UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM SISTEMÁTICA E EVOLUÇÃO
FILOGENIA MOLECULAR DO GÊNERO MORGANELLA ZELLER
(FUNGI, BASIDIOMYCOTA) UTILIZANDO MARCADORES ITS
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Dissertação de Mestrado
Natal/RN, agosto de 2015
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MARIANA PIRES DE MOURA
Filogenia molecular do gênero Morganella Zeller
(Fungi, Basidiomycota) utilizando marcadores ITS
Área de concentração: Sistemática e Evolução Orientador: Prof. Dr. Iuri Goulart Baseia
Coorientador: Prof. Dr. Paulo Sérgio Marinho Lúcio
Natal, RN 2015
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Sistemática e Evolução, da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como requisito para obtenção do título de Mestre em Sistemática e Evolução.
Catalogação da Publicação na Fonte. UFRN / Biblioteca Setorial do Centro de Biociências
Moura, Mariana Pires de.
Filogenia molecular do gênero Morganella Zeller (Fungi, Basidiomycota) utilizando marcadores ITS / Mariana Pires de Moura. – Natal, RN, 2015.
52 f.: il.
Orientador: Prof. Dr. Iuri Goulart Baseia.
Coorientador: Prof. Dr. Paulo Sérgio Marinho Lúcio.
Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Biociências. Programa de Pós-Graduação em Sistemática e Evolução.
1. Fungos gasteroides. – Dissertação. 2. Sistemática – Dissertação. 3. DNA. – Dissertação. I. Baseia, Iuri Goulart. II. Lúcio, Paulo Sérgio Marinho. III. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. IV. Título.
RN/UF/BSE-CB CDU 582.281.21
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MARIANA PIRES DE MOURA
FILOGENIA MOLECULAR DO GÊNERO MORGANELLA ZELLER (FUNGI, BASIDIOMYCOTA) UTILIZANDO MARCADORES ITS
Área de concentração: Sistemática e Evolução APROVADA EM 25 /08/ 2015
BANCA EXAMINADORA
______________________________________________________________ Prof Dr. Iuri Goulart Baseia
Universidade Federal do Rio Grande do Norte (Orientador)
_______________________________________________________________ Profa Dra. Bianca Denise Barbosa da Silva
Universidade Federal do Rio Grande do Norte (Membro interno)
_______________________________________________________________ Profa Dra. Maria Paz Martín Esteban
(Membro externo)
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Sistemática e Evolução, da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como requisito para obtenção do título de Mestre em Sistemática e Evolução.
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AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus, por ter me concedido sabedoria, paciência, discernimento e permanecesse firme diante das dificuldades.
Ao meu orientador, Dr. Iuri Goulart Baseia, que aceitou o desafio de me orientar e confiado na realização desse trabalho, mesmo eu não tendo nenhum conhecimento sobre fungos gasteroides. Obrigada por toda disponibilidade, paciência, ensinamentos e apoio.
Ao meu coorientador, Dr. Paulo Sérgio Marinho Lúcio, pela amizade, encorajamento, conversas incentivadoras e paciência que vem me demonstrado ao longo desses anos.
Aos Professores Dra. Maria Paz Martín Esteban (RJB – Espanha), Dra. Bianca Denise Barbosa da Silva (UFRN) e Dr. Carlos Alfredo Galindo Blaha (UFRN) pela contribuição neste trabalho, críticas, sugestões fornecidas, e por aceitarem participar da banca avaliadora.
Ao Programa de Pós-graduação em Sistemática e Evolução (PPGSE), Centro de Biociências/ UFRN, pela oportunidade. Aos Departamentos de Botânica e Zoologia (DBEZ) e Biologia e Genética pela infraestrutura disponibilizada nos laboratórios de Biologia de Fungos e de Genética Molecular de Plantas.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pela bolsa concedida e pelo custeio através dos projetos Pesquisador Visitante Especial (PVE) e Programa de Pesquisa em Biodiversidade do Semiárido (PPBio Semiárido).
