UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ODONTOLOGIA MESTRADO EM ODONTOLOGIA
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM CLÍNICA INTEGRADA
ANA PATRÍCIA DE OLIVEIRA SOUZA
AVALIAÇÃO DA ASSOCIAÇÃO DE UMA BIOCERÂMICA DE FOSFATO DE CÁLCIO COM CÉLULAS-TRONCO MESENQUIMAIS DE CORDÃO
UMBILICAL HUMANO NA BIOENGENHARIA DO TECIDO ÓSSEO
Recife – PE 2013
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ODONTOLOGIA MESTRADO EM ODONTOLOGIA
AREA DE CONCENTRAÇÃO EM CLÍNICA INTEGRADA
ANA PATRÍCIA DE OLIVEIRA SOUZA
AVALIAÇÃO DA ASSOCIAÇÃO DE UMA BIOCERÂMICA DE FOSFATO DE CÁLCIO COM CÉLULAS-TRONCO MESENQUIMAIS DE CORDÃO
UMBILICAL HUMANO NA BIOENGENHARIA DO TECIDO ÓSSEO
Dissertação apresentada ao Colegiado da Pós-Graduação em Odontologia do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal de Pernambuco, como requisito parcial para obtenção do grau de mestre em Odontologia com área de concentração em Clínica Integrada.
Orientadora: Profa. Dra. Alessandra de Albuquerque Tavares de Carvalho
Co-Orientadora: Profa. Dr. Márcia Bezerra da Silva
Recife –PE 2013
TÍTULO DO TRABALHO: AVALIAÇÃO DA ASSOCIAÇÃO DE UMA BIOCERÂMICA DE FOSFATO DE CÁLCIO COM CÉLULAS-TRONCO MESENQUIMAIS DE CORDÃO UMBILICAL HUMANO NA BIOENGENHARIA DO TECIDO ÓSSEO
NOME DO ALUNO: Ana Patrícia de Oliveira Souza
DISSERTAÇÃO APRESENTADA EM: 29/08/2013
MEMBROS DA BANCA EXAMINADORA:
Profa. Dra. Liriane Baratella Evêncio__________________________________ Profa. Dra. Paloma Lys de Medeiros___________________________________ Profa. Dra. Flávia Maria de Moraes Ramos Perez_________________________
Recife –PE 2013
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO REITOR
Prof. Dr. Anísio Brasileiro de Freitas Dourado VICE-REITOR
Prof. Dr. Silvio Romero de Barros Marques PRÓ-REITOR DA PÓS-GRADUAÇÃO
Prof. Dr. Francisco de Souza Ramos CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
DIRETOR
Prof. Dr. Nicodemos Teles de Pontes Filho
COORDENADOR DA PÓS-GRADUAÇÃO EM ODONTOLOGIA Profa.Dra. Jurema Freire Lisboa de Castro
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ODONTOLOGIA MESTRADO EM CLÍNICA INTEGRADA
COLEGIADO MEMBROS PERMANENTES
Profa. Dra. Alessandra Albuquerque T. Carvalho Prof. Dr. Anderson Stevens Leônidas Gomes
Prof.Dr. Arnaldo de França Caldas Junior Prof. Dr. Carlos Menezes Aguiar Prof.Dr. Danyel Elias da Cruz Perez Prof. Dr. Edvaldo Rodrigues de Almeida Profa.Dra. Flavia Maria de Moraes Ramos Perez
Prof. Dr. Jair Carneiro Leão Profa. Dra. Jurema Freire Lisboa de Castro
Profa. Dra. Liriane Baratella Evêncio Prof.Dr. Luiz Alcino Monteiro Gueiros Prof.Dra. Maria Luiza dos Anjos Pontual
Prof.Dr. Paulo Sávio Angeiras Goes Profa. Dra. Renata Cimões Jovino Silveira
Profa.Dra. Silvia Regina Jamelli Prof.Dra. Simone Guimaraes Farias Gomes
Prof.Dr. Tibério César Uchoa Matheus MEMBRO COLABORADOR Prof. Dr. Cláudio Heliomar Vicente da Silva Profa. Dra. Lúcia Carneiro de Souza Beatrice
SECRETARIA Oziclere Sena de Araújo
Dedico essa Dissertação a todos aqueles que são a razão da minha vida:
Meus filhos Thiago e Gabriel, meu marido Giovani e Socorro minha mãe. Dedico também a todos aqueles que foram amigos e deram-me apoio nessa grande conquista
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus por permitir mais essa conquista e ser sempre meu refúgio e fortaleza.
À minha orientadora, Profa. Dra. Alessandra Albuquerque T. Carvalho, pela amizade, apoio, confiança e dedicação, durante todo o Mestrado.
À minha co-orientadora Profa Dra Márcia Bezerra da Silva e a Profa Dra Paloma Lys de Medeiros, pela competência, dedicação, apoio, amizade, empenho e empolgação na realização da pesquisa.
A todos que colaboraram carinhosamente para a realização do nosso trabalho: Dra. Valéria Rego Alves Pereira do Centro de Pesquisa Ageu Magalhães (CPqAM/FIOCRUZ/PE), Jeann Fabiann Branco Júnior (aluno de iniciação científica do Centro de Pesquisa Ageu Magalhães (CPqAM/FIOCRUZ/PE), Prof. Cláudio Rodrigues do Departamento de Biofísica e Radiobiologia CCB//UFPE e Prof. Reginaldo Pereira do Departamento de Fisiologia e Farmacologia CCB/UFPE.
A todos os professores que fazem parte do Programa de Pós-Graduação em Odontologia e empenham-se em tornar-nos Mestres, dando-nos a melhor das lições com seu exemplo.
A todos os colegas do mestrado pelos momentos compartilhados e em especial àqueles que se fizeram presentes nas horas certas.
Aos funcionários do Curso de Odontologia, em especial a Dona Rita de Estomatologia e da Pós-Graduação destacando, Dona Tânia e Oziclere Sena.
À minha família e pacientes por todo apoio carinho e compreensão, apoiando-me em todos os momentos, auxiliando-me na realização desse ideal.
"Quando uma criatura humana desperta para um grande sonho e sobre ele lança
toda a força de sua alma, todo o universo conspira a seu favor."
RESUMO
Técnicas e biomateriais vêm sendo testados e utilizados, todos com suas vantagens e desvantagens, assim como limitações principalmente com relação ao tamanho da reconstrução e à necessidade de um leito receptor adequado, que proporcione a vascularização, nutrição e fornecimento de células em boa quantidade para o processo de neoformação óssea. Foi realizado um estudo in vitro associando células-tronco mesenquimais (CTMs) de cordão umbilical humano com uma biocerâmica fosfacálcica bifásica nano-micro-macro porosa de hidroxiapatita - beta tricálcio fosfato (HA-βTCP) densa. A proporção de hidroxiapatita (HA) foi de 60% e βTCP 40% com micro poros de 10 micra de diâmetro e diâmetro dos poros intercomunicantes de até 500 micra. O experimento foi mantido em estufa a 37º por 21 dias e as trocas do meio de cultura realizadas a cada 03 dias. As amostras foram analisadas semanalmente até 21 dias por microscópio invertido de contraste de fase e após os 21 dias foi realizada a análise citoquímica das amostras com o método do vermelho de alizarina. Os resultados demonstraram que a morfologia das CTMs em estudo condiz com o achado de que a estimulação das mesmas pela presença do biomaterial foi capaz de produzir células possivelmente secretoras demostrando que a associação da biocerâmica Osteosynt® com células-tronco mesenquimais de cordão umbilical humano é um campo bastante promissor na bioengenharia de tecido ósseo.
Palavras-chave: Bioengenharia. Biocerâmica. Células-tronco mesenquimais. Osteoblastos. Indutores.
