpus Dois Vizinhos, como requisito parcial à obtenção do título de Zootecnista.
Orientadora: Prof. Dra. Emilyn Midori Maeda
DOIS VIZINHOS
2015
A minha mãe Bernadete, ao meu pai Polan e ao meu irmão Leandro pelo apoio e compreensão
AGRADECIMENTOS
A Deus pelo dom da vida e por ter me dado força para superar as dificuldades, pois sem Ele jamais estaria aqui.
Aos meus pais Polan e Bernadete e ao meu irmão Leandro, pelo amor, incentivo e apoio incondicional.
Ao meu namorado Carlos por todos os momentos de felicidade, ainda que nos momentos mais difíceis, e por sempre me fazer acreditar que tudo é possível.
A minha família e meus amigos, por fazerem parte da minha vida.
A minha orientadora Prof. Dra. Emilyn Midori Maeda, pela paciência, apoio e confiança para a elaboração deste trabalho.
A Cândida Camila dos Reis pela disponibiliade de tempo em me ajudar, pela paciência e apoio. Aos professores Lucas da Silva Domingues, Luciana Boemer Cesar Pereira, Fabiana Luiza Matielo Paula, pelo auxílio na obtenção dos resultados estatísticos.
A Universidade Tecnológica Federal do Paraná e aos professores que fizeram parte da minha formação profissional e pessoal.
Ministério da Educação
Universidade Tecnológica Federal do Paraná Campus Dois Vizinhos
Gerência de Ensino e Pesquisa Curso de Zootecnia
UNIVERSIDADE TECNOLÓGICA FEDERAL DO PARANÁ
PR
TERMO DE APROVAÇÃO TCC
Protozoários ciliados em ovinos suplementados com gordura protegida
Autor: Letícia Wlodarski
Orientador: Prof. Dra. Emilyn Midori Maeda
TITULAÇÃO: Zootecnista
APROVADA: em 19 de fevereiro de 2015.
Prof. Dr. Cleverson Busso Cândida Camila dos Reis (Zootecnista)
Prof. Dra. Emilyn Midori Maeda Orientadora
Resumo
WLODARSKI, Letícia. Protozoários ciliados em ovinos suplementados com gordura protegida. 2015. 30f. Trabalho (Conclusão de Curso) – Programa de Graduação em Bacharelado em Zootecnia, Universidade Tecnológica Federal do Paraná. Dois Vizinhos, 2015.
O presente trabalho tem por objetivo quantificar os protozoários ciliados no rúmen de ovinos em relação à suplementação com gordura protegida de óleo de palma. O experimento foi realizado na Universidade Tecnológica Federal do Paraná, Campus Dois Vizinhos, na UNEPE de metabolismo animal, no período de junho a agosto de 2014. Foram utilizados quatro ovinos machos fistulados no rúmen com peso vivo médio de 50 kg. Estes animais foram mantidos em gaiolas com bebedouros e comedouros individuais alimentados com 20% de feno de Tifton 85 e 80% de concentrado. Nos tratamentos foram adicionados 0, 2, 4 e 6% de gordura protegida de óleo de palma. O período experimental foi de 80 dias, com 14 dias de adaptação e um dia de coleta do líquido ruminal, o qual foi utilizado para a quantificação dos protozoários e determinação do pH. O delineamento experimental utilizado foi Quadrado Latino (4x4), com quatro níveis de inclusão da gordura e quatro períodos. O pH foi determinado com pHmetro digital, nos tempos 0, 2, 4, 6 e 8 horas após o fornecimento da dieta. A coleta para quantificação dos protozoários foi feita nos tempos zero e duas horas. Foi utilizada Câmara de contagem adaptada de Sedgewick-Rafter, as amostras coletadas foram fixadas em formalina 18,5% e depois aplicadas em solução de lugol (100 mL de água destilada, cinco gramas de iodo e dez gramas de iodeto de potássio), foram consideradas as médias das contagens feitas em 100 campos independentes, realizadas em duplicata e analisados em microscópio com aumento de 10x. Dos alimentos fornecidos aos animais foram retiradas amostras dos dias da coleta e feita a pré-secagem em estufa de ventilação forçada a 55ºC por 72h para posteriores análises bromatológicas de matéria seca, matéria orgânica, proteína bruta e fibra em detergente neutro. Os dados foram submetidos a análise de variância e o efeito do nível de inclusão da gordura foi analisado por regressão. Não foi observada diferença significativa na contagem total de protozoários ciliados o rúmen de ovinos (P>0,05) para os níveis de inclusão de gordura protegida na dieta (0, 2, 4 e 6%), no entanto houve diferença (P<0,05) entre os tempos 0 e 2 horas após a alimentação. Em relação ao pH, houve diferença significativa (P<0,05) em relação as dietas fornecidas e o tempo de coleta e apresentou valor mínimo 6,1 com nível de 0,18% de inclusão de gordura, as 5,35 horas após a alimentação. O uso da gordura protegida de óleo de palma até 6% no concentrado em dieta de ovinos não afeta a população de ciliados no rúmen. A câmara adaptada de contagem de protozoários permite a contagem de acordo com a metodologia recomendada da literatura. Observa-se redução de protozoários ruminais com a diminuição do pH ruminal e presença constante de oxigênio.
Palavras chave: Fermentação ruminal. Microbiologia ruminal. Isotricha .
WLODARSKI, Letícia. Ciliated protozoa in sheep supplemented with protected fat. 2015. 30f. Trabalho (Conclusão de Curso) – Programa de Graduação em Bacharelado em Zootecnia, Universidade Tecnológica Federal do Paraná. Dois Vizinhos, 2015.
