MF-0451.R-0 - MÉTODO DE DETERMINAÇÃO DO EFEITO CAUSADO POR AGENTES TÓXICOS SOBRE A RESPIRAÇÃO DE BACTÉRIAS DA ESPÉCIE Pseudomonas putida

MF-0451.R-0 - MÉTODO DE DETERMINAÇÃO DO EFEITO CAUSADO POR AGENTES TÓXICOS SOBRE A RESPIRAÇÃO DE BACTÉRIAS DA ESPÉCIE Pseudomonas putida

Notas:

Aprovado pela Deliberação CECA nº 3110, de 01 de março de 1994 Publicado no DOERJ de 28 de abril de 1994

1. OBJETIVO

Estabelecer o método de determinação do efeito causado por agentes tóxicos sobre a respiração de bactérias da espécie Pseudomonas putida.

2. DOCUMENTOS DE REFERÊNCIA

Documentos aprovados pela Comissão Estadual de Controle Ambiental - CECA e publicados no Diário Oficial do Estado do Rio de Janeiro:

-NT-202 Critérios e Padrões para Lançamento de Efluentes Líquidos; -NT-213 Critérios e Padrões para Controle da Toxicidade em Efluentes

Líquidos Industriais;

-JN-214 Justificativa Técnica da NT-213 - Critérios e Padrões para Controle da Toxicidade em Efluentes Líquidos Industriais;

-MF-402 Método de Coleta de Amostras de Efluentes Líquidos Industriais;

-MF-457 Método de Determinação do Efeito Causado por Agentes Tóxicos sobre o Crescimento de Bactérias da Espécie Pseudomonas putida;

-DZ-942 Diretriz do Programa de Autocontrole de Efluentes Líquidos-PROCON ÁGUA.

3. DEFINIÇÕES

Para efeito deste documento são consideradas as definições:

3.1 Agentes Tóxicos - substâncias químicas puras, misturas de substâncias químicas, formulações, efluentes líquidos e águas que possam causar efeitos adversos no metabolismo dos organismos-teste.

3.2 Toxicidade - capacidade de um agente tóxico provocar um efeito observável em um organismo aquático vivo.

3.3 Toxicidade Aguda - toxicidade em que os efeitos nos organismos-teste são observados em curto período de tempo de, no máximo, 96 horas.

3.4 Teste de Toxicidade - teste padronizado no qual organismos aquáticos vivos são utilizados para detectar a toxidade de um agente tóxico.

3.5 Taxa de Consumo de Oxigênio - consumo de oxigênio pelas bactérias por unidade de tempo;

3.6 Concentração Efetiva Média - CE50 - concentração nominal do agente

tóxico, que causa efeito inibidor de 50% na taxa de consumo de oxigênio por bactérias, durante o período de teste.

3.7 Concentrações Efetivas - CE0 e CE100 - concentrações nominais do

agente tóxico na água, que causam efeito inibidor de 0% e 100%, respectivamente, na taxa de consumo de oxigênio por bactérias, durante o período do teste.

3.8 Concentração de Efeito não Observado-CENO - maior concentração de agente tóxico que não causa efeito inibidor na taxa de consumo de oxigênio das bactérias, no período do teste. É expressa em porcentagem do agente tóxico na solução-teste.

3.9 Número de Unidades de Toxicidade ou Fator de Diluição-UT - definido pela fórmula: UT = 100/CENO.

3.10 UTB - número de unidades de toxicidade, tendo como referência testes em

bactérias.

4. PRINCÍPIO DO MÉTODO

A bactéria da espécie Pseudomona putida é considerada organismo modelo na biocenose do lodo ativado. A atividade metabólica desses organismos compreende o consumo de oxigênio durante a utilização do substrato. A alteração do consumo de oxigênio por esses organismos serve como medida da energia obtida na manutenção das atividades metabólicas. Certos agentes tóxicos têm a propriedade de causar efeitos adversos no metabolismo desses organismos, inibindo ou estimulando o processo de respiração.

Baseado nessas propriedades, o método determina a taxa de consumo de oxigênio pelas bactérias na presença do agente tóxico, utilizando o substrato de glicose.