ABSTRACT
Biomaterials and techniques have been tested and used, all with their advantages and disadvantages, and limitations, especially with respect to the size of the reconstruction and the need for a good receiver site, providing vascularization, nutrition and supply of cells in good quantity for process of bone formation. Was conducted an in vitro study involving mesenchymal stem cells (MSCs) from human umbilical cord with a biphasic calcium phosphate bioceramic nano-micro-macro porous hydroxyapatite beta - tricalcium phosphate (HA-βTCP) dense. The ratio is 60% HA and 40% βTCP microspores with a diameter of 10 microns and interconnecting pores of diameter up to 500 microns. The experiment was held at 37 for 21 days and exchange of culture vehicle taken every 03 days. The samples were analyzed weekly up to 21 days by inverted microscope and phase contrast after 21 days carried out cytochemical analysis of samples with the method of Alizarin Red. The results show that the morphology of MSCs under study is consistent with the finding that stimulation of the same by the presence of the biomaterial was able to produce cells secreting possibly demonstrating the association of bioceramic Osteosynt ® with mesenchymal stem cells from human umbilical cord is a promising in the ground of bone tissue bioengineering.
Keywords: Bioengineering. Bioceramic. Stem cells mesenchymal. Osteoblasts. Inductors.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 Reabsorção e neoformação óssea 20
Figura 2 Peças prototipadas de ossos de diversas partes do corpo para reconstrução
23
Figura 3. Foto de cordão umbilical humano na etapa inicial do processo de isolamento das células-tronco mesenquimais
26
Figura 4. Capela de fluxo laminar onde o botton da biocerâmica foi seccionado com o motor Surgic XT NSK e peça de mão Kavo
acoplado com disco de aço.
27
Figura 5. Placa de 96 poços contendo amostras da biocerâmica, meio e células-tronco mesenquimais de cordão umbilical humano
28
Figura 6. Avaliação semanal da cultura com o microscópio Leica 28 Figura 7: As células sendo examinadas ao microscópio invertido
(LEICA DMIL; Leica Microsystems GmbH, Bensheim, Alemanha) e sendo feita a captação das imagens com uma câmera de vídeo CCD
(Motic 2000; Quimis Diadema, SP, Brasil) acoplada ao microscópio
29
Figura 8. Fotomicrografia de células-tronco mesenquimais de cordão umbilical humano cultivadas in vitro, realizada com auxílio
de microscópio invertido de contraste de fase. Observa-se formação
de monocamada com típicas células fibroblastóide. Escala de barra = 50 µm.
30
FIGURA 9: Análise por citometria de fluxo da expressão de marcadores de superfície de células-tronco mesenquimais do cordão umbilical humano. Os dados mostrados são do fenótipo de células analisadas no final da terceira passagem. O controle é mostrado em vermelho
Figura 10. Fotomicrografia da biocerâmica fosfocálcica bifásica porosa de HA-βTCP em associação com células-tronco mesenquimais de cordão umbilical, realizadas com auxílio de microscópio invertido de contraste de fase. Células fibroblastóide são observadas próximas ao único bloco de cerâmica (estrela).Escala de barra = 100 µm.
32
Figura 11: Fotomicrografia de células-tronco mesenquimais de cordão umbilical humano cultivadas em associação com a biocerâmica fosfocálcica bifásica porosa de HA-βTCP, em diferenciação osteogênica coradas com solução vermelho de Alizarina e visualizadas com auxílio de microscópio invertido de contraste de fase Escala de barra = 50 µm.
33
Figura 12. Fotomicrografia da morfologia de células-tronco mesenquimais de cordão umbilical humano induzidas à diferenciação osteogênica pela biocerâmica fosfocálcica bifásica porosa de HA-βTCP (fragmentos castanhos). Culturas avaliadas com auxílio de microscópio invertido: sem contraste de fase (A) e com contraste de fase (B). Escala de barra = 100.
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
BMPs: proteínas ósseas morfogenéticas βTPC: beta tricálcio fosfato
CPqAM: Centro de Pesquisas Ageu Magalhães CT: células-tronco
CTMs: células-tronco mesenquimais
DMEM: Dulbecco's Modified Eagle Medium EDTA: ácido etilenodiamino tetra-acético FIOCRUZ: Fundação Oswaldo Cruz FITC: fluorescein isothiocyanate HA: hidroxiapatita
HA-βTCP: hidroxiapatita-beta-tricálcio fosfato PBS: fosfato de sódio e cloreto
SFB: soro fetal bovino
SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO 14 2 REVISÃO DA LITERATURA 17 3 MATERIAIS E MÉTODOS 23 3.1.Considerações bioéticas 23 3.2.Localização do estudo 23 3.3 Tipo de estudo 23 3.4. Tamanho da amostra 23 3.5. Obtenção da cultura de células-tronco 23 3.5.1. Coleta de cordão umbilical humano 23 3.5.2. Isolamento e cultivo das células-tronco mesenquimais
(MSCs)
24
3.5.3. Imunofenotipagem das CTMs 25 3.5.4. Cultivo das células-tronco com a biocerâmica 26 3.5.5. Avaliação das características morfológicas das CTMs 27
3.5.6. Análise das células diferenciadas 28
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO 28
4.1. Isolamento e cultivo das CTMs de cordão umbilical humano 28 4.2. Análise da imunofenotipagem das CTMs 29 4.3. Morfologia das CTMs durante o processo de diferenciação
osteogênica sobre a biocerâmica 30
5 CONCLUSÕES 33
APÊNDICE: Termo de consentimento livre e esclarecido 37 ANEXO: Normas da revista Acta Biomaterialia 39
15
1. INTRODUÇÃO
Perdas ósseas na face podem impossibilitar reabilitações protéticas e causar deformações comprometendo a estética do paciente.
Para o processo de reconstrução óssea necessitamos de uma matriz, osteocondução, osteoindução e osteogênese. Para haver osteogênese necessita-se de células ósseas, que atualmente são encontradas em enxertos autógenos ou em tecido ósseo sadio adjacente ao local da reconstrução. A maior concentração de células encontra-se no osso esponjoso.
A regeneração de grandes defeitos ósseos é um problema clínico significativo e comum que apresenta limitações nos tratamentos já existentes, como enxertos ósseos autólogos e aloenxertos, aumentando a necessidade de pesquisas com substitutos ósseos sintéticos (WEI X, et al. 2013). Xenoenxertos como Bio-Oss® e Osteograf funcionam como substitutos ósseos naturais, são derivados do componente mineral de ossos bovinos e são muito semelhantes aos ossos humanos, porém apresentam alto grau de reabsorção (COELHO, 2013).
Dentre os biomateriais pesquisados, as biocerâmicas a base de fosfato de cálcio são as que apresentam potencial aplicabilidade na substituição e regeneração do tecido ósseo, pois apresentam características específicas tais como, composição química semelhante à fase mineral de ossos, boa biocompatibilidade, bioatividade, ausência de toxicidade local ou sistêmica e capacidade de ligar-se ao tecido hospedeiro ou ser absorvida pelo tecido vivo (RODRIGUES, et al., 2012).
Aloenxertos, xenoenxertos e biomateriais a base hidroxiapatita e beta tricálcio fosfato são uma ótima matriz para neoformação óssea, porém seu
16 padrão de reabsorção não pode ser controlado e não apresentam células ósseas, portanto não são osteogênicos. Aloenxertos e xenoenxertos têm ainda a desvantagem de pequeno potencial de antigenicidade e risco de transmissão de doenças (MORI, et al., 2010).
A remodelação óssea é um sistema complexo que ocorre em uma matriz em função do equilíbrio entre reabsorção pelos osteoclástos e neoformação óssea pelos osteoblastos envolvendo a indução de células osteoprogenitoras por fatores de crescimento, dentre eles fator de transformação do crescimento (TGF) e proteínas ósseas morfogenéticas (BMPs) (GUERRERO, et al., 2013).
Vários estudos têm relatado a importância de pesquisas com células-tronco mesenquimais para a engenharia de tecido ósseo (OLIVEIRA, 2008). Em casos de reconstruções de mandibulectomias, o leito receptor não é adequado, não tem suporte e não apresenta células progenitoras suficientes para induzir a neoformação óssea com o biomaterial. A possibilidade de reconstrução óssea na região crânio-facial, com peças de biocerâmica confeccionadas através de prototipagem, traria um benefício enorme para pacientes que tiveram perdas ósseas nessas regiões, restaurando a anatomia do defeito ósseo causado por perdas dentárias, traumatismos ou patologias.
