Avaliação do efeito do ambiente enriquecido sobre o processo de desmielinização e remielinização

(1)

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO

Departamento de Biociências

AVALIAÇÃO DO EFEITO DO AMBIENTE ENRIQUECIDO SOBRE O PROCESSO DE DESMIELINIZAÇÃO E REMIELINIZAÇÃO

Nome do aluno: Nathalia Serra de Oliveira Nome do orientador: Profa. Dra.

Local de trabalho: Departamento de Biociências da Universidade Federal de São

Paulo (UNIFESP) – Campus Baixada Santista

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO

Departamento de Biociências – Campus Baixada Santista

Curso de Terapia Ocupacional

Nathalia Serra de Oliveira

Profa. Dra. Glaucia Monteiro de Castro

Departamento de Biociências da Universidade Federal de São Campus Baixada Santista

Santos-SP

2011

15

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO

Campus Baixada Santista

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO

Departam

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO

Departamento de– Campus Baixada Santista

Curso de Terapia Ocupacional

Trabalho de Conclusão de Curso (TCC) apresentado na Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP) Campus Baixada Santista

Terapia Ocupacional,

requisitos para obtenção do título de bacharel em Terapia Ocupacional. Orientadora: Profa. Drª. Glaucia Monteiro de Castro

16

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO

Campus Baixada Santista

Trabalho de Conclusão de Curso (TCC) apresentado na Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP) – Campus Baixada Santista – Curso de Terapia Ocupacional, como parte dos requisitos para obtenção do título de bacharel em Terapia Ocupacional.

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17 Santos-SP

2011

Autorizo a reprodução e divulgação total ou parcial deste trabalho, por qualquer meio convencional ou eletrônico, para fins de estudo e pesquisa, desde que citada a fonte.

Ficha Catalográfica

Oliveira, N.S.

Avaliação do efeito do ambiente enriquecido sobre o processo de desmielinização e remielinização /Nathalia Serra de Oliveira.

Santos, 2011. 82f

Trabalho de Conclusão de Curso (Graduação) - Universidade Federal de São Paulo - UNIFESP - Campus Baixada Santista, 2011

Curso: Terapia Ocupacional

Orientador: Glaucia Monteiro de Castro

PALAVRAS-CHAVE. 1.Esclerose múltipla. 2, Cuprizona 3.Enriquecimento ambiental. 4.Desmielinizaçao. 5. Testes comportamentais. I. Glaucia Monteiro de Castro. II. Avaliação do efeito do ambiente enriquecido sobre o processo de desmielinização e remielinização. III. Unifesp – Campus Baixada Santista

CDD 615.8515 Ficha catalográfica - Biblioteca - UNIFESP, Campus Baixada Santista.

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18

Folha de Aprovação

Nathalia Serra de Oliveira

AVALIAÇÃO DO EFEITO DO AMBIENTE ENRIQUECIDO SOBRE O PROCESSO DE DESMIELINIZAÇÃO E REMIELINIZAÇÃO

Trabalho de Conclusão de Curso (TCC) apresentado na Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP) – Campus Baixada Santista, para o Curso de Terapia Ocupacional.

Orientadora: Profa. Dra. Glaucia Monteiro de Castro

Aprovado em:

Banca Examinadora

Profa Devaneide Silva

Instituição: UNISANTA / Lar das Moças Cegas Assinatura

Profa Dra Glaucia Monteiro de Castro Instituição: UNIFESP

Assinatura

Profa Dra Luciana Le Sueur Maluf Instituição: UNIFESP

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19 D

edicatória

À minha família e à minha orientadora por participarem da realização

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20

Agradecimentos

Á minha mãe, Sônia, o meu maior exemplo de dedicação, força, amor e amizade, a qual me orgulho diariamente em tê-la ao meu lado. Por todo o apoio e incentivo durante essa jornada e por não medir esforços para a realização dos meus sonhos. Agradeço diariamente por você fazer parte da minha vida, minha grande amiga, fonte de luz, conforto, amor e segurança. Compreendendo a minha ausência, comemorando cada pequena conquista e me guiando em cada passo desse longo caminho.

Ao meu pai Mauricio (in memorian) e meu avô, Arnaldo (in memorian), exemplos de amor, paciência, superação e compreensão, que me ensinaram muito durante nossa convivência. Sinto enorme satisfação em ter dividido momentos preciosos e por auxiliarem na construção dos meus valores. Certamente devo muito do que sou hoje a vocês.

Ao meu irmão, Luan e a toda Família Serra pelo companheirismo, amizade e por todo apoio.

Ao meu namorado Reinaldo, sempre presente acompanhando todo o meu esforço e por compreender minhas ausências, me apoiando, incentivando e estimulando diariamente.

Ás minhas amigas e (agora) companheiras de profissão Mariane Mendonça, Natália Ramalho Putini e em especial a Gabriela Galacini Prado pela constante presença em todos os momentos que com muito afeto me trazem momentos muito significativos e eternos.

Ás minhas companheiras de laboratório Carine e a Daniele, pela amizade, apoio e por me auxiliarem na realização desse trabalho.

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21 Às Professoras Luciana LeSueur Maluf, Carolina Carvalho e Carla Medalha por todo conhecimento transmitido com paciência e dedicação e pela amizade.

À minha orientadora Professora Drª Glaucia Monteiro de Castro, por todo ensinamentos, amizade, lições de profissionalismo, amor à profissão, ética, paciência e toda confiança em mim depositada, me incentivando sempre e proporcionando momentos de muita alegria e satisfação. Orientar é um dom.

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22

Resumo

OLIVEIRA, N S. AVALIAÇÃO DO EFEITO DO AMBIENTE ENRIQUECIDO SOBRE O PROCESSO DE DESMIELINIZAÇÃO E REMIELINIZAÇÃO . 82f. TCC do Curso de Terapia Ocupacional da Universidade Federal de São Paulo. Campus Baixada Santista, Santos, 2011 A Esclerose Múltipla (EM) é uma doença neurológica crônica, inflamatória, desmielinizante do Sistema Nervoso Central (SNC). Para seu estudo diversos modelos vêm sendo utilizados, entre os quais desmielinização induzida com cuprizona, a qual desencadeia alterações comportamentais nos animais. Estudos recentes fornecem novos parâmetros sobre a ação do

enriquecimento ambiental e sua relevância para o envelhecimento e doenças

neurodegenerativas. O enriquecimento ambiental é uma condição de habitação para animais que permite maior estimulação sensorial, motora, social e cognitiva em relação às condições-padrão, proporcionando a reorganização funcional dos circuitos neuronais. O presente estudo tem por objetivo avaliar o processo de desmielinização e neurotoxicidade desencadeado pelo tratamento com a cuprizona frente à exposição ao ambiente enriquecido. Foram utilizados ratos da linhagem Lewis, machos com idade de sete semanas. Os animais controle receberam ração comercial moída e o grupo tratado recebeu ração moída com adição de cuprizona (0,6%) por 4 semanas. Os grupos que passaram por o período de recuperação receberam a ração comercial normal por mais uma semana, totalizando 5 semanas. Animais pertencentes aos grupos de ambiente enriquecido foram expostos a sessões diárias de uma hora durante o período experimental. Na primeira, terceira e última semana do tratamento, os animais foram submetidos a testes de comportamento e neurotoxicidade. Grupos tratados com cuprizona apresentam escores de neurotoxicidade significativamente mais elevados (p < 0,001) 15 dias após início do tratamento. Os resultados do teste Walking Track demonstraram impressão completa e uniforme das patas dos animais do grupo controle. Por outro lado, a impressão das patas dos animais tratados apresentou-se errátil e sem uniformidade de caminhada e na distância entre as pegadas. Animais expostos ao ambiente enriquecido e ao período de recuperação apresentam impressão uniforme, semelhante aos dos animais controle. No Campo aberto, notou-se redução significativa na quantidade de cruzamentos e na exploração vertical nos grupos tratados com cuprizona quando comparado ao grupo controle, por outro lado animais tratados expostos ao ambiente enriquecido apresentam índices semelhantes aos dos animais controle. No teste do labirinto em cruz, com o decorrer do tratamento, o grupo cuprizona aumentou significativamente sua permanência no braço fechado e diminuiu significativamente sua permanência no braço aberto. Animais tratados que frequentaram sessões de ambiente enriquecido apresentam índices semelhantes ao grupo controle e na analise do processo de desmielinização com Luxol Fast Blue apresentam densidade intermediaria entre os grupos controle após o período de recuperação. Estes dados sugerem que a exposição ao ambiente enriquecido pode atuar na recuperação dos animais com desmielinização induzida pela cuprizona, estimulando a regeneração.