5. RESUMO DA TÉCNICA

O método consiste na exposição de uma suspensão de bactérias da espécie Pseudomonas putida a várias concentrações de um agente tóxico, por 30 minutos sob aeração. Após esse período, as suspensões-teste são transferidas para uma câmara de medição e as concentrações de oxigênio são medidas e registradas durante cerca de 3 minutos. O efeito é expresso em CENO e em CE50.

6. APLICABILIDADE

Este método se aplica a efluentes líquidos industriais, águas superficiais e subterrâneas, assim como a substâncias químicas puras, misturas de substâncias químicas e formulações, não voláteis e solúveis em água.

Não é aplicável a amostras de água com salinidade natural superior a 5g/kg.

7. INTERFERÊNCIAS

Substâncias químicas puras, misturas de substâncias químicas e formulações pouco solúveis em água e voláteis dificultam a determinação da toxicidade.

Para substâncias com baixa solubilidade em água, este método prevê o pré-tratamento da amostra, de modo a eliminar esta interferência (item 12.2).

Efluentes líquidos, com alto consumo de oxigênio dissolvido, pH menor que 7,0 ou maior que 8,0, óleos, graxas e salinidade provocam variações no resultado, pois modificam a atividade metabólica das bactérias. Valores de pH abaixo de 7 ou acima de 8 terão seus efeitos avaliados dentro do teste. No caso de efluentes com pH menor que 7,0 e maior que 8,0 recomenda-se a realização de dois testes, um com o pH original e outro com pH corrigido para a faixa de 7,0 a 8,0.

8. APARELHAGEM E MATERIAIS

8.1 Os aparelhos, vidrarias e materiais necessários são: - balança analítica com precisão de 0,1 mg;

- condutivímetro/salinômetro; - medidor de pH;

- medidor de oxigênio com dispositivo para compensação de temperatura; - registrador gráfico;

- câmara-teste em acrílico com orifício para o eletrodo de oxigênio (figura 1);

- agitador magnético;

- barra magnética revestida de teflon com 15 mm de comprimento e 6 mm de diâmetro;

- mesa agitadora para erlenmeyers de 250 mL ou 500 mL; - centrífuga refrigerada;

- autoclave para esterilização; - estufa para esterilização;

- sistema de aeração com filtro para retirar óleo; - banho-maria termostatizado com precisão de 0,1 ºC; - espectrofotômetro;

- cubetas de 10 mm de caminho ótico; - termômetro;

- erlenmeyer de 100 mL, 250 mL e 500 mL;

- balão volumétrico de 100 mL, 200 mL e 1000 mL;

- pipetas volumétricas de 10 mL, 20 mL, 25 mL, 30 mL e 50 mL l; - pipetas tipo Mohr, graduadas, de 1 mL, 2 mL, 5 mL e 10 mL; - tubos de vidro para aeração (ex. pipetas Pasteur);

- provetas de 100 mL e 250 mL; - tubos de ensaio 18 x 180 mm;

- alça de platina para repiques da cultura;

- rolhas esterilizáveis e permeáveis ao ar (algodão e gaze ou de outros materiais adequados).

8.2 Todo o material que entre em contato com as amostras do agente tóxico no decorrer do teste deve ser quimicamente inerte.

8.3 A vidraria, antes de ser utilizada nos testes, deve ser lavada na seguinte seqüência: detergente, água de torneira, acetona pura, água de torneira, ácido nítrico a 5%, água de torneira e água destilada.