This study aims to quantify the ciliated protozoa in the rumen of sheep in relation to supplementation protected fat palm oil. The experiment was conducted at the Federal Technological University of Paraná, Campus Dois Vizinhos in animal metabolism UNEPE, from June to August 2014. Four male sheep with ruminal cannula were used with 50 kg body weight . These animals were kept in cages with water fountains and individual feeders fed 20% of Tifton 85 hay and 80% concentrate. The treatments were 0, 2, 4 and 6% added protected fat from palm oil. The experimental period was 80 days, with 14 days of adaptation and a day of collection of ruminal fluid, which was used for the quantification of protozoa and pH determination. The experimental design was Latin square (4x4), with four levels of inclusion of fat and four periods. The pH was determined with a digital pH meter, at 0, 2, 4, 6 and 8 hours after feeding the diet. The collection to quantify the protozoa was taken at zero and two hours. It was used adapted Counting chamber Sedgewick-Rafter, the collected samples were fixed in formalin 18.5% and then applied lugol solution (100 mL of distilled water five and ten grams of iodine g of potassium iodide), the mean scores were considered independent made of 100 fields performed in duplicate analyzed under a microscope with 10X magnification. The feed supplied to the animals were samples taken from days of collection and made pre-drying in forced ventilation oven at 55 ° C for 72 hours for further chemical analysis of dry matter, organic matter, crude protein and neutral detergent fiber. Data were subjected to analysis of variance and the effect of the inclusion level of fat was analyzed by regression. No significant difference was observed in total count of ciliate protozoa the rumen of sheep (P> 0.05) for inclusion levels of dietary fat protected (0, 2, 4 and 6%), however significant differences (P <0.05) between times 0 and 2 hours after feeding. Regarding the pH, there was significant difference (P <0.05) compared the diets provided and the time of collection and showed minimum level 6.1 with 0.18% inclusion of fat, 5.35 hours after power. The use of protected fat of palm oil up to 6% in the concentrate in the diet of sheep does not affect the population of rumen protozoa. The adjusted number of protozoa chamber allows to count according to the methodology recommended in the literature. There is a reduction Protozoa with decreasing pH and constant presence of oxygen.
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ... 7
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ... 8
2.1 ASPECTOS GERAIS DA OVINOCULTURA ... 9
2.2 PROTOZOÁRIOS ... 10
2.3 PARÂMETROS RUMINAIS ... 12
2.3.1 pH RUMINAL ... 12
2.4 GORDURA PROTEGIDA E PROTOZOÁRIOS CILIADOS ... 144
2.5 CARACTERIZAÇÃO DE PROTOZOÁRIOS CILIADOS ... 16
3 MATERIAL E MÉTODOS ... 178
4 RESULTADO E DISCUSSÃO ... 19
5 CONCLUSÃO ... 23
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1 INTRODUÇÃO
A ovinocultura no Brasil e no mundo apresentou na última década um grande avanço no sistema de produção. Meios de divulgação, crescimento do poder aquisitivo, conhecimento das formas de preparação da carne, técnicas de manejo e nutrição, por consequência, são os principais fatores que contribuíram para o aumento da procura e da produção de carne de ovinos. No Brasil, o efetivo de animais foi de 16,789 milhões de cabeças (IBGE, 2012), participando desse dado, todas as regiões do país, que nos últimos anos tem apresentado resultados significativos e expressivos comparados com anos anteriores.
Os ruminantes, por possuírem o sistema digestório composto por quatro compartimentos, apresentam uma grande diversidade de microorganismos, entre bactérias, fungos, vírus bacteriófagos e protozoários, os quais são os componentes da microbiota ruminal, (MACKIE, 2002). Essa diversidade está relacionada com a fermentação e digestão do alimento, o hospedeiro e a dieta ingerida. Os protozoários ciliados do rúmen (Alveolata, Ciliophora) são classificados no filo Ciliophora, e estão presentes na classe Litostomatea, subclasse Trichostomatia e distribuídos em duas ordens: Vestibuliferida e Entodiniomorphida e a subordem Entodiniomorphina (LYNN, 2008).
A dieta é um dos principais fatores relacionados à diversidade de protozoários, pois apartir da alimentação outros parâmetros também são afetados, como o pH e o tempo de passagem do alimento, os quais controlam o estabelecimento, desenvolvimento e conservação das populações de protozoários do sistema digestório (WILLIANS; COLEMAN, 1992). Após a ação fermentativa dos protozoários ciliados, ocorre a formação de ácidos graxos voláteis, acido láctico, dióxido de carbono e hidrogênio. A produção de ácidos graxos voláteis é essencial aos ruminantes, pois apartir deste, sintetizam o carbono e a energia (KITTELMANN; JANSSEN, 2011).
A utilização da gordura protegida de óleo de palma na nutrição animal, tem demonstrado resultados satisfatórios, pois têm-se um melhor desempenho dos animais, tanto reprodutivo, quanto alimentar, sua utilização nao altera o consumo, e não proporciona diminuição na digestibilidade do alimento, (FERREIRA et al., 2009). Acredita-se que a gordura protegida seja inerte no rúmen, desta forma, não altera a quantificação de microorganismos no rúmen, e não altera o metabolismo e a degradação ruminal, PALMQUIST & MATTOS, 2006).
Cada vez mais se torna importante o conhecimento da microbiota ruminal, pois apartir deste estudo, sabe-se a influência da dieta, os diferentes microorganismos existentes e como a
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gordura protegida permanece no rúmen. No entanto, a escassez de pesquisas na área é grande. A implantação da técnica de determinação e quantificaçãode protozoários resultaria em avanços na área de nutrição animal, facilitaria o ajustamento de dietas e permitiria a validação de novas técnicas para posteriores pesquisas.
Objetivo: O presente trabalho tem por objetivo quantificar os protozoários ciliados no rúmen de ovinos em relação à suplementação com gordura protegida de óleo de palma e análise de pH.
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2.1 ASPECTOS GERAIS DA OVINOCULTURA
Os ovinos foram uma das primeiras espécies a serem domesticadas pelo homem. Sua criação era realizada principalmente para os fins de subsistência, produção de carne e leite, como também se fazia o uso da lã e do couro, os quais eram utilizados como proteção, servindo de abrigo em intempéries do ambiente (VIANA, 2008).