Palavras-chave: Esclerose Multipla. Cuprizona. Enriquecimento Ambiental. Desmielinização. Testes Comportamentais

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23

Abstract

OLIVEIRA,N S . Evaluation of the effect of enriched environment on the process of demyelization and remyelization. 82f. TCC do Curso de Terapia Ocupacional da Universidade Federal de São Paulo. Campus Baixada Santista, Santos, 2011

Multiple Sclerosis (MS) is a chronic neurological disease, inflammatory, demyelinating of the Central Nervous System (CNS). To study this disease many models have been used, such as the demyelination induced by cuprizone, induce behavioral changes in experimental animals. Recent studies provide pointed to new clues to the environmental enrichment and their relevance to the aging and neurodegenerative diseases. The environmental enrichment is a condition of housing for animals that allows greater stimulation sensory, motor, social and cognitive in relation to pattern condition, providing the reorganization neuronal circuits. The aim of this study is analyze the demyelination and neurotoxicity process in animals treated with cuprizone exposed to the enriched environment. Lewis rats, males ageing seven weeks, received milled chow and the treated group received addition of cuprizone (0.6 %) in the diet for four weeks. The groups which were permitted to recover received a commercial chow one more week, in a total of five weeks (CEP 103/2010). The animals exposed to the enriched environment were exposed to daily sessions of one hour during the experimental period. In the first, third, and last week of treatment, the animals were subjected to tests of behavior and neurotoxicity. At the end of the treatment, the animals were anesthetized and perfused. Groups treated with cuprizone present scores of neurotoxicity significantly higher than control groups. The results of the Walking Track test demonstrated the hind foot prints impression complete and uniform in the control group. On the other hand, the treated animals presented the uncertain steps. Animals exposed to the enriched environment and were permitted to recover exhibited a uniform pattern, similar to those of control animals. In the open field, a significant reduction in the number of crosses and the readings in the cuprizone treated groups in comparison to the control group. However, treated animals exposed to the enriched environment exhibited indexes similar to control animals. The elevated plus-maze test, the cuprizone group increased significantly its permanence in the closed arm. In addition, treated animals exposed to the enriched environment present indexes similar to the control group. Supporting our clinical findings, histological analysis showed intermediate density between the groups CPZ and CTR EER at the end of the experimental period. These results suggest that the exposition to an enriched environment could act to induce the recovering of the demyelination process induced by cuprizone, activating the regeneration process.

Keywords: Multiple Sclerosis, Cuprizone. Environmental enrichment. Demyelination.

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24

LISTAS DE ABREVIAÇÕES E SIGLAS

BDNF Fator neurotrófico derivado do cérebro

BHE Barreira Hemato-Encefálica

CEMIB Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica

CPZ Grupo Tratado com Cuprizona

CPZ EE Grupo tratado com cuprizona exposto ao ambiente enriquecido

CPZ EER Grupo tratado com cuprizona exposto ao ambiente enriquecido e com período de recuperação

CPZ R Grupo tratado com cuprizona exposto com período de recuperação

CTR Grupo Controle

CTR EE Grupo controle exposto ao ambiente enriquecido

CTR EER Grupo controle exposto ao ambiente enriquecido e com período de recuperação

CTR R Grupo controle com período de recuperação

EA Enriquecimento Ambiental

EM Esclerose Multipla

EQ 5D EuroQoL-5D

FOB Funcional observacional battery

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LFB Luxol Fast Blue

NGF Fator de Crescimento neural

SF 36 Medical outcomes study-36 – Item short from health survery

SNC Sistema Nervoso Central

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LISTAS DE FIGURAS

Figura 1 Delineamento experimental

Figura 2 Sessão de ambiente enriquecido

Figura 3 Evolução da massa corpórea durante o período experimental

Figura 4 Comparativo do consumo diário de ração

Figura 5 Teste de Neurotoxicidade

Figura 6 Exploração vertical

Figura 7 Bolos fecais

Figura 8 Cruzamentos no Campo Aberto

Figura 9 Permanência no centro do Campo Aberto

Figura 10 Comportamento de limpeza no Campo Aberto

Figura 11 Entradas no braço aberto e braço fechado

Figura 12 Permanência no braço aberto e no braço fechado

Figura 13 Exploração do objeto conhecido

Figura 14 Exploração do objeto desconhecido

Figura 15 Exploração do ambiente

Figura 16 Interação social com resposta

Figura 17 Interação social sem resposta

Figura 18 Comportamentos individualizados

Figura 19 Walking track

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27

SUMÁRIO

pág

I.INTRODUÇÃO 15

I.1 Esclerose Multipla 15

I.2 Intervenções da Terapia Ocupacional 17 I.3 Terapia Ocupacional e Integração Sensorial 19

I.3 Modelos Experimentais 20

I.4 Cuprizona 21

I.5 Modelo Cuprizona em ratos Lewis 21 I.6 Alterações comprtamentais 22

I.7 Enriquecimento Ambiental 24

II. JUSTIFICATIVA 27

III. OBJETIVOS 29

III.1 Geral 29

III. 2 Específicos 29

IV. MÉTODOS 30

IV.1 Animais e tratamento 30

IV.2 Dieta 30

IV.3 Delineamento experimental 30

IV.4 Enriquecimento Ambiental 32

IV.5 Avaliação comportamental 33 IV.5.1 Teste de neurotoxicidade 33 IV.5.2 Teste de Campo aberto 33 IV.5.3 Teste de reconhecimento de objetos 33

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28 IV.5.4 Teste de interação social 34

IV.5.5 Teste do Labirinto em cruz elevado 34

IV.5.6 Walking track 34

IV.6 Eutanásia e Avaliação Histopatológica do Processo de Desmielinização

35

IV.7 Analise Estatística 36

V. RESULTADOS 36

V.1 Massa Corporea e consumo de ração 36

V.2 teste de neurotoxicidade 38

V.3 Campo aberto 41

V.4 Labirinto em Cruz elevado 46

V.5 Teste de reconhecimento de objetos 48 V.6 Teste de interação social 52

V.7 Walking track 55

V.8 Analise Morfologica 57

VI DISCUSSÃO 59

VII. CONSIDERAÇÕES FINAIS 68

VIII. ANEXOS 69

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29

I. INTRODUÇÃO

I.1. Esclerose Multipla

A Esclerose Múltipla (EM) é uma doença inflamatória crônica do Sistema Nervoso Central (SNC), resultante de uma resposta imune fora dos padrões de normalidade provocando a destruição da mielina, e pode apresentar uma evolução progressiva e incapacitante. Geralmente a EM se manifesta entre os 30 e 40 anos de idade no auge da capacidade física e mental de seus portadores e afeta mais as mulheres, na proporção aproximada de 5:2 (EWING e BERNARD, 1998 ; TIBERY, 2005; MAITRA , 2010).

Os sintomas mais comuns compreendem o comprometimento motor, espasmos tônicos, distúrbios sensitivos, alterações visuais, disfunção de esfíncteres e episódios dolorosos. (TIBERY, 2005) Com a progressão da doença, pode ocorrer a perda cognitiva e dificuldades de concentração e memória (EWING e BERNARD, 1998).