8.4 Toda vidraria usada na cultura e nas repicagens das bactérias deve ser esterilizada antes do uso.

9. PRODUTOS QUÍMICOS E SOLUÇÕES

9.1 PRODUTOS QUÍMICOS E MICROBIOLÓGICOS a) Nitrato de sódio (NaNO3) PA;

b) Fosfato de potássio bibásico (K2HPO4) PA; c) Fosfato de potássio monobásico (KH2PO4) PA; d) Sulfato de magnésio (MgSO4. 7H2O) PA;

f) Cloreto de sódio (NaCl) PA;

g) Hidróxido de sódio pastilhas (NaOH) PA; h) Ácido clorídrico (HCl) PA;

i) Fosfato de sódio bibásico (Na2HPO4 . 2H2O) PA; j) Cloreto de amônio (NH4Cl) PA;

l) Cloreto de cálcio (CaCl2. 2H2O) PA; m) Cloreto de ferro III (FeCl3. 6H2O) PA; n) Sulfato de sódio (Na2SO4) PA;

o) Bicarbonato de sódio (NaHCO3) PA; p) Acetona PA;

q) Ácido Nítrico (HNO3) PA;

r) D(+) glicose (C6H12O6 . H2O) para fins bioquímicos e microbiológicos; s) Agar para fins microbiológicos;

t) Extrato de fermento em pó para meio de cultura; u) Peptona de caseína seca para fins microbiológicos; 9.2 SOLUÇÕES

a) Solução de ácido clorídrico, 1N; b) Solução de hidróxido de sódio, 1N; c) Solução de ácido nítrico a 5%;

d) Solução de D(+) glicose, 2,5 N - preparar 100 ou 200 mL da solução e esterilizar em autoclave a 121 ºC, por 10 min;

e) Solução tampão de hidróxido/fosfato (KH2PO4 0,05 mol/L e NaOH 0,035 mol/L) - diluir 6,8g de KH2PO4 e 1,4g de NaOH em 1 litro de água deionizada, sendo 7,2 o pH da solução;

f) Solução salina 0,9% de NaCI, esterilizada em autoclave a 121 ºC por 10 min;

g) Solução de cloreto de cálcio 0,11 mol/L - 16,17g/L de CaCl2 . 2H2O PA (manter em frasco âmbar em geladeira a 4 ºC);

h) Solução de sulfato de magnésio 0,04 mol/L - 9,86g/L de MgSO4 . 7H2O PA (manter em frasco âmbar em geladeira a 4 ºC);

i) Solução de sulfato de sódio 0,015 mol/L - 2,13g/L de NA2SO4 PA (manter em frasco âmbar em geladeira a 4 ºC);

j) Solução de bicarbonato de sódio 0,15 mol/L - 12,6g/L de NaHCO3 PA (manter em frasco âmbar em geladeira a 4 ºC);

l) Água de diluição do Agente Tóxico - preparar água reconstituída usando, para cada litro, 10 mL de cada uma das soluções: (g) cloreto de cálcio 0,11 mol/L; (h) sulfato de magnésio 0,04 mol/L; (i) sulfato de sódio 0,015 mol/L; (j) bicarbonato de sódio 0,15 mol/L. A água reconstituída deve ser aerada continuamente antes do uso;

n) Meio líquido para cultura-teste de bactérias - diluir 1 litro de água deionisada 15,6 g de peptona de caseína, 2,8 g de extrato de fermento, 5,6 g de cloreto de sódio e 1,0 g de D (+) glicose. Separar 200 mL dessa solução em erlenmeyer de 500 mL (ou 100 mL em erlenmeyer de 250 mL), tampar com rolha esterilizável e permeável ao ar e esterilizar em autoclave a 121 ºC por 10 min.

OBSERVAÇÃO: No preparo das soluções, da água reconstituída e do meio de cultura deve ser usada água deionizada com condutividade inferior a 5S/cm.

10. AMOSTRAS DO AGENTE TÓXICO

10.1 AMOSTRAS DE EFLUENTES LÍQUIDOS

10.1.1 A amostra do efluente líquido deve ser mantida à temperatura em torno de 4 ºC para sua utilização em, no máximo, 48 horas ou à temperatura menor ou igual a -12 ºC, por um período máximo de 7 dias, após o que a amostra perde a validade.

10.1.2 O Volume de amostra necessário dependerá da toxicidade do efluente líquido e da necessidade de repetição do teste. É coletado normalmente 1 litro de amostra.

10.1.3 Os frascos utilizados para coleta de amostras podem ser de vidro neutro, lavados de acordo com as instruções constantes no item 8.3, ou de polietileno virgem.