Aos amigos do laboratório de biologia molecular, Bruno e Verônica, com quem pude dividir as frustrações e alegrias que os experimentos nos proporcionam. Aos companheiros do laboratório de biologia de fungos: Ana Clarissa, Julieth, Marcelo, Marcos, Natália, Rhudson e Tiago. Agradeço a Dônis e Bianca por sempre me ajudarem quando precisei, pelos ensinamentos e imensa boa vontade.
Aos meus queridos pais, Andréa e Antônio Carlos, e irmã, Larissa, por estarem sempre ao meu lado, me incentivando e, principalmente por nunca deixarem de acreditar na minha capacidade.
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Enfim, a todos que, de diferentes formas e maneiras, contribuíram para a realização deste trabalho. Muito Obrigada!
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RESUMO
Com o desenvolvimento e aprimoramento das técnicas para estudos moleculares e sua consequente aplicação à sistemática, relevantes modificações ocorreram na classificação dos gasteromicetos. O gênero Morganella pertence à família Lycoperdaceae, e é caracterizado, principalmente, pelo hábito lignícola e presença de paracapilícios. Dados recentes demonstram a descoberta de novas espécies para o grupo e a existência de uma grande diversidade de espécies ocorrendo em ecossistemas tropicais. Entretanto, as relações filogenéticas do gênero, como também a classificação taxonômica, ainda requerem revisões para serem melhor compreendidas, além de que, trabalhos que abordem esse tema ainda são escassos na literatura. Desta forma, objetivou-se neste trabalho realizar estudos de filogenia molecular com espécies do gênero Morganella, visando ampliar o conhecimento sobre a filogenia do grupo mediante a inclusão de dados de espécies tropicais. Para isso, os espécimes utilizados, tanto para as extrações de DNA quanto para a revisão morfológica, foram obtidos a partir de herbários brasileiros e estrangeiros. Para a análise morfológica foram observados caracteres relevantes para a taxonomia do grupo. Para as análises filogenéticas foram utilizados os métodos de Máxima Parcimônia e Análise Bayesiana, utilizando-se o espaçador interno transcrito (ITS) do DNA ribossômico nuclear. Nas análises filogenéticas realizadas, os representantes de Morganella formaram um clado monofilético com um bom valor de suporte, e com base nestes resultados o gênero não deve ser incluído como subgênero de Lycoperdon. As análises indicaram que M. pyriformis não se agrupa com os demais representantes de Morganella, e portanto não deve ser incluído no grupo como representante do subgênero Apioperdon, pois se trata de um representante de Lycoperdon. Por outro lado, M. fuliginea, M. nuda, M. albostipitata, M. velutina, M. subincarnata, se encontram agrupadas, com valores de suporte alto, dentro do gênero Morganella. Morganella arenicola, com base em estudos morfológicos e moleculares, não se agrega em Morganella. Morganella nuda se agrupou com M. fuliginea dando indícios de que podem se tratar de uma variação intraespecífica. Os resultados das análises realizadas favorecem para um melhor esclarecimento e posição das espécies de Morganella. No entanto, estudos adicionais utilizando um maior número de espécies, e também outros marcadores moleculares se fazem necessários para um melhor entendimento da filogenia de Morganella.
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ABSTRACT
With the development and improvement of techniques for molecular studies and their subsequent application to the systematic, significant changes occurred in the classification of gasteroid fungi. The genus Morganella belongs to the family Lycoperdaceae, and is characterized mainly by lignicolous habit and presence of paracapilicium. Recent data demonstrate the discovery of new species for the group and the existence of a wide variety of species occurring in tropical ecosystems. However, the phylogenetic relationships of the genus, as well as the taxonomic classification, still require revisions to be better understood, the literature studies that address this issue are still very scarce. Thus, the objective of this study was to conduct studies of molecular phylogeny with species of the genus Morganella, to enhance understanding of the phylogeny of the group by including tropical species data. For this, the specimens used both for DNA extractions as for morphological review were obtained from Brazilian and foreign herbaria. For morphological analysis were observed characters relevant to the group's taxonomy. For phylogenetic analysis the Maximum Parsimony and Bayesian Analyzes were used, using the internal transcribed spacer (ITS) of nuclear ribosomal DNA. In phylogenetic analyzes, representatives from Morganella form a monophyletic clade with good support value and based on these results the genus should not be included as subgenus of Lycoperdon. The analysis indicated that M. pyriformis was not grouped with other representatives of Morganella, and therefore should not be included in the group as representative of Apioperdon subgenus because it is a Lycoperdon representative. Moreover, M. fuliginea, M. nuda, M. albostipitata, M. velutina, M. subincarnata are grouped with high support values within the genus Morganella. Morganella arenicola based on morphological and molecular studies does not aggregate in Morganella. Morganella nuda was grouped with M. fuliginea giving indications that can be treated as an intraspecific variation. The results of the analyzes favor to a better understanding of the species of Morganella. However, additional studies using a greater number of species, as well as other molecular markers are needed for a better understanding of the phylogenetic of Morganella.
