UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS INSTITUTO DE QUÍMICA
KAHLIL SCHWANKA SALOME
APLICAÇÃO DA TÉCNICA DE MATRIX-ASSISTED DOSY NO ESTUDO DA SEPARAÇÃO VIRTUAL DE ENANTIÔMEROS.
CAMPINAS 2019
APLICAÇÃO DA TÉCNICA DE MATRIX-ASSISTED DOSY NO ESTUDO DA SEPARAÇÃO VIRTUAL DE ENANTIÔMEROS.
Tese de Doutorado apresentada ao Instituto de Química da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos para a obtenção do título de Doutor em Ciências.
Orientador: Prof. Dr. Claudio Francisco Tormena
O arquivo digital corresponde à versão final da Tese defendida pelo aluno Kahlil Schwanka Salome e orientada pelo Prof. Dr. Claudio Francisco Tormena
CAMPINAS 2019
Salome, Kahlil Schwanka,
Sa36a SalAplicação da técnica de Matrix-Assisted DOSY no estudo da separação virtual de enantiômeros / Kahlil Schwanka Salome. – Campinas, SP : [s.n.], 2019.
SalOrientador: Claudio Francisco Tormena.
SalTese (doutorado) – Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química.
Sal1. Ressonância magnética nuclear. 2. Enantiômeros. 3. DOSY com detecção de 19F. I. Tormena, Claudio Francisco, 1972-. II. Universidade Estadual de Campinas. Instituto de Química. III. Título.
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Enantiodiscrimination by Matrix-Assisted DOSY NMR Palavras-chave em inglês:
Nuclear magnetic resonance Enantiomers
DOSY with 19F detection
Área de concentração: Química Orgânica Titulação: Doutor em Ciências
Banca examinadora:
Claudio Francisco Tormena [Orientador] Luiz Alberto Colnago
Tiago Venancio
Airton Gonçalves Salles Junior Emilio Carlos de Lucca Júnior
Data de defesa: 30-08-2019
Programa de Pós-Graduação: Química
Identificação e informações acadêmicas do(a) aluno(a) - ORCID do autor: https://orcid.org/0000-0002-0891-1525 - Currículo Lattes do autor: http://lattes.cnpq.br/8834345836051525
Prof. Dr. Claudio Francisco Tormena (Orientador)
Dr. Luiz Alberto Colnago (Embrapa Instumentação)
Prof. Dr. Tiago Venancio (Universidade Federal de São Carlos)
Prof. Dr. Airton Gonçalves Salles Junior (Universidade Estadual de Campinas)
Prof. Dr. Emilio Carlos de Lucca Júnior (Universidade Estadual de Campinas)
A Ata da defesa assinada pelos membros da Comissão Examinadora, consta no SIGA/Sistema de Fluxo de Dissertação/Tese e na Secretaria do Programa da Unidade.
Este exemplar corresponde à redação final da Tese de Doutorado defendida pelo aluno KAHLIL SCHWANKA SALOME, aprovada pela Comissão
“Algumas regras para a vida: - Questione a autoridade.
- Nenhuma ideia é verdadeira só porque alguém diz que é, incluindo eu. - Pense por si próprio, questione a si próprio.
- Não acredite em algo só porque quer acreditar, acreditar em algo não o torna verdadeiro.
- Teste ideias pelas evidências adquiridas, pela observação e experimentação.
- Se uma ideia prevalecente falhar num teste bem desenvolvido, está errada. Supere. - Siga as evidências onde quer que elas levem, se não houver evidências, evite julgamento.
- Lembre-se, você pode estar errado.
- O universo não tem obrigação de fazer sentido para você.”
Dedico esta tese a todos que contribuíram para sua elaboração e a todos que ainda acreditam em uma educação libertadora.
AGRADECIMENTOS
“Many places I have been Many sorrows joys I have seen But I don’t regret Nor will I forget All who took that road with me.” À minha mãe Josélia Schwanka Salomé por ter ficado viva no início do meu doutorado e ao meu pai Jorge Moisés Salomé por ter segurado as pontas sozinho, principalmente no começo dos 4 anos. Obrigado a todos os que se fizeram pais e mães, padrinhos e madrinhas, família, durante o doutorado e meus 29 anos;
Ao professor Dr. Cláudio Francisco Tormena pela oportunidade de trabalhar em um grupo maravilhoso, pelos ensinamentos, discussões científicas e não tão científicas assim, pela competência e amizade que vou carregar pela vida;
Ao professor Dr. Roberto Rittner Neto e a professora Dra. Denize Cristina Favaro pelas discussões e contribuições para este trabalho. Conviver diariamente com estes professores foi excelente;
Aos professores Drs. Airton Gonçalves Salles Júnior e Edvaldo Sabadini pelas contribuições na banca de qualificação;
Novamente ao professor Dr. Airton e estendo ao professor Dr. Emílio Carlos de Lucca Júnior pelas contribuições na banca de defesa;
Aos professores Drs. Luiz Alberto Colnago e Tiago Venâncio pelas contribuições em diversas AUREMNS na minha formação e agora na banca de defesa;
Aos amigos e técnicos do laboratório de RMN Anderson Santos Pedrosa e Gustavo Giraldi Shimamoto por manterem sempre (que possível) tudo funcionando;
Aos amigos ex-técnica e ex-técnico do LFQO Monique Ottmann e Henrique Piva por manterem o LFQO organizado, normalmente;
Aos professores (as), técnicos (as) e secretários (as) do IQ-UNICAMP que contribuíram também para a formação que eu tive;
Aos amigos e amigas do LFQO, com os quais tive a oportunidade de conviver (no sentido horário): Guilherme Dal Poggeto, Renan Freitas Gimenez, João Vitor Oliveira Soares, Amanda Ferreira da Silva, Weslley Guilherme Dias de Paiva Silva, Cassia Chiari, Maiara da Silva Santos, Renan Vidal Viesser, Lucas Gelain Martins, Lucas José Karas, Kennedy Daniel de Carvalho Santos, Luana Andrade
Dutra, Uenifer Rodrigues Couto, Laiza Bruzadelle Loureiro, Carolyne Brustolin Braga, Thaís Mendonça Barbosa, Isabela Cunha, Victor Ulian Antunes, Guilherme Borghi, Bruna Rogério de Abreu, Angelita Nepel, (prof) Rodrigo Antonio Cormanich e a membra honorária Cíntia Mendonça. Vocês me ensinaram muito além de RMN;
Especialmente à Angelita Nepel, que dividiu comigo as dores e as delícias deste doutorado, 4 anos de vida e o aluguel;
Aos amigos ex-DQUI-UFPR, que fazem bastante falta. Em especial ao pessoal do LECOSIN e LAPNEQ que contribuíram bastante na minha formação.
Aos amigos do vôlei de sempre. E aos de toda terça e quinta, aqui representados pelas professoras Stefanie Alves e Bruna Florenziano;
Aos amigos que fiz em Campinas e que facilitaram minha vida fora da universidade: Cabeto (in memoriam), Maria e família da COMO? Espaço Educador Vegano; Marcela e Rafael representando o We Can Veg It; Jaqueline e Rafael da Pizza Power; Manolo e Marisa da Senhorita Pepis; Carol e Thiago do The Boinas e Mariah e Renata da Veg Vida. Obrigado por permanecerem na luta diária.
À CAPES. O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001;
À CNPQ; À FINEP; À FAPESP;
A todos que me ajudaram de alguma forma e a todos que ainda resistem, muito obrigado;
E um agradecimento especial à Syntia. Sem ela, nada disso teria sido possível.
“To these memories I will hold With your blessing I will go To turn at last to paths that lead home And though where the road then takes me I cannot tell We came all this way But now comes the day To bid you farewell I bid you all a very fond farewell” Billy Boyd – The Last Goodbye
RESUMO
A espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear (RMN) de alta resolução é atualmente uma das técnicas mais utilizadas para a determinação estrutural de moléculas. Porém, pares de enantiômeros não são diferenciáveis em uma solução isotrópica, criando um obstáculo na caracterização completa de compostos. Como alternativa, diversas metodologias podem ser utilizadas como a derivatização do analito utilizando um composto de configuração absoluta conhecida ou a utilização de agentes quirais de solvatação (CSA) que formam complexos diastereoisoméricos in situ permitindo assim a diferenciação dos sinais de cada enantiômero. A análise de difusão por RMN (Diffusion Ordered SpectroscopY, DOSY) também não consegue diferenciar enantiômeros, uma vez que estes possuem o mesmo coeficiente de difusão, mas na presença de um CSA, os sinais podem ser separados e assim os coeficientes de difusão podem ser mensurados. Assim, utilizando a técnica de DOSY assistida por uma Matriz (Matriz Assisted DOSY, MAD) foram analisados 17 analitos com 9 CSAs diferentes utilizando os núcleos de 1H e 19F quando possível.