O biomaterial do presente estudo foi uma biocerâmica fosfacálcica bifásica nano-micro-macro porosa de HA-βTCP ( hidroxiapatita beta-tricálcio fosfato) com características e propriedades físico-químicas semelhantes à matriz mineral do tecido ósseo. A proporção de hidroxiapatita (HA) foi de 60% e beta-tricálcio-fosfato (βTCP) foi de 40% com micro poros de 10 micra de diâmetro e diâmetro dos poros intercomunicantes de até 500 micra. Com essa biocerâmica de fosfato de cálcio pode-se confeccionar peças individualizadas
17 com o formato do osso da face que estiver comprometido e do tamanho necessário através da prototipagem 3D. Foi realizado um estudo in vitro da associação de células-tronco com a biocerâmica para avaliar através da microscopia invertida de fase a osteoindução do biomaterial nas células-tronco de cordão umbilical e o potencial osteogênico do biomaterial através do método do vermelho de alizarina.
18
2. REVISÃO DA LITERATURA
A reabsorção óssea alveolar que ocorre após perda do elemento dentário, traumatismos dentais, traumatismos faciais e patologias ósseas, leva a perda de suporte ósseo para reabilitações protéticas e deformidades faciais. Os efeitos são maiores em deformidades localizadas na região anterior dos maxilares ou envolvendo grandes perdas ósseas (OLIVEIRA, 2008).
A reconstrução de processos alveolares com enxertos ósseos foi um dos aspectos proeminentes para o avanço da implantodontia. Entre as técnicas cirúrgicas para reabilitar maxilares atróficos estão às menos invasivas como pequenos enxertos ósseos e implantes curtos e procedimentos mais complexos como enxertos ósseos associados à cirurgia ortognática (LUBIANA et al, 2007).
Outra alternativa no processo de enxertias é o aloenxerto que serve como uma matriz osteocondutora para neoformação óssea e está disponível em grandes quantidades sem necessidade de um segundo local cirúrgico para sua remoção, diminuindo sua morbidade (PELEGRINE; MACEDO; COSMO, 2008).
O único material osteogênico é o osso autógeno e sua forma mais eficaz é o osso esponjoso, pois fornece a maior concentração de células ósseas. Na Fase I, com a osteogênese ocorre formação de um produto osteóide proporcionalmente ao número de células transplantadas principalmente da porção esponjosa do enxerto autógeno. As células sobrevivem nos primeiros 3 ou 4 dias pela nutrição do tecido celular subjacente. Na Fase II, osteoindução, as células do tecido receptor promovem a reabsorção das células
19 transplantadas que morrem e liberam as proteínas indutoras e os fatores de crescimento. Começa após aproximadamente seis semanas e dura no mínimo seis meses. O osso cortical é a fonte primária das proteínas morfogenéticas. Na Fase III, osteocondução, a matriz inorgânica de hidroxiapatita forma uma plataforma no enxerto ósseo contribuindo para o efeito osteocondutor à medida que ocorre a substituição óssea como na Figura 1 (ZERBO, 2001).
O osso autógeno é considerado o “padrão ouro” para reconstrução de rebordos alveolares, pois apesar de perder boa parte de sua vitalidade celular revasculariza-se e incorpora-se ao leito receptor, possibilitando a osseointegração de implantes (VASCONCELOS; PETRILLI; PALECKIS, 2006). Os aloplásticos são materiais sintéticos bio-inertes e outros bio-ativos. A hidroxiapatita, o fosfato tricálcio, a fenoapatita e o biovidro são bio-ativos, pois reagem com o meio em torno deles. Apresentam-se como blocos sólidos, porosos ou os dois. Os sólidos são reabsorvidos mais lentamente que os porosos da mesma composição. Quando ambos são porosos, o fosfato tricálcico reabsorve mais rápido que a hidroxiapatita por ser cristalina e menos solúvel (NEVES, 2001).
Os enxertos aloplásticos são osteocondutores, exclusivamente sintéticos e biocompatíveis. São vendidos em uma grande variedade de texturas, tamanhos de partículas e formatos. Podem ser separados em cerâmicos, polímeros e combinações. As cerâmicas podem ser: Bio-inertes, que não tem união direta com o osso receptor e são presas mecanicamente em contato com o osso. O tipo de cicatrização em um implante osseointegrado bio-inerte é um processo osteocondutor; por exemplo, óxido de alumínio e óxido de titânio. Bio-ativas, as quais se unem ao osso e agem como um substrato para o
20 crescimento ósseo e por isto constituem a maior família de aloplastos usados para enxerto em implantodontia. São osteocondutoras e osteoindutoras mas não osteogênicas; por exemplo, fosfato de cálcio e hidroxiapatita sintética (MISCH, 2006).
Figura 1 Reabsorção e neoformação óssea (PELEGRINE; MACEDO; COSMO, 2008).
O processo de reconstrução óssea necessita apresentar princípios orgânicos que influenciam diretamente a osteogênese que são: A matriz (arcabouço local) ou material usado para reconstrução; células-tronco progenitoras para diferenciação e multiplicação; proteínas sinalizadoras de indução da transformação das células mesenquimais indiferenciadas ou células-tronco em osteoblastos e em outras células especializadas e condições locais e orgânicas para permitir neoformação vascular (angiogênese) para nutrição e viabilização do processo (PELLEGRINE, MACEDO E COSMO, 2008).
A regeneração tecidual guiada usando hidroxiapatita bifásica+ beta-tricálcio-fosfato (Bone Ceramic) ou osso mineral natural coberto com colágeno
21 (BioOss Collagen) foi comprovadamente eficaz, e ambos apresentam propriedade de osteocondução (SCHWARZ et al., 2007).
A composição química e estrutura física de um biomaterial exercem influências diretas no comportamento celular, levando a diferentes respostas teciduais. A existência de uma matriz que, além de ser biocompatível e de apresentar micro e macroporos intercomunicantes, permita a adesão e a diferenciação osteogênica de células-tronco, é essencial para a bioengenharia de tecido ósseo (SILVEIRA et al., 2006).
Vários tipos celulares estão em investigação em experimentos animais, porém o maior potencial terapêutico está nas células-tronco. Estas células possuem capacidade de proliferação indefinida, auto renovação, produção de diferentes linhagens celulares e regeneração de tecidos. Estão presentes principalmente em embriões, células-tronco (CT) embrionárias, no cordão umbilical e na medula óssea que são chamadas de células-tronco adultas (SILVEIRA et al., 2006).
As células-tronco são classificadas de acordo com sua plasticidade, isto é, seu potencial de diferenciação nos diversos tecidos. As células-tronco embrionárias são células totipotentes, ou seja, têm uma grande capacidade de diferenciação e de divisão, podendo diferenciar-se em todos os tipos de tecido do corpo. As células-tronco adultas são células pluripotentes que têm a capacidade de diferenciar-se em muitos tecidos, porém não em todos. Seu potencial de replicação, diferentemente das embrionárias é limitado (PERES; CURI, 2005). Elas podem ser encontradas em diversos tecidos do corpo como reservas endógenas teciduais, sangue periférico, placenta, sangue do cordão umbilical, células perivasculares e medula óssea, sendo esta a que mais se
22 destaca devido a sua disponibilidade imediata e reserva praticamente ilimitada (MUSCHLER et al, 2004).
A presença de um material de suporte é indispensável quando se necessita reconstruir um tecido ósseo adulto. Macroscopicamente ele vai permitir a manutenção do volume ósseo perdido e prevenir a invaginação de massa muscular circunvizinha no defeito ósseo. Do ponto de vista tecidual, este material fará o vigamento, servindo como uma matriz no qual novo tecido será formado. Em nível celular obtém-se uma superfície na qual as células-tronco poderão aderir-se, proliferar-se e diferenciar-se (POTIER; PETITE, 2005).
Lobo et al (2011) utilizaram a biocerâmica Osteosynt®, na proporção de 65% de hidroxiapatita e 35% de beta-tricálcio-fosfato, na forma de grânulos de 40-60 micra, sobre a qual foram cultivadas células-tronco de polpa de dentes decíduos. O biomaterial nanoestruturado permitiu a adesão das células-tronco e sua proliferação in vitro. Uma revisão sobre as propriedades dos materiais em relação a osteoindutividade comprovou que ainda não se sabe como algumas cerâmicas de fosfato de cálcio podem ser mais osteoindutivas que outras e como suas propriedades físico-químicas influenciam esse processo (SAMAVEDI, WHITTINGTON, GOLDSTEIN, 2009).