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LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - A – espécime imaturo de M. arenicola com hábito lignícola. B – espécime maduro de M. fuliginea com hábito lignícola. C – espécime imaturo de M. arenicola com hábito folícola. D – espécime maduro de M. arenicola com hábito folícola ... 13 Figura 2 - Basidiomas do gênero Morganella. a – exoperídio. b – hábito lignícola. c – gleba. d – perídio. e – subgleba reduzida. ... 14 Figura 3 - Detalhes das hifas do exoperidio. A – M. velutina. B – M. purpurascens. C – M. afra. ... 15 Figura 4 - Exsicatas dos parátipos de Morganella mexicana. A- ficha descritiva do herbário New York Botanical Garden de Morganella mexicana. B- Parátipo de Morganella mexicana (NY00839022). C- Parátipo de Morganella mexicana (NY00839023). ... 22 Figura 5 - Representação esquemática de uma unidade de repetição do nrDNA, indicando as regiões gênicas (em preto) e espaçadoras (cinza), e os primers utilizados para a amplificação do marcador ITS. ... 25 Figura 6 - Eletroforese em gel de agarose 1% de amostras de DNA genômico; 1-4: M. arenicola, 5-7: M. fuliginea, 8: M. arenicola, 9-10: M. albostipitata. ... 29 Figura 7 - Amplificações de ITS, mostrando bandas de aproximadamente 700bp. M. marcador DNA Ladder 100bp evidenciando banda de 500bp; 1-5: M. arenicola, 6-10: M. fuliginea, 11: M. nuda. ... 29 Figura 8 - Amplificações dos parátipos de Morganella utilizando os pares de primers internos. A – amplificação dos parátipos (NY00839022) e (NY00839023) usando os primers internos ITS1/ITS2. B – amplificação dos parátipos (NY00839022) e (NY00839023) usando os primers internos ITS3/ITS4B. ... 30 Figura 9 - Basidiomas. A – Morganella arenicola. B – M. fuliginea. C – M. albostipitata. D – M. nuda. ... 32
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Figura 10 - Basidiósporos de gênero Morganella em microscopia eletrônica de varredura (MEV). A – Morganella arenicola: basidiósporos verrugosos. B – M. fuliginea: basidiosporos equinulados. C – M. albostipitata: basidiosporos equinulados. D – M. nuda: basidiosporos equinulados. ... 32 Figura 11 - Árvore consenso do alinhamento total, a partir da análise de Máxima Parcimônia realizada pelo programa PAUP*. Os valores encontrados nos ramos indicam os valores de bootstrap (>50%). ... 36 Figura 12 - Árvore consenso da análise Bayesiana do alinhamento total gerada pelo programa MrBayes. Os valores encontrados nos ramos indicam os valores de probabilidade posterior (>0.5). ... 37 Figura 13 - Árvore consenso do alinhamento reduzido, a partir da análise de Máxima Parcimônia realizada pelo programa PAUP*. Os valores encontrados nos ramos indicam os valores de bootstrap (>50%). ... 38 Figura 14 - Árvore consenso de análise Bayesiana do alinhamento reduzido gerada pelo programa MrBayes. Os valores encontrados nos ramos indicam os valores de probabilidade posterior (>0.5). ... 39
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LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Espécies do gênero Morganella de acordo com o Index Fungorum ... 17 Tabela 2 - Sequência dos primers utilizados ... 25 Tabela 3 - Resultados da análise morfológica ... 31 Tabela 4 - Espécimes de Morganella e Lycoperdon incluídas na análise molecular .. 49