Primeiramente foram determinados os melhores parâmetros de aquisição para os experimentos de difusão e então foi observada a separação dos sinais de enantiômeros nos espectros 1D de 1H e 19F{1H} e nos mapas de difusão para a maioria
dos analitos utilizando principalmente 4 das matrizes propostas. Com isso, verificou-se que é possível a verificou-separação de enantiômeros via MAD com experimentos simples e utilização de matrizes de baixo custo.
ABSTRACT
High-Resolution Nuclear Magnetic Resonance (HR-NMR) is an important technique for determining the structure of molecules. However, enantiomers give the exact same chemical shift and coupling constants in an isotropic solution, which limits the technique for configuration assignment. To overcome this disadvantage, many authors suggest different methodologies such as using Chiral Solvating Agents (CSAs) which is a molecule that binds in situ to both enantiomers through non-covalent interactions with different binding constants, leading to different chemical shifts of the diastereoisomeric complex. Diffusion Ordered SpectroscopY (DOSY) itself is not able to differentiate enantiomers, once the pair has the exact same diffusion coefficient. However, the addition of a CSA can allow separation, and thus obtain a clean spectrum of each enantiomer and even determine the enantiomeric excess and association/binding constant. This Matrix-Assisted DOSY (MAD) technique has been used already for enantiodiscrimination with good results but employing expensive CSAs. This work demonstrates the potential of the 1H-MAD and 19F-MAD technique in
the enantiodiscrimination of 17 analytes using 9 CSAs. The acquisition parameters were optimized and the signals separations in 1D spectra and DOSY maps were observed using mainly 4 CSAs. Therefore, it is possible to achieve enantiodiscrimination using low-cost CSAs and simple experiments.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Cristais de quartzo observados por Haüy. A) Forma cristalina até então relatada. B e C) Cristais de quartzo observados por Haüy com facetas apontando para a esquerda (B) e para a direita (C). ... 20 Figura 2: Estruturas das moléculas de A) D-Ácido tartárico e B) Ácido racêmico (forma racêmica do ácido tartárico) ... 21 Figura 3: Estruturas dos compostos 1,7-dioxaespirot[5.5]undecano, carvona, limoneno e aspartame ... 23 Figura 4: Estrutura dos compostos (R) e (S)-metrotexato ... 23 Figura 5: Estruturas da (S) e (R)-varfarina com destaque para os carbonos que sofrem hidroxilação pela via metabólica principal (em vermelho) e pela via metabólica secundária (em azul) ... 24 Figura 6: Estruturas dos compostos (R) e (S)-talidomida com destaque para o hidrogênio que pode ser desprotonado, levando à racemização do composto. ... 25 Figura 7: Estruturas das moléculas E e Z-2-buteno evidenciando os substituintes do carbono 2... 26 Figura 8: Estruturas das moléculas (S)-1-feniletanol e de sua imagem especular, o composto (R)-1-feniletanol ... 26 Figura 9: Estruturas das moléculas (R)-1,3-dicloro-1,2-propadieno e (S)-1,3-dicloro-1,2-propadien ... 27
Figura 10: Exemplo de dois enantiômeros de bifenilas (A) e binaftilas (B) demonstrando que não é possível a interconversão das estruturas pela rotação da ligação simples ... 28 Figura 11: Representação de uma sequência de spin-eco para um spin. Figura 11A: sequência de pulsos spin-eco. Figura 11B: efeito dos pulsos na magnetização com o campo não homogêneo ... 31 Figura 12: Ilustração da sequência de pulsos PFGSE com o efeito dos pulsos na intensidade do sinal. ... 31 Figura 13: Ilustração da sequência de pulsos PFGSE com o efeito dos pulsos na intensidade do sinal. ... 32 Figura 14: representação da sequência de pulsos Oneshot45 (os intervalos entre os pulsos estão fora de escala). ... 34
Figura 15: Ilustração do processo de obtenção de um mapa de difusões. Primeiramente são obtidos os espectros de RMN 1D para então serem ajustados à uma equação e assim gerar o mapa 2D... 35 Figura 16: Espectros de RMN de 1H da prometazina pura (acima, em roxo)
e com quantidades crescentes de (S)-BINOL demonstrando que a separação entre os sinais aumenta com o aumento da quantidade de BINOL. Figura adaptada da referência 54. ... 39 Figura 17: Estruturas das isoflavonas que foram enantiodiscriminadas utilizando BINOL (referência 55) e do complexo ternário de BINOL, DMAP e do analito (referência 56) ... 40 Figura 18: CSAs (1-9) e analitos (10-26) utilizados nesta tese... 42 Figura 19: Mistura racêmica do 4'-flúor-1-feniletanol e (S)-BINOL em diferentes solventes. A) Espectro de RMN de 1H e B) Espectro de RMN de 19F{1H} 45
Figura 20: Espectros de RMN de 1H de: misturas de (R)-BINOL e cânfora
enantioenrriquecida (esquerda) e (S)-BINOL e cânfora enantioenrriquecida (direita) com concentrações crescentes de BINOL. ... 46 Figura 21: Espectros de RMN de 19F{1H} da molécula 23 com o CSA 1 com
a potência do desacoplador crescente de baixo para cima: 0; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,57928 (valor padrão) e 0,6 W. ... 48 Figura 22: Espectros de RMN de 1H da mistura racêmica do
4'-flúor-1-feniletanol e (S)-BINOL em diferentes temperaturas ... 49 Figura 23: Espectros de RMN de 19F{1H} da mistura racêmica do
4'-flúor-1-feniletanol e (S)-BINOL em diferentes temperaturas ... 50 Figura 24: Variação do deslocamento químico de 1H (azul) e 19F (vermelho)
com a variação da temperatura ... 51 Figura 25: Módulo da variação do deslocamento químico de 1H (azul) e 19F
(vermelho) com a variação da temperatura ... 51 Figura 26: Espectros de 19F{1H} de maior atenuação demonstrando o NS 8
(A, verde) e NS 32 (B, laranja) e curvas ajustadas para os experimentos de medida de difusão com TD igual a 8 (C, vermelho) e igual a 32 (D, azul). ... 54 Figura 27: Projeção de MAD de 1H com o espectro menos atenuado acima
Figura 28: Comparação entre o sinal de uma das metilas do grupo isopropila de misturas de 10 e 11, com excesso enantiomérico de 10, e matriz 1 (vermelho) ou matriz 2 (azul). ... 58 Figura 29: Comparação entre o sinal de uma das metilas do grupo isopropila de misturas de 10 e 11, com excesso enantiomérico de 11, e matriz 1 (vermelho) ou matriz 2 (azul). ... 58 Figura 30: Projeção de MAD de 1H com o espectro menos atenuado acima
para os compostos 10 e 11 e os CSAs 1 (esquerda) e 2 (direita). ... 59 Figura 31: Comparação entre o sinal do hidrogênio α-carbonila das amostras de 1 a 5 de cânfora. ... 60 Figura 32: Projeção de MAD de 1H com o espectro menos atenuado acima
para o composto 12 e os CSAs 1 (esquerda) e 2 (direita)... 61 Figura 33: Projeção de MAD de 1H com o espectro menos atenuado acima
para o composto 12 e o CSA 5. ... 62 Figura 34: Ampliação de espectros de RMN de 1H do ácido mandélico (13)
puro e na presença de 5 CSAs diferentes. De baixo para cima: Sem CSA, moléculas
1, 2, 3, 4 e 5. ... 63
Figura 35: Projeção de MAD de 1H com o espectro menos atenuado acima para o composto 13 e os CSAs 1 (esquerda) e 2 (direita)... 64 Figura 36: Projeção de MAD de 1H com o espectro menos atenuado acima
para o composto 13 e os CSAs 3 (esquerda) e 4 (direita)... 64 Figura 37: Projeção de MAD de 1H com o espectro menos atenuado acima
para o composto 13 e o CSA 5. ... 65 Figura 38: Ampliação de espectros de RMN de 1H de amostras contendo
13 e: A) 1 a 25 ºC. B) 2 a 25 ºC. C) 5 a 25 ºC. D) 5 a 15 ºC. E) 3 a 5 ºC. F) 5 a -10 ºC.