Segundo Viana (2008), a criação de ovinos tem se expandido em diversas regiões do continente, devido ao grande potencial de adaptação destes animais, estes conseguem expressar suas características produtivas em locais com diferentes climas, condições de relevo e vegetação.
A figura 1 representa a densidade de cabeças ovinas/km2 nas diferentes regiões dos
continentes, no ano de 2007 (FAO, 2007). Observa-se uma maior concentração entre os países da África, Ásia e Oceania. Contudo, nas Américas do Norte e Sul, a densidade é menor. A China destaca-se como o país com maior número de animais, em sequência tem-se Austrália, Índia, Irã, Sudão e Nova Zelândia.
Figura 1 – Densidade de cabeças ovinas/ km2 das terras agrícolas no ano de 2007. Fonte:
adaptado da FAO (2007).
No Brasil, o efetivo de animais foi de 16,789 milhões de cabeças no ano de 2012. Os maiores produtores estão concentrados no Nordeste do País (55,5%), onde a criação é realizada em todos os estados, destacando-se a Bahia (16,8%) e Ceará (12,3%). Neste mesmo ano, o Sul do país foi responsável por 30% da criação de ovinos, sendo o Rio Grande do Sul incumbido por 24%, o que representa 4% da produção nacional, (IBGE, 2012).
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já na Nova Zelândia chega a 313,0 cabeças/km2, desta forma, observa-se que existe um grande
potencial para a ovinocultura em terras brasileiras. Em um contexto geral, a produção de ovinos apresenta significativa importância econômica para muitos países, devido ao sistema de produção extensivo e o baixo uso de tecnologias mais sofisticadas.
Segundo dados do IBGE (2010), o estado do Paraná possui o 6º maior rebanho nacional com aproximadamente 614 mil ovinos. A produção de ovinos no estado apresenta grande semelhança com o manejo adotado nos estados do Rio Grande do Sul e o Nordeste, pois o abate de cordeiros é o mais preconizado, devido ao tamanho das propriedades, pequeno e médio porte, contudo essa atividade representa grande potencial genético, podendo ser introduzida na propriedade como uma renda secundária, (Silva, 2004). Na mesorregião do Sudoeste do estado, encontra-se um efetivo de aproximadamente 97 mil animais, (IBGE, 2010).
2.2 PROTOZOÁRIOS
Em virtude da evolução do trato gastrointestinal dos ruminantes, ocorreu também o desenvolvimento de protozoários ciliados no rúmen, os quais apresentam uma relação simbiótica, juntamente com bactérias, fungos e protozoários flagelados, estes compreendem a microbiota ruminal, (MACKIE, 2002).
Segundo Nakamura e Kanegasaki (1969), em um experimento realizado com ovinos, estes autores observaram uma diminuição no número de protozoários quando fornecido somente feno de gramínea na dieta, 2-4 x 105/mL, no entanto, quando a alimentação era a base
de feno e concentrado a contagem de ciliados apresentou variação, 7-12 x 105/mL. A microbiota
do rúmen apresenta aproximadamente 104 - 106 protozoários/mL, (KAMRA, 2005).
Entre os microrganismos presentes no rúmen, são encontrados os protozoários ciliados, os quais são unicelulares, anaeróbios, e não patogênicos, podem apresentam de 20 a 200μm, sendo de 10 a 100 vezes maiores que as bactérias, (DEHORITY, 1993).
Atualmente, os protozoários ciliados do rúmen (Alveolata, Ciliophora) são classificados no filo Ciliophora, e estão presentes na classe Litostomatea, subclasse Trichostomatia e distribuídos em duas ordens: Vestibuliferida e Entodiniomorphida.
A ordem Vestibuliferida compreende cinco famílias de ciliados sendo que, em mamíferos ruminantes está representada principalmente pela família Isotrichidae, que inclui três gêneros de ciliados: Dasytricha, Isotricha e Oligoisotricha
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Archistomatina e Blepharocorythina são representadas pelas famílias Buetschliidae e Blepharocorythidae que incluem os gêneros Buetschlia e Charonina, respectivamente.
A terceira subordem, Entodiniomorphina, compreende 10 famílias de ciliados endossimbiontes, incluindo a família Ophryoscolecidae, que compreende os gêneros:
Entodinium, Eodinium, Diplodinium, Diploplaston, Eremoplastron, Eudiplodinium, Ostracodinium, Metadinium, Enoploplastron, Elytroplastron, Polyplastron, Epidinium e Ophryoscolex (LYNN, 2008).
Calcula-se que a constituição dos protozoários ciliados presentes no rúmen, representam aproximadamente 2% do conteúdo total deste compartimento digestório, 40% do nitrogênio microbiano e são responsáveis por 60% dos produtos finais da fermentação (YOKOYAMA; JOHNSON, 1988).
Estudos realizados com ruminantes demonstram que no decorrer do dia, a variação de protozoários no rúmen é bastante diversificada. Segundo Werner (1962), essa alteração pode ocorrer devido a diversos fatores, como o período pós-alimentação, a dieta fornecida, o tempo de divisão dos ciliados, o intervalo entre o recebimento de alimento, entre outros.
O aparecimento de protozoários no rúmen ocorre comumente com o fornecimento de dietas mais digestíveis, outro fator importante é a quantidade de energia, que é a fonte de reserva para esses organismos do rúmen, estes armazenam elevadas quantidades de polissacarídeos quando não se tem mais energia proveniente do meio externo (VAN SOEST, 1994).
