A molécula de BINOL (1,1’-Bi-2-naftol, Figura 10B) desde 1990 está entre os ligantes quirais mais utilizados em reações, em grandes quantidades ou como catalisador assimétrico, que resultam em produtos quirais [47]. A pesquisa com o BINOL e derivados ganhou tamanha importância que Noyori e Knowles dividiram o prêmio Nobel de química em 2001 pelo estudo de hidrogenações assimétricas envolvendo o BINAP como catalisador, um derivado do BINOL. [48]
Atualmente derivados do BINOL são relatados em diversas aplicações como sensores [49,50], catalisador homogêneo em sínteses [51,52] e auxiliar quiral em resoluções cinéticas de misturas racêmicas [53].
Em RMN, o BINOL e seus derivados já vêm sendo usados como moléculas que induzem a separação de enantiômeros formando complexos diastereoisoméricos, como por exemplo, BINOL para discriminação do anti-histamínico prometazina [54]. Neste caso, os autores utilizaram proporções diferentes de (S)-BINOL em relação ao fármaco e verificaram que com mais BINOL, a separação dos sinais de uma das metilas da molécula alvo é melhor (Figura 16).
Figura 16: Espectros de RMN de 1H da prometazina pura (acima, em roxo) e com quantidades
crescentes de (S)-BINOL demonstrando que a separação entre os sinais aumenta com o aumento da quantidade de BINOL. Figura adaptada da referência 54.
1.6 BINOL
Além de fármacos, o BINOL foi utilizado para a separação dos sinais de três isoflavonas [55], e também em conjunto com uma base orgânica para a discriminação de hidrogênios de centros assimétricos α-carboxílicos [56] (Figura 17). Na grande maioria dos estudos, as moléculas são de síntese complexa e são aplicáveis para apenas alguns tipos de analitos quirais. Assim, as moléculas de BINOL e BINAP são boas alternativas a serem estudadas como CSA em experimentos de MAD.
Figura 17: Estruturas das isoflavonas que foram enantiodiscriminadas utilizando BINOL (referência 55) e do complexo ternário de BINOL, DMAP e do analito (referência 56)
Então, o objetivo principal deste trabalho foi avaliar a interação de matrizes quirais com diversos analitos com relação à separação de sinais em RMN de analitos racêmicos ou enantioenrriquecidos (proporções de enantiômeros diferentes de 1:1) utilizando a metodologia MAD.
2 METODOLOGIA
2.1 MOLÉCULAS TRABALHADAS
Foram utilizados 9 CSAs, sendo estes (R)-BINOL (1), (S)-BINOL (2), (R)- BINAP (3) (S)-BINAP (4), (R)-Macrociclo-1 (5), TADDOL (6), composto análogo ao TADDOL e ao DINOL, chamado aqui de α-DINOL (7), acetato de celulose (8) e acetato/ftalato de celulose (9) para a separação dos enantiômeros dos analitos. Quanto aos analitos, foram testados 17 analitos em misturas racêmicas ou enantioenrriquecidas, sendo eles: (+)-mentol (10), (-)-mentol (11), cânfora com excesso enantiomérico da espécie (R) (12), ácido mandélico (13), 1-feniletanol (14), 2’, 3’ e 4’-metoxi-1-feniletanol (15-17), 2’, 3’ e 4’-nitro-1-feniletanol (18-20), 2’, 3’ e 4’- fluoro-1-feniletanol (21-23) metilsulfinilbenzeno (fenilmetilsulfóxido) (24), 1- feniletilamina (25) e α-pineno (26) (Figura 18).
Produtos comerciais de pureza analítica foram empregados nos procedimentos e purificados previamente quando necessário.
Os compostos 14 a 23 foram obtidos reduzindo a carbonila da acetofenona correspondente usando 1,2 g da acetofenona (aproximadamente 10 mmol) e 12 mmols de LiAlH4 em THF a 0 ºC. As reações foram monitoradas por cromatografia de
camada delgada e interrompidas com adição de água quando não havia mais a presença da mancha referente ao reagente. O produto bruto foi extraído, seco e purificado quando necessário utilizando técnicas cromatográficas em coluna “flash” [57] empacotada com 15 cm de sílica gel 60G de granulometria 230-400 mesh.