O biomaterial do estudo foi uma biocerâmica fosfacálcica bifásica nano-micro-macro porosa de hidroxiapatita beta-tricálcio-fosfato com características e propriedades físico-químicas semelhantes à matriz mineral do tecido ósseo. Era composto principalmente de substâncias fosfacálcicas mais estáveis com arquitetura porosa intercomunicantes e resistência mecânica necessária, sendo substituída naturalmente pelo organismo no processo de reabsorção óssea. A
23 proporção de HA é 60% e βTPC é 40% com micro poros de 10 micra e o diâmetro dos poros intercomunicantes de até 500 micra. Uma das grandes vantagens da biocerâmica Osteosynt® é que podem ser confeccionadas peças para reconstruções feitas individualmente correspondendo ao formato exato do defeito ósseo através de modelos prototipados de tomografias 3D (Figura 2).
Figura 2 Peças prototipadas de ossos de diversas partes do corpo para reconstrução (PELEGRINE; MACEDO; COSMO, 2008).
Os meios indutores atualmente são tóxicos ou de difícil obtenção como BMPs. Diante do exposto, o estudo em questão avaliou o potencial da biocerâmica Osteosynt® como um possível indutor in situ na regeneração óssea, prático, de fácil obtenção, biocompatível e estéril, facilitando estudos com osteoblastos.
24
3. MATERIAIS E MÉTODOS
A pesquisa foi realizada como a seguir. 3.1 Considerações éticas
Após a aprovação pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal de Pernambuco:
CAAE-0133.0.172.000-09 Registro CEP/CCS /UFPE Nº 135/09
3.2 Localização do estudo
A fase experimental foi realizada no Laboratório de Biofísica das Membranas e Células-Tronco do Departamento de Biofísica e Radiobiologia da UFPE, Recife PE.
3.3 Tipo de estudo
Foi realizada uma investigação experimental em laboratório, do tipo qualitativa.
3.4 Tamanho da amostra
Foram utilizados oito amostras da biocerâmica fosfacálcica bifásica nano-micro-macro porosa de hidroxiapatita beta-tricálcio-fosfato Osteosynt® densa para associação com células-tronco de cordão umbilical humano cultivadas no Laboratório de Biofísica das Membranas e Células-Tronco do Departamento de Biofísica e Radiobiologia da UFPE.
3.5 Obtenção e cultura de células-tronco
Para obter e cultivar as células-tronco foram realizados os procedimentos a seguir:
25 As células-tronco mesenquimais foram isoladas de cordão umbilical humano de partos cesáreos realizados no Hospital De Ávila sendo o termo de consentimento livre e esclarecido em anexo, assinado pelas mães doadoras antes da coleta. Os cordões foram coletados em um recipiente estéril contendo solução de EDTA (2 mM) em cloreto de sódio a 0,9%, antibióticos–penicilina (150 U/ml) e estreptomicina (150 µg/mL) e anfotericina (5 mg/ml) e foram processados no período de até 6 horas após o parto no Laboratório de Biofísica das Membranas e Células-Tronco do Departamento de Biofísica e Radiobiologia da UFPE.
3.5.2 Isolamento e cultivo das células-tronco mesenquimais (MSCs)
A metodologia necessária e eficiente para o isolamento e cultivo das MSCs foi bem estabelecida pela equipe do Laboratório de Biofísica das Membranas e Células-Tronco do Departamento de Biofísica e Radiobiologia da UFPE (MIRANDA-OLIVEIRA, et al. 2009; MALAGUETA-VIEIRA, et al. 2010; ALBERTIM, 2010). As artérias e veias foram retiradas do cordão umbilical e descartadas, o tecido contendo a geléia de Wharton foi seccionado em fragmentos com cerca de três cm (Figura 2).
26
Figura 3. Foto de cordão umbilical humano na etapa inicial do processo de isolamento das células-tronco mesenquimais
Estes fragmentos de tecidos foram depositados em garrafas de cultura, contendo meio Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) baixa glicose (Gibco) suplementado com 15% soro fetal bovino (SFB), LGC Biotecnologia, 20% fator de crescimento (F12, Gibco), antibióticos–penicilina (150 U/ml), estreptomicina (150 µg/mL) e anfotericina (5 mg/ml). As garrafas foram armazenadas na estufa a 37 ºC, 80% umidade e 5% CO2. As células migraram
espontaneamente do tecido, aderiram-se ao plástico das garrafas e formaram “monocamadas” após 15 e 21 dias.
3.5.3. Imunofenotipagem das CTMs
As células obtiveram a confirmação da linhagem mesenquimal através da realização da citometria de fluxo (FACScalibur BD® ), sendo utilizados anticorpos monoclonais, ou seja marcadores de células mesenquimais (CD 29, CD 44 E CD 90) e marcadores de células das linhagens endotelial e hematopoiética (CD 31, CD 34 e CD 45), que reconhecem antígenos específicos da membrana das células e que foram conjugados com moléculas fluorescentes (FITC).
27 3.5.4. Cultivo das células-tronco com a biocerâmica
Em uma capela de fluxo laminar seccionamos a biocerâmica com um motor Surgic XT NSK com peça de mão Kavo e disco de aço em um fragmento maior, cinco fragmentos menores e fragmentos diminutos com pó (Figura 4).
Figura 4. Capela de fluxo laminar onde o botton da biocerâmica foi seccionado com o motor Surgic XT NSK e peça de mão Kavo acoplado com disco de aço.
Em uma placa de 96 poços colocamos o meio DMEM baixa glicose (Gibco) suplementado com 15% soro fetal bovino (SFB, LGC Biotecnologia) e antibióticos–penicilina (150 U/ml) e estreptomicina (150 µg/mL) e anfotericina (5 mg/ml) em 09 poços com o biomaterial e as células da seguinte forma:
1. Poço A1- Fragmento maior com células-tronco
2. Poços- F3, F4, F5, F6 e F7- Fragmentos menores com células-tronco 3. Poços G8 e G9- Pó e fragmentos diminutos com células-tronco
28
Figura 5. Placa de 96 poços contendo amostras da biocerâmica, meio e células-tronco mesenquimais de cordão umbilical humano.
A placa foi mantida em estufa a 37º por 21 dias, realizando as trocas do meio de cultura a cada 03 dias.
3.5.5. Avaliação das características morfológicas das CTMs cultivadas em contato com a biocerâmica comercial Osteosynt®
As culturas de células foram acompanhadas semanalmente através de sistema de vídeo-microscopia (LEICA) para verificação das características morfológicas e analise das condições do cultivo (Figura 6).
29 3.5.6. Análise das células diferenciadas
As células submetidas à indução e controle foram lavadas com PBS, fixadas em formaldeído a 4% durante 20 minutos, lavadas com água deionizada e expostas a 2% de vermelho de alizarina durante 15 minutos. Foram lavadas várias vezes com água deionizada, retirando o excesso de corante e examinadas ao microscópio invertido (LEICA DMIL; Leica Microsystems GmbH, Bensheim, Alemanha). As imagens foram adquiridas com uma câmera de vídeo CCD (Motic 2000; Quimis Diadema, SP, Brasil) acoplada ao microscópio (Figura 7).
Figura 7. Células examinadas ao microscópio invertido (LEICA DMIL; Leica Microsystems GmbH, Bensheim, Alemanha) e realização da captação das imagens com uma câmera de vídeo CCD (Motic 2000; Quimis Diadema, SP, Brasil) acoplada ao microscópio.
4.RESULTADOS E DISCUSSÃO
De acordo com os dados obtidos observamos que:
4.1 Nas garrafas de cultura de CTMs, após 72 horas, apresentaram colônias de células com morfologia fibroblastóide, onde sua análise morfológica é de grande importância, visto que o padrão de crescimento destas células é descrita como fibroblast-like [19]. A formação da monocamada ocorreu em torno
30 de uma semana de cultivo in vitro, onde visualizamos tapete celular com algumas áreas abertas a serem posteriormente preenchidas (Figura 8).