Segundo Carvalho et al. (1997), ao suplementar bovinos com diferentes níveis de concentrado na dieta, a quantificação de protozoários, pode tornar-se significativa aumentando de forma benéfica aos ruminantes, principalmente em relação aos microorganismos amilolíticos como os Entodinium. Dietas contendo níveis crescentes de fibra e alta taxa de concentrado, contribuem para o aumento da contagem dos protozoários no rúmen, principalmente dos Entodinium spp., no entanto os gêneros que apresentaram maior relevância foram Epidinium, Isotricha, Dasytricha e Eudiplodinium, esse aumento ocorre devido a maior facilidade de degradar a fibra (NOGUEIRA FILHO et al., 1999). Segundo Bird et al. (1979) e Franzolin (1988), os protozoários do gênero Entodinium, correspondem a aproximadamente 90% dos ciliados na microbiota ruminal de ovinos alimentados com cana-de-açúcar.
No entanto, ainda são escassas as informações referentes aos benefícios e a ação desses microrganismos no rúmen, justamente devido à complexidade e a variedade populacional destes, como também as distintas morfofisiologias existentes entre as espécies de ciliados.
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2.3 PARÂMETROS RUMINAIS
2.3.1 pH RUMINAL
O rúmen representa um biossistema dependente da ingestão alimentar, da constituição química dos componentes da dieta, da quantidade ingerida de alimento, a constância na ali-mentação, a qualidade do material ingerido, tamanho da partícula e da relação concentrado:vo-lumoso. Segundo Hoover e Stokes (1991), todos esses elementos influem no pH, o qual é dos fatores que controla os processos químicos e fisiológicos da fermentação ruminal.
Em decorrência do processo de fermentação do rúmen, várias ações físicas e microbi-ológicas são oriundas desse processo, como a transformação da dieta fornecida aos animais em ácidos graxos voláteis, proteína microbiana, amônia, metano, nitrato, entre outros. Segundo Van Soest, (1994), os ruminantes controlam a população de microorganismos no rúmen devido ao processo de ingestão e mastigação dos alimentos, desta forma, adicionam tampões e expe-lem os ácidos produzidos, eliminando produtos e gases indesejáveis ao organismo, nessas con-dições tem-se a mantença apropriada de microorganismos, controle do pH, umidade e tempe-ratura ideias.
Os protozoários ciliados do rúmen sofrem grande infuência da diminuição do pH, o qual é determinado pela quantidade excessiva de concentrado fornecido na dieta. Segundo Yo-koama e Johnson, (1988), quando mantem-se o pH em torno de 5,5 alguns gêneros de proto-zoários podem se sobressair em relação aos outros, dentre eles os Isotrichia e Entodinia, se este valor for alterado, decrescer, as concentrações destes microorganismos também diminuem. O pH ruminal pode variar entre 5,5 e 7,2, essa diminuição ocorre devido ao forneci-mento de uma dieta com altos níveis de concentrado, estes valores decrescem devido a rápida taxa de fermentação ruminal, (OWENS e GOETSCH, 1988). Quando utiliza-se uma ração com valores elevados de concentrado, ocorre uma seleção de microrganismos no rúmen, pois alguns não conseguem sobreviver em valores muito baixos de pH, principalmente os protozoários, assim, os microrganismos que degradam a fibra vão estar em pequenas concentrações, o que pode ocasionar em um acúmulo de fibra no conteúdo ruminal,(OWENS e GOETSCH, 1988).
Os ruminantes no decorrer do seu desenvolvimento, adquiriram a habilidade de aproveitar com eficácia carboidratos estruturais como energia, e compostos nitrogenados não-protéicos como proteína, (VALADARES FILHO; PINA, 2006). Essa habilidade
desenvolveu-13
se devido às divisões do sistema gastrintestinal, e da diversificação de microorganismos existentes, os quais tem função de fermentar proteínas, materiais fibrosos e ácidos graxos voláteis e em alguns casos, vitaminas. Desta forma, os animais tem a diversificação na escolha dos alimentos e nas fontes de vitaminas e aminoácidos necessários a sua mantença (VAN SOEST, 1994).
Os ruminantes apresentam divisão do sistema gástrico compreendido em quatro compartimentos: rúmen, retículo, omaso e abomaso. No abomaso, ou estômago verdadeiro, é onde ocorre à liberação do ácido gástrico, já nos três primeiros, acontece o processo fermentativo dos alimentos, devido ao revestimento epitelial existente e pela mucosa absortiva (BERCHIELLI et al., 2006). Os primeiros compartimentos são responsáveis pela fermentação, onde se tem a retenção do alimento e a digestão da fibra, em ambiente anaeróbio. O pH do rúmen apresenta alta relação com os produtos finais da fermentação como os ácidos graxos e o percentual de microrganismos presentes nesse compartimento do trato gastrintestinal.
Os microorganismos do rúmen, principalmente os protozoários, necessitam de condições ideais de pH para sua mantença na microflora intestinal. Desta forma, os valores podem variar entre 6,2 a 6,8, dependendo da alimentação fornecida, pois dietas contendo maior quantidade de forrageiras tendem a oscilar mais rapidamente o pH, em razão da alta atividade de fermentação do material fibroso, (MOULD;ORSKOV, 1983).
Os ruminantes conseguem manter as condições adequadas de pH através da saliva, esta contém bicarbonato de sódio que proporciona pH em média 8,1.Contudo para que ocorra a concentração normal de saliva, torna-se necessário fornecer ao animal uma alimentação adequada, na qual não ocorra uma variação brusca nos teores de umidade do alimento. Pois, dietas contendo elevado teor de umidade, diminui a produção de saliva e alimentos fibrosos, contribuem para o aumento desta (BERCHIELLI et al., 2006). Ao fornecer dietas com valores inferiores a 40% de fibra, a produção de saliva se torna baixa, desta forma o crescimento de microorganismos é afetado (VALADARES FILHO; PINA, 2006).