Todas as reações foram monitoradas via cromatografia em camada delgada (CCD) empregando placas de alumínio de 2,5 cm por 5,0 cm, revestidas com sílica gel contendo indicador fluorescente comerciais. A revelação das cromatoplacas se deu em câmara com radiação ultravioleta, com solução de ácido sulfúrico em etanol e água ou com solução de vanilina.
As amostras de RMN foram preparadas utilizando 8,0 µmol do analito e 41,0 µmol dos CSAs 1-4 ou 8,0 µmol de 5 em 300 µL de CDCl3 em tubos de RMN de
2.1 MOLÉCULAS TRABALHADAS
2.2 PARÂMETROS EXPERIMENTAIS
As medidas de difusão foram feitas em um equipamento Bruker AVANCE- III de 11,74 Tesla, operando a 499,87 MHz para 1H e 470,29 MHz para 19F, equipado
com uma sonda SmartProbe BBO de 5 mm, com gradiente no eixo z.
A sequência de pulsos escolhida foi a Oneshot45 para os núcleos de 1H e 19F. Os dados foram adquiridos com 32 incrementos de gradiente, 32k pontos, 32
varreduras (scans) e 32 varreduras falsas (dummy scans). O tempo para recuperação do gradiente (d16) e a duração do pulso de purga (p19) foram fixados em 0,2 e 0,6 ms respectivamente. O fator de desbalanceamento dos gradientes (cnst14) foi fixado em 0,2 para todos os casos. O tempo de difusão Δ (d20) e o tempo de duração dos pulsos de gradiente de codificação e decodificação δ (p30) foram otimizados para cada amostra. Os experimentos foram feitos a 25 ºC a não ser quando o efeito da variação da temperatura foi avaliado.
Os dados de difusão foram processados de diversas maneiras diferentes utilizando o programa TopSpin 3.7 juntamente com o Origin 8.1 e o programa GNAT. Utilizando o GNAT é possível aplicar a deconvolução dos sinais por um sinal de referência (reference deconvolution [58]) de maneira mais direta que o TopSpin, facilitando bastante a análise e apresentando resultados mais confiáveis, assim estes dados serão apresentados. Os erros apresentados nas tabelas e figuras são os erros estimados do procedimento de ajuste do decaimento exponencial dos sinais de interesse.
As amostras foram preparadas utilizando uma matriz e um analito dissolvidos em 300 µL de CDCl3 e utilizando tetrametilsilano como referência (0,00
3.1 PARÂMETROS EXPERIMENTAIS. 3.1.1VARIAÇÃO DE SOLVENTE
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1 PARÂMETROS EXPERIMENTAIS
Para garantir as melhores condições possíveis de análise, primeiramente foram variados diversos parâmetros experimentais como a polaridade do solvente, temperatura, potência do desacoplador em sequências de pulso para detectar 19F{1H},
concentração de CSA e parâmetros de aquisição como número de varreduras (NS) e número de incrementos de gradiente (TD), que serão discutidos a seguir.
3.1.1 VARIAÇÃO DE SOLVENTE
A escolha do solvente é primordial para a análise de RMN, uma vez que os analitos e o CSA devem estar completamente solúveis dentro do tubo de RMN. Então, solventes com alta capacidade de solubilização são preferíveis.
Para análises de difusão, deve-se considerar também a viscosidade dos solventes, uma vez que em solventes mais viscosos existem menos correntes de convecção que atrapalham as medidas, como discutido anteriormente.
Foram testados 6 solventes deuterados quanto à separação de sinais do grupo metila do analito 23 complexado com a matriz 1: metanol, acetona, acetonitrila, diclorometano e clorofórmio. A amostra em clorofórmio foi a que apresentou a melhor separação dos sinais nos espectros de RMN de 1H e 19F{1H} (Figura 19).