Figura 8. Fotomicrografia de células-tronco mesenquimais de cordão umbilical humano cultivadas in vitro, realizada com auxílio de microscópio invertido de contraste de fase. Observa-se formação de monocamada com típicas células fibroblastóide. Escala de barra = 50 µm.
As células aderentes foram cultivadas até alcançarem uma confluência de 80-90%, quando foi procedida a realização da 1ª passagem ou seja, as células foram tripsinizadas (5mg de tripsina/mL PBS, Sigma), ressuspendidas em meio de cultura, coradas com Azul de Trypan (0,2%, Sigma), contadas em Câmara de Neubauer e acondicionadas em garrafas de 75 cm2 (Cellstar) para expansão.
4.2. Análise da imunofenotipagem das CTMs
A análise imunofenotípica deste estudo (Figura 9) revelou expressão positiva para marcadores moleculares de superfície como CD 44 (receptor de hialuronato), CD 29 (molécula de adesão da superfamília das Integrinas – VLA beta) e CD 90 (Thy-1). Além do que, foi confirmada expressão negativa para marcadores típicos de linhagens hematopoiéticas e endoteliais, como CD 31 (PECAM-1: molécula de adesão plaquetária), CD 34 (receptor de células endoteliais) e CD 45 (presentes em todas as células hematopoiéticas); confirmando-se assim o que é mencionado na literatura.
31
Figura 9. Análise por citometria de fluxo da expressão de marcadores de superfície de células-tronco mesenquimais do cordão umbilical humano. Os dados mostrados são do fenótipo de células analisadas no final da terceira passagem. O controle é mostrado em vermelho.
Todas as células do organismo apresentam um perfil de marcadores de superfície que caracterizam a singularidade biológica e a marca das células que os contêm [20]. Apesar da grande quantidade de marcadores positivos descritos na literatura não há para as CTMs um marcador positivo definido e definitivo. Sendo sua caracterização estabelecida pela identificação de uma combinação de marcadores específicos e não específicos [21,22, e 23].
Para a Sociedade Internacional de Terapia Celular (SITC) as CTMs são negativas para a expressão dos marcadores CD34, CD45 e CD14; crescem aderidas ao substrato, são cultiváveis por longos períodos e capazes de se diferenciar em pelo menos duas linhagens celulares. Há na literatura, um consenso de que as CTMs expressam níveis variáveis de CD44 e também têm expressão positiva para a molécula de adesão CD29 [24].
4.3. Morfologia das CTMs durante o processo de diferenciação osteogênica sobre a Biocerâmica
A morfologia das CTMs em estudo condiz com o achado de que a estimulação das mesmas pela presença do biomaterial (cerâmica em pequenos blocos ou diminutos fragmentos) com capacidade de diferenciação osteogênica foi capaz de produzir células possivelmente secretoras (Figura 10).
32
Figura 10. Fotomicrografia da biocerâmica fosfocálcica bifásica porosa de HA-βTCP em associação com células-tronco mesenquimais de cordão umbilical, realizadas com auxílio de microscópio invertido de contraste de fase. Células fibroblastóide são observadas próximas ao único bloco de cerâmica (estrela). Escala de barra = 100 µm.
A característica marcante neste processo foi a aglomeração celular e poder observar a disposição das células em cadeias, além de uma morfologia marcada pela presença de concreções de cálcio no interior das mesmas revelado pela citoquímica coradas com o vermelho de Alizarina (Figura 11). Quanto mais próximo dos fragmentos mais as células foram induzidas à diferenciação e apresentaram mais depósitos de cálcio, quando comparadas àquelas situadas mais distantes. Independente da localização, a cultura como um todo foi induzida a diferenciação osteogênica em função do contato com a biocerâmica estudada (Figuras 12).
33
Figura 11. Fotomicrografia de células-tronco mesenquimais de cordão umbilical humano cultivadas em associação com a biocerâmica fosfocálcica bifásica porosa de HA-βTCP, em diferenciação osteogênica coradas com solução vermelho de Alizarina e visualizadas com auxílio de microscópio invertido de contraste de fase: Detecta-se depósitos de cálcio nas células diferenciadas (setas brancas); depósitos de cálcio intracitoplasmáticos são observados corados em vermelho. Escala de barra = 50 µm.
Figura 12. Fotomicrografia da morfologia de células-tronco mesenquimais de cordão umbilical humano induzidas à diferenciação osteogênica pela biocerâmica fosfocálcica bifásica porosa de HA-βTCP (fragmentos castanhos). Culturas avaliadas com auxílio de microscópio invertido: sem contraste de fase (A) e com contraste de fase (B). Escala de barra = 100 µm.
Na engenharia tecidual, as CTMs são as células de escolha para pesquisas com o objetivo de reparar defeitos teciduais. As linhas de pesquisas avançam na criação in vitro de tecidos que possam aumentar a osteogênese no sítio desses defeitos ou no transplante direto das CTMs em scafolds, devido ao papel dessas células na formação da matriz extracelular25. Analisamos o potencial de diferenciação em osteoblastos das CTMs sobre a biocerâmica fosfocálcica bifásica porosa de HA-βTCP durante três semanas de indução
34 osteogênica e podemos constatar que a biocerâmica em questão sustentou a diferenciação sendo evidenciada pela marcação dos depósitos de cálcio intracelulares com o vermelho de alizarina, em todas as amostras.
5 CONCLUSÕES
A biocerâmica comportou-se como um indutor prático, eficaz e biocompatível, promovendo a diferenciação osteogênica e mantendo-se estável durante o experimento, podendo ser usado em pesquisas com células-tronco de cordão umbilical humano para osteoindução.
As células-tronco foram induzidas a diferenciação osteogênica em função do contato com a biocerâmica estudada e constatamos que a mesma sustentou a diferenciação evidenciada pela marcação dos depósitos de cálcio intracelulares com o vermelho de alizarina.
A cultura foi induzida a diferenciação osteogênica em todas as amostras do biomaterial, demonstrando em análises iniciais que a associação da biocerâmica Osteosynt® à célula-tronco de cordão umbilical humano sugere apresentar um ótimo potencial para o desenvolvimento de novas técnicas terapêuticas no tratamento de grandes perdas ósseas.
35 REFERÊNCIAS
1. Wei X, et al. Hydroxyapatite microspheres: A novel bioactive and osteoconductive carrier for controlled release of bone morphogenetic protein-2 in bone regeneration. Acta Biomaterialia 2013, 8374- 8873.
2. Coelho APG. Evaluation of bone response to various anorganic bovine bone xenografts: an experimental calvaria defect study. International Journal of Oral and Maxillofacial Surgery, 2013, 298- 301.
3. Rodrigues PL, et al. Efeito da adição de alumina nas propriedades físicas e mecânicas do β-fosfato tricálcico. Cerâmica, 2012, 368-373 4. Mori M, et al. Biological implications of growth factors in bone
remodeling following fracture, surgical resection and bonegrafting. Part 1: Transforming growth factors, bone morphogenetic proteins and related factors. Asian Journal of Oral and Maxillofacial Surgery, p. 117-125, 2010.
5. Guerrero J, et al. Cell interactions between human progenitor-derived endothelial cells and human mesenchymal stem cells in a three-dimensional macroporous polysaccharide-based scaffold promote osteogenesis. Acta Materialia, 2013, 189-204.
6. Oliveira AP. Estudo retrospectivo de 09 casos de enxerto ósseo halógeno. Monografia apresentada à Universidade Federal de Pernambuco para obtenção do título de Especialista em Cirurgia Buco Maxilo Facial, 2008.
7. Pellegrine AA, Macedo LG, Cosmo LA. Transplantes ósseos na odontologia. Nova Odessa: Napoleão, 2008. 272 p.
36 8. Zerbo IR, et al. Histology of human alveolar bone regeneration with a porous tricalcium phos-phate. A report of two cases. Clin Oral Impl Res, 2001, 379-384.