Em um experimento realizado com novilhos, alimentados com feno de capim coastcross com livre fornecimento e porcentagens de concentrado de 25 a 75%, os valores de pH variaram entre 5,76 a 6,83 após a alimentação (CARDOSO et al., 2000). Estudos realizados por Owens e Goetsch (1988), registraram de 6,5 a 5,5 nos valores de pH, quando os animais foram sub-metidos a uma alimentação com níveis acima de 70% de concentrado na matéria seca.
A celulose e a hemicelulose, quando degradadas, proporcionam maior concentração de acetato, no entanto, quando ocorre a degradação de carboidratos solúveis,como o amido e os açúcares, têm-se maiores teores de propionato. Esta diminuição do acetato ocorre devido a
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alimentação com elevada quantidade de carboidratos, pois a fermentação é acelerada, induzindo a morte de bactérias e protozoários, pela decorrência da redução rápida do pH do rúmen, (MOTA et al., 2010).
A utilização de concentrados na dieta de ruminantes, quando em níveis adequados, contribuem para a melhora da microbiota ruminal, proporcionando benefícios aos animais, em relação à taxa de protozoários ciliados, pois estes, ajustam e mantem um equilíbrio no rúmen, controlam a taxa de fermentação, evitam problemas metabólicos, como a acidose ruminal. Devido a essa fermentação moderada, o pH ruminal não sofre uma queda acentuada, pois os protozoários digerem os grânulos de amido mais lentamente, desta forma a produção de lactato diminui, o que favorece a estabilização do ecossistema ruminal (KOZLOSKI, 2002).
2.4 GORDURA PROTEGIDA E PROTOZOÁRIOS CILIADOS
A utilização da gordura protegida pode ser incluída como suplementação energética para os ruminantes, como cordeiros em fase de terminação em confinamento (HOMEM JÚNIOR et al., 2010). Seu uso proporciona resultados benéficos aos animais, como um maior rendimento de carcaça e maior eficiência alimentar, (FERNANDES et al., 2011) e (JAEGER et al., 2004). Segundo Ortiz (2011), a gordura protegida contribui para manter alta energia na dieta, bem como aumentar a absorção de vitaminas, garantindo uma melhor eficiência energética.
Acredita-se que a utilização da gordura protegida é inerte no rúmen, e que para ser digerida necessita de um meio ácido. O pH ruminal tem caráter básico, desta forma não ocorre a digestão da gordura, desde que esta seja protegida. O processo da digestão ocorre no abo-maso, onde o pH é ácido variando em torno de 2 a 3. Segundo Gressler; Souza (2009), a utili-zação da gordura protegida é uma alternativa bastante utilizada e que vem sendo difundida na alimentação animal, esta oferece uma fonte de energia que auxilia no funcionamento das célu-las. O manuseio de lipídios na dieta pode ter baixo ou nenhuma implicação na fermentação ruminal.
Algumas fontes de gordura, principalmente as que estão protegidas do processo de degradação, apresentam efeito inerte sobre os microorganismos ruminais, não apresentando toxidez da gordura e não alteram o processo de degradação ruminal dos alimentos, (PAL-MQUIST & MATTOS, 2006). Segundo Huang et al., (2009), a suplementação com gordura protegida, favorece um melhor desempenho animal, melhora a eficiência alimentar e reprodu-tiva, como também proporciona um aumento na produção de carne.
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Segundo Gonçalves e Domingues (2007), a utilização da gordura protegida é de grande importância na produção animal, principalmente para dietas que demandam maiores exigências nutricionais em ácidos graxos e elevada densidade energética,a gordura proporciona um maior ganho de peso e deposição de gordura na carcaça. Estes mesmos autores concluíram que a gordura protegida também contribui para uma maior rapidez no desenvolvimento dos animais, proporciona maior quantidade de musculatura, carcaças de qualidade, entre outros.
O acrescimento da gordura protegida na dieta, também é uma opção para aumentar o nível de energia, este lipídio não proporciona o aumento da ingestão de carboidratos estruturais e não causa diminuição do consumo de alimentos fibrosos, (SILVA et al., 2007).
O uso da gordura protegida têm apresentado resultados satisfatórios quando utilizadas na nutrição de ruminantes, pois melhoram os índices produtivos, não prejudicam o consumo de alimentar e sua utilização não diminui a digestibilidade do alimento, (FERREIRA et al., 2009).
Ivan et al. (2001), ao utilizar óleo da semente de girassol, na dieta de ovinos, sendo incluída na proporção de 6% da MS, observaram que estes animais ao receberem esta alimen-tação, apresentaram defaunação, somente prevalecendo os protozoários do gênero Entodinium.
Apesar da gordura protegida apresentar efeito inerte sobre o rúmen, alguns trabalhos demonstram que pode acorrer algumas alterações na microbiota ruminal, fazendo com que o número de protozoários ciliados seja prejudicado. Autores como Machmüller; Ossowski; Kreu-zer (2000), ao suplementarem cordeiros, com dietas contendo 5,6% de óleo de côco, grãos de oleaginosas (sementes de girassol, colza), linhaça e gordura protegida, observaram reduções na população de protozoários, exceto quando utilizaram gordura protegida, não visualizou-se efeitos prejudiciais no ambiente ruminal. Desta forma, verifica-se que a gordura protegida, de-vido sua proteção, não causa interferência na população de ciliados.
Os protozoários contribuem para a degradação da fibra devido ao fato de que ao se aderirem nesta, facilitam o deslocamento das bactérias que realizam essa atividade. Ao adicio-nar a gordura protegida na dieta, segundo estudos já realizados, ocorre um decréscimo no nú-mero de protozoários, desta forma, também causa a diminuição da degradação da fibra, pois dificulta o ascesso dos protozoários ao material fibroso que por consequência diminui a ação das bactérias fibrolíticas.
Desta forma, estudos devem ser realizados para analisar e concluir qual o efeito da gor-dura protegida na população de protozoários ciliados, bem como determinar e quantificar quais são os ciliados mais predominantes em virtude dos diferentes níveis da gordura.