... 66 Figura 39: Ampliação de espectros de RMN de 1H do composto
1-feniletanol (14) puro e na presença de 4 CSAs diferentes. De baixo para cima: Sem CSA, moléculas 1, 2, 3 e 4. ... 67 Figura 40: Projeção de MAD de 1H com o espectro menos atenuado acima
para o composto 14 e os CSAs 1 (esquerda) e 2 (direita)... 68 Figura 41: Ampliação de espectros de RMN de 1H do composto 15 puro e
na presença de 4 CSAs diferentes. De baixo para cima: Sem CSA, moléculas 1, 2, 3 e 4. ... 69
Figura 42: Representação dos efeitos de blindagem (B0-B1) e desblindagem
(B0+B1) eletrônica da nuvem pi do anel aromático ... 69
Figura 43: Projeção de MAD de 1H com o espectro menos atenuado acima
para o composto 15 e os CSAs 1 (esquerda) e 2 (direita)... 70 Figura 44: Ampliação de espectros de RMN de 1H do composto 16 puro e
na presença de 4 CSAs diferentes. De baixo para cima: Sem CSA, moléculas 1, 2, 3 e 4. ... 71 Figura 45: Projeção de MAD de 1H com o espectro menos atenuado acima
para o composto 16 e os CSAs 1 (esquerda) e 2 (direita)... 71 Figura 46: Ampliação de espectros de RMN de 1H do composto 17 puro e
na presença de 4 CSAs diferentes. De baixo para cima: Sem CSA, moléculas 1, 2, 3 e 4. ... 72 Figura 47: Projeção de MAD de 1H com o espectro menos atenuado acima
para o composto 17 e os CSAs 1 (esquerda) e 2 (direita)... 72 Figura 48: Ampliação de espectros de RMN de 1H do composto 18 puro e
na presença de 4 CSAs diferentes. De baixo para cima: Sem CSA, moléculas 1, 2, 3 e 4. ... 73 Figura 49: Ampliação de espectros de RMN de 1H do composto 19 puro e
na presença de 4 CSAs diferentes. De baixo para cima: Sem CSA, moléculas 1, 2, 3 e 4. ... 74 Figura 50: Projeção de MAD de 1H com o espectro menos atenuado acima
para o composto 19 e os CSAs 3 (esquerda) e 4 (direita)... 75 Figura 51: Ampliação de espectros de RMN de 1H do composto 20 puro e
na presença de 4 CSAs diferentes. De baixo para cima: Sem CSA, moléculas 1, 2, 3 e 4. ... 75 Figura 52: Projeção de MAD de 1H com o espectro menos atenuado acima
para o composto 20 e os CSAs 1 (esquerda) e 2 (direita)... 76 Figura 53: Projeção de MAD de 1H com o espectro menos atenuado acima
para o composto 20 e os CSAs 3 (esquerda) e 4 (direita)... 76 Figura 54: Ampliação de espectros de RMN de 1H (abaixo, em azul) ou 1H{19F} (acima, em vermelho) do composto 21 puro e na presença de 1 ou 2... 79
Figura 55: 2'-flúor-1-feniletanol com destaque para a interação ηF19 →
Figura 56: Espectros de RMN de F do composto 21 puro e na presença de 5 CSAs diferentes. De baixo para cima: Sem CSA, moléculas 1, 2, 3, 4 e 5. ... 80 Figura 57: Projeção de MAD de 1H (esquerda) e 19F (direita) com o espectro
menos atenuado acima para o composto 21 e o CSAs 5... 81 Figura 58: Ampliação de espectros de RMN de 1H (esquerda) e 19F (direita)
do composto 22 puro e na presença de 5 CSAs diferentes. De baixo para cima: Sem CSA, moléculas 1, 2, 3, 4 e 5. ... 82 Figura 59: Projeção de MAD de 1H com o espectro menos atenuado acima
para o composto 22 e os CSAs 1 (esquerda) e 2 (direita)... 82 Figura 60: Projeção de MAD de 1H com o espectro menos atenuado acima
para o composto 23 e os CSAs 1 (esquerda) e 2 (direita)... 83 Figura 61: Projeção de MAD de 19F com o espectro menos atenuado acima
para o composto 22 e os CSAs 1 (esquerda) e 2 (direita)... 83 Figura 62: Projeção de MAD de 19F com o espectro menos atenuado acima
para o composto 23 e os CSAs 1 (esquerda) e 2 (direita)... 84 Figura 63: Projeção de MAD de 1H (esquerda) e 19F (direita) com o espectro
menos atenuado acima para o composto 22 e o CSAs 5... 85 Figura 64: Projeção de MAD de 1H (esquerda) e 19F (direita) com o espectro
menos atenuado acima para o composto 23 e o CSAs 5... 85 Figura 65: Ampliação de espectros de RMN de 1H do composto 24 puro e
na presença de 4 CSAs diferentes. De baixo para cima: Sem CSA, moléculas 1, 2, 3 e 4. ... 86 Figura 66: Projeção de MAD de 1H com o espectro menos atenuado acima
para o composto 24 e os CSAs 1 (esquerda) e 2 (direita)... 87 Figura 67: Ampliação de espectros de RMN de 1H do composto 25 puro e
na presença de 4 CSAs diferentes. De baixo para cima: Sem CSA, moléculas 1, 2, 3 e 4. ... 87 Figura 68: Projeção de MAD de 1H com o espectro menos atenuado acima
para o composto 25 e os CSAs 1 (esquerda) e 2 (direita)... 88 Figura 69: estruturas das bases utilizadas nos testes de formação de um complexo diastereoisomérico ternário ... 89 Figura 70: Ampliação de espectros de RMN de 1H do composto 13 puro e
em quatro condições diferentes. De baixo para cima: Sem CSA, na presença das moléculas 2, 2 e 27, 2 e 28, 2 e 29. ... 90
Figura 71: Ampliação de espectros de RMN de 1H do composto 13 puro e
nas cinco condições descritas na Tabela 4. De baixo para cima: Sem CSA, amostra 1, 2, 3, 4 e 5. ... 91 Figura 72: Projeção de MAD de 1H com o espectro menos atenuado acima
para o composto 13 e os CSAs 2 e 27 (amostra 1,Tabela 4) ... 93 Figura 73: Projeção de MAD de 1H com o espectro menos atenuado acima
para o composto 13 e os CSAs 2 e 27 (amostra 2,Tabela 4) ... 93 Figura 74: Projeção de MAD de 1H com o espectro menos atenuado acima
para o composto 13 e os CSAs 2 e 27 (amostra 3, Tabela 4) ... 94 Figura 75: Projeção de MAD de 1H com o espectro menos atenuado acima
para o composto 13 e os CSAs 2 e 27 (amostra 4, Tabela 4) ... 94 Figura 76: Projeção de MAD de 1H com o espectro menos atenuado acima
para o composto 13 e os CSAs 2 e 27 (amostra 5, Tabela 4) ... 95 Figura 77: Oxocano estudado que apresenta o efeito Perlin ... 96 Figura 78: Representação das estruturas das moléculas utilizadas no artigo ... 97
Figura 79: Gráfico de dispersão da constante de acoplamento (J-coupling) versus energia de hiperconjugação dos valores calculados para as moléculas da Figura 78. ... 98 Figura 80: Sequência de pulsos PFGSE separada em 5 partes ... 115
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Valores de coeficiente de difusão (× 10-10 m2s-1) para
determinados valores de NS e TD ... 53 Tabela 2: Amostras preparadas contendo mentol e BINOL em diferentes quantidades ... 57 Tabela 3: amostras preparadas contendo cânfora e BINOL em diferentes quantidades ... 59 Tabela 4: Amostras preparadas em CDCl3 contendo ácido mandélico (13),
(S)-BINOL (2) e DMAP (27) em diferentes proporções. ... 91 Tabela 5: Valores medidos e calculados de 1J
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ... 20
1.1 QUIRALIDADE ... 20
1.2 RESSONÂNCIA MAGNÉTICA NUCLEAR ... 29
1.3 MEDIDAS DE DIFUSÃO POR RMN ... 29
1.4 MAD ... 36
1.5 IDENTIFICAÇÃO DE ENANTIÔMEROS POR RMN ... 37
1.6 BINOL ... 39 2 METODOLOGIA ... 41 2.1 MOLÉCULAS TRABALHADAS ... 41 2.2 PARÂMETROS EXPERIMENTAIS ... 43 3 RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 44 3.1 PARÂMETROS EXPERIMENTAIS ... 44 3.1.1 Variação de solvente ... 44 3.1.2 Concentração de CSA... 46 3.1.3 Potência do desacoplador ... 47 3.1.4 Temperatura ... 48 3.1.5 Parâmetros de aquisição... 52
3.2 SEPARAÇÃO DE SINAIS DE ENANTIÔMEROS ... 55
3.2.1 Analitos 10 e 11 (mentol) ... 57
3.2.2 Analito 12 (cânfora) ... 59
3.2.3 Analito 13 (ácido mandélico) ... 62
3.2.4 Analitos derivados do 1-feniletanol (14-20) ... 66
3.2.5 Analitos 21-23 (R = 2'-, 3'- ou 4'-F) ... 78
3.2.6 Analitos 24, 25 e 26 ... 85
4 TRABALHO DESENVOLVIDO EM PARARELO ... 96
5 CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS FUTURAS ... 99
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...101
1.1 QUIRALIDADE
1 INTRODUÇÃO
1.1 QUIRALIDADE
A quiralidade é uma propriedade molecular que fascina cientistas desde o seu descobrimento e sua origem na natureza ainda é incerta. Dúvidas como por que a natureza cria L-aminoácidos e D-açúcares e não o contrário, ou simplesmente uma mistura racêmica em ambos os casos ainda intrigam os pesquisadores. Questões relacionadas a quiralidade de compostos remontam ao início do século XIX, onde o cristalógrafo René-Just Haüy estudou cristais de quartzo e verificou que os cristais possuíam pequenas facetas não observadas anteriormente e observou também que alguns cristais eram inclinados para a esquerda e outros para a direita (Figura 1), porém Haüy não se atentou que estes cristais eram imagens especulares não sobreponíveis (ou enantiomorfos), possivelmente devido à qualidade da cristalização que não permitiu a observação de detalhes de cada face do cristal. [1]
Figura 1: Cristais de quartzo observados por Haüy. A) Forma cristalina até então relatada. B e C) Cristais de quartzo observados por Haüy com facetas apontando para a esquerda (B) e para a direita (C).