10.1.4 É necessário que alguns parâmetros e características do efluente sejam determinados e observados no momento da coleta, tais como pH, temperatura, oxigênio dissolvido, salinidade, sólidos, cor, presença de óleo, vazão e outros. Anotar esses dados na Ficha de Coleta.

10.1.5 As mesmas determinações e observações feitas no momento da coleta devem ser repetidas em laboratório, à temperatura do teste, imediatamente antes do preparo das soluções-teste e anotadas na Ficha de Controle (Anexo 2).

10.2 AMOSTRAS DE SUBSTÂNCIAS QUÍMICAS PURAS, MISTURAS DE SUBSTÂNCIAS QUÍMICAS E FORMULAÇÕES

10.2.1 É necessário conhecer as características físicas, químicas e toxicológicas do agente tóxico a ser testado, o que possibilita a seleção do método mais apropriado de preparo da amostra e de determinação de toxidade, além dos cuidados necessários para manuseio da mesma. Anotar essas características na Ficha de Controle (Anexo 2).

10.2.2 Amostras de agentes tóxicos com baixa solubilidade em água devem ser preparados por dispersão ultrassônica. Se necessário, deverão ser adicionados solventes orgânicos, dispersantes ou emulsificantes.

11. CULTURA-TESTE 11.1 ORGANISMO-TESTE

Pseudomonas putida (Migula), bactéria aeróbia da família das Pseudomonadaceae, do tipo bastonete gram-negativo com diâmetro de 0,7 a 1,1 μm e comprimento de 2,0 a 4,0 μm, mantida em cultura axênica em condições controladas de temperatura e disponibilidade de nutrientes.

11.1.1 Identificação e Origem

Pseudomonas putida, cepa Berlin 33/2, proveniente da coleção alemã de microorganismos, código DMS 50026.

A cultura pura pode ser obtida no Laboratório de Ecotoxicologia da FEEMA, situado à Av. Salvador Allende, 5500, Jacarepaguá, Rio de Janeiro, RJ.

11.2 PREPARO DA CULTURA-TESTE

A partir da cultura estoque (Anexo 1), preparar a cultura-teste em meio líquido.

11.2.1 Retirar as células bacterianas do tubo de cultura estoque, "lavando-o" com 5 mL de solução salina 0,9% (item 9.2 "f") ou com 5 mL do próprio meio líquido usado para a cultura-teste (item 9.2 "n").

11.2.2 Transferir 0,1 mL dessa suspensão de bactérias para o erlenmeyer, contendo 100 ou 200 mL do meio da cultura-teste (item 9.2 "n").

11.2.3 Colocar o erlenmeyer, fechado com rolhas esterilizáveis e permeáveis ao ar na mesa agitadora, a 24 ºC1 ºC, durante um período de 16h2h, quando a cultura atinge o máximo da fase de crescimento exponencial.

11.2.4 Adicionar, ao final da fase de crescimento exponencial (16h2h), 10 mL de solução tampão (item 9.2 "e") para cada 100 mL de cultura-teste e centrifugar a 7000 rpm, por 10 minutos, em centrífuga refrigerada a 10 ºC. Repetir essa operação por duas vezes.

11.2.5 Manter a suspensão de bactérias (células + solução tampão à temperatura constante e em agitação, até o início do teste.

11.3 AFERIÇÃO DO INÓCULO

11.3.1 Retirar uma alíquota de 1 mL da suspensão de bactérias e diluir em água deionizada na proporção de 1:100.

11.3.2 Medir a absorbância desta diluição com uma cubeta de 10 mm de caminho ótico em um comprimento de onda de 436 nm. O valor medido deve estar na faixa de 0,25 a 0,40 unidades de absorbância. Caso a absorbância medida esteja fora dessa faixa, a suspensão original de bactérias (item 11.2.4) deve ser concentrada, através de centrifugação, ou diluída com a solução tampão e aferida novamente.

11.3.3 Multiplicar a absorbância medida pelo fator de diluição (100) para obter o "valor da concentração" da suspensão original de bactérias a ser usada no teste, que estará na faixa de 25 a 40 unidades de absorbância. Anotar esse valor na Ficha de Controle (Anexo 2). A medida de absorbância é indicadora da concentração de células na

suspensão, servindo para aferir a condição ótima do inóculo para a realização do teste.