Pessoas diagnosticadas com esclerose múltipla apresentam diversas dificuldades na realização de suas atividades diárias, perda de mobilidade e dificuldades na realização de atividades de auto-cuidado. Programas de reabilitação com uma equipe multiprofissional são indicados para esses pacientes, com apresentação de resultados significativos na minimização dos sintomas (MAITRA, 2010).

Embora a etiologia da EM permaneça desconhecida, estudos epidemiológicos confirmam susceptibilidade genética para a doença, indicando diferentes genes envolvidos na manifestação e no curso clínico da EM (CHAPMAN et al, 2001 e MAITRA , 2010). Além disso, o número de casos substancialmente maior em latitudes extremas sugere o envolvimento de componente ambiental, como infecções virais comuns, visto que a migração para áreas de menor risco antes da adolescência reduz o risco de desenvolvimento da EM (KEEGAN e NOSEWORTHY,2002; GALE e HEMMER, 2002. MARTYN, 1995)

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30 Em função das características imunológicas e patológicas, numerosos estudos apontam para a natureza autoimune da EM, na qual componentes do SNC atuam como antígenos, atraindo células do sistema imunológico que atravessam a barreira hematoencefálica (BHE), dando início à reação imunológica (BRIGHT e SRIRAM 2001). Desta forma, a EM constitui-se um exemplo de resposta inflamatória aberrante, na qual a bainha de mielina torna-se o alvo primário do ataque imunológico (STEINMAN et al 2002).

O ataque autoimune orquestrado contra epítopos da bainha de mielina e oligodendrócitos promove a liberação de anticorpos juntamente com a fixação do sistema complemento, fazendo com que macrófagos fagocitem a mielina. Paralelamente, a liberação de citocinas, mediadores tóxicos solúveis e óxido nítrico lesam o tecido, liberando radicais livres, os quais ocasionam estresse oxidativo e excitotoxicidade pelo glutamato (BRÜCK, 2005).

Através da análise post mortem das lesões não é possível esclarecer se a perda axonal é decorrente da inflamação cerebral difusa ou da ativação da micróglia e, consequentemente, se o comprometimento neuronal é um processo degenerativo totalmente independente. Evidências sugerem que axônios recentemente desmielinizados são vulneráveis ao microambiente da reação inflamatória das lesões agudas, o que reforça o envolvimento da linhagem oligodendrocítica na sobrevivência neuronal mediada por contato e liberação de fatores de crescimento, os quais atuam em vias de sinalização celular (STORCH et al,2000; ARNETT et al 2003 e WILKINS et al , 2003 ).

A reação inflamatória que promove a desmielinização cria um ambiente que impede o acesso, a sobrevivência e, consequentemente, a diferenciação de precursores do oligodendrócito. Nas lesões crônicas, ocorre falha progressiva na remielinização, resultando na perda da condução axonal, o que irá contribuir para atrofia axonal. Os axônios e a mielina perdidos são substituídos por uma cicatriz glial (ARNETT et al., 2003).

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31

I.2 Intervenções da Terapia Ocupacional

A neuro-reabilitação é uma intervenção complementar ao tratamento medicamentoso, formando assim uma estratégia integral de cuidado com o paciente com a finalidade de minimizar a incapacidade de uma pessoa com uma doença neurológica (CACÉRES, 2000). A Terapia Ocupacional (TO) conta com valiosos instrumentos para auxiliar pacientes com esclerose múltipla a fim de melhorar a qualidade de vida (do paciente, do cuidador e da família), incentivar a participação de atividades que os pacientes querem e/ou precisam executar e promover maior independência, considerando as dificuldades do individuo em uma abordagem global (biopsicossocial) (STEULTEJENS et al., 2011 e HOFFOMANN e DYNIEWICZ, 2009 ).

A EM é considerada uma doença incapacitante que atinge adultos jovens, com curso clinico variável e imprevisível, com diferentes manifestações clinicas e necessidades que podem se modificar com a progressão da doença, onde 50% dos pacientes apresentam problemas relacionados a mobilidade (CACÉRES, 2000). Os pacientes geralmente são encaminhados para a terapia ocupacional com queixas de fadiga, alterações de coordenação motora, alterações de sensibilidade e espasticidade que provocam limitações no desempenho de atividades do cotidiano. E em muitos casos o encaminhamento ocorre após a significativa evolução do curso clinico da doença (STEULTEJENS et al., 2011).

O profissional de TO desenvolve estratégias a fim de atingir as necessidades individuais especificas com base na variação dos sintomas da EM. É necessário realizar avaliações periódicas, pois com a progressão da doença, o foco da intervenção necessita ser reestruturado. Todos os pacientes com EM podem se beneficiar de intervenções e/ou orientações da TO, que idealmente deveriam ter início concomitante com a manifestação/diagnóstico da doença.

As intervenções do terapeuta ocupacional têm profundo efeito nas atividades diárias dos pacientes com esclerose múltipla, pois lutam com a perda de suas habilidades, dificuldades na mobilidade e em atividades de auto-cuidado dia após dia.

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32 Além de mudanças significativas observadas no âmbito físico, emocional e na cognição em decorrência da progressão da doença, estes pacientes são expostos a frequentes e longas internações para intervenções medicamentosas e ao tratamento de reabilitação (CACÉRES, 2000).

Como um profissional pertencente a equipe de reabilitação, o Terapeuta Ocupacional pode ser um facilitador do processo de reorganização do individuo em relação as atividades de vida diária e atividades de seu interesse:orientando, dando condições, treinando, supervisionando, analisando e adaptando o espaço físico, mobiliários, instrumentos que serão utilizados (HOFFOMANN e DYNIEWICZ, 2009) e maximizando a independência nas atividades de vida diárias (MAITRA, 2010).

A TO proporciona o desenvolvimento de capacidades e habilidades, faz adaptações individuais que tem como meta proporcionar a independência funcional na vida diária, manutenção da força, movimentos e coordenação motora. (HOFFOMANN e DYNIEWICZ 2009). Utilizando alguns recursos como a dessensibilização, organização sensorial, técnicas manuais e massagens, exercícios, banhos de contraste, reeducação neuromuscular, reinserção social, auto-cuidado, atividades de vida diária, entre outros (MAITRA , 2010)

Sabe-se que ao ser diagnosticado com uma doença crônica, o paciente desenvolve preocupações, medo e revolta, ante as “avaliações negativas” de sua vida (HOFFOMANN e DYNIEWICZ 2009). A TO tem por objetivo observar o indivíduo como um todo, com necessidades físicas, psíquicas e sociais. Desta forma, planeja ações que atendem todas as demandas desse indivíduo, a partir de suas prioridades e interesses.

Umas das queixas mais frequentes do paciente com esclerose múltipla são a redução na força, perda dos movimentos, da sensibilidade e da coordenação motora. Pode-se então proporcionar atividades, como por exemplo: de autocuidado, respeitando as características individuais, com um olhar critico e reflexivo (HOFFOMANN e DYNIEWICZ 2009) e concomitantemente pode-se trabalhar aspectos motores, sociais, emocionais em uma mesma atividade.

A fraqueza nas mãos, rigidez a espasticidade e a fadiga excessiva são um dos sintomais que mais causam preocupação nos pacientes acometidos pela EM. Com

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33 essas características o paciente pode ser beneficiado pela Terapia de Mão oferecida por Terapeutas ocupacionais, onde são utilizados exercícios e atividades terapêuticas, baseadas em técnicas especificas e (se necessário) no uso de órteses. (HOFFOMANN e DYNIEWICZ 2009).