Figura 19: Mistura racêmica do 4'-flúor-1-feniletanol e (S)-BINOL em diferentes solventes. A) Espectro de RMN de 1H e B) Espectro de RMN de 19F{1H}
Este resultado é um indício de que a interação entre o CSA e o analito não é estável em solventes polares, uma vez que embora estes solventes solubilizem melhor os analitos e os CSAs, essa maior capacidade de solubilização se deve à melhor solvatação, que ocorre principalmente via ligações de hidrogênio. As ligações de hidrogênio entre o solvente e as espécies competem com as ligações de hidrogênio entre o analito e o CSA, diminuindo a eficiência da enantiodiscriminação. Ou seja, para as análises de interações intermoleculares, é necessário que o solvente solubilize completamente o analito e o CSA mas que as interações intermoleculares (analito-CSA) prevaleçam sobre a solvatação. Sendo assim, o clorofórmio deuterado foi utilizado nas análises subsequentes por ser possível observar a interação entre os compostos e por ser a opção mais econômica quando comparado com diclorometano deuterado. Como o clorofórmio é um solvente de baixa viscosidade, foram utilizados tubos de RMN de 3 mm para minimizar o efeito das correntes de convecção [22].
3.1 PARÂMETROS EXPERIMENTAIS. 3.1.2CONCENTRAÇÃO DE CSA
3.1.2 CONCENTRAÇÃO DE CSA
Além do solvente, outro parâmetro importante no preparo da amostra é a concentração de CSA. Para medir a concentração ideal, foram preparadas 6 amostras variando a proporção molar de BINOL em relação à cânfora de 0 até 5, o que representa aproximadamente 0, 2, 4, 6, 8 e 10 mg de BINOL para 1 mg de cânfora enantioenrriquecida em 300 µL de CDCl3. Com isso, verificou-se que quanto mais
BINOL, melhor é a separação dos enantiômeros da cânfora até o limite testado, devido ao limite de solubilidade do CSA em CDCl3 (Figura 20).
Dentro do tubo de RMN tem-se um equilíbrio de complexação onde coexistem espécies livres e espécies complexadas. A concentração das espécies afeta diretamente o equilíbrio de complexação, então quanto mais CSA, maior será a quantidade de cânfora complexada, fazendo com que aumente a separação entre os sinais de cada complexo diastereoisoméricos.
Figura 20: Espectros de RMN de 1H de: misturas de (R)-BINOL e cânfora enantioenrriquecida
(esquerda) e (S)-BINOL e cânfora enantioenrriquecida (direita) com concentrações crescentes de BINOL.
3.1.3 POTÊNCIA DO DESACOPLADOR
O desacoplador é uma parte fundamental da sequência de oneshot45 de
19F, pois ele suprime os acoplamentos heteronucleares H-F, fazendo com que os
sinais de flúor apareçam como singletos no espectro de RMN, considerando que o flúor não esteja acoplado com mais nenhum outro núcleo além do hidrogênio. Porém, para que ocorra o desacoplamento é necessário aplicar um pulso com uma certa potência durante a aquisição e este pulso pode vir a aquecer a amostra.
Então, para a aquisição de espectros de 19F{1H} é aconselhável calibrar a
potência do desacoplador, uma vez que quanto menor a potência utilizada, menor é a variação de temperatura da amostra e assim, menor é a corrente de convecção dentro do tubo, uma vez que o tempo de aquisição é de 7 segundos. Foram testados diversos valores para potência de desacoplamento: 0; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,57928 (valor padrão) e 0,6 W. De posse destes espectros é possível definir que utilizando os três valores mais baixos não ocorre o total desacoplamento dos sinais de 19F, fazendo com
que aumente a largura de linha do sinal e diminua sua intensidade, o que é ruim para medidas de difusão, uma vez que os sinais devem estar o mais separado e com a melhor relação sinal/ruído possível (Figura 21). Assim, o valor de 0,4 W foi escolhido por ser o valor mais baixo que faz com que o sinal de cada flúor apareça como um singleto, sem acoplamento com núcleos de hidrogênio evitando assim correntes de convecção que prejudicam a análise.