11.3.4 Outros métodos para avaliação da atividade metabólica da cultura de bactérias são:

a) medir a taxa de consumo de oxigênio no frasco-controle (água de diluição + substrato de glicose + inóculo) durante o teste, que deverá estar na faixa de 2,00,2 mgO2/L.min, o que corresponde a uma concentração de cerca de 108 microorganismos/mL, e a um lodo ativado com alta atividade metabólica, o que indica que a suspensão de bactérias pode ser usada como inóculo no teste.

b) efetuar testes com substâncias puras cujos valores da inibição da taxa de consumo de oxigênio são conhecidos na literatura, como por exemplo o sulfato de cobre (Ref. 14.2 e 14.3), usando os mesmos procedimentos do item 12.

12. PROCEDIMENTO 12.1 LOCAL DO TESTE

O local do teste deve ser independente dos locais de lavagem de material, isento de gases tóxicos e poeiras, com temperatura controlada na faixa de 24 ºC1 ºC.

12.2 PREPARO DAS SOLUÇÕES-TESTE

As soluções-teste devem ser preparadas em local apropriado à temperatura de 24 ºC1 ºC e em condições assépticas.

Para diluição das amostras deve ser usada água reconstituída, conforme item 9.2 "l".

12.2.1 Efluentes Líquidos

a) Medir o pH, o OD, a temperatura e a condutividade da amostra e anotar na Ficha de Controle (Anexo 2). Outras determinações e observações feitas por ocasião da coleta, devem ser também repetidas e anotadas; b) Preparar as soluções-teste em balões volumétricos, diluindo a amostra

segundo a tabela:

SÉRIE DE DILUIÇÕES PARA TESTE COM EFLUENTES LÍQUIDOS PARTES DA ÁGUA DE DILUIÇÃO PARTE DO EFLUENTE FATOR DE DILUIÇÃO (UT) CONCENTRAÇÃO % 0 1 3 7 15 31 63 127 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 4 8 16 32 64 128 100,00 50,00 25,00 12,50 6,25 3,12 1,56 0,78

12.2.2 Substâncias químicas puras, misturas de substâncias químicas e formulações.

A amostra deve passar por um teste preliminar para que seja estabelecida a faixa de concentração das soluções-teste a ser usada no teste (ver item 12.3).

a) Preparar uma solução-estoque diluindo a amostra em água reconstituída;

Amostras com baixa solubilidade em água devem sofrer um pré-tratamento por dispersão ultrassônica.

Se necessário, deverão ser adicionados solventes orgânicos, dispersantes ou emulsificantes.

A substância auxiliar não deve ultrapassar 0,5 mg/L nas soluções-teste. Quando alguma substância auxiliar é usada, preparar uma solução de controle, em água reconstituída, contendo a substância auxiliar na concentração máxima utilizada no teste.

b) Medir o pH, o OP, a temperatura e a condutividade da solução estoque e anotar na Ficha de Controle (Anexo 2).

c) Preparar as soluções-teste, em balões volumétricos de 200 mL, diluindo a solução-estoque de acordo com a faixa de concentração pré-estabelecida no teste preliminar;

d) Teste do Branco - medir a concentração de oxigênio nas soluções-teste para detectar uma possível ocorrência de oxidação elevada do substrato, variando a concentração de oxigênio do meio, o que poderá afetar o resultado do teste. Anotar na Ficha de Controle (Anexo 2). 12.3 TESTE PRELIMINAR

12.4 DESENVOLVIMENTO DO TESTE

12.4.1 Colocar 100 mL de cada solução-teste em frascos erlenmeyer de 250 mL. No frasco de controle colocar 100 mL da água de diluição.

Preparar os frascos de controle para a água de diluição e para a substância auxiliar (se houver) usando 100 mL de cada solução.

A solução da substância auxiliar deve ser preparada segundo instruções constantes do item 12.2.2 "a".