A fadiga e a termo-sensibilidade são as manifestações clinicas comuns que podem limitar as intervenções na neuroreabilitação e que muitas vezes pode ser mal compreendida pela família, amigos e empregadores, já que não é uma manifestação visível. Foi demonstrado que a elevação da temperatura corpórea dos pacientes com EM podem afetar a sua condição geral (CACÉRES 2000). O terapeuta ocupacional deve adotar estratégias para minimizar essa sintomatologia ao longo da terapia. Tendo como objetivo a conservação de energia, facilitação das atividades (HOFFOMANN e DYNIEWICZ 2009), utilização eficiente dos segmentos corporais. Da mesma forma, é fundamental (STEULTEJENS et al 2011) alem de estar atento às manifestações desses sintomas.

O terapeuta ocupacional pode propor intervenções que permitam ao paciente com alterações cognitivas e de memória, desenvolvam diferentes estratégias compensatórias para adquirirem maior independência em suas atividades. Além de utilizar a estimulação cognitiva através de atividades que trabalhem o raciocínio, memória e atenção (MAITRA, 2010)

Estudos recentes mostram que a TO é associada a positivos resultados para pacientes com esclerose múltipla incluídos em programas de reabilitação (MAITRA et al., 2010, HOFFOMANN e DYNIEWICZ 2009).

1.3 Terapia Ocupacional e Integração sensorial

Na prática clínica em Terapia Ocupacional pode-se utilizar a técnica de Integração Sensorial (IS), indicada para disfunções sensoriais, déficits de atenção, hiperatividade, distúrbios de aprendizagem, incapacidades motoras, síndromes genéticas, lesões neurológicas, e também pode ser aplicada como meio de prevenção das possíveis perdas das capacidades físicas que sofremos ao longo de nossos anos

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34 de vida. A IS baseia-se no entendimento da sequência do desenvolvimento humano e, no entendimento das respostas adaptativas que o indivíduo é capaz de expressar a cada nível etário. Se a modulação do sistema sensorial e as capacidades de suporte funcional não estão integradas, então as respostas adaptativas não atingirão um nível ótimo. (AYRES, 1972).

A IS é o processo que organiza as sensações do próprio corpo e do ambiente, permitindo a organização do comportamento e o uso eficiente do corpo nas ações e atividades cotidianas. Todas as ações, não só motoras, mas também processos de aprendizagem e formação de conceito são dependentes da capacidade de interpretar as informações sensoriais, provenientes tanto do meio como dos nossos próprios movimentos e das interações pessoais, materiais e objetos (AYRES, 1972).

Ayres, 1972 pesquisou o papel das sensações próprias do corpo:, tátil, vestibular e proprioceptivo, no planejamento motor e na organização do comportamento, verificando seu impacto na aprendizagem e no desempenho escolar, seus resultados sugerem que a IS melhorou a aprendizagem, o desempenho motor e o desempenho escolar (AYRES, 1972).

I.4 Modelos Experimentais

A encefalomielite experimental autoimune (EAE) é o modelo experimental da EM mais utilizado em pesquisas. Muito significativo, trouxe muitas contribuições para o esclarecimento do processo inflamatório no SNC, tanto que as terapias medicamentosas mais modernas utilizadas atualmente foram desenvolvidas com bases neste modelo. Entretanto, não tem se mostrado adequado para avaliação dos processos de lesão do oligodendrócito. As várias formas de indução da EAE, ou a utilização de desmielinização induzida por vírus são caracterizadas por um processo de desmielinização esporádico, inconsistente e esparso, fazendo com que a análise destas lesões seja dificultada por falta de reprodutibilidade anatômica e por variabilidade entre os animais utilizados (MATSUSHIMA e MORELL, 2001).

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35 Para avaliação dos processos de desmielinização/remielinização, o modelo de desmielinização quimicamente induzido com a adição de cuprizona à dieta dos animais vem sendo amplamente utilizado em camundongos, visto que a lesão provocada permite a avaliação dos parâmetros que têm auxiliado no esclarecimento dos processos envolvidos na lesão do oligodendrócito (ARNETT et al., 2003)

I.5 Cuprizona

A cuprizona (bis-ciclohexanona-oxaldiidrazona) vem sendo cada vez mais utilizada no desenvolvimento de modelos de desmielinização tóxica, uma vez que a dieta com adição de cuprizona em animais jovens induz desmielinização sincronizada e consistente, permitindo a avaliação molecular, bioquímica e morfológica dos sítios lesados. Com a remoção deste composto da dieta, é possível avaliar o processo de remielinização (MATSUSHIMA MORELL, 2001).

No tratamento com a cuprizona, a desmielinização é o primeiro efeito observado nos animais, sendo os oligodendrócitos o foco primordial. Por atuar como um quelante de cobre, elemento essencial de algumas metaloenzimas, há sugestões de que os oligodendrócitos sejam especialmente sensíveis à deficiência deste elemento (ARNETT et al 2003 e ADAMO, 2006). A razão pela qual a desmielinização ocorre ainda não foi esclarecida, mas acredita-se que seja em função das grandes demandas metabólicas exigidas para manutenção da bainha de mielina (KONDO, NAKANO e SUSUKI, 2003).

I.6 Modelo da Cuprizona em Ratos Lewis

A principal motivação para o desenvolvimento de um modelo de desmielinização química em ratos Lewis é o fato deste animal ser geneticamente predisposto à autoimunidade, possibilitando o estudo do processo de desmielinização e remielinização independentes da interferência da resposta inflamatória autoimune periférica (ADAMO, 2006).

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36 Embora a administração de cuprizona resulte em reação inflamatória com acúmulo de células da micróglia e astrócitos, esta se restringe ao SNC. Desta forma, a reação inflamatória ocorre de forma independente da ação dos linfócitos T (ARNETT et al., 2003), o que permite a avaliação da desmielinização no SNC sem a interposição das reações sistêmicas.

Ratos da linhagem Lewis são altamente susceptíveis a autoimunidade mediada por células Th1. Tal susceptibilidade é decorrente da resposta hipotalâmica alterada, especialmente pela redução na síntese e secreção do hormônio liberador de corticotrofina, ocasionando concentrações reduzidas de hormônio adrenocorticotrópico (ACTH) e, consequentemente, glicocorticóides (STERNBERG, 1992). Observa-se ainda, que nestes animais a expressão de citocinas atinge níveis bem mais elevados que em outras linhagens. A expressão exacerbada de citocinas pró-inflamatórias, característica desta linhagem permite a análise da influência destas citocinas sobre a biologia dos oligodendrócitos e, consequentemente, sobre o processo de desmielinização (Franco-Pons, 2007)

I.7 Alterações comportamentais

È conhecido que a desmielinização induzida com cuprizona desencadeia alterações comportamentais nos animais (CAMMER W, 1999). Em estudo realizado por Franco-Pons e colaboradores, foram utilizados camundongos tratados durante seis semanas com dieta de cuprizona a 0,2%, seguida de seis semanas de recuperação. Com isso, verificou-se que esses animais apresentaram perda de peso corporal, desmielinização do corpo caloso, aumento de atividade do SNC e anormalidades na marcha. Notou-se ainda que os animais do grupo tratado com cuprizona apresentavam alterações da coordenação motora quando comparados ao grupo controle, durante a execução de testes de comportamento realizados como: rota round, campo aberto e FOB. (Franco-Pons, 2007)

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37 Dessa maneira, testes comportamentais tem se revelado úteis no estudo de modelos de indução de desmielinização utilizando a cuprizona, para a avaliação da neurotoxicidade, feitos através da observação do animal em diversas situações em que os animais são expostos a um ambiente desconhecido, ou como se comporta em situações em que é manipulado. (Xavier, 1999)

A atividade exploratória, num contexto geral, refere-se à obtenção de informação acerca do ambiente, o que abrange as respostas reflexas imediatas e as respostas voluntárias típicas. Estudos psicológicos de atividade exploratória têm se baseado na exposição do animal a uma alteração ambiental discreta e localizada ou no confinamento a um ambiente nunca experimentado anteriormente. (Xavier, 1999)

As medidas obtidas no teste de campo aberto relacionam-se a um grupo de alterações fisiológicas associadas à emocionalidade, como por exemplo, a freqüência cardíaca e a pressão arterial. Sendo assim, a aferição desses dois fatores fisiológicos associados ás medidas de ambulação e defecação podem prover um embasamento para melhor discussão dos dados e conseqüente discussão sobre o comportamento emocional (Xavier, 1999).