3.1 PARÂMETROS EXPERIMENTAIS. 3.1.2POTÊNCIA DO DESACOPLADOR
Figura 21: Espectros de RMN de 19F{1H} da molécula 23 com o CSA 1 com a potência do desacoplador
crescente de baixo para cima: 0; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,57928 (valor padrão) e 0,6 W.
3.1.4 TEMPERATURA
A temperatura de análise também é um parâmetro bastante importante para medidas de difusão devido a dois motivos principais: o primeiro é que a interação do CSA com o analito é regida por uma constante de equilíbrio que pode variar com a mudança da temperatura. Já o segundo, é a possibilidade de criação de correntes de convecção. Porém, espera-se que com a diminuição da temperatura a formação do complexo diastereoisomérico seja favorecida, aumentando a separação dos sinais no espectro de RMN de 1H. Assim, variou-se a temperatura de aquisição da amostra
contendo o analito 4'-flúor-1-feniletanol e o (S)-BINOL entre -33 ºC e 33 ºC e a separação entre os sinais nos espectros de RMN de 1H (Figura 22) e de 19F{1H} (Figura
23) foi de fato maior em temperaturas mais baixas.
Com a diminuição da temperatura, o movimento das moléculas na amostra é menor e a interação entre os compostos ocorre por mais tempo, ou seja, o tempo em que o analito está complexado com o CSA é maior em temperaturas menores
resultando em diferenças maiores entre os enantiômeros que é refletida em valores maiores de Δδ.
Figura 22: Espectros de RMN de 1H da mistura racêmica do 4'-flúor-1-feniletanol e (S)-BINOL em
3.1 PARÂMETROS EXPERIMENTAIS. 3.1.4TEMPERATURA
Figura 23: Espectros de RMN de 19F{1H} da mistura racêmica do 4'-flúor-1-feniletanol e (S)-BINOL em
diferentes temperaturas
É interessante notar que com a diminuição da temperatura, o deslocamento químico observado para o núcleo de hidrogênio diminui, enquanto para o núcleo de flúor o deslocamento químico aumenta, ambas com comportamento muito parecido (Figura 24 e 20), mas comparando os módulos das variações de deslocamento, percebe-se que a variação para o núcleo de flúor é mais acentuada (Δδ 19F > Δδ 1H),
Figura 24: Variação do deslocamento químico de 1H (azul) e 19F (vermelho) com a variação da
temperatura
Figura 25: Módulo da variação do deslocamento químico de 1H (azul) e 19F (vermelho) com a variação
da temperatura
Este comportamento exponencial já era esperado, uma vez que o deslocamento químico observado é uma média do deslocamento químico de todas as espécies em solução e pode ser representado por:
3.1 PARÂMETROS EXPERIMENTAIS. 3.1.4TEMPERATURA
Onde a e b são as frações molares dos analitos livres e complexados com o CSA, respectivamente.
Esta equação nos mostra que o deslocamento químico observado no espectro de RMN é a média do deslocamento químico de todas as espécies em solução, ponderada pelas respectivas populações. Então, existem as moléculas de analitos livres e os analitos complexados com o CSA e a população de cada espécie varia com a temperatura. Com estes gráficos é possível extrair a equação destas exponenciais e estimar os pontos de maior separação e de coalescência dos sinais. Como as curvas são de formato exponencial, teoricamente o valor de Δδ nunca será 0, ou seja, os sinais sempre estarão separados. Porém, em uma dada temperatura, a separação destes sinais será menor que a resolução espectral impossibilitando a distinção dos sinais de cada espécie.
Para o caso mostrado existem dois analitos (os dois enantiômeros) que interagem de maneiras distintas com o CSA e criam quatro espécies diferentes no meio: os analitos (R) e (S) livres e os complexos diastereoisoméricos dos analitos com o CSA. Porém, no espectro de RMN de flúor são observados somente dois sinais, referentes aos de cada enantiômero. Com a diminuição da temperatura, a espécie complexada é favorecida (o valor de b aumenta) e assim o valor do
também muda. No limite de temperaturas baixas, os valores de b e o Δδ são máximos, já no limite de temperaturas altas o equilíbrio de complexação é tão rápido que a RMN não consegue medir.