Dois anos depois, Jean-Baptiste Biot sem saber dos trabalhos de Haüy, cortou lâminas de cristais de quartzo e verificou, com o polarímetro que ele mesmo inventou, que algumas lâminas desviavam a luz para a esquerda (levorrotatórias) e outras para a direita (dextrorrotatórias) e a intensidade do desvio da luz dependia da grossura das lâminas. Em 1815, Biot publicou seus estudos com diversas substâncias que desviavam a luz polarizada (como cânfora e soluções de açúcares) e que não precisavam ser cristais. Líquidos puros, soluções e até mesmo compostos na fase gasosa também desviavam a luz polarizada. A descoberta mais interessante foi que esta luz sofria desvios quando atravessava soluções de ácido tartárico (Figura 2A), enquanto soluções de ácido racêmico (Figura 2B), que possui a mesma composição química, não desviavam a luz.
Figura 2: Estruturas das moléculas de A) D-Ácido tartárico e B) Ácido racêmico (forma racêmica do ácido tartárico)
Então Biot, considerado o pai da polarimetria, verificou que algumas substâncias naturais como glicose, nicotina e sucrose rotacionavam o plano da luz polarizada e outras substâncias não. Mas foi somente em 1821 que Sir John Herschel comparou os trabalhos de Haüy e Biot e percebeu que os cristais de quartzo que apontavam para a esquerda desviavam a luz para um lado e os cristais que apontavam para a direita, desviavam a luz para o outro. Esta foi a primeira vez que a direção da rotação da luz polarizada foi correlacionada com uma propriedade macroscópica.
Mas o conceito de quiralidade na química foi conhecido somente devido aos trabalhos de Louis Pasteur com o ácido tartárico. Após diversos trabalhos de Joseph Louis Gay-Lussac, Jöns Jacob Berzelius, Justus von Liebig e Friedrich Wöhler com relação à isomeria de compostos e Eilhardt Mitscherlich juntamente com Biot com relação às propriedades óticas de cristais, Pasteur estudou uma série de sais do ácido tartárico e do ácido racêmico e verificou que os cristais dos sais de ácido tartárico
1.1 QUIRALIDADE
possuíam facetas hemiédricas1 e eram dextrorrotatórias enquanto os cristais dos sais
do ácido paratartárico eram holoedros2 e oticamente inativos, com uma exceção, o
paratartarato de sódio e amônio que também possuía facetas hemiédricas. Como este caso era diferente dos outros, Pasteur investigou estes cristais com mais cautela e percebeu duas estruturas cristalinas diferentes e que eram imagens especulares não sobreponíveis entre si, ou seja, dois cristais enantiomorfos.
Como os cristais eram grandes e bem formados, Pasteur pôde separá-los manualmente e então, medir o desvio ótico das soluções dos cristais no polarímetro construído por Biot. Com essas medidas, Pasteur verificou que cada solução desviava a luz para um lado e na mistura das soluções não era observado desvio da luz. Esse foi o início do estudo da quiralidade e somente em 1884 que Lorde Kelvin cunhou os termos quiralidade e quiral, derivados do grego “cheir” que significa mão e as mãos por sua vez, são os exemplos mais comuns de imagens especulares não coincidentes, mas que possuem as mesmas propriedades.3 No caso de moléculas, os enantiômeros
possuem as mesmas propriedades físicas e químicas, com exceção da interação com um plano de luz polarizada ou ainda com outras moléculas quirais.
Na natureza existem diversos relatos da importância da enantiodiferenciação, por exemplo, o composto 1,7-dioxaespiro[5.5]undecano é o feromônio sexual produzido pelas moscas-das-frutas (Drosophila melanogaster), o enantiômero (R) atrai os machos enquanto o enantiômero (S) atrai as fêmeas. Nossas papilas gustativas conseguem diferenciar os enantiômeros do adoçante Aspartame, que é composto pelas formas L da fenilanalina e do ácido aspártico, enquanto seus enantiômeros não possuem gosto. Nosso sistema olfativo também diferencia enantiômeros de diversas moléculas como da carvona, que na forma (R) possui aroma de hortelã (Mentha spicata) e na forma (S) possui aroma de cominho (Carum carvi) e do limoneno, que poussui aroma de laranja na forma (R) e aroma de limão na forma (S) (Figura 3). [2]
1Um cristal hemiédrico é aquele que tem metade da estrutura semelhantes a uma forma
cristalina. Ou ainda, que possui metade das faces para formar uma estrutura de simetria completa, como o tetraedro em relação ao octaedro.
2 Possui todas as faces geometricamente iguais.
3 Para mais informações com relação à história do estudo da assimetria e quiralidade,
Figura 3: Estruturas dos compostos 1,7-dioxaespirot[5.5]undecano, carvona, limoneno e aspartame
Nos medicamentos, diversos enantiômeros possuem ação mais forte do que outros. Por exemplo o L-metotrexato, de configuração (S), é melhor absorvido que o D-metotrexato, de configuração (R), no tratamento de doenças autoimunes (Figura 4). Já a S-varfarina é mais potente que o enantiômero (R) e no corpo humano, estes enantiômeros passam por vias metabólicas diferentes.
1.1 QUIRALIDADE
Em ambos os casos as vias metabólicas (de hidroxilação) principais estão destacadas em vermelho e as secundárias em azul. A forma (S) é metabolizada mais facilmente hidroxilando o carbono 7 (em vermelho) enquanto a via metabólica secundária ocorre pelos carbonos 6 e 4' (em azul), já a forma (R) é oxidada mais facilmente nos carbonos 6, 8 e 10 (em vermelho) e com média facilidade nos carbonos 7 e 4' (em azul) (Figura 5). [3]
Figura 5: Estruturas da (S) e (R)-varfarina com destaque para os carbonos que sofrem hidroxilação pela via metabólica principal (em vermelho) e pela via metabólica secundária (em azul)
Porém, em alguns medicamentos, o isômero que não apresenta a atividade desejada (distômero) não é simplesmente inativo ou ainda apenas menos ativo que o isômero principal (eutômero), a presença do outro enantiômero pode ser responsável inclusive por efeitos adversos de medicamentos. A penicilamina só pode ser comercializada na forma (S) para tratamento de reumatismo e como quelante, pois sua forma (R) inibe a ação da vitamina B6 (piridoxina) e pode levar a problemas de pele, anemia, danos no sistema nervoso e convulsões.
Outro exemplo intrigante é o caso da talidomida, que é possivelmente o exemplo mais clássico na história dos medicamentos quirais. Após a Segunda Guerra Mundial, diversas pessoas tinham problemas para dormir e a talidomida surgiu como um medicamento indutor do sono dado como seguro principalmente por ser não barbitúrico, ou seja, não induzir a depressão do sistema nervoso central. Logo após o surgimento na Alemanha em 1957, este medicamento era comercializado sem a necessidade de prescrição médica, pois era considerado inofensivo e em 1960, já era comercializado em 46 países. Como este medicamento era muito famoso, o obstetrista australiano William McBride descobriu que poderia prescrever a talidomida para enjoos, porém os testes clínicos nunca foram feitos em animais no período
gestacional e em 1961 o medicamento foi banido do mercado após aproximadamente 10000 crianças nascerem com membros defeituosos. Após alguns testes, foi descoberto que o enantiômero (R) (eutômero) é sedativo, indutor do sono e alivia enjoos, porém o enantiômero (S) (distômero) é teratogênico. Ainda, a parte mais crítica da administração da talidomida decorrente da acidez do hidrogênio destacado
em vermelho (Figura 6). Como este hidrogênio é bastante ácido, a molécula pode ser
desprotonada facilmente gerando um carbocátion, que é planar. Ao ser protonada novamente, o hidrogênio pode entrar por qualquer face do carbocátion, gerando uma mistura de enantiômeros. Ou seja, independentemente da forma administrada, o composto é racemizado no organismo. Atualmente, a talidomida é utilizada para casos específicos de tratamento de câncer nas células plasmáticas e hanseníase. Após este incidente, passou a ser obrigatório o teste com cada enantiômero separadamente de novas drogas antes da comercialização. [2]
Figura 6: Estruturas dos compostos (R) e (S)-talidomida com destaque para o hidrogênio que pode ser desprotonado, levando à racemização do composto.