Assim, utiliza-se parâmetros observacionais do comportamento dos ratos, organizados em baterias do Teste FOB (Funcional Observacional Battery), o objetivo principal destas observações é de proporcionar dados para a avaliação da neutoxicidade (Ross, 2000).

O teste de Campo aberto consiste na mensuração dos comportamentos assumidos pela colocação do sujeito experimental em um espaço novo e aberto, no qual a fuga é prevenida por uma parede circundante a arena durante um tempo pré-determinado (Xavier, 1999). Recentemente, foi demonstrado que as estruturas cerebrais apresentam diferenças na susceptibilidade ao tratamento com a cuprizona, desta forma, as alterações comportamentais refletem o comprometimento em regiões específicas do cérebro (XU YANG, 2009).

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38

I.8 Enriquecimento Ambiental

A interação com o ambiente tem um papel fundamental no refinamento do circuito neuronal necessário para o funcionamento normal do cérebro ao longo da vida (ANDIN et al., 2007). O enriquecimento ambiental é uma condição de habitação para animais que permite maior estimulação sensorial, motora e cognitiva em relação às condições padrão encontradas nos laboratórios proporcionando a reorganização funcional dos circuitos neuronais (CALEO et al., 2009).

O Enriquecimento Ambiental (EA) consiste na colocação de objetos estimuladores tais como túneis, material para nidificação, rodas, rampas, escadas, brinquedos, bolinhas, rampas, níveis diferentes, matérias para roer entre outros, inclusive o recipiente de alimentação que pode ser de diversos formatos e cores, trocado de local, permitindo maior exploração sensorial (WURM et al., 2007 e CALEO, 2009).

Esses objetos são alterados diariamente, para que o estimulo não seja incorporado ao ambiente deixando de ser um fator estimulador para o animal (WURM et al., 2007 e VAN PRAAG, KEMPERMANN e GAGE, 2000), promovendo maior oportunidade de interação social e execução de exercício físico voluntario (CALEO, 2009).

O ambiente enriquecido oferece uma combinação de estímulos inanimados e sociais complexos, não é possível isolar um desses fatores e estudá-los separadamente. È essencial a associação de diferentes fatores complexos para que a estimulação aconteça.

Recentemente, investigações clínicas têm proporcionado crescentes evidencias da eficácia das intervenções físicas e psicossociais para o tratamento de distúrbios neurológico e psiquiátricos (SIFONIOS et al., 2009). Estudos mostraram que o ambiente enriquecido favorece as habilidades para aprendizagem (ANDIN et al., 2007 e, MESHI et al., 2006), diminui os níveis de ansiedade (MESHI et al., 2006), melhora a capacidade cognitiva, aumenta a neurogênese (SEGOVIA, DEL ARCO e MORA, 2009, ANDIN et al., 2007 e WURM et al., 2007,), aumenta a resolução espacial melhorando o

(25)

39 desempenho nas tarefas (WURM et al., 2007) e escores dos testes comportamentais, potencializando a plasticidade neuronal no cérebro adulto (VAN PRAAG, KEMPERMANN e GAGE, 2000).

Estudos recentes fornecem novos parâmetros sobre os mecanismos de neuroplasticidade em relação ao enriquecimento ambiental e sua relevância para o envelhecimento e doenças neurodegenerativas (SEGOVIA, DEL ARCO e MORA, 2009). O cérebro adulto responde a exercícios físicos e a estimulação ambiental com aumento de novos neurônios no giro denteado, que possuem viabilidade para interação com a células pré existentes. Sugerindo nova forma de proporcionar a plasticidade neuronal em cérebros adultos no qual o desempenho pode ser otimizado através de novas condições ambientais (ANDIN et al., 2007 , WURM et al., 2007 e JOHANSSON e BELICHENKO, 2002)

O EA exerce um papel importante na plasticidade cerebral. A eficácia da utilização do ambiente enriquecido tem sido demonstrada a nível celular, molecular, fisiológico e comportamental. O EA estimula o desenvolvimento do sistema nervoso, facilita a recuperação de funções, auxilia no desenvolvimento motor, reduz a neurodegeneração, melhora a capacidade de aprendizagem espacial, na maturação da função visual pode ser significativamente influenciada pela natureza dos estímulos, e aumenta as respostas dos neurônios do córtex auditivo e visual, potencializando as funcionalidades. (CAI et al., 2009)

Os estímulos externos são essenciais para a modelagem do córtex visual. Experiências visuais diversas aumentam o numero e o tamanho das sinapses e a atividade neuronal. Estudos recentes indicam que animais que permanecem no escuro com ausência de experiência visual, mantêm seu córtex visual imaturo. O aumento da atividade neuronal induzida por estímulos ambientais desencadeiam eventos importantes para a plasticidade cortical visual, incluindo aumento da rede vascular, aceleração do desenvolvimento do sistema visual e alterações comportamentais. (BENGOETXEA, ARGANDON and LAFUENTE, 2008)

Pacientes acometidos pela esclerose múltipla tem de 25-50% mais chances de desenvolver depressão, o que acredita-se estar relacionada com a gravidade da lesão

(26)

40 neurológica e as alterações no sistema imunológico podem contribuir para que esses índices sejam elevados. Observa-se a presença de sintomas neuropsiquiátricos como ansiedade, fadiga, retardo psicomotor e cognitivo (MAGARA et al., 2000). Em nossos estudos anteriores utilizamos o modelo experimental com a adição de cuprizona à ração e a análise comportamental sugere até o presente momento, a presença da maioria destes sintomas neuropsiquiátricos.

Sifonios e colaboradores (2009) sugerem que a exposição ao ambiente enriquecido pode exercer sobre animais expostos a um modelo experimental de depressão, efeitos semelhantes aos antidepressivos. (SIFONIOS et al., 2009)

A exposição a um ambiente enriquecido tem provado ser benéfica no processo de recuperações após lesões cerebrais, já que o EA estimula a reorganização dos feixes e de áreas atingidas pela lesão, estimulando a plasticidade axonal, restabelecendo a junção sináptica após a lesão neuronal (CALEO et al., 2009 , ANDIN et al., 2007), aumento de oligodendrócitos, modesto aumento os astrócitos, diminuição da morte celular por apoptose no hipocampo (VAN PRAAG, KEMPERMANN AND GAGE, 2000)

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41

II. JUSTIFICATIVA

Tem sido um dos grandes desafios da ciência encontrar estratégias que melhorem a reorganização funcional dos circuitos do cérebro após uma lesão, na tentativa de melhorar a condição de pacientes acometidos por distúrbios neurológicos (CALEO, 2009).

A esclerose múltipla é umas das principais causas de incapacidade neurológica adquirida em jovens adultos (TIBERY, 2005). Alguns pacientes com EM apresentam sintomatologia de psicopatologia e alterações comportamentais antes de receber o diagnostico da doença.

Assim, os modelos animais da esclerose múltipla constituem um instrumento importante para o esclarecimento da fisiopatologia da doença e dos mecanismos moleculares da lesão tecidual, constituindo uma poderosa ferramenta na investigação de novas abordagens terapêuticas.

Nesse contexto, as alterações comportamentais induzidas pela cuprizona não estão totalmente esclarecidas, mas têm despertado muito interesse, visto que as desordens da substância branca estão relacionadas com distúrbios mentais. Estudos recentes sugerem que alterações na comunicação entre diferentes regiões cerebrais sejam responsáveis pelos sintomas clínicos e disfunções cognitivas observados em pacientes com tais distúrbios, como por exemplo, na esquizofrenia.