Contudo, apesar da diminuição da temperatura favorecer a formação do complexo diastereoisomérico, temperaturas baixas também favorecem a formação de
correntes de convecção em RMN [22] e por isso optou-se por fazer as análises a 25 ºC.
3.1.5 PARÂMETROS DE AQUISIÇÃO
Em seguida, foram variados o número de varreduras (NS) e o número de pontos entre o valor máximo e o valor mínimo de atenuação do sinal devido ao
gradiente aplicado (TD) utilizando o composto 4’-flúor-1-feniletanol adquirindo espectros de RMN de flúor.
Foram testados 3 valores de NS e 3 valores de TD. A Tabela 1 abaixo correlaciona os dois parâmetros com os coeficientes de difusão de cada um dos enantiômeros do composto 4’-flúor-1-feniletanol. Quando foi utilizado um valor de NS igual a 8 e TD igual a 8, os valores de erro observados foram bastante altos e acredita- se que a curva construída a partir da atenuação dos sinais não é representativa com apenas 8 pontos devido à complexidade da amostra.
Tabela 1: Valores de coeficiente de difusão (× 10-10 m2s-1) para determinados valores de NS e TD
TD NS 8 16 32 8 13,4 ± 0,2 14,2 ± 0,2 14,1 ± 0,1 14,6 ± 0,2 15,1 ± 0,1 14,7 ± 0,1 16 14,1 ± 0,2 14,0 ± 0,1 13,7 ± 0,1 14,8 ± 0,2 14,8 ± 0,1 14,7 ± 0,1 32 14,6 ± 0,3 13,7 ± 0,1 13,2 ± 0,1 15,3 ± 0,2 15,0 ± 0,1 14,4 ± 0,1
Com o aumento do número de varreduras (Tabela 1, coluna 1) os valores de erro continuam altos, indicando que para melhorar os resultados obtidos, deve-se priorizar o aumento de pontos entre o máximo e mínimo de gradientes.
Na última coluna, tem-se o valor máximo testado de TD e percebe-se que os erros diminuem significativamente quando comparados à coluna de TD igual a 8. Ou seja, para uma boa descrição dos valores de coeficiente de difusão, deve-se ter em mente que é necessária uma boa relação sinal/ruído (que significa valores de NS altos para que o último espectro – mais atenuado – ainda possua intensidade suficiente) e ainda, quanto maior o TD, mais pontos serão usados para construir a reta para determinar o coeficiente de difusão, aumentando a precisão da análise. A diferença entre os valores de NS e entre os valores de TD pode ser mais bem visualizada na Figura 26 (A e B), onde os sinais representam o espectro de maior atenuação em um experimento para medir difusão. O sinal verde (quadro A) foi retirado de um experimento com NS igual a 8 resultando em uma relação sinal/ruído de 19,54 e o sinal laranja (quadro B) foi retirado de um experimento com NS 32
3.1 PARÂMETROS EXPERIMENTAIS. 3.1.5PARÂMETROS DE AQUISIÇÃO
resultando em uma relação sinal/ruído de 26,17. Já a diferença entre os valores de TD 8 e TD 32 pode ser mais bem observada ao comparar-se as retas ajustadas para cada experimento. Na Figura 26 (C), de TD igual a 8, tem-se poucos pontos, prejudicando assim o ajuste correto da reta, enquanto na Figura 26 (D), de TD igual a 32, tem-se diversos pontos para a construção da reta. A comparação entre as retas construídas a partir dos pontos pode ser feita pelo valor de R2, quanto mais próximo
de 1, mais próximos estão os pontos experimentais de uma reta.
Figura 26: Espectros de 19F{1H} de maior atenuação demonstrando o NS 8 (A, verde) e NS 32 (B,
laranja) e curvas ajustadas para os experimentos de medida de difusão com TD igual a 8 (C, vermelho) e igual a 32 (D, azul).
Sendo assim, optou-se por utilizar 32 para NS e TD para maximizar a razão sinal ruído e minimizar o erro experimental em todos os experimentos subsequentes.