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ... 11
1.1 Caracterização do gênero Morganella ... 13
1.2 Sistemática do gênero Morganella ... 15
1.3 Estudos moleculares ... 18 2 OBJETIVOS ... 21 3 MATERIAL E MÉTODOS ... 22 3.1 Espécimes estudados ... 22 3.2 Estudo morfológico ... 23 3.3 Análise molecular ... 23 4 RESULTADOS ... 29 5 DISCUSSÃO ... 40 6 CONCLUSÃO ... 43 REFERÊNCIAS ... 44 APÊNDICE ... 49
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1 INTRODUÇÃO
Diversos táxons distintos de basidiomicetos desenvolveram corpos de frutificação angiocárpicos ao longo da evolução e esta característica durante muito tempo foi utilizada para agrupa-los na classe Gasteromycetes. Com o avanço das técnicas moleculares (Hibbett et al., 2007; Kruger et al. 2001; Hibbett et al. 1997; Binder & Bresinsky, 2002), a origem polifilética destes táxons foi comprovada e gasteromicetes passou a ser uma terminologia genérica sem significado taxonômico. A palavra deriva do grego “gaster”, que significa estômago, e “mycetes” que significa fungos (Miller & Miller, 1988). Em 1973, Dring com base em dados morfológicos propôs nove ordens para a tradicional classe Gasteromycetes: Gautieriales, Hymenogastrales, Lycoperdales, Melanogastrales, Nidulariales, Phallales, Podaxales, Sclerodermatales e Tulostomatales. Utilizando ferramentas moleculares (nuSSU, -LSU, e 5.8S rRNA, rpb1, rpb2 e tef1), Hibbett et al. (2006) propuseram uma classificação filogenética ampla do reino Fungi, na qual os fungos gasteroides encontram-se inseridos no sub-reino Dikarya, filo Basidiomycota, subfilo Agaricomycotina, classe Agaricomycetes, subclasse Agaricomycetidae.
Além dos corpos de frutificação angiocárpicos, estas diversas linhagens possuem outra característica notável em comum, que é a produção de estatismosporos, ou seja, nestes fungos a liberação dos esporos ocorre de forma passiva, ao contrário da maioria dos basidiomicetos que produzem seus esporos em basidiomas gimnocárpicos, onde a liberação é ativa (balistosporia) devido a presença do apêndice hilar (Alexopoulos et al., 1996; Miller & Miller, 1988). Os gasteromicetos são organismos de grande diversidade morfológica também conhecidos como bufas de lobo (do inglês - puffballs), estrelas da terra (do inglês - earthstars), chifres fedorentos (do inglês - stinkhorns) e os fungos ninhos de passarinhos (do inglês - bird’s nest fungi). Em 2007, Webster & Weber em uma abordagem didática e evolutiva, segregaram os táxons gasteroides no clado eugárico (puffballs e bird’s nest fungi), clado boletoide (earth balls) e no clado gonfoide-faloide (earth stars, cannonball fungi, stinkhorns).
Com relação a morfologia das linhagens gasteroides, há uma grande variação na forma, coloração e dimensão dos basidiomas, o que torna a taxonomia dos grupos muito distinta. Com relação ao hábito, algumas espécies possuem desenvolvimento abaixo do
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solo, denominado hipógeo, por outro lado em outras o desenvolvimento ocorre sobre o solo, sendo por isso denominado epígeo (Miller & Miller, 1988). Embora existam muitas espécies ectomicorrízicas, diversos táxons de fungos gasteroides são sapróbios, crescendo sobre solo humoso, folhas caídas, madeira morta, fezes de ruminantes, e outras fontes de matéria orgânica vegetal morta (Webster & Weber, 2007).