É aconselhável fazer 2 ou 3 réplicas de cada solução-teste e do(s) controle(s).

12.4.2 Colocar 2 mL da solução de substrato de glicose (item 9.2 "d") em cada frasco-teste, inclusive nos do controle.

12.4.3 Colocar os frascos em banho-maria a 24 ºC1 ºC.

12.4.4 Colocar em cada frasco-teste, a intervalos de 5 min., começando pelo frasco de controle, 2 mL da suspensão de bactérias (item 11.2). Aerar, utilizando tubos de vidro de pequeno diâmetro ou pipetas Pasteur.

O volume final do teste é de 104 mL. A concentração final máxima, no caso de amostras de efluentes líquidos, é de 96,15%.

12.4.5 Manter os frascos em banho-maria a 24 ºC1 ºC por 30 minutos sob aeração constante, após a colocação do inóculo.

12.4.6 Após esse tempo, com o auxílio de uma bomba peristáltica, introduzir a amostra em teste (solução-teste + solução de glicose + suspensão de bactérias) na câmara de medição até enchê-la, onde o eletrodo de oxigênio medirá a concentração de oxigênio durante 3 minutos. Após esse período, desligar a bomba, cortando o fluxo. (Figura 2).

A medição é iniciada pela solução controle e depois as soluções-teste, respeitando a seqüência em que foi colocado o inóculo.

Durante a leitura, manter a amostra em suspensão dentro da câmara de medição, utilizando agitador magnético.

Evitar a ocorrência de bolhas de ar dentro da câmara, pois interferem na medição.

Após 2 horas do início do teste, fazer a medição do 2º frasco controle para verificar se houve alguma alteração na taxa de consumo do oxigênio.

O consumo de oxigênio é registrado graficamente.

13. RESULTADOS

13.1 CÁLCULO DA TAXA DE CONSUMO DE OXIGÊNIO

Para cada solução-teste e para o controle determina-se a taxa de consumo de oxigênio por minuto:

TCO =

tm Cm Ci 

TCO = taxa de consumo de oxigênio por minuto (mgO2/L min) Ci = concentração de OD inicial

Cm = menor concentração de OD obtida no intervalo de tempo de medição (3 min.)

tm = tempo em que se observou a menor concentração de OD 13.2 CÁLCULO DA INIBIÇÃO

A inibição do consumo é calculada para cada concentração, segundo a seguinte fórmula: I = TCOc TCOs TCOc  100

I = inibição da taxa de consumo de oxigênio em %

TCOc = taxa de consumo de oxigênio do controle (valor médio das 2 medições, em mg O2/L min)

TCOs = taxa de consumo de oxigênio de cada solução-teste em mg02/L min)

O efeito da amostra sobre a taxa de consumo de oxigênio da suspensão de bactérias, em geral é inibidor, porém algumas substâncias podem funcionar como nutrientes para as bactérias, estimulando, ao invés de inibir, o seu metabolismo. Nesse caso, essa ocorrência deve ser mencionada no relatório.

13.3 DETERMINAÇÃO DA CE50, CE0 e CE100

Para o cálculo da CE50 só são utilizados valores de inibição da taxa de consumo de oxigênio maiores que 10% em relação ao controle.

A concentração efetiva (CE50) só são utilizados valores de inibição da taxa de consumo de oxigênio maiores que 10% em relação ao controle.

A concentração efetiva (C50), que produz 50% de efeito inibidor sobre a taxa de consumo de oxigênio da suspensão de bactérias, é adotada para os testes com substâncias químicas puras, misturas de substâncias químicas ou formulações. É determinada graficamente em papel probit-log (figura 3) ou por regressão linear, a partir dos resultados de inibição medidos.

Os valores da CE0 e CE100 são obtidos como a CE50.

A CE0 é a maior concentração testada que não causou nenhum efeito inibidor e a CE100 a menor concentração na qual a inibição do consumo de oxigênio foi total.