9. Misch CE. Implantes Dentários Contemporâneos. 2a. São Paulo: Santos, 2006. 685 p.
10. Schwarz JM, et al. Observing metabolic functions at the genoma scale. Genome Biology, 2007, p. 123-126.
11. Silveira C D, et al. Stemcell therapy for cardiology: a new path to humanity and a new care for nurses - a case report. Online Brazilian Journal of Nursing [online] 2006 Apr; v.4 n.1, Disponível em: www.uff.br/nepae/objn401silveiraetal.htm. Acesso em 21 de maio de 2012.
12. Peres CM, Curi . Como cultivar células. 1 ed. io de aneiro, Guanabara Koogan, 2005.
13. Muschler G, Nakamoto C, Griffith, LG. Engineering principles of clinical cell-based tissue engineering. Journal Bone Joint Surgery Am, Boston, 2004,p.1541-57.
14. Lobo SE. Associação de células-tronco da polpa dental a biocerâmica de fosfato de cálcio na bioengenharia do tecido ósseo. Tese apresentada a Universidade Federal de São Paulo para obtenção do Título de Doutora em Biologia Estrutural e Funcional, 2011.
15. Samavedi S, Whittington AR, Goldstein AS. Calcium phosphate ceramics in bone tissue engineering: A review of properties and their influence on cell behavior. Acta Biomaterialia, USA, 2009, p.8037-8045. Disponível em: <http://dx.doi.org/10.1016/j.actbio.>. Acesso em: 14 jun. 2013.
37 16. Miranda-Oliveira AL, et al. Isolamento rápido e eficaz de células-tronco mesenquimais de cordão umbilical. Recife,PE. In: Simpósio Internacional De Terapias Avançadas E Células-tronco, 2009.
17. Malagueta-Vieira LLL, et al. Estudo dos canais iônicos nas células-tronco mesenquimais de cordão umbilical humano. Gramado, RS. In: V Congresso Brasileiro Células- Tronco e Terapia Celular, 2010.
18. Albertim GJB. Estudo da participação de canais de potássio no processo de RVD das células-tronco mesenquimais obtidas do cordão umbilical
humano. Gramado, RS. In: V Congresso Brasileiro Células- Tronco e Terapia Celular, 2010.
19. Bittencourt RAC, et al. Isolamento e cultivo de células-tronco mesenquimais da medula óssea. Acta Ortop. Bras. 2006, p. 141-146. 20. Covas, DT. Células-tronco mesenquimais. In: Zago MA, Covas DT.
Células-tronco: a nova fronteira da medicina. São Paulo: Atheneu, 2006. p. 35-48.
21. Meirelles LS, et al. Mesenchymal stem cells reside in virtually all post-natal organs and tissues. Journal of Cell Science, 2006, p. 2204-2213. 22. Meirelles LS, et al. In search of the in vivo identity of mesenchymal stem
cells. Stem Cells, 2008, p. 2287-2299.
23. Meirelles, LS, Fontes AM, Covas DT, Caplan AI. Mechanisms involved in the therapeutic properties of mesenchymal stem cells. Cytokine Growth Factor Rev.,2009, p. 419-427.
24. Bydlowski SP, et al. Características biológicas das células-tronco mesenquimais. Rev. Bras. Hematol. Hemoter., 2009, p. 25-35.
38
39
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Resolução nº 196/96 – Conselho Nacional de Saúde
O(a) Sr(a) foi selecionado(a) e está sendo convidado(a) para participar da pesquisa intitulada: "AVALIAÇÃO DA ASSOCIAÇÃO DE CÉLULAS-TRONCO
MESENQUIMAIS DE CORDÃO UMBILICAL HUMANO À UMA BIOCERÂMICA DE FOSFATO DE CÁLCIO NA BIOENGENHARIA DO TECIDO ÓSSEO", que será realizada pela Dra Ana Patrícia de Oliveira Souza no Laboratório de Cultura de Células do Departamento de Biofísica e Radiobiologia - CCB da UFPE sob Co-orientação da Profa Dra Márcia Bezerra da Silva(Depto de Biofísica e Radiobiologia-CCB/UFPE) e Orientação da Profa Dra Alessandra de Albuquerque Tavares de Carvalho (Depto de Odontologia-CCS/UFPE)
Justificativa e objetivos: Através deste estudo avaliaremos o comportamento das células-tronco de cordão umbilical humano frente a um biomaterial a base de hidroxiapatita e beta tricálcio fosfato, cujo objetivo será diferenciar as células em osteoblastos.
Informações:
Procedimentos: No dia do seu parto a parte do cordão umbilical do seu filho que seria desprezado e posteriormente incinerado será colhido por mim em recipiente estéril e trazido para o laboratório para ser processado em até 06 horas. Será retirada uma parte (a geléia de Warthon) e tratada para retirar as células-tronco mesenquimais(CTMs) que depois será colocada em porções de uma biocerâmica para avaliar como será a diferenciação das CTMs em osteoblastos.
Forma de acompanhamento e assistência: Os pesquisadores estarão à disposição para quaisquer esclarecimentos adicionais pessoalmente, por fone ou email (modo de contato abaixo).
Garantias:
Garantia de esclarecimentos: Os pesquisadores esclarecerão os voluntários quanto a todos os aspectos da pesquisa, antes, durante e depois da mesma. Liberdade de recusa a participação: Sua participação é voluntária, isto é, a qualquer momento você pode recusar-se a participar em qualquer fase da mesma ou de retirar seu consentimento, sem qualquer penalização ou prejuíso. Sigilo: Seus dados pessoais serão mantidos em sigilo.
Ressarcimento e indenização: Não há gastos previstos pela sua participação na pesquisa portanto não há previsão de ressarcimento. Não há riscos previsíveis pela sua participação na pesquisa portanto nãohá previsão de indenização. O benefício relacionado à sua participação será de aumentar o conhecimento científico para na área de bioengenharia de tecido ósseo.
A Sra receberá uma cópia do termo de consentimento livre e esclarecido onde consta o celular/e-mail do pesquisador responsável, e demais membros da equipe, podendo tirar as suas dúvidas sobre o projeto e sua participação, agora ou a qualquer momento. Desde já agradecemos!
Para contato com os pesquisadores: Dra. Ana Patrícia de Oliveira Souza (oapatricia@hotmail.com), Fone: (81) 91038449 (81) 30884310 e Profa Dra Alessandra de Albuquerque Tavares de Carvalho (at.carvalho@uol.com.br) Av. Prof. Morais Rêgo, 1235- Cidade Universitária. Recife, PE-Brasil, CEP: 50.670-901 Fone: (81) 2126-8817. Em caso de dúvidas quanto aos seus direitos como
40 voluntário de pesquisa entre em contato com o Comitê de Ética em Pesquisa da UFPE: Av. Prof. Morais Rêgo, 1235- Cidade Universitária. Recife, PE-Brasil, CEP: 50.670-901 Fone: 21268588 (cepccs@ufpe.br).
Eu,..., concordo em participar da pesquisa intitulada "AVALIAÇÃO DA ASSOCIAÇÃO DE CÉLULAS-TRONCO MESENQUIMAIS DE CORDÃO UMBILICAL HUMANO À UMA BIOCERÂMICA DE FOSFATO DE CÁLCIO NA BIOENGENHARIA DO TECIDO ÓSSEO"
Declaro estar ciente do inteiro teor deste TERMO DE CONSENTIMENTO e estou de acordo em participar do estudo proposto, sabendo que dele poderei desistir a qualquer momento, sem sofrer qualquer punição ou constrangimento. ... (voluntário) ... (pesquisador) ... (testemunha) Recife, ____ de _______________ de 20___.
41
42
AUTHOR INFORMATION PACK 22 Aug 2013 www.elsevier.com/locate/actamat 1
ACTA MATERIALIA
Published on behalf of Acta Materialia, Inc.
AUTHOR INFORMATION PACK TABLE OF CONTENTS . XXX . • Description • Audience • Impact Factor
• Abstracting and Indexing • Editorial Board
• Guide for Authors p.1 p.1 p.1 p.2 p.2 p.4 ISSN: 1359-6454 DESCRIPTION .
Acta Materialia provides a forum for publishing full-length, original papers and
commissioned
overviews which advance the in-depth understanding of the relationship between the processing,
the structure and the properties of inorganic materials. Papers which have a high impact potential
are sought. The structure encompasses atomic and molecular arrangements, chemical and electronic
structures, and microstructure. Emphasis is on either the mechanical or functional
behavior of
inorganic solids at all length scales down to nanostructures.