Com o desenvolvimento e aprimoramento das técnicas para estudos moleculares e sua consequente aplicação à sistemática, relevantes modificações ocorreram na classificação dos gasteromicetos. Podemos citar como exemplo o reconhecimento de Agaricaceae Chevall. agregando representantes das famílias Lycoperdaceae Smarda, Nidulariaceae Fr., Podaxaceae Corda, Tulostomataceae E. Fisch. (Kirk et al., 2008). De acordo com o Dictionary of Fungi (Kirk et al., 2008), Lycoperdaceae inclui os gêneros Abstoma G. Cunn., Acutocapillitium P. Ponce de León, Arachnion Schwein., Bovista Pers., Calbovista Morse, Calvatia Fr., Calvatiopsis Hollós, Disciseda Czern., Gastropila Homrich & J.E. Wright, Japonogaster Kobayasi, Langermannia Rostk., Lycogalopsis E. Fisch., Lycoperdon P. Michelli, Lycoperdopsis Henn., Morganella Zeller e Vascellum F. Smarda.
Os representantes da família Lycoperdaceae geralmente apresentam hábito epígeo e basidiomas globosos a subglobosos, apresentando normalmente perídio com duas camadas (Miller & Miller, 1988). Inclui espécies com basidiomas angiocárpicos e uma gleba inicialmente branca que, na maturidade, torna-se pulverulenta com coloração amarronzada, contendo trilhões de esporos, os quais são dispersos a partir da abertura apical do endoperídio. As espécies têm o hábito sapróbio, seja crescendo em madeira morta, serapilheira ou sobre o solo em florestas ou pradarias abertas (Larsson & Jeppson, 2008). A distribuição dessa família é cosmopolita e seus espécimes são comumente encontrados em climas temperado, árido e tropical (Pegler et al., 1995). Na família Lycoperdaceae, encontramos o gênero Morganella Zeller, que é o foco do estudo.
Esclarecimentos sobre a natureza monofilética ou parafilética do gênero Morganella e a delimitação do clado em Lycoperdaceae, bem como sua caracterização morfológica, constitui um problema interessante a ser estudado. Com as ferramentas disponíveis para estudos sobre filogenia molecular podemos esclarecer dúvidas fundamentais, sobretudo quanto a monofilia e o posicionamento das espécies do gênero. A falta de informações sobre a filogenia molecular de Morganella e gêneros afins gera
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controvérsias sobre as relações filogenéticas nos táxons de Lycoperdaceae. Os poucos dados sobre a filogenia molecular de Lycoperdaceae se baseiam quase exclusivamente em táxons provenientes de regiões temperadas, gerando uma filogenia limitada e inconclusiva. É fundamental a inclusão de dados das espécies de regiões tropicais e subtropicais nessas análises, incluindo espécies endêmicas. Sendo assim, este estudo visa ampliar os conhecimentos sobre filogenia molecular de Morganella a partir da inclusão de sequencias ITS de espécies tropicais, a fim de delimitar as espécies e melhor compreender as suas relações filogenéticas.
1.1 Caracterização do gênero Morganella
Os representantes de Morganella apresentam basidiomas epígeos, depresso globoso a piriforme, que raramente ultrapassam 3 cm de diâmetro, sendo o hábito lignícola (figura 1 e figura 2b) característico para quase todas as espécies do grupo, com exceção de M. stercoraria, que é encontrada em esterco de vaca, e M. arenicola, que geralmente ocorre em solo arenoso e raramente sobre madeira em decomposição (Ponce de Leon, 1971; Alfredo et al., 2014).
Fonte: Julieth Sousa (PPGSE – UFRN)
Figura 1: A – espécime imaturo de M. arenicola com hábito lignícola. B – espécime maduro de
M. fuliginea com hábito lignícola. C – espécime imaturo de M. arenicola com hábito folícola. D
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O perídio (figura 2d) é composto por duas camadas: 1) uma mais externa, denominada de exoperídio (figura 2a), que pode variar de acordo com a textura da superfície (furfurácea, velutínea, granular, verrugosa a espinhosa), e também de acordo com a coloração, que pode variar de avermelhado, ou marrom-avermelhado até o preto-arroxeado; 2) outra mais interna denominada de endoperídio, que pode ser considerada papiráceo, lisa ou reticulada, e a presença de uma abertura apical, geralmente irregular, denominada ostíolo. Apresentam uma estrutura geralmente inconspícua que pode estar presente abaixo da gleba é denominada de subgleba (figura 2e), que pode ser compacta ou em câmaras, sem a presença de diafragma. A gleba (figura 2c) é branca no início do desenvolvimento dos basidiomas, tornando-se marrom e pulverulenta na maturidade.