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2.5 CARACTERIZAÇÃO DE PROTOZOÁRIOS CILIADOS
Devido a grande variedade de microorganismos existentes no conteúdo ruminal, é de suma importância o estudo da interação desses seres entre si e com o ambiente do rúmen. Para que a produção animal, principalmente de ruminantes, possa apresentar resultados satisfatórios, se busca maximizar a utilização de diferentes alimentos, como também explorar a microbiota ruminal, de forma a entender o processo fermentativo, a fim de garantir uma melhor eficiência alimentar.
A quantificação e o papel dos protozoários ciliados podem variar de acordo com a alimentação, os períodos de fornecimento da dieta, a estação do ano, entre outros. Segundo Dehority (2003), a concentração de protozoários ciliados do rúmen pode apresentar oscilação diurna diariamente. Em estudo realizado com cinco novilhos fistulados recebendo dieta contendo elevadas quantidades de concentrado, em um período de 30 dias, (FRANZOLIN e DEHORITY, 1996), não verificaram variação de microrganismos no rúmen.
Autores como Dehority e Tirabasso (1989), ao estudarem os protozoários ciliados do gênero Isotricha de ovinos, constataram o aumento desses microorganismos desde o ato da alimentação e persistindo por aproximadamente 2 a 4 horas. Também relataram que essa concentração de protozoários pode ser alterada pelo período de amostragem, o grau e constância na alimentação.
Segundo Rossi; Martinelle; D’Agosto (2013), em um estudo realizado com bovinos, para contagem de protozoários ciliados do rúmen, verificou-se que após testes com diferentes formas de filtragem, conclui-se que quando as amostras são filtradas a diversidade e a densidade de protozoários diminuem, desta forma não se obtém dados verídicos da população de microrganismos, no entanto se a amostra coleta for fixada em formalina, recomenda-se a filtragem.
Em estudo realizado com protozoários do gênero Entodinium, observou-se uma redução do número destes organismos no conteúdo ruminal devido ao fornecimento de dietas com óleo de soja, sendo essa dieta associada ou não a monensina. Esse resultado indica que os protozoários são sensíveis ao óleo, podendo este componente causar a diminuição parcial ou total dos ciliados desse gênero (MARTINELE et al. 2008). Outros gêneros também foram afetados, apresentando redução na contagem, entre eles os Dasytricha, Eremoplastron e Isotricha.
Coalho et al. (2003), em estudos realizados com bovinos, observaram que dietas contendo diferentes níveis de proteína não-degradável, juntamente com a inclusão de uréia,
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proporcionou aumento no número de protozoários, sendo mais predominante o gênero
Entodinium.
Os Holotricha, aparecem em maior quantidade em dietas onde os animais estão sob pastejo, ingerindo feno ou cana-de-açucar. Este gênero de protozoários, degradam os polissacarídeos não estruturais e os carboidratos solúveis das palntas (HUNGATE, 1966).
Nogueira filho et al. (1992), ao fornecerem capim elefante para bovinos fistulados, sendo estes cortes realizados em diferentes estádios vegetativos, observaram uma maior predominância de Entodinium spp., Diplodinium spp e Polyplastrom spp. Ocorreu a diminuição do Entodinium spp., do decorrer da idade da planta.
Há resultados contraditórios na literatura, alguns autores afirmam ocorrer um aumento na população de protozoários de acordo com algumas dietas fornecidas, no entando outros estudos indicam a diminuição. Desta forma, tem-se uma dificuldade no esclarecimento destas dúvidas, e qual é o verdadeiro papel dos protozoários. Autores como Franzolin e Dehority, (1996), em experimento realizado com novilhos recebendo dietas com alto teor de concentrado durante 30 semanas, oberservaram a presença de dois gêneros diferentes, sob condições semelhantes de manejo. Bovinos que receberam grande quantidade de concentrado e alta concentração de amido, apresentaram diminuição ou eliminação total dos protozoários ciliados. Este fato pode ser explicado devido a diminuição do pH, causado pela grande quantidade de concentrado e também pela relação volumoso:concentrado.
3 MATERIAL E MÉTODOS
O experimento foi realizado na Universidade Tecnológica Federal do Paraná, Campus Dois Vizinhos, na UNEPE de metabolismo animal, no período de julho a setembro de 2014. Foram utilizados quatro ovinos machos fistulados no rúmen com peso vivo médio de 50 kg. Estes animais foram mantidos em gaiolas com bebedouros e comedouros individuais alimentados com 20% de feno de Tifton 85 e 80% de concentrado. As dietas fornecidas eram isoenergeticas e isoprotéicas com 18% de Proteína Bruta e 80% de Nutrientes Digestíveis Totais, (NRC, 2007).
Tabela 1- Composição percentual e química1 das dietas na base da Matéria Seca.
Ingrediente Tratamentos (% MS)2
0 2 4 6
18 Milho grão 58,7 47,6 45,1 35,1 Farelo de trigo 0 10 10 17,7 Gordura 0 2 4 6 Feno 20 20 20 20 Nutrientes (% MS) Matéria seca 88 88 88 88 Proteína Bruta 18 18 18 18
Nutrientes digestíveis totais 78,14 78,72 80,74 81,6
Fibra em detergente neutro 21,85 24,61 24,43 26,57
1 Composição química avaliada por análise bromatológica Silva e Queiroz (2002).
2 Tratamentos: 0: (0% de gordura protegida); 2: (2% de gordura protegida); 4: (4% de gordura protegida) e 6: (6% de gordura protegida).
Os tratamentos foram compostos por 0, 2, 4 e 6% de gordura protegida de óleo de palma. O período experimental totalizou 80 dias, 15 dias de adaptação e um dia de coleta do líquido ruminal, o qual foi utilizado para a quantificação dos protozoários e determinação do pH. O delineamento experimental utilizado foi Quadrado Latino (4x4), com quatro níveis de inclusão da gordura e quatro períodos.