Resultados anteriores obtidos em nosso laboratório demonstraram que as alterações comportamentais observados em animais tratados com a cuprizona estão relacionadas com a ocorrência de desmielinização, especificamente na região do corpo caloso. Estes animais apresentam índices de neurotoxicidade elevados, alterações na marcha e coordenação motora além de redução na atividade exploratória avaliada na arena do campo aberto e sinais de ansiedade.

Entender os mecanismos moleculares envolvidos na desmielinização pode auxiliar a compreender grandes questões sem respostas até o momento, como a remielinização falha. Além disso, a destruição da bainha de mielina tem sido destaque na fisiopatologia de doenças relevantes clinicamente.

(28)

42 Desta forma, o presente trabalho propõe que a exposição a ambientes enriquecidos favorecem a liberação de fatores de crescimento, os quais, consequentemente, contribuem para o processo de remielinização e regeneração cerebral.

(29)

43 Geral:

Determinar a ocorrência de desmielinização quimicamente induzida e o comprometimento do sistema nervoso central, relacionando a resposta comportamental com achados neuropatológicos e indicadores de estresse em animais tratados com cuprizona.

Específicos:

- Avaliar as alterações comportamentais e neurotoxicidade durante o processo de desmielinização e, posteriormente, durante a remielinização através do teste FOB (Functional Observation Battery – FOB), teste de campo aberto e teste de labirinto em cruz elevado.

- Determinar a ocorrência de desmielinização quimicamente induzida e o comprometimento do sistema nervoso central por meio de análise histopatológica.

(30)

44

IV.1. Animais e tratamento

Foram utilizados ratos da linhagem Lewis, machos adquiridos do Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica (CEMIB-UNICAMP), com idade de sete semanas. Os animais foram mantidos no biotério do Campus Baixada Santista da Unifesp, em ciclo de claro/escuro (12/12h), temperatura constante (24±1°C), recebendo água e ração autoclavadas ad libitum. Todos os procedimentos deste protocolo experimental foram submetidos ao Comitê de Ética em Pesquisa da UNIFESP (1254/10)

IV.2. Dieta

Os animais foram alimentados com ração moída adicionada de 0,6% de cuprizona (bis-ciclohexanona-oxaldiidrazona - Sigma-Aldrich, St Louis-Mo-USA), durante quatro semanas, a partir da sétima semana de vida, segundo protocolo descrito abaixo (Figura 1). Os grupos controle (N=16) receberam tratamento idêntico ao grupo cuprizona (N=16), porém sem a adição da droga na dieta.

Os animais expostos ao período de recuperação (após o tratamento com cuprizona) receberam ração moída comercial sem adição de cuprizona na quinta semana.

IV. 3 Delineamento experimental

Os animais foram divididos em grupos 8 grupos experimentais contendo 4 animais cada. Os grupos: Controle (CTL), Cuprizona (CPZ), Controle com recuperação (CTL REC) e Cuprizona com recuperação (CPZ REC) foram mantidos em condições padrão do Laboratório. Já os grupos Controle com ambiente enriquecido (CTL EE), Cuprizona com ambiente enriquecido (CPZ EE), Controle com ambiente enriquecido e recuperação (CTL EER) e Cuprizona com ambiente enriquecido e recuperação (CPZ EER) foram expostos a sessões diárias de enriquecimento ambiental. No primeiro dia do tratamento com

(31)

45 cuprizona (inicio da adição da droga a dieta) foram realizados os testes comportamentais, como podemos observar na figura1.

Figura1. Delineamento experimental. Os animais foram divididos em 8 grupos experimentais,

sendo 4xepostos ao ambiente enriquecido e 4 mantidos no ambiente padrão. No presente estudo iremos abordar somente 5 grupos do dlineamento experimental, entre eles: Controle, Cuprizna, Cuprizona com Recuperação, Controle ambiente enriquecido e recuperação e Cuprizona ambiente enriquecido e recuperação

(32)

46 Animais tratados com cuprizona e seus respectivos controles (4 animais/grupo) foram submetidos a sessões diárias de 1 hora de ambiente enriquecido,. Os animais eram colocados em uma gaiola com 3 pavimentos, equipada com rampas, escadas, rede, material para nidificação e roda para exercício. A cada sessão eram adicionados novos brinquedos coloridos, com variadas formas, pesos, texturas e tamanhos, sendo que a maioria emitia sons quando manipulados a fim de estimular sensorialmente os animais. Os brinquedos foram alterados a cada sessão, para que o estimulo não seja incorporado ao ambiente.

Figura 2. Sessão de Ambiente Enriquecido. Gaiola de ambiente enriquecido, na qual os

animais dos grupos tratados foram expostos em sessões de 1 hora diária, com oferecimento de

(33)

47

IV 5. Avaliação comportamental

IV.5.1. Teste de Neurotoxicidade

Com o intuito de avaliar a evolução das alterações comportamentais, todos os animais foram submetidos ao teste comportamental e motor de neurotoxicidade (Functional

Observation Battery – FOB – anexo I) em quatro ocasiões do período experimental: 1) No

primeiro dia do tratamento, no 21º dia do tratamento, no 15º dia de recuperação e na semana da eutanásia. Este teste consiste em várias análises que permitem a determinação de atividade e excitabilidade do SNC, neuromuscular, autônomo e sensoriomotor, os quais são classificados segundos escores previamente estabelecidos.

IV.5.2 Teste de Campo Aberto

No teste de Campo Aberto foi avaliado o número de cruzamentos, permanência na região central, número de explorações verticais, auto limpeza e bolos fecais no primeiro dia do tratamento, no 14º dia, no 21º dia do tratamento na semana de recuperação e anteriormente a eutanásia. Os testes são conduzidos por um profissional treinado, observador cego, que necessariamente não acompanha o experimento.

IV.5.3 Teste de Reconhecimento de Objetos

O animal é colocado na arena de Campo aberto juntamente com dois objetos, sendo um objeto conhecido (permanece integralmente em sua habitação) e outro objeto novo. Mensura-se o tempo que o animal explora o objeto novo, o objeto conhecido e o ambiente durante de 5 minutos a fim de avaliar a cognição e memória. Os testes foram

(34)

48 realizados em dois períodos experimentais: no primeiro dia de tratamento e anteriormente a eutanásia.

IV. 5.4 Teste de Interação social

Com o intuído que avaliar a sociabilidade, o teste de interação social mensura o comportamento social de animais de diferentes grupos experimentais. Um animal controle e um animal tratado correspondente percorrem juntos livremente a arena de Campo aberto durante 5 minutos, e são mensurados as interação com resposta, interação sem resposta e comportamentos individuais.

IV. 5.5 Teste do Labirinto em Cruz Elevado

Os animais serão testados no labirinto em cruz elevado individualmente durante o período de 10 minutos, o qual consiste de dois braços abertos e dois braços fechados. No início de cada teste, o rato é colocado na área central do labirinto, na direção do braço aberto. A contagem do número de entradas é feita quando o animal coloca as quatro patas em um dos braços e o tempo de permanência no mesmo. No primeiro dia do tratamento, no 21º dia do tratamento, no 14º dia de recuperação e na semana da eutanásia.

IV.5.6 Walking Track

Com o intuito de avaliar o padrão da marcha, o animal caminha sobre um corredor confeccionado em madeira (42 X 8 cm) com papel branco do mesmo tamanho, cobrindo o assoalho do corredor para registrar as impressões das patas posteriores. .