Figura 2: Basidiomas do gênero Morganella. a – exoperídio. b – hábito lignícola. c – gleba. d –
perídio. e – subgleba reduzida.
No interior da gleba são encontradas hifas generativas denominadas de paracapilícios e também abundantes membranas glebais. Os paracapilicios são hifas generativas que apresentam parede celular fina, hialinas, cianófilas (reação positiva a coloração por azul de algodão) e septadas (Calonge, 1998). As hifas do exoperídio são formadas por cadeias de células mais ou menos ramificadas que variam de arredondadas a alongadas (sphaerocysts), ou por células setosas de parede espessa (figura 3) (Kreisel &
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Dring, 1967; Suárez & Wright, 1996). Basidiósporos globosos a subglobosos com ornamentação, verrugosa a espinhosa (Morales et al., 1974; Ponce de Leon, 1971). Ainda, na espécie M. pyriformis são encontrados a presença de abundantes capilícios, hifas esqueleteas, com parede celular espessa, amarronzadas, não cianófilas (sem reação a coloração com azul de algodão) e asseptadas ou raramente septadas (Calonge, 1998). As espécies de Morganella se distingue de Lycoperdon, Calvatia, Bovista, e de outros gêneros de Lycoperdaceae, pelo pequeno tamanho dos basidiomas, ausência de eucapilícios, presença de abundantes membranas glebais e paracapilícios (Ponce de Leon, 1971).
Fonte: Kreisel & Dring (1967)
Figura 3: Detalhes das hifas do exoperidio. A – M. velutina. B – M. purpurascens. C – M. afra.
1.2 Sistemática do gênero Morganella
O gênero Morganella foi proposto inicialmente por Zeller como como um gênero monotípico (Zeller, 1948). A espécie tipo, Morganella mexicana Zeller, foi depositada no Herbário Morgan da Universidade de Iowa (IA), sendo posteriormente perdida. Após estudos realizados em 1967 por Kreisel e Dring, de uma pequena parte do
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material citado como parátipo por Zeller, que se encontrava no Herbario NY, o gênero foi alterado para incluir espécies que continham a presença de paracapilício e crescimento em madeira em decomposição (Bates, 2004; Kreisel & Dring, 1967). A espécie tipo Morganella mexicana foi considerada sinônimo de Morganella fuliginea Berk. & M.A. Curtis, após comparações morfológicas realizadas por Kreisel & Dring (1967), Ponce de Leon (1971) e Suárez & Wright (1996). Como consequência, as espécies L. purpuracens Berk. & Curt., L. subincarnatum Peck., L. fuligineum Berk. & Curt. e L. compactum Cunn. foram incluídas no gênero Morganella respectivamente como: M. purpuracens Berk. & Curt., M. subincarnata Peck., M. fuliginea Berk. & M.A. Curtis e M. compacta Cunn. (Kreisel & Dring, 1967). No gênero Lycoperdon, pode-se encontrar a espécie, L. pyriforme Schaeff. ex Pers., que apresenta crescimento em madeira em decomposição, e presença de paracapilicio e também capilício persistindo na gleba madura, ocupando, então, de acordo com Kreisel e Dring (1967) uma posição intermediária entre Lycoperdon e Morganella. As espécies de Morganella estão distribuídas globalmente ocorrendo, em regiões tropicais, subtropicais e temperadas
Segundo Kreisel e Dring (1967), o gênero Morganella estaria representado por sete espécies reconhecidas: M. fuliginea, M. velutina, M. purpuracens, M. puiggarii, M. compacta, M. afra e M. subincarnata. Entretanto, ao longo do tempo, novas espécies foram incluídas no gênero, totalizando 19 espécies registradas no index fugorum (tabela 1). Contudo, a espécie Morganella albina foi sinonimizada com a espécie Lycogalopsis solmsii Fischer, e assim, excluída do gênero (Ponce de Leon, 1971). Em 1996, Suárez & Wright sinonimizaram a espécie Morganella puiggarii Speg. com Morganella fuliginea. Em 2003, Kruger & Kreisel propuseram a transferência da espécie L. pyriforme para o gênero Morganella.