Quando se trata de quiralidade, é importante a distinção dos termos centro quiral e unidade estereogênica. O termo unidade estereogênica é mais genérico e pode ser caracterizado por um ponto em uma molécula onde a troca de posição de dois grupos entre si, leva a um estereoisômero. Já um centro quiral é um caso específico de unidade estereogênica onde a troca de posição de dois substituintes ligados a um átomo leva à uma imagem especular da primeira molécula não sobreponível com esta. Como exemplo, o composto E-2-buteno possui duas unidades estereogênicas, os carbonos 2 e 3, que se dois dos substituintes de um desses carbonos forem trocados, gera-se o composto Z-2-buteno (Figura 7), mas esse composto não possui centro quiral, pois a troca destes substituintes não leva à imagem especular do composto original.
1.1 QUIRALIDADE
Figura 7: Estruturas das moléculas E e Z-2-buteno evidenciando os substituintes do carbono 2
Compostos orgânicos quirais são facilmente reconhecidos, pois normalmente possuem ao menos um carbono com quatro ligantes diferentes. Um exemplo é o 1-feniletanol, onde o carbono benzílico possui 4 substituintes diferentes e, portanto, é assimétrico. Se uma das formas do 1-feniletanol for colocada em frente a um espelho, a imagem gerada não é sobreponível com a molécula original, é o enantiômero desta (Figura 8).
Figura 8: Estruturas das moléculas (S)-1-feniletanol e de sua imagem especular, o composto (R)-1-feniletanol
Porém não é necessária a presença de um carbono com 4 substituintes diferentes para que a molécula seja quiral, um exemplo são os alenos. Na Figura 9 estão representadas as moléculas 1,3-dicloro-1,2-propadieno evidenciando que a rotação da molécula de configuração (R) em qualquer eixo não leva à molécula de configuração (S), pois uma é a imagem especular da outra.
Figura 9: Estruturas das moléculas (R)-1,3-dicloro-1,2-propadieno e (S)-1,3-dicloro-1,2-propadien
Outro exemplo bastante importante é o dos atropoisômeros como a bifenila ortossubstituída (Figura 10A). Este composto possui uma ligação simples unindo os dois anéis aromáticos que pode rotacionar livremente, porém devido à presença dos substituintes na posição orto, a barreira energética para a rotação é alta fazendo com que os dois confôrmeros sejam enantiômeros entre si. Este mesmo raciocínio serve para os compostos contendo um substituinte binaftil como BINOL e BINAP (Figura 10B, R1=R2=OH ou R1=R2=PPh2, respectivamente), nestes compostos um naftil é
ligado ao outro por uma ligação simples que pode rotacionar, porém, esta rotação não é totalmente livre. Conforme a ligação simples é rotacionada, o impedimento estérico
1.1 QUIRALIDADE
entre os substituintes na posição 2 de cada naftil aumenta, fazendo com que o ângulo diedro entre os carbonos 2-1-1'-2' seja sempre maior que 0º e menor que 180º.
O interesse em estudos de moléculas quirais abrange diversas áreas além do desenvolvimento de novas drogas como: estudo dos medicamentos nos organismos [4], controle de pragas [5], alimentos [6], agricultura [7] e sensores [8].
Sendo assim, se faz necessária a identificação correta de enantiômeros em mistura, que pode ser feita de diversas formas sendo que as mais utilizadas são técnicas cromatográficas, de raios-X, [α]D, dicroísmo circular eletrônico ou vibracional
e Ressonância Magnética Nuclear [9]. Das técnicas mais utilizadas, a RMN já se provou mais confiável e eficaz para a análise de diversos enantiômeros [10].
Figura 10: Exemplo de dois enantiômeros de bifenilas (A) e binaftilas (B) demonstrando que não é possível a interconversão das estruturas pela rotação da ligação simples
1.2 RESSONÂNCIA MAGNÉTICA NUCLEAR
A técnica de RMN é bastante recente. Os primeiros relatos da medição da ressonância de núcleos datam de 1938, feitos por Isidor Rabi, vencedor do prêmio Nobel de 1944 pelo seu método de ressonância para registro das propriedades magnéticas do núcleo atômico. Em 1941 Yevgeny Zavoisky, conhecido pelo descobrimento da ressonância paramagnética eletrônica, também observou as propriedades magnéticas do núcleo, mas acabou abandonando essa linha de pesquisa por acreditar que os resultados não eram replicáveis. Em 1946, Edward Purcell em Harvard [11] e Felix Bloch em Stanford [12] conseguiram simultaneamente reproduzir experimentos de RMN em sólidos e líquidos e dividiram o prêmio Nobel de física de 1952 pelo desenvolvimento de novos métodos de medições de precisão magnética nuclear e suas descobertas relacionadas.
Após mais de 70 anos de evolução, a RMN se tornou uma das melhores técnicas para elucidação estrutural de compostos puros em solução, uma vez que é possível extrair informações de conectividade atômica, estereoquímica relativa e em alguns casos, até mesmo estereoquímica absoluta [13] [14]. Porém a análise de compostos em mistura ainda é bastante laboriosa devido ao grande número de sinais e sobreposições, então uma alternativa é a utilização de metodologias de separação física das espécies via cromatografia acoplada à RMN [15] ou então a separação virtual utilizando técnicas de medida e processamento de dados de difusão Diffusion-Ordered NMR SpectrocopY, (DOSY). [16]
1.3 MEDIDAS DE DIFUSÃO POR RMN
O fenômeno da difusão ocorre devido ao movimento aleatório das moléculas em um meio impulsionado pela energia térmica do sistema, também chamado de movimento Browniano em homenagem a Robert Brown. Em um tubo de RMN com uma amostra isotrópica o deslocamento médio de todas as moléculas é 0, porém o deslocamento quadrático médio é diferente de zero e essa é a propriedade medida quando se fala em difusão.
1.2 RESSONÂNCIA MAGNÉTICA NUCLEAR
O fenômeno da difusão é descrito pela equação de Einstein-Stokes [17]:
𝐷 = 𝑘𝑇 6 𝜋 𝜇 𝑟𝑠
Onde D é o coeficiente de difusão, k é a constante de Boltzmann, T é a temperatura, µ é a viscosidade do meio e rs é o raio de uma esfera com propriedades análogas às
da molécula estudada.
A partir desta equação, é possível estabelecer uma relação entre o coeficiente de difusão e o tamanho da molécula, que é um parâmetro até então um pouco obscuro para a RMN, que fornecia informações "apenas" de deslocamento químico, constante de acoplamento e interações via espaço por NOE.
Porém, Evans e colaboradores comprovaram que os coeficientes de difusão estimados pela equação são diferentes dos valores obtidos por medidas de difusão via RMN para moléculas pequenas [18], ou seja, a relação entre o valor de D obtido via espectros de RMN e rs é meramente qualitativa: quanto maior a difusão
medida, maior deve ser a molécula quando comparada com outra analisada nas mesmas condições.
Experimentos para medir difusão são amplamente utilizados na literatura, para a identificação de compostos em misturas de diversas origens como metabólitos secundários, compostos supramoleculares e inclusive para a diferenciação de enantiômeros [19]. Existem diversas sequências de pulsos que podem ser utilizadas para medir a difusão de compostos e a maioria delas é baseada em gradientes de campo pulsado (PFG, do inglês Pulsed Field Gradient) [20] e independente da sequência utilizada, DOSY é originalmente uma forma de processamento dos dados obtidos a partir destas sequências, porém atualmente já se utiliza esta nomenclatura para experimentos de RMN utilizados para medir difusão.
A medida de difusão por RMN pode ser compreendida de maneira simplificada analisando uma situação idealizada do comportamento de um único spin em um campo magnético não homogêneo (Figura 11). Nesta sequência, que serve como modelo para as outras, a magnetização primeiramente se encontra alinhada com o campo magnético no eixo z, então sofre um pulso de 90º e vai para o plano xy.