O pH foi determinado no líquido ruminal com o auxílio de um phametro digital, nos tempos 0, 2, 4, 6 e 8 horas após o fornecimento da dieta. A coleta para quantificação dos protozoários foi feita nos tempos zero e duas horas após a alimentação,. A contagem dos protozoários ciliados foi realizada através da Câmara adaptada de Sedgewick-Rafter, fabricada em PTEG, em dimensões idênticas a original. As amostras de líquido e conteúdo ruminal coletadas foram fixadas em formalina 18,5% e depois aplicadas solução de lugol (100 mL de água destilada, cinco gramas de iodo e dez gramas de iodeto de potássio) de acordo com metodologia modificada de D’Agosto e Carneiro (1999). Foram consideradas as médias das contagens feitas em 100 campos independentes, realizadas em duplicata e analisadas em microscópio com aumento de 10x. Para a coleta das amostras, as cânulas dos animais foram abertas sendo feita a retirada do líquido ruminal. As amostras foram armazenadas em frascos plásticos com 20 ml de líquido ruminal não filtrado e 20 ml de formalina. Dos alimentos fornecidos aos animais foram retiradas amostras dos dias da coleta e feita a pré-secagem em estufa de ventilação forçada a 55ºC por 72h para posteriores análises bromatológicas de matéria seca, matéria orgânica, proteína bruta e fibra em detergente neutro, de acordo com as metodologias descritas por Silva e Queiroz (2002). Os dados foram submetidos a análise de variância e o efeito do nível de inclusão da gordura foi analisado por regressão.
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4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Não foi observada diferença significativa na contagem total de protozoários ciliados no rúmen de ovinos (P>0,05) para os níveis de inclusão de gordura protegida na dieta (0, 2, 4 e 6%), no entanto houve diferença (P<0,05) entre os tempos 0 e 2 horas após a alimentação. Sendo a maior população de protozoários encontrada no tempo 0 (Tabela 2), período que antecede o fornecimento dos alimentos aos animais.
Tabela 2- Números médios totais de protozoários ciliados/mL de conteúdo ruminal (104) de ovinos fistulados alimentados com dieta a base de concentrado e suplementados com gordura protegida, aos níveis de 0, 2, 4 e 6% (tratamentos %) coletados 0 e 2 horas após a alimentação.
Tempo Tratamentos (%)
0 2 4 6 0 0,22a 0,31a 0,19a 0,18a 2 0,17b 0,18b 0,16b 0,14b Total 0,39 0,49 0,35 0,32 CV(%) 29,9
CV = coeficiente de variação; Letras diferentes na mesma coluna, diferem pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.
Observa-se que mesmo não havendo diferença significativa (p>0,05) entre os tratamentos em relação a população total de protozoários, houve maior contagem no tratamento contendo 2% de gordura de protegida, é possível que neste tratamento protozoários que se desenvolvem melhor em alimentos com alta proporção de amido, como por exemplo os
Entodinium e Isotrichas que são encontrados em maior número em dietas ricas em cereais
(WILLIANS;COLEMAN ,1992).
Valinote et al. (2005) realizaram um experimento com a inclusão de sal de cálcio de ácidos graxos, caroço de algodão e caroço de algodão sem monensina, e obtiveram vários gêneros de protozoários em todos os tratamentos, mas não foram encontradas diferenças estatísticas entre a dieta controle e a utilização de sal de cálcio de ácidos graxos, com total de 65,65x104/mL e 66,78x104, respectivamente, afirmando que o último foi inerte no rúmen, desta
forma, não afetando a população de protozoários, corroborando com o presente estudo. Towne et al. (1990), ao suplementar bovinos de corte com gordura, observaram valores médios de 15,9x104/g de conteúdo ruminal no total de protozoários ciliados.
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Ao comparar o número de ciliados encontrados no presente estudo com a literatura, observa-se valores inferiores no número de protozoários. Além da dimininuição do total de protozoários duas horas após o fornecimento da dieta, ao contrário do que ocorre na literatura que verificam sequestro e migração de espécies dos gêneros Isotricha e Dasytricha com aumento destes até quatro horas após a alimentação (Dehority e Tirabasso 1989). Este número reduzido pode ser explicado pelo fato de que foram realizados trabalhos concomitantes a este estudo, desta forma houve uma maior frequência na abertura das cânulas, o que pode ter causado a entrada de oxigênio e oscilação da temperatura do rúmen e posteriormente a morte dos microrganismos. Ainda podem ser explicados em função da redução do pH observado (Tabela 3).
De acordo com Bürger et al. (2000), em um trabalho utilizando níveis crescentes de concentrado (30, 45, 60, 75 e 90%), obteve-se comportamento linear decrescente na população de protozoários, 33,6x104, 25,5x104, 17,5x104, 9,5x104 e 1,4x104cél./mL, respectivamente.
Sendo que a proporção de 90% ocasionou uma redução mais significativa no número de ciliados (1,4x104cél./mL), desta forma ao adicionar elevado nível de concentrado na dieta,
valores entre 75 a 90%, a redução de protozoários se torna maior, assim como neste estudo em que teve um número pouco expressivo de protozoários em uma dieta contendo 80% de concentrado. Ainda, Valinote et al. (2005) ao realizar um experimento com a adição de 5% de sal de cálcio de ácidos graxos na alimentação de novilhos Nelore, contendo nesta dieta alta proporção de concentrado (81% de concentrado na MS) observaram o decréscimo na população de protozoários.
Da mesma forma Dijkstra (1994), afirma que altos níveis de concentrado podem causar elevada redução na quantidade de protozoários, ou até mesmo o desaparecimento destes microorganismos. Uma das principais causas seria a grande quantidade de carboidratos presentes na dieta, por consequência os ciliados não conseguem realizar o engolfamento de todo o amido presente, sendo estes degenerados no ambiente ruminal, como observado no presente estudo ao adicionar elevada proporção de concentrado na dieta.