The following aspects of the science and engineering of inorganic materials are of particular interest:
(i) Cutting-edge experiments and theory as they relate to the understanding of the properties,
(ii) Simulation and modeling preferably combined with experimentation specifically as they relate to
the understanding of the properties,
(iii) Elucidation of the mechanisms involved in the synthesis and processing of materials specifically
as they relate to the understanding of the properties,and
(iv) Characterization of the structure and chemistry of materials specifically as it relates to the
understanding of the properties.
Short communications and comments to papers published in Acta Materialia may be
submitted to Scripta Materialia.
Benefits to authors
We also provide many author benefits, such as free PDFs, a liberal copyright policy, special discounts
on Elsevier publications and much more. Please click here for more information on our author services.
Please see our Guide for Authors for information on article submission. If you require any further
43
AUDIENCE
.
Materials Scientists and Engineers. IMPACT FACTOR
.
2012: 3.941 © Thomson Reuters Journal Citation Reports 2013
AUTHOR INFORMATION PACK 22 Aug 2013 www.elsevier.com/locate/actamat 2 ABSTRACTING AND INDEXING
.
Applied Mechanics Reviews Cambridge Scientific Abstracts Chemical Abstracts
Current Contents Engineering Index INSPEC
Materials Science Citation Index Metals Abstracts PASCAL/CNRS Scopus EDITORIAL BOARD . Coordinating Editor
S. Mahajan, Dept. of Chemical Engineering and Materials Science, University of California at Davis, 1 Shields
Avenue, Davis, CA 95616, USA, Tel: +1 530 752 5132, Fax: +1 530 752 1031, Email: actamat@ucdavis.edu
Editorial Assistant: Becky Houston , Email: actamat@ucdavis.edu Editors
G. Gottstein, Inst. für Metallkunde und Metallphysik, Rheinisch-Westfälische Technische Hochschule
Aachen (RWTH), Kopernikusstr. 14, D-52056 Aachen, Germany, Fax: +49-241-80-2-26-08, Telephone:
+49-241-80-2-68-60 , Email: acta@imm.rwth-aachen.de
Editorial Assistant: Norma Gottstein
M. Harmer, Dept. of Materials Science & Engineering, Lehigh University, 27 Memorial Drive West, Bethlehem,
PA. 18015, USA, Email: actamat@lehigh.edu
Editorial Assistant: Elsie Hamel
K. Hono, National Institute of Materials Science, 1-2-1 Sengen, 305-0047 Tsukuba, Japan, Fax: 81-298-59-2701,
Telephone: 81-298-59-2718, Email: acta@nims.go.jp
Editorial Assistant: Huai Ying Fang
S. Jin, Dept. of Materials Science and Engineering, Dept. of Mechanical & Aerospace Engineering &
Nanoengineering, University of California at San Diego (UCSD), 9500 Gilman Dr, La Jolla, CA 92093, USA , Email:
actamat@ucsd.edu
Editorial Assistant: Michael Reiss
R. Kirchheim, Inst. für Materialphysik, Georg-August Universität Göttingen, Tammannstr. 1, 37077 Göttingen,
Germany, Fax: +49-551-39-5000, Email: acta@uni-goettingen.de
Editorial Assistant: Dorothea Kirchheim
J. Rickman, Dept. of Materials Science & Engineering, Lehigh University, 27 Memorial Drive West, Bethlehem,
PA. 18015, USA, Telephone: +610-758-4236, Email: actamat@lehigh.edu
Editorial Assistant: Elsie Hamel
C.A. Schuh, Dept. of Materials Science and Engineering, Massachusetts Institute of Technology (MIT), 77
Massachusetts Avenue, Cambridge, MA 02139, USA, Fax: 617-324-0052, Telephone: +1-617-452-2659,
Email: actamaterialia@mit.edu
Associate Editors: Professor Katharine M. Flores, Dr. Marc Legros, Professor David Rodney
44 R. Wagner, Institut Laue-Langevin, 6 rue Jules Horotwiz BP 156, 38042 Grenoble, France, Fax:
+33-476-961195, Email: acta@ill.fr
Editorial Assistant: Margrit Wagner
The Board of Governors of Acta Materialia The Board of Governors is constituted as follows: G. Gray, III,
Chair, Treasurer and Board Governor
T.B. Massalski,
Executive Secretary and Board Governor
A.J. Coury,
Board Governor
Y. Brechet,
Société Française de Métallurgie et de Matériaux Representative Governor
C. Hansson,
The Metallurgical Society of CIM (Canada) Representative Governor
W. Kurz,
AUTHOR INFORMATION PACK 22 Aug 2013 www.elsevier.com/locate/actamat 3 FEMS Representative Governor
S. Mahajan,
Coordinating Editor and Governor
T. Ohji, ASM Governor G.B. Olson, ASM Governor D. Raabe,
German Steel Institute (VDeh) Representative Governor
S. Ramakrishna, ASM Governor M. Singh, ASM Governor G.W. Warren, TMS Governor K.S. Anseth,
AUTHOR INFORMATION PACK 22 Aug 2013 www.elsevier.com/locate/actamat 4 GUIDE FOR AUTHORS
.
INTRODUCTION
Acta Materialia provides a forum for publishing full-length, original papers and
commissioned
overviews which advance the in-depth understanding of the relationship between the processing,
the structure and the properties of inorganic materials. Papers which have a high impact potential
are sought. The structure encompasses atomic and molecular arrangements, chemical and electronic
structures, and microstructure. Emphasis is on either the mechanical or functional behavior of
inorganic solids at all length scales down to nanostructures.
The following aspects of the science and engineering of inorganic materials are of particular interest:
(i) Cutting-edge experiments and theory as they relate to the understanding of the properties,
(ii) Simulation and modeling preferably combined with experimentation specifically as they relate to
the understanding of the properties,
(iii) Elucidation of the mechanisms involved in the synthesis and processing of materials specifically
as they relate to the understanding of the properties, and
(iv) Characterization of the structure and chemistry of materials specifically as it relates to the
45
Short communications and comments to papers published in Acta Materialia may be submitted to
Scripta Materialia. BEFORE YOU BEGIN Ethics in publishing
For information on Ethics in publishing and Ethical guidelines for journal publication see
http://www.elsevier.com/publishingethics and http://www.elsevier.com/journal-authors/ethics.
Conflict of interest
All authors are requested to disclose any actual or potential conflict of interest including any financial,
personal or other relationships with other people or organizations within three years of beginning the
submitted work that could inappropriately influence, or be perceived to influence, their work. See
also http://www.elsevier.com/conflictsofinterest. Further information and an example of a Conflict of
Interest form can be found at:
http://elsevier6.custhelp.com/app/answers/detail/a_id/286/p/7923/.
Submission declaration
Submission of an article implies that the work described has not been published previously (except
in the form of an abstract or as part of a published lecture or academic thesis or as an electronic
preprint, see http://www.elsevier.com/postingpolicy), that it is not under consideration for publication
elsewhere, that its publication is approved by all authors and tacitly or explicitly by the responsible
authorities where the work was carried out, and that, if accepted, it will not be published elsewhere
including electronically in the same form, in English or in any other language, without the written
consent of the copyright-holder.
Changes to authorship
This policy concerns the addition, deletion, or rearrangement of author names in the authorship of
accepted manuscripts:
Before the accepted manuscript is published in an online issue: Requests to add or remove
an author,
or to rearrange the author names, must be sent to the Journal Manager from the corresponding author
of the accepted manuscript and must include: (a) the reason the name should be added or removed,
or the author names rearranged and (b) written confirmation (e-mail, fax, letter) from all authors that
they agree with the addition, removal or rearrangement. In the case of addition or removal of authors,
this includes confirmation from the author being added or removed. Requests that are not sent by
the corresponding author will be forwarded by the Journal Manager to the corresponding author, who
must follow the procedure as described above. Note that: (1) Journal Managers will inform the Journal
Editors of any such requests and (2) publication of the accepted manuscript in an online issue is
46
After the accepted manuscript is published in an online issue: Any requests to add, delete,
or rearrange
author names in an article published in an online issue will follow the same policies as noted above
and result in a corrigendum.