No momento imediato após o pulso de 90º, o sinal detectado é máximo, uma vez que a magnetização não sofreu efeitos de decaimento de T1 e T2. No tempo entre os pulsos
de 90º e 180º ocorre a evolução da magnetização no plano xy e a difusão do spin. O pulso de 180º serve para refocalizar a evolução da magnetização, porém neste caso o campo não é homogêneo, e então a magnetização não é completamente refocalizada, resultando em um sinal com intensidade I < I0.
Figura 11: Representação de uma sequência de spin-eco para um spin. Figura 11A: sequência de pulsos spin-eco. Figura 11B: efeito dos pulsos na magnetização com o campo não homogêneo
Esse mesmo raciocínio pode ser estendido para situações reais, como uma das primeiras sequências para medir difusão, descrita por Stejskal e Tanner, que utiliza ecos de spin com gradientes de campo pulsado (PFGSE, do inglês Pulsed Field Gradient Spin Echo) [21]. Neste caso, o campo B0 é homogêneo e é aplicado um outro
campo magnético variado linearmente (um gradiente de campo) para criar a não homogeneidade (Figura 12).
1.3 MEDIDAS DE DIFUSÃO POR RMN
No tempo entre os pulsos de 90º e 180º a magnetização evolui no plano xy e na metade deste tempo, um pulso de gradiente é aplicado que codifica cada spin de maneira diferente, dependendo da sua posição em relação ao tubo de RMN. Os spins agora codificados, difundem pelo tubo, são refocalizados pelo pulso de 180º e então decodificados pelo segundo pulso de gradiente.
A codificação e decodificação de spins podem parecer complexas em um primeiro momento, porém os gradientes apenas defasam e refocalizam a magnetização. Para exemplificar esta influência, na Figura 13A está representada a sequência de PFGSE, já nos quadros B e C estão representados experimentos com Δ' igual a zero, ou seja sem tempo para as moléculas difundirem, e com Δ' maior que zero.
Figura 13: Ilustração da sequência de pulsos PFGSE com o efeito dos pulsos na intensidade do sinal.
Quando as moléculas não têm tempo para difundir (Figura 13B), os spins são codificados e decodificados rapidamente, ou seja, o efeito é igual à uma sequência sem os pulsos de gradiente. Com Δ' maior do que zero (Figura 13C), as moléculas têm tempo para difundir, fazendo com que o primeiro pulso de gradiente sentido por cada spin seja diferente do segundo pulso. Devido a esta diferença, a magnetização não é completamente refocalizada e assim, o sinal final é atenuado. Com o aumento da força do gradiente por incremento em um experimento de difusão, os sinais ficam cada vez mais atenuados e a difusão, de maneira concisa, pode ser medida a partir do ajuste do decaimento da intensidade dos sinais na equação de Stejskal e Tanner
[21] (a versão não tão concisa da dedução desta equação encontra-se nos apêndices):
rearranjada para
(1)
Onde é o coeficiente de difusão, e são as intensidades dos sinais inicial e após a atenuação por difusão, é a constante magnetogírica do núcleo, é a duração do pulso de gradiente, é a amplitude do gradiente e é o tempo de difusão corrigido devido ao tempo .
Esta sequência apresenta diversos problemas como: a atenuação dos sinais devido à difusão pode ser confundida com a atenuação devido à relaxação por T2, correntes residuais de gradiente podem distorcer a linha de base do espectro e
correntes de convecção podem aumentar os valores de difusão, visto que a convecção aumenta o movimento molecular [22]. Para minimizar estes efeitos, diversas sequências foram propostas [20] e para este trabalho foi escolhida a sequência oneshot45 [23] [24]. A oneshot45 (Figura 14) é derivada da sequência oneshot [25], que por sua vez é derivada da sequência BPPSTE (Bipolar Pulse Pair STimulated Echo) [20], mas com pulsos de balanceamento de gradiente antes e depois do período de difusão Δ. Esta adição de pulsos desbalanceados (1+α e 1-α) faz com que magnetizações que não foram refocalizadas pelo pulso de 180º sejam defasadas e não interfiram na análise.
1.3 MEDIDAS DE DIFUSÃO POR RMN
Figura 14: representação da sequência de pulsos Oneshot45 (os intervalos entre os pulsos estão fora de escala).
A Oneshot45 necessita apenas de 2 transientes por incremento, o que diminui bastante o tempo de experimento quando comparada a outras sequências. Além disso, a Oneshot45 consegue eliminar distorções nos sinais causadas por J-modulation devido ao pulso de 45º no final da sequência, que é responsável por transformar a magnetização anti-fase, resultante da evolução do acoplamento escalar, em termos não detectáveis diretamente. Botana e colaboradores demonstraram que a Oneshot45 é bastante eficaz para uma mistura de 1-propanol e 2-pentanol, assim como para uma mistura mais complexa contendo quinina, geraniol e canfeno [23].
Em um experimento de medidas de difusão, as durações do tempo de difusão e do pulso de gradiente são constantes e a cada incremento a força do gradiente aumenta, resultando em sinais cada vez mais atenuados. Após a obtenção de todos os incrementos, tem-se os valores das constantes utilizadas assim como os valores de I e I0 e então é possível calcular o valor de D. Neste trabalho todos os
espectros foram processados utilizando os programas TopSpin 3.5 em conjunto com o Origin 8.1 e utilizando o programa GNAT. [26]
Na Figura 15 a seguir estão representados espectros de RMN de 1H de
uma mistura de treonina, fenilalanina e glicina em D2O, obtidos utilizando a sequência
Oneshot45 com 16 pontos de gradiente crescente. Quando são comparados o primeiro e o último ponto, é possível perceber que todos os sinais sofrem atenuação, mas alguns sinais são mais atenuados que outros. Fazendo o ajuste do decaimento de cada sinal na equação (1), é obtido o coeficiente de difusão para cada sinal, que pode ser exibido em um mapa bidimensional de deslocamento químico versus
coeficiente de difusão. Assim, cada sinal é correlacionado com um valor de coeficiente de difusão e então, os sinais do mesmo composto podem ser identificados.
Figura 15: Ilustração do processo de obtenção de um mapa de difusões. Primeiramente são obtidos os espectros de RMN 1D para então serem ajustados à uma equação e assim gerar o mapa 2D.
Nas medidas de difusão diversos fatores são inerentes à medida e podem ser contornados ou minimizados, como convecção, J-modulation e contaminação dos valores de D por relaxação T2, que já foram descritos. Porém as medidas de difusão
dependem do ajuste correto do decaimento exponencial dos sinais no espectro unidimensional. Para isso, os sinais devem estar com a maior dispersão possível, sem sobreposições para que não haja interferência de um sinal no outro nas medidas de difusão. Caso duas moléculas possuam sinais sobrepostos no espectro 1D, mas coeficientes de difusão distintos, é possível obter o valor de D de cada uma por meio de processamentos diferentes. [27] [28]
No exemplo citado, os três aminoácidos e o solvente possuem sinais separados no espectro de RMN de 1H e possuem coeficientes de difusão diferentes.
Por outro lado, se duas ou mais moléculas possuem sinais separados no espectro 1D e coeficientes de difusão similares, elas não serão diferenciadas. Para contornar esse problema, a adição de outro composto em conjunto com os analitos para a análise de difusão vem ganhando espaço nos últimos anos. [29]
1.4 MAD 1.4 MAD
A adição de um outro composto à mistura problema tem o intuito de fazer com que cada analito interaja de maneira diferente com o composto extra e com isso, modificar os coeficientes de difusão dos analitos. Esta técnica tem o nome de Matrix-Assisted DOSY (MAD) e consiste em adicionar um composto de forma que, idealmente, este composto interaja somente com um analito de uma mistura, aumentando o raio hidrodinâmico deste analito e assim possibilitando a diferenciação por difusão entre o complexo matriz-analito e o outro analito livre.
Nestes casos, o valor de difusão observado depende diretamente da interação do analito com a matriz, ou seja, o Dobservado é ponderado pelos valores de
Danalito livre e complexado obedecendo à equação:
𝐷𝑜𝑏𝑠𝑒𝑟𝑣𝑎𝑑𝑜 = 𝑥 𝐷𝑎𝑛𝑎𝑙𝑖𝑡𝑜 𝑙𝑖𝑣𝑟𝑒+ 𝑦 𝐷𝑎𝑛𝑎𝑙𝑖𝑡𝑜 𝑐𝑜𝑚𝑝𝑙𝑒𝑥𝑎𝑑𝑜
Onde x e y são as respectivas frações molares.