Segundo Dewhurst et al., (2000), os lipídios, não estando estes na forma protegida, atuam diretamente sobre a síntese de nitrogênio microbiano, pois não fornece energia para os microrganismos do rúmen, desta forma, gerando a defaunação da população de protozoários.
No entanto ainda não há afirmações sobre o envolvimento na defaunação e a relação deste com a eficiência da síntese de nitrogênio microbiano. Acredita-se que a gordura protegida seja inerte no rúmen, de acordo com o presente trabalho, essa afirmação pode ser confirmada.
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Pois não ocorreu toxicidade ou diminuição exacerbada na população de ciliados quando fornecido até 6% de gordura.
Tabela 3- Valores de pH ruminal de ovinos fistulados alimentados com dieta a base deconcentrado suplementados com quatro níveis de gordura protegida (0, 2, 4 e 6%) e o tempo de coleta (0, 2, 4, 6 e 8 horas) após a alimentação.
A tabela 3 representa os valores de pH obtidos no presente experimento. Houve diferença significativa (P<0,05) em relação as dietas fornecidas e o tempo de coleta com efeito quadrático (pH= 6,15 - (0,495X) + 1,328X2) e (pH=6,32-0,109X+0,011X2), respectivamente. O pH ruminal, parâmetro indicativo da fermentação ruminal, foi modificado pela dieta (P<0,05) e apresentou valor mínimo 6,1 com nível de 0,18% de inclusão de gordura, as 5,35 horas após a alimentação. No entanto, apesar da elevada quantidade de concentrado na dieta, não houve grande diminuição nos valores de pH, que oscilou entre 6,0 e 6,29 nos tempos observados.
Observa-se neste estudo, uma diminuição do pH ao decorrer dos diferentes tempos de coleta do líquido ruminal, e em relação a inclusão de gordura protegida houve o aumento. Isso devido a composição percentual e química das dietas (Tabela 1) que houve maior inclusão de farelo de trigo para manterem as dietas isoprotéicas e isoenergéticas, que aumentaram os teores de FDN de 21,85 a 26,57, respectivamente para os tratamentos controle e 6% de inclusão.
Devido a esse aumento da FDN a taxa de fermentação foi mais lenta, oque manteve os valores de pH maiores.
Os ovinos também conseguem manter os valores de pH estáveis em diferentes dietas devido a capacidade tamponante da saliva, a qual proporciona um ambiente equilibrado para a microbiota ruminal. A saliva também auxilia na fixação dos microorganismos nas partículas do alimento e através dos movimentos ruminais de mistura e eructação, a ruminação aumenta
Tempo Tratamentos (%) 0 2 4 6 Média 0 6,35 6,14 6,59 6,56 6,45 2 6,11 5,98 6,19 6,24 6,15 4 6,06 6,14 6,08 6,14 6,11 6 6,16 5,85 6,14 6,11 6,12 8 6,24 5,90 6,32 6,43 6,28 Média 6,18 6,0 6,26 6,29
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o fluxo de saliva, e esta por conter bicarbotato de sódio, controla a acidez decorretente do processo fermentativo da degradação dos alimentos (OWENS & GOETSCH 1993). Pôde-se observar desta forma, que apesar da quantidade de concentrado em relação ao volumoso (80:20) fornecido na dieta, os animais conseguiram manter estável o ambiente ruminal, o que pode ser confirmado pelos valores de pH, os quais não foram menores que 6,0.
Franzolin & Dehority (1996), ao realizarem um estudo referente a adição de monensina e óleo de soja na alimentação de ruminantes, fornecendo alta proporção de concentrado (90%), observaram a defaunação de dois animais entre os cinco estudados. Esta defaunação pode ter ocorrido devido a menor adaptação do animal perante a dieta fornecida e o tempo de adaptação. Desta forma, demonstrando que cada animal apresenta diferente capacidade de mantença da microbiota ruminal, pois os parâmetros fermentativos e digestivos variam para cada indivíduo em relação a dieta a qual é submetido. Estes autores também descreveram que o pH dos animais defaunados foi menor, o que também foi encontrado neste estudo, pois em relação ao tempo houve a diminuição do número de ciliados como também do pH pós alimentação.
Algumas características em relação ao tempo, nível e hábito de consumo, bem como aspectos relacionados à ruminação, salivação e o tamponamento do rúmen, exercem grande influência sobre a conservação e manutenção das espécies de protozoários ciliados. Afirmando que o tipo de dieta, tempo de alimentação, período pós alimentação e o pH, são os fatores determinantes para a contagem e quantificação dos protozoários (FRANZOLIN & DEHORITY, 1996).
Ao adicionar concentrado à dieta de ruminantes, em níveis que não prejudiquem a microbiota ruminal, ocorre um beneficiamento para os animais que o ingerem, pois os protozoários controlam a fermentação no rúmen, fazendo com que haja um equilíbrio neste compartimento, impedindo disfunções e problemas metabólicos, como a acidose. Esse controle da fermentação ocorre por parte dos protozoários, pois ao digerirem os grânulos de amido, mais vagarosamente que as bactérias, controlam a queda de pH, (KOZLOSKI, 2002). Apesar dessa afirmação, o ambiente ruminal é muito complexo devido as interações que podem ocorrer entre os microorganismos, o ambiente ruminal e os animais. Pode ter havido uma maior participação das bactérias na degradação dos alimentos, devido ao baixo número de protozoários comparado a literatura.
5 CONCLUSÃO
O uso da gordura protegida de óleo de palma até 6% no concentrado em dieta de ovinos não afeta a população de ciliados no rúmen. A câmara adaptada de contagem de protozoários
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confeccionada em Pteg permite a contagem de acordo com a metodologia recomendada da literatura. Observa-se redução de protozoários ruminais com a diminuição do pH ruminal e presença constante de oxigênio.
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