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Tabela 1 – Espécies do gênero Morganella de acordo com o Index Fungorum
Espécies de Morganella Característica Referência
Esporos Exoperídio Peristômio Paracapílício Capilício Substrato
M. afra Kreisel & Dring 1967 Minuciosamente asperulado
Minuciosamente granular
Poro irregular
Presente Ausente Madeira Kreisel e & Dring (1967) Ponce de Leon
(1971)
M.albina (Cooke) P. Ponce de
León 1969
Asperulado Furfuráceo ——— Presente Ausente Madeira Ponce de Leon (1969)
M. albostipitata Baseia &
Alfredo 2012
Equinulados Granuloso Poro lacerado
Presente Ausente Madeira Alfredo et. al (2012)
M. arenicola Alfredo & Baseia
2014 Asperulado Pequenos espinhos / granuloso Poro simples
Presente Presente Solo e madeira
Alfredo et. al (2014)
M. benjaminii (Rick) Cortez,
Calonge & Baseia 2007
Verrugosos Pequenos espinhos
Poro simples
Presente Ausente Liteira Cortez et al. (2008)
M. compacta (G. Cunn.)
Kreisel & Dring 1967
Moderamente verrogoso
Espinhoso Poro simples
Presente Ausente Madeira Kreisel e & Dring (1967) Ponce de Leon
(1971)
M. costaricensis M.I. Morales
1974
Liso a gutulado Espinhoso Poro irregular
Presente Ausente Madeira Suárez & Wright (1996), Calonge et. al
(2005)
M. fuliginea (Berk. & M.A.
Curtis) Kreisel & Dring 1967
Equinulados Espinhoso Poro irregular
Presente Ausente Madeira Kreisel e & Dring (1967) Ponce de Leon
(1971)
M. mexicana Zeller 1948 ——— ——— ——— ——— ——— ——— Suárez & Wright (1996)
M. nuda Alfredo & Baseia
2014
Equinulados Granuloso Poro simples
Presente Ausente Madeira Alfredo & Baseia (2014)
M. puiggarii (Speg.) Kreisel &
Dring 1967
——— ——— ——— ——— ——— ——— Suárez & Wright (1996)
M. purpurascens (Berk. &
M.A. Curtis) Kreisel & Dring 1967
Minuciosamente espinhoso
Tubérculos minúsculos
——— Presente Ausente Madeira Kreisel e & Dring (1967) Ponce de Leon
(1971)
M. pyriformis (Schaeff.) Kreisel
& D. Krüger 2003
——— ——— ——— ——— ——— ——— Larsson & Jeppson
(2008)
M. rimosa Baseia & Alfredo
2012
Verrugosos a equinulados
Rimoso / granuloso
Lacerado Presente Ausente Madeira Alfredo et. al (2012)
M. samoensis (Bres. & Pat.) P.
Ponce de León 1971
Liso Furfuráceo Lacerado Presente Ausente Madeira Ponce de Leon (1971)
M. stercoraria P. Ponce de León 1971 Liso a moderamente rugoso Pequenos espinhos no ápice Poro irregular
Presente Ausente Esterco de vaca
Ponce de Leon (1971)
M. subincarnata (Peck) Kreisel
& Dring 1967
Equinulados Espinhoso Poro Presente Ausente Madeira Kreisel e & Dring (1967) Ponce de Leon
(1971)
M. sulcatostoma C.R. Alves &
Cortez 2013 Verrugoso Densamente espinhoso, tornando caduco na maturidade Sulcado-estriado
Presente Presente Folhas caídas
Syagrus
Alvez & Cortez (2013)