(35)

49 Decorridos os tempos de tratamento, os animais foram anestesiados com solução de uretana (2,5g/Kg i.p.) e em seguida perfundidos por 5 minutos via transcardíaca com solução salina heparinizada 0,1% seguida de perfusão por 30 minutos de solução fixadora (paraformaldeído 4% em PBS 0,05M pH 7.4). Os encéfalos foram removidos e mergulhados por 1 hora na mesma solução, para pós-fixação. Posteriormente, foram imersos em solução de sacarose 30% para crioproteção. Após 48 horas, as amostras foram incluídas em OCT-Tissue Tek (Sakura Finetek, USA), congeladas em N-hexano e gelo seco, e armazenadas em Biofreezer (-80°C). Secções coronais dos encéfalos (de 10 a 20 µm de espessura) foram obtidas em criostato (CM1850, Leica) e coletadas em lâminas histológicas gelatinizadas.

A detecção de desmielinização foi realizada pelo método de Luxol Fast Blue. Após secagem em temperatura ambiente, os cortes foram submetidos à retirada de lipídios numa solução de clorofórmio/álcool absoluto (1:1 – Merck - Darmstadt, Germany) durante 12 horas. A seguir, os cortes foram colocados em solução de Luxol

Fast Blue por 12 horas, em temperatura de 56ºC. Posteriormente, o excesso de

coloração foi retirado com uma lavagem de etanol a 95ºC e a seguir com água destilada. A diferenciação dos cortes foi feita com solução de carbonato de lítio por 30 segundos, seguida a lavagem com água destilada. Em seguida, foi realizada a contra-coloração com Cresil violeta por 30-40 segundos. Após lavagem com água destilada, as lâminas foram reveladas em etanol a 95% por 5 minutos, acompanhadas ao microscópio. Os cortes foram então desidratados com série crescente de álcool e xilol e montados com Entelan (Merck - Darmstadt, Germany). A mielina, incluindo fosfolipídios, apresentou coloração azulada/esverdeada e, os neurônios, coloração rosa/violeta.

(36)

50 A significância estatística entre os grupos controle e tratados foi determinada através do teste não paramétrico de Kruskal-Wallis, utilizando-se o software GraphPad Prism versão 5.0. Os resultados foram apresentados na forma de média + erro padrão (EPM) e o grau de significância estabelecido em p<0,05.

V. RESULTADOS

V.1 Massa Corpórea e Consumo de ração

Os animais de ambos os grupos apresentam peso uniforme no início do experimento. Iniciado o tratamento com cuprizona, ocorre a perda de peso a partir do 8º dia.

Os animais alimentados com adição de cuprizona durante quatro semanas, seguida por uma semana de recuperação (sem a adição de cuprizona na alimentação) e mantidos em condições padrão (CPZ REC), apresentavam em média 210g antes do período de recuperação e 225g anteriormente a eutanásia. Por outro lado animais tratados com cuprizona durante 4 semanas, seguido pelo período de recuperação e que foram expostos à sessões de enriquecimento ambiental (CPZ EER) durante 1 hora diária pesavam em media 222g anteriormente a recuperação e 246g ao termino do tratamento. Já o grupo controle correspondente (CTL EER) pesava 257g no inicio do período de recuperação e 266g ao termino do período experimental. Nota-se na Figura 3 que os animais exibem padrão de peso semelhante em seus respectivos grupos e a interrupção do tratamento não afeta o peso de forma significativa.

O consumo médio de ração por animal avaliado a cada dois dias durante e o consumo diário dos animais controle foi adotado como medida padrão de consumo (100%). Contudo avaliou-se o efeito da adição da cuprizona à dieta dos animais tratados como observa-se na figura 4. Há uma grande variabilidade neste consumo, entretanto, sem diferenças significativas em relação à ração sem adição do composto

(37)

51 1º 7º 13º 19º 25º 31º 37º 43º 150 200 250 300 Controle ( CTL n=4) Cuprizona (CPZ n=4)

Cuprizona recuperação (CPZ REC n=4)

Controle com Ambiente Enriquerido e Recuperação (CTL EER n=4) Cuprizona com Ambiente Enriquerido e Recuperação (CUP EER n=4)

Inicio da Recuperação Dias de tratamento M a s s a c o rp o ra l (g )

Figura 3. Evolução da massa corpórea durante o período experimental. Nota-se que os

animais tratados com adição de cuprizona 0,6% a ração moída não acompanham a evolução característica de massa corpórea dos animais controle até o 37º dia de tratamento. Durante o período de recuperação, o qual os grupos CPZ EER e CPZ REC não receberam a adição da droga, observa-se que ocorreu um pequeno aumento da massa corpórea dos animais, enquanto os animais do grupo CTL EER permaneceram com o desenvolvimento típico da idade.

(38)

52 Consumo diário de ração

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 0 50 100 150 200 250 % r a ç ã o i n g e ri d a

Figura 4. comparativo do consumo diário de ração. O consumo diário dos animais controle

foi adotado como medida padrão de consumo (100%). Desta forma, avaliou-se o efeito da adição da cuprizona à dieta dos animais. Como pode ser observado há uma grande variabilidade neste consumo, entretanto, sem diferenças significativas em relação à ração sem

adição do composto.

V.2. Teste de Neurotoxidade - FOB

O teste FOB consiste em uma bateria composta por diferentes categorias que permite determinar a atividade e excitabilidade do sistema nervoso central, autônomo e sensório motor, os quais são classificados com pontuação previamente estabelecida. Os parâmetros fornecem informação sobre o estado clínico geral do animal com o objetivo de fornecer dados acerca da neurotoxicidade .

O teste foi realizado em quatro períodos, no 1º dia do tratamento, no 15º dia do tratamento, 30º dia do tratamento e 45º dia do tratamento.

Observou-se que no 1º dia de tratamento, todos os grupos experimentais são semelhantes, evidenciando comportamentos e reflexos considerados típicos do destes animais, apresentando escore médio de 33,5 pontos.

(39)

53 Após 15 dias, os grupos tratados com cuprizona (CPZ, CPZ REC e CPZ EER) apresentaram pontuações significativamente maiores (p<0,001) quando comparado aos respectivos grupos controle (CTL e CTL EER).

Os animais tratados com cuprizona apresentaram sinais clínicos como alterações na reação de endireitamento, no padrão da marcha, perda de sensibilidade à dor e ao toque, sensibilização ao som, oferecem resistência à abordagem e piloereção generalizada a partir do décimo quinto dia de tratamento.

Observa-se após 30 dias do inicio do tratamento que os grupos cuprizona (CPZ) e cuprizona com recuperação (CPZ REC) que permaneceram em habitação padrão, apresentam piora dos sinais clínicos decorrentes do tratamento, correspondendo ao baixo desempenho no teste. Ao comparar o grupo CTL com o grupo CPZ observamos um aumento significativo na pontuação do teste (p<0, 001) no 30º dia de tratamento. Nota-se que o grupo CPZ teve um aumento gradativo e significativo (p<0, 001) no decorrer do tratamento.

Em contra partida, o grupo cuprizona exposto a sessões de ambiente enriquecido (CPZ EER) apresenta um escore mais baixo, quando comparado aos grupos tratados mantidos em ambiente padrão. Estes animais exibem melhor desempenho em itens que necessitem de habilidades como coordenação motora, reação de endireitamento, resposta a estímulos e sensibilidade. Embora com sinais clínicos menos acentuados, ainda exibem escores elevados quando comparado aos grupos controle.

No 45º dia de tratamento, correspondente ao termino do período de recuperação, o grupo cuprizona com recuperação (CPZ REC) mantém comportamento semelhante ao expresso durante a execução do teste no 30º dia tratamento. Nota-se que o grupo do CPZ REC exibe gradual acentuação das alterações clinica, evidenciadas pelo alto escore no teste FOB ao término do tratamento quando comparado ao 1º e ao 15º dia.

De forma semelhante, o grupo cuprizona com ambiente enriquecido apresenta o mesmo comportamento após o período de recuperação, quando comparado do seu teste anterior, se aproximando da pontuação dos animais do grupo controle, o qual expressou comportamentos uniformes e característicos dos ratos Lewis, durante todo o período experimental.