AUTHOR INFORMATION PACK 22 Aug 2013 www.elsevier.com/locate/actamat 5
Copyright
Upon acceptance of an article, authors will be asked to complete a 'Journal Publishing Agreement' (for
more information on this and copyright see http://www.elsevier.com/copyright). Acceptance of the
agreement will ensure the widest possible dissemination of information. An e-mail will be sent to
the corresponding author confirming receipt of the manuscript together with a 'Journal Publishing
Agreement' form or a link to the online version of this agreement.
Subscribers may reproduce tables of contents or prepare lists of articles including abstracts for internal
circulation within their institutions. Permission of the Publisher is required for resale or distribution
outside the institution and for all other derivative works, including compilations and translations
(please consult http://www.elsevier.com/permissions). If excerpts from other copyrighted works are
included, the author(s) must obtain written permission from the copyright owners and credit the
source(s) in the article. Elsevier has preprinted forms for use by authors in these cases: please consult
http://www.elsevier.com/permissions.
Retained author rights
As an author you (or your employer or institution) retain certain rights; for details you are referred
to: http://www.elsevier.com/journal-authors/author-rights-and-responsibilities.
Role of the funding source
You are requested to identify who provided financial support for the conduct of the research and/or
preparation of the article and to briefly describe the role of the sponsor(s), if any, in study design; in
the collection, analysis and interpretation of data; in the writing of the report; and in the decision to
submit the article for publication. If the funding source(s) had no such involvement then this should
be stated. Please see http://www.elsevier.com/funding.
Funding body agreements and policies
Elsevier has established agreements and developed policies to allow authors whose articles appear in
journals published by Elsevier, to comply with potential manuscript archiving requirements as specified
as conditions of their grant awards. To learn more about existing agreements and policies please visit
http://www.elsevier.com/fundingbodies.
Language (usage and editing services)
Please write your text in good English (American or British usage is accepted, but not
a mixture of these). Authors who feel their English language manuscript may require
47
editing to eliminate possible grammatical or spelling errors and to conform to correct
scientific English may wish to use the English Language Editing service available from
Elsevier's WebShop http://webshop.elsevier.com/languageediting/ or visit our customer support site
http://support.elsevier.com for more information.
Submission
Submission to this journal proceeds totally online and you will be guided stepwise through the creation
and uploading of your files. The system automatically converts source files to a single PDF file of the
article, which is used in the peer-review process. Please note that even though manuscript source
files are converted to PDF files at submission for the review process, these source files are needed for
further processing after acceptance. All correspondence, including notification of the Editor's decision
and requests for revision, takes place by e-mail removing the need for a paper trail.
Submit your article
Please submit your article via http://ees.elsevier.com/am/.
Referees
Please submit, with the manuscript, the names, affiliations, and e-mail addresses of 4 potential
referees. Note that the editor retains the sole right to decide whether or not the suggested reviewers
are used. PREPARATION
Use of wordprocessing software
It is important that the file be saved in the native format of the wordprocessor used. The text should
be in single-column format. Keep the layout of the text as simple as possible. Most formatting codes
will be removed and replaced on processing the article. In particular, do not use the wordprocessor's
options to justify text or to hyphenate words. However, do use bold face, italics, subscripts,
superscripts etc. When preparing tables, if you are using a table grid, use only one grid for each
individual table and not a grid for each row. If no grid is used, use tabs, not spaces, to align columns.
AUTHOR INFORMATION PACK 22 Aug 2013 www.elsevier.com/locate/actamat 6 The electronic text should be prepared in a way very similar to that of conventional manuscripts
(see also the Guide to Publishing with Elsevier:
http://www.elsevier.com/guidepublication). Note that
source files of figures, tables and text graphics will be required whether or not you embed your figures
in the text. See also the section on Electronic artwork.
To avoid unnecessary errors you are strongly advised to use the 'spell-check' and 'grammar-check'
functions of your wordprocessor.
Article structure
General guidelines for online submission:
Elsevier can accept text files in most standard word-processing formats but Microsoft Word 97 is
48
preferred. Alternatively, the initial submission can be in either PostScript or PDF format. Please note,
however, that the text file of a revision must be uploaded in an editable format, either Microsoft Word
or LaTex. Graphics should be high-resolution and the preferred formats are either TIFF or JPEG. For
further information on the preparation of electronic artwork please refer to the following website:
http://www.elsevier.com/artworkinstructions.
Please follow the instructions below for guidance on the style of the journal. Most formatting
codes are removed or replaced when your article is prepared for publication so there is no need
for you to use excessive layout styling. However, please do not use options such as automatic
word breaking, justified layout, double columns or automatic paragraph numbering (especially for
numbered references). Do use bold face, italic, subscripts, superscripts, etc., as appropriate. Ensure
that each new paragraph is clearly indicated. When preparing tables, if you are using a table grid,
please use only one grid for each separate table and not a grid for each row. If no grid is being used,
use tabs to align columns instead of spaces.
All online submissions must be accompanied by a covering letter detailing what you are submitting.
Please indicate the author to whom correspondence should be addressed (in the case of multiple
authors) and include a contact address, telephone/fax numbers for the corresponding author and email
addresses for all authors. Please include details of any previous or concurrent submissions and
also any information that will support your submission (e.g. original or confirmatory data, relevance,
topicality). Please indicate if this is a resubmission of a paper previously rejected by an Acta Materialia
editor and, if so, provide the manuscript number of the rejected paper along with the name of the
processing editor. (Referees are chosen carefully and all editorial decisions are considered final. In the
event of rebuttal by the authors, complete statements should be emailed directly to the processing
editor. The editor will invite resubmission if he determines that the argument supports it.) Please note
that when your manuscript is received at Elsevier it is considered to be in its final form. Therefore
you need to check your manuscript carefully before you submit it online.
Length of papers
The pressure for publication space in Acta Materialia is extreme. This situation may require the
processing editor to impose a limitation on the length of a paper. Papers are normally be less than
10 printed pages in length; as a rule of thumb, a paper of 20 double-spaced typescript pages, plus
a typical number of figures (8 or so) reduces to 10 printed pages. Use double spacing and minimum
49
1-inch (3 cm) margins, and 12 pt font size standard fonts. Papers which are longer than 25 doublespaced
typescript pages may be returned by the processing editor to the authors with a request that
they be shortened before being considered further. On the other hand, extremely short papers less
than 3300 words will not be processed. Short communications and comments to papers published in
Acta Materialia should be submitted to Scripta Materialia.
Pagination
Please ensure that your manuscript is paginated, as this will help both editors and reviewers to process
it promptly.
Subdivision - numbered sections
Divide your article into clearly defined and numbered sections. Subsections should be numbered
1.1 (then 1.1.1, 1.1.2, ...), 1.2, etc. (the abstract is not included in section numbering). Use this
numbering also for internal cross-referencing: do not just refer to 'the text'. Any subsection may be
given a brief heading. Each heading should appear on its own separate line.
Introduction
Provide a critical assessment of the literature relevant to the problem at hand, delineating unresolved
issues. State clear objectives to explain how this study will take the field forward. AUTHOR INFORMATION PACK 22 Aug 2013 www.elsevier.com/locate/actamat 7
Experimental
Provide sufficient detail to allow the work to be reproduced. Methods already published should be
indicated by a reference: only relevant modifications should be described.
Error bars:
Error bars are required on all experimental and calculated data points with an explanation in the text
as to how the errors were determined.
SI Units
SI units should be used throughout.
Theory/calculation
A Theory section should extend, not repeat, the background to the article already dealt with in the
Introduction and lay the foundation for further work. In contrast, a Calculation section represents a
practical development from a theoretical basis.
Results
Results should be clear and concise.
Discussion
Should develop cogent explanation for the results and explore their significance. In the case
of computational studies, results should be compared with information available from published
experimental work, if possible.
Conclusions
The main conclusions of the study may be presented in a short Conclusions section, which should
stand alone.
Appendices
If there is more than one appendix, they should be identified as A, B, etc. Formulae and equations in