Diversos autores já utilizaram a técnica de MAD como, por exemplo, na separação de flavonoides utilizando SDS (dodecilsulfato de sódio) [30], monoterpenos e flavonoides comparando os surfactantes Brij e SDS e afirmando que a separação utilizando Brij foi melhor para este caso [31], discriminação de o-, m-, e p-metoxifenóis utilizando SDS [32] e ainda a comparação de SDS e AOT (1,4-bis(2-etilexil)sulfosuccinato) que formam micelas diretas e reversas respectivamente, na separação de álcoois alifáticos e o-, m-, e p-metoxifenóis. [33]
Recentemente a utilização de MAD foi relatada na literatura com o emprego de compostos perfluorados para separação de aminoácidos em diversos valores de pH [34], a separação de ácidos carboxílicos utilizando micelas do surfactante CTAB que não aparecem no espectro de RMN devido à uma modificação na sequência de pulsos [35] e de flavonoides glicosilados utilizando SDS. [36]
Contudo esses experimentos são limitados pela disponibilidade de compostos compatíveis com os analitos. [37] Neste tipo de experimento, os sinais de cada molécula no espectro de 1H são separados baseando-se na diferença do
nos coeficientes de difusão são suficientes para que sejam obtidos espectros separados de cada substância.
Porém, enantiômeros possuem o mesmo deslocamento químico e o mesmo coeficiente de difusão em uma mesma solução, sendo então necessário adicionar uma matriz como surfactantes, polímeros e ciclodextrinas, que por sua vez, interajam de maneira diferente com cada enantiômero separando os sinais na dimensão do 1H, possibilitando assim a separação na dimensão da difusão. [16] [38]
1.5 IDENTIFICAÇÃO DE ENANTIÔMEROS POR RMN
Utilizando a espectroscopia de RMN de 1H com o auxílio de compostos
enantiomericamente puros, alguns autores já relataram a separação de enantiômeros principalmente via uma reação para que ocorra a formação de diastereoisômeros e assim facilitar a identificação. Alguns dos reagentes de derivatização mais utilizados são conhecidos como reagente de Mosher: MTPA (ácido α-metoxi-α-trifluorometil-α-fenilacético), MPA (ácido metoxiα-metoxi-α-trifluorometil-α-fenilacético), entre outros derivados, que são bastante úteis para determinação da configuração absoluta de álcoois, aminas, ácidos carboxílicos e sulfóxidos, que possuem grupos funcionais adequados para a formação do diastereoisômero. Na presença destes compostos, o grupo funcional ligado ao centro estereogênico da molécula é derivatizado formando o produto correspondente (álcoois formando ésteres, aminas formando amidas, ácidos carboxílicos formando metil ésteres ou amidas e sulfóxidos formando N-(metoxifenilacetil)sulfoximinas) e após a reação, são adquiridos os espectros dos diastereoisômeros resultantes. A determinação da configuração absoluta é feita por meio da correlação entre o centro estereogênico do composto de interesse e do reagente auxiliar, de acordo com o deslocamento químico dos hidrogênios da molécula. [13] [14]
Porém a utilização de ácidos (ou cloretos de ácidos) de Mosher é uma alternativa inviável se for levado em consideração que a amostra é derivatizada, ou seja, passa por uma reação química para formação de outra espécie, e para ser
1.5 IDENTIFICAÇÃO DE ENANTIÔMEROS POR RMN
recuperada é necessária outra reação seguida de purificação. Ainda, o custo dos reagentes é alto4 o que inviabiliza o uso rotineiro desta técnica.
Uma alternativa à reação química para gerar o diastereoisômero é utilizar um agente de solvatação quiral (CSA, Chiral Solvating Agent), o qual levará a formação de um complexo diastereoisomérico, possibilitando a diferenciação e quantificação dos enantiômeros. Porém, Parella e colaboradores demonstraram que apesar destes agentes quirais serem de fácil preparo e não induzirem o aumento da largura dos sinais no espectro de RMN de 1H, a diferenciação dos sinais de cada
enantiômero não é uniforme para os hidrogênios e, principalmente, a diferença no deslocamento químico dos sinais resultantes é pequena, causando sobreposição e dificultando a identificação e integração de cada sinal. [39]
Apesar de diversos autores relatarem em trabalhos recentes a discriminação quiral por RMN [40,41,42], a separação de enantiômeros utilizando a técnica MAD ainda é pouco relatada na literatura, mas os relatos encontrados demonstram o potencial da técnica, porém com a utilização de auxiliares caros ou de rota sintética complexa. Por exemplo, Chaudhari e colaboradores publicaram a utilização de um éter de coroa para a separação de diversos compostos com centro estereogênico [43], Uccello-Barretta e colaboradores relataram a derivatização de uma β-ciclodextrina para a discriminação de α-aminoácidos fluorados [44] e Adams e colaboradores utilizaram a β-ciclodextrina para diferenciar epímeros da naringina [45]. Recentemente, Ito e colaboradores utilizaram derivados de bisuréia como agentes quirais na diferenciação de diversos ânions quirais [46].
Porém, cada um destes CSAs apresenta alguma desvantagem notável como a necessidade de sintetizar o CSA para poder utilizá-lo ou quando é disponível comercialmente, o CSA é bastante caro ou ainda apenas solúvel em água. Assim, a busca por um CSA solúvel em solventes orgânicos, de fácil aquisição e que sirva para todos os analitos é constante. Neste sentido, o BINOL pode ser uma boa opção.
4 Os ácidos (R) e (S) custam por volta de 1500,00 reais o grama, enquanto os cloretos de
ácido custam por volta de 6000,00 reais o grama (preços retirados de www.sigmaaldrich.com em 03/02/2019).
1.6 BINOL
A molécula de BINOL (1,1’-Bi-2-naftol, Figura 10B) desde 1990 está entre os ligantes quirais mais utilizados em reações, em grandes quantidades ou como catalisador assimétrico, que resultam em produtos quirais [47]. A pesquisa com o BINOL e derivados ganhou tamanha importância que Noyori e Knowles dividiram o prêmio Nobel de química em 2001 pelo estudo de hidrogenações assimétricas envolvendo o BINAP como catalisador, um derivado do BINOL. [48]
Atualmente derivados do BINOL são relatados em diversas aplicações como sensores [49,50], catalisador homogêneo em sínteses [51,52] e auxiliar quiral em resoluções cinéticas de misturas racêmicas [53].
Em RMN, o BINOL e seus derivados já vêm sendo usados como moléculas que induzem a separação de enantiômeros formando complexos diastereoisoméricos, como por exemplo, BINOL para discriminação do anti-histamínico prometazina [54]. Neste caso, os autores utilizaram proporções diferentes de (S)-BINOL em relação ao fármaco e verificaram que com mais BINOL, a separação dos sinais de uma das metilas da molécula alvo é melhor (Figura 16).
Figura 16: Espectros de RMN de 1H da prometazina pura (acima, em roxo) e com quantidades
crescentes de (S)-BINOL demonstrando que a separação entre os sinais aumenta com o aumento da quantidade de BINOL. Figura adaptada da referência 54.
1.6 BINOL
Além de fármacos, o BINOL foi utilizado para a separação dos sinais de três isoflavonas [55], e também em conjunto com uma base orgânica para a discriminação de hidrogênios de centros assimétricos α-carboxílicos [56] (Figura 17). Na grande maioria dos estudos, as moléculas são de síntese complexa e são aplicáveis para apenas alguns tipos de analitos quirais. Assim, as moléculas de BINOL e BINAP são boas alternativas a serem estudadas como CSA em experimentos de MAD.
Figura 17: Estruturas das isoflavonas que foram enantiodiscriminadas utilizando BINOL (referência 55) e do complexo ternário de BINOL, DMAP e do analito (referência 56)
Então, o objetivo principal deste trabalho foi avaliar a interação de matrizes quirais com diversos analitos com relação à separação de sinais em RMN de analitos racêmicos ou enantioenrriquecidos (proporções de enantiômeros diferentes de 1:1) utilizando a metodologia MAD.
2 METODOLOGIA
2.1 MOLÉCULAS TRABALHADAS
Foram utilizados 9 CSAs, sendo estes BINOL (1), (S)-BINOL (2), (R)-BINAP (3) (S)-(R)-BINAP (4), (R)-Macrociclo-1 (5), TADDOL (6), composto análogo ao TADDOL e ao DINOL, chamado aqui de α-DINOL (7), acetato de celulose (8) e acetato/ftalato de celulose (9) para a separação dos enantiômeros dos analitos. Quanto aos analitos, foram testados 17 analitos em misturas racêmicas ou enantioenrriquecidas, sendo eles: (+)-mentol (10), (-)-mentol (11), cânfora com excesso enantiomérico da espécie (R) (12), ácido mandélico (13), 1-feniletanol (14), 2’, 3’ e metoxi-1-feniletanol (15-17), 2’, 3’ e nitro-1-feniletanol (18-20), 2’, 3’ e 4’-fluoro-1-feniletanol (21-23) metilsulfinilbenzeno (fenilmetilsulfóxido) (24), 1-feniletilamina (25) e α-pineno (26) (Figura 18).