(40)

54

CTL CPZ CPZ REC CTL EE R CPZ EE R CTL CPZ CPZ REC CTL EE R CPZ EE R CTL CPZ CPZ REC CTL EE R CPZ EE R CPZ REC CTL EE R CPZ EE R 30

40 50

before CPZ diet 15 days CPZ treated 30 days CPZ

treated 08 days CPZ recovered

**

*

F O B s c o re Controle _Cuprizona Cuprizona recuperado Controle ambiente enriquecido

Cuprizona ambiente enriquecido

.

Figura 5. Teste de Neurotoxicidade (FOB). Ao início do tratamento todos os animais exibem

comportamento padrão. No 15º dia e no 30º dia de tratamento os animais tratados com cuprizona exibem os sinais clínicos da desmielinização, evidenciados pela alteração do escore no teste FOB. Ao final do experimento, o grupo que recebeu ração com adição de cuprizona mantidos em condições padrão apresentou escore significativamente mais elevados (p<0,001), em comparação aos demais grupos (p<0,001) . Embora o grupo cuprizona exposto ao ambiente enriquecido, exiba escore significativamente maior (p<0,01) ao término do tratamento, quando comparado ao grupo controle exposto ao ambiente enriquecido, este escore se mantem no 30º e 45º dia de tratamento, sugerindo que o ambiente pode atuar na redução da intensidade dos sinais clínicos após retirada da droga. Teste de Kruskal-Wallis, **p<0,001 e *p<0,01

(41)

55

V.3. Campo aberto

V.3.1 Exploração vertical

No inicio do tratamento há homogeneidade de todos os grupos experimentais. Após 15 dias de tratamento os grupos CPZ apresentam os primeiros sinais de comprometimento do SNC com a diminuição significativa (p<0,01) no numero de explorações verticais, quando comparado ao grupo controle. Padrão este mantido após 30 dias do inicio do tratamento

Após o período de recuperação o comportamento exploratório do CPZ REC ainda continua diminuído, apresentando uma redução significativa durante o período experimental. Entretanto os animais tratados que frequentaram as sessões no ambiente enriquecido têm o comportamento exploratório semelhante aos animais controle expostos as mesmas condições, como mostra a Figura 6.

V.3.2 Bolos Fecais

A avaliação da quantidade de bolos fecais depositadas durante a exposição ao teste de campo aberto no 1º, 15º, 30º e 45 º dia do tratamento, indicou que não há diferenças na quantidade de bolos fecais entre os diferentes grupos durante o período experimental (figura 7)

(42)

56 Figura 6. Exploração vertical. Ao início do período experimental nota-se comportamento

homogêneo entre os grupos. No 15º e no 30º nota-se a redução do comportamento exploratório nos grupos tratados com cuprizona sugerindo redução na interação com o ambiente. Nota-se diferença significativa quando comparamos o grupo CPZ e CTL. (p<0,01). Após o período de recuperação, os índices do grupo tratado mantido em condições padrão permaneceram reduzidos significativamente quando comparado ao inicio do tratamento, em contra partida o grupo tratado que exposto ao enriquecimento ambiental expressou comportamentos similares ao grupo controle exposto ao ambiente enriquecido. Teste de Kruskal-Wallis, *p<0,01

CTL CPZ CPZ REC CTL EE R CPZ EE R CTL CPZ CPZ REC CTL EE R CPZ EE R CTL CPZ CPZ REC CTL EE R CPZ EE R CPZ REC CTL EE R CPZ EE R

0 10 20 30 40

before CPZ diet 15 days CPZ treated 30 days CPZ treated 08 days CPZ recovered

*

n u m b e r o f re a ri n g Controle _Cuprizona Cuprizona recuperado Controle ambiente enriquecido

(43)

57

CTL CPZ CPZ REC CTL EE R CPZ EE R CTL CPZ CPZ REC CTL EE R CPZ EE R CTL CPZ CPZ REC CTL EE R CPZ EE R CPZ REC CTL EE R CPZ EE R

0 2 4 6 8 08 days CPZ recovered 30 days CPZ treated 15 days CPZ treated before CPZ diet n u m b e r o f s to o ls

Figura 7. Bolos fecais – Não há diferença na quantidade de bolos fecais depositados durante

o Teste Campo Aberto entre os grupos experimentais durante todo o período de tratamento.

V.3.3 Cruzamentos

No inicio do tratamento, os animais exibem comportamento padrão sem diferenças entre os grupos experimentais. Após 15 dias de tratamento, todos os grupos tratados com cuprizona apresentam redução significativa (p<0,001) na quantidade de cruzamentos quando comparado aos grupos controles. Após 30 dias do inicio do tratamento os grupos CPZ, CPZ EE e CPZ REC apresentam acentuada diminuição na quantidade de cruzamentos realizados durante o teste. No período de recuperação, a quantidade de cruzamentos realizada pelo grupo cuprizona permaneceram baixas, entretanto os animais que frequentaram sessões de enriquecimento ambiental mantêm o padrão observado anteriormente no 15º dia, sem diferenças significativas. (figura 8)

(44)

58 CTL CPZ CPZ REC CTL EE R CPZ EE R CTL CPZ CPZ REC CTL EE R CPZ EE R CTL CPZ CPZ REC CTL EE R CPZ EE R CPZ REC CTL EE R CPZ EE R

0 20 40 60 80 100 120

before CPZ diet 15 days CPZ treated _{30 days CPZ}

**

_**

n u m b e r o f c ro s s in g s

Figura 8. Cruzamentos no Campo Aberto. Inicialmente, todos os grupos experimentais

exibem comportamentos semelhantes. Após 15 dias, os grupos tratados com cuprizona apresentaram redução significativa (p<0,001) no número de cruzamentos quando comparado aos grupos controle. Conforme esperado, no 30º dia da administração da cuprizona, os animais exibem decréscimo significativo (p<0,001) na quantidade de cruzamentos em relação aos animais do grupo controle. Ao final do tratamento, o grupo CPZ REC, mantem o padrão observado no 30º dia. Por outro lado, a redução na quantidade de cruzamentos observada no grupo CTL EER observado após o 15º dia de tratamento, é mantido até o final do experimento. Teste de Kruskal-Wallis, **p<0,001

V.3.4 Permanência no Centro

A permanência no centro é mensurada através da contagem dos cruzamentos realizados na região central da arena do teste de campo aberto.

Nota-se que não há diferenças significativas na quantidade de cruzamentos realizados no centro no inicio do tratamento e após 15 dias. Já após 30 dias há um

(45)

59 aumento significativo na permanência na região central do grupo controle (CTL) quando comparado ao grupo cuprizona (CPZ). Já o grupo tratado exposto a sessões de ambiente enriquecido (CPZ EE R) aumentou significativamente a permanência no centro no 30º dia de tratamento quando comparado do grupo controle correspondente (CTL EE R).

CTL CPZ CPZ REC CTL EE R CPZ EE R CTL CPZ CPZ REC CTL EE R CPZ EE R CTL CPZ CPZ REC CTL EE R CPZ EE R CPZ REC CTL EE R CPZ EE R 0

5 10 15 20

before CPZ diet 15 days CPZ treated 30 days CPZ

*

n u m b e r o f c ro s s e s m a d e i n t h e c e n te r

Figura 9. Permanência no Centro . Observa-se que não houve diferenças significativas entre

os grupos tratados e controles na permanência no centro do teste comportamental Campo Aberto no 1º e no 15º dia de tratamento. Já no 30º dia nota-se um aumento significativo na permanência na região central da arena nos grupos CTL e CPZ EER. Esse dado pode ser sugerir comportamento indicativo de estresse e ansiedade. Teste de Kruskal-Wallis *p<0,01