Exemplo: Concentração

(mg/L) 1 6 12 24 48 96 192 650 --- inibição (%) 0 9 22 44 68 86 95 100

Resultados obtidos pelo método gráfico: (Figura 3) CE0 = 1 mg/L

CE50 = 28 mg/L CE100 = 650 mg/L

13.4 DETERMINAÇÃO DA CENO e UTB

A CENO é determinada a partir dos dados de inibição da taxa de consumo de oxigênio no teste com efluentes líquidos e UTB pelo fator de diluição correspondente, em número inteiro.

Exemplo: CENO = 12,5% UTB = 8

13.5 CRITÉRIOS DE VALIDADE DOS RESULTADOS

O teste será considerado válido, quando a taxa de consumo de oxigênio nos frascos de controle for igual a 2,00,2 mgO2/L.min durante o período de medição (3 minutos).

13.6 RELATÓRIO

No relatório do teste deverão constar as informações: a) método utilizado;

b) identificação da amostra (e se houve algum tratamento preliminar); c) data da realização do teste;

d) origem e identificação da cepa de bactéria; e) concentração do inóculo;

f) água de diluição da amostra; g) a CE0 e CE100;

h) a taxa de consumo de oxigênio do controle; i) a CE50 ou UTB e CENO;

j) qualquer modificação introduzida no método.

14. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

14.1 Robra, K.H., Bewertung toxischer Wasserinhaltsstoffe aus ibrer Inhibitorwirkung auf die Substratoxydation von Pseudomonas Stamm Berlim mit Hilfe polarographischer Sauerstoffmessungen gwf Wasser-Abwasser 117 (1976), H.2, S. 80-86. 86.

14.2 POPP, W. Testverfabren mit Bakterien zur Bestimmung der Toxizitat von Wasserinhaltstoffen und Abwasser Munchener Beitrage zur Abwasser - Fischerei - und FluBbiologie - Band 42. Gefahrliche Stoffe im Abwasser und Oberflachenwasser. 95-107. 1988.

14.3 DIN. DEUTSCHES INSTITUT FUR NORMUNG. Bestimmung der Wirkung von Wasserinhaltstoffen auf die Sauerstoffverbrauchsrate von Pseudomonas putida. (DIN. 38412.L).

14.4 Bestimmung der Hemmwirkung von Wasserinhaltstoffen auf Bakterien (Pseudomonas - Zellverhrungshemmtest). (DIN.38412. Teil 8. Entewurf. Aug. 1988).

14.5 LITCHFIELD, J.T. & WILCOXON, F.A. Simplifield methods of evaluation dose effect experiments J. Pharm. Exp. Ther. 96:99 - 133, 1949.

14.6 FINNEY, D.J. Statistical methods on biological assay Wycombe, UK, Griffin Ltd., 1978.

ANEXO 1

PREPARO DA CULTURA ESTOQUE 1. PREPARO DO MEIO NUTRIENTE

a) Dissolver os reagentes em água deionizada, completando o volume a 1000 mL e aquecendo ligeiramente até que a solução se torne límpida: - 1,00 g de nitrato de sódio (NaNO3)

- 0,24 g de fosfato de potássio bibásico (K2HPO4) - 0,12 g de fosfato de potássio monobásico (KH2PO) - 0,20 g de sulfato de magnésio (MgSO4 . 7 H2O) - 10,0 g de D(+) glicose (C6H12O6H2O)

- 18,0 g de Agar

- 0,0005 g de citrato ferro (III) 19% de Ferro (C6H5FeO7 . 5H2O) - 0,1 g de extrato de fermento

b) Colocar 6 mL da solução em tubos de ensaio, tampar com rolha esterilizável e permeável ao ar e autoclavar durante 10 min. a 121 ºC. c) Colocar os tubos com meio estéril em posição inclinada a temperatura

ambiente, até solidificar.

d) Podem ser mantidos na geladeira.

2. MANUTENÇÃO DE CULTURAS

Inocular os tubos contendo meio com cultura de bactérias e mantê-los a temperatura de 25 ºC.

Efetuar a repicagem das culturas, a intervalos de 7 dias, dando origem a novas culturas estoque.

OBS: Material para construção da câmara: Acrílico transparente. Figura 1-modelo de câmara para medição da respiração de bactérias.