Produtos comerciais de pureza analítica foram empregados nos procedimentos e purificados previamente quando necessário.
Os compostos 14 a 23 foram obtidos reduzindo a carbonila da acetofenona correspondente usando 1,2 g da acetofenona (aproximadamente 10 mmol) e 12 mmols de LiAlH4 em THF a 0 ºC. As reações foram monitoradas por cromatografia de
camada delgada e interrompidas com adição de água quando não havia mais a presença da mancha referente ao reagente. O produto bruto foi extraído, seco e purificado quando necessário utilizando técnicas cromatográficas em coluna “flash” [57] empacotada com 15 cm de sílica gel 60G de granulometria 230-400 mesh.
Todas as reações foram monitoradas via cromatografia em camada delgada (CCD) empregando placas de alumínio de 2,5 cm por 5,0 cm, revestidas com sílica gel contendo indicador fluorescente comerciais. A revelação das cromatoplacas se deu em câmara com radiação ultravioleta, com solução de ácido sulfúrico em etanol e água ou com solução de vanilina.
As amostras de RMN foram preparadas utilizando 8,0 µmol do analito e 41,0 µmol dos CSAs 1-4 ou 8,0 µmol de 5 em 300 µL de CDCl3 em tubos de RMN de
2.1 MOLÉCULAS TRABALHADAS
2.2 PARÂMETROS EXPERIMENTAIS
As medidas de difusão foram feitas em um equipamento Bruker AVANCE-III de 11,74 Tesla, operando a 499,87 MHz para 1H e 470,29 MHz para 19F, equipado
com uma sonda SmartProbe BBO de 5 mm, com gradiente no eixo z.
A sequência de pulsos escolhida foi a Oneshot45 para os núcleos de 1H e 19F. Os dados foram adquiridos com 32 incrementos de gradiente, 32k pontos, 32
varreduras (scans) e 32 varreduras falsas (dummy scans). O tempo para recuperação do gradiente (d16) e a duração do pulso de purga (p19) foram fixados em 0,2 e 0,6 ms respectivamente. O fator de desbalanceamento dos gradientes (cnst14) foi fixado em 0,2 para todos os casos. O tempo de difusão Δ (d20) e o tempo de duração dos pulsos de gradiente de codificação e decodificação δ (p30) foram otimizados para cada amostra. Os experimentos foram feitos a 25 ºC a não ser quando o efeito da variação da temperatura foi avaliado.
Os dados de difusão foram processados de diversas maneiras diferentes utilizando o programa TopSpin 3.7 juntamente com o Origin 8.1 e o programa GNAT. Utilizando o GNAT é possível aplicar a deconvolução dos sinais por um sinal de referência (reference deconvolution [58]) de maneira mais direta que o TopSpin, facilitando bastante a análise e apresentando resultados mais confiáveis, assim estes dados serão apresentados. Os erros apresentados nas tabelas e figuras são os erros estimados do procedimento de ajuste do decaimento exponencial dos sinais de interesse.
As amostras foram preparadas utilizando uma matriz e um analito dissolvidos em 300 µL de CDCl3 e utilizando tetrametilsilano como referência (0,00
3.1 PARÂMETROS EXPERIMENTAIS. 3.1.1VARIAÇÃO DE SOLVENTE
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1 PARÂMETROS EXPERIMENTAIS
Para garantir as melhores condições possíveis de análise, primeiramente foram variados diversos parâmetros experimentais como a polaridade do solvente, temperatura, potência do desacoplador em sequências de pulso para detectar 19F{1H},
concentração de CSA e parâmetros de aquisição como número de varreduras (NS) e número de incrementos de gradiente (TD), que serão discutidos a seguir.
3.1.1 VARIAÇÃO DE SOLVENTE
A escolha do solvente é primordial para a análise de RMN, uma vez que os analitos e o CSA devem estar completamente solúveis dentro do tubo de RMN. Então, solventes com alta capacidade de solubilização são preferíveis.
Para análises de difusão, deve-se considerar também a viscosidade dos solventes, uma vez que em solventes mais viscosos existem menos correntes de convecção que atrapalham as medidas, como discutido anteriormente.
Foram testados 6 solventes deuterados quanto à separação de sinais do grupo metila do analito 23 complexado com a matriz 1: metanol, acetona, acetonitrila, diclorometano e clorofórmio. A amostra em clorofórmio foi a que apresentou a melhor separação dos sinais nos espectros de RMN de 1H e 19F{1H} (Figura 19).
Figura 19: Mistura racêmica do 4'-flúor-1-feniletanol e (S)-BINOL em diferentes solventes. A) Espectro de RMN de 1H e B) Espectro de RMN de 19F{1H}
Este resultado é um indício de que a interação entre o CSA e o analito não é estável em solventes polares, uma vez que embora estes solventes solubilizem melhor os analitos e os CSAs, essa maior capacidade de solubilização se deve à melhor solvatação, que ocorre principalmente via ligações de hidrogênio. As ligações de hidrogênio entre o solvente e as espécies competem com as ligações de hidrogênio entre o analito e o CSA, diminuindo a eficiência da enantiodiscriminação. Ou seja, para as análises de interações intermoleculares, é necessário que o solvente solubilize completamente o analito e o CSA mas que as interações intermoleculares (analito-CSA) prevaleçam sobre a solvatação. Sendo assim, o clorofórmio deuterado foi utilizado nas análises subsequentes por ser possível observar a interação entre os compostos e por ser a opção mais econômica quando comparado com diclorometano deuterado. Como o clorofórmio é um solvente de baixa viscosidade, foram utilizados tubos de RMN de 3 mm para minimizar o efeito das correntes de convecção [22].
3.1 PARÂMETROS EXPERIMENTAIS. 3.1.2CONCENTRAÇÃO DE CSA 3.1.2 CONCENTRAÇÃO DE CSA
Além do solvente, outro parâmetro importante no preparo da amostra é a concentração de CSA. Para medir a concentração ideal, foram preparadas 6 amostras variando a proporção molar de BINOL em relação à cânfora de 0 até 5, o que representa aproximadamente 0, 2, 4, 6, 8 e 10 mg de BINOL para 1 mg de cânfora enantioenrriquecida em 300 µL de CDCl3. Com isso, verificou-se que quanto mais
BINOL, melhor é a separação dos enantiômeros da cânfora até o limite testado, devido ao limite de solubilidade do CSA em CDCl3 (Figura 20).
Dentro do tubo de RMN tem-se um equilíbrio de complexação onde coexistem espécies livres e espécies complexadas. A concentração das espécies afeta diretamente o equilíbrio de complexação, então quanto mais CSA, maior será a quantidade de cânfora complexada, fazendo com que aumente a separação entre os sinais de cada complexo diastereoisoméricos.
Figura 20: Espectros de RMN de 1H de: misturas de (R)-BINOL e cânfora enantioenrriquecida
(esquerda) e (S)-BINOL e cânfora enantioenrriquecida (direita) com concentrações crescentes de BINOL.
3.1.3 POTÊNCIA DO DESACOPLADOR
O desacoplador é uma parte fundamental da sequência de oneshot45 de
19F, pois ele suprime os acoplamentos heteronucleares H-F, fazendo com que os
sinais de flúor apareçam como singletos no espectro de RMN, considerando que o flúor não esteja acoplado com mais nenhum outro núcleo além do hidrogênio. Porém, para que ocorra o desacoplamento é necessário aplicar um pulso com uma certa potência durante a aquisição e este pulso pode vir a aquecer a amostra.
Então, para a aquisição de espectros de 19F{1H} é aconselhável calibrar a
potência do desacoplador, uma vez que quanto menor a potência utilizada, menor é a variação de temperatura da amostra e assim, menor é a corrente de convecção dentro do tubo, uma vez que o tempo de aquisição é de 7 segundos. Foram testados diversos valores para potência de desacoplamento: 0; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,57928 (valor padrão) e 0,6 W. De posse destes espectros é possível definir que utilizando os três valores mais baixos não ocorre o total desacoplamento dos sinais de 19F, fazendo com
que aumente a largura de linha do sinal e diminua sua intensidade, o que é ruim para medidas de difusão, uma vez que os sinais devem estar o mais separado e com a melhor relação sinal/ruído possível (Figura 21). Assim, o valor de 0,4 W foi escolhido por ser o valor mais baixo que faz com que o sinal de cada flúor apareça como um singleto, sem acoplamento com núcleos de hidrogênio evitando assim correntes de convecção que prejudicam a análise.