M. velutina (Berk. & M.A.
Curtis) Kreisel & Dring 1967
Equinulados Espinhoso Poro simples
Presente Ausente Madeira Suárez & Wright (1996), Kreisel e & Dring (1967) Ponce de
Leon (1971)
No Brasil, diversos trabalhos sobre a micobiota do país têm contribuído para o conhecimento dos fungos gasteroides, incluindo o gênero Morganella. Vários estudos de revisão sobre fungos da América do Sul abrangem espécies de Morganella do Brasil (Ponce de Leon, 1971; Suárez & Wright, 1996; Kreisel & Dring, 1967), além dos registros mais recentes da descoberta de novas espécies para o grupo (Cortez et al.,
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2007; Alfredo et al., 2012; Alves & Cortez, 2013; Alfredo et al., 2014; Alfredo & Baseia, 2014). Entretanto, as relações filogenéticas do gênero, como também a classificação taxonômica, ainda requerem revisões para serem bem compreendidas, além do que, ainda são escassos na literatura trabalhos que abordem esse tema.
De acordo com Trierveiler-Pereira & Baseia (2009), são encontradas 232 espécies de fungos gasteroides para o Brasil, porém, este número provavelmente está superestimado devido à inclusão de inúmeros sinônimos e registros duvidosos. Entretanto, dentre estes registros, Morganella fuliginea é a espécie mais amplamente distribuída, encontrada em 7 estados. Suárez & Wright (1996), Cortez et al. (2007) e Meijer (2006) relataram cinco espécies para o Brasil: M. benjaminii (RS), M. fuliginea (RS, PR, SP, RJ, GO, DF e RO), M. pyriformis (RS, SP e MG), M. velutina (SP e MG) e M. subincarnata (RS). Alfredo et al. (2012) descreveram duas novas espécies de Morganella, registradas para a Amazônia: M. albostipitata e M. rimosa, ambas com hábito lignícola. Alves e Cortez (2013) publicaram uma nova espécie encontrada no estado do Paraná, M. sulcatostoma. E, recentemente, Alfredo et al. (2014) e Alfredo e Baseia (2014) descreveram outras duas novas espécies: M. arenicola e M. nuda, para o Norte e Nordeste do Brasil. Estes dados recentes demonstram a existência de uma grande diversidade de espécies de Morganella ocorrendo em ecossistemas tropicais. 1.3 Estudos moleculares
A geração de sequências de DNA a partir de marcadores moleculares obtidos por PCR, vem sendo realizada há mais de duas décadas. A definição de barcodes universais para animais, plantas e fungos, no entanto, é mais recente. Em Maio de 2004, foi lançado o “Consortium for the Barcode of Life” – CBOL – (www.barcodeoflife.org) com o objetivo de contribuir para o desenvolvimento de um sistema capaz de identificar todas as espécies do planeta baseado na utilização de um pequeno fragmento padronizado de DNA. Em se tratando de animais, o gene mitocondrial COI, que codifica a citocromo oxidase (HEBERT et al, 2003), foi aceito como o marcador ideal. Em plantas, o consenso quanto ao melhor marcador foi definido pelo uso de dois genes de regiões codificantes plastidiais, o matK (Maturase K) e o rbcL (Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase) (CBOL Plant Working Group, 2009). O mesmo consórcio definiu, em 2012 (Schoch et al., 2012), após análise dos principais marcadores em mais 15.500 espécies e 2.500 gêneros, o barcode universal de fungos como sendo a região ITS do rDNA nuclear (ITS - Internal Transcribed Spacer).
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O DNA que codifica para RNA ribossômico apresenta-se como um cluster gênico, no qual se encontram os genes 18S, 5,8S, 28S (e 5S para muitos fungos). Processos pós-transcricionais irão formar o RNA ribossômico pela remoção dos espaçadores internos transcritos que incluem as duas regiões de ITS e de IGS. A região ITS está localizada entre os genes 18S e 28S, e é dividida em ITS1, localizada entre os genes 18S e o 5.8S, e o ITS2, que separa os genes 5.8S e 28S. Enquanto as regiões conservadas dos genes ribossômicos têm evoluído lentamente e são altamente semelhantes dentro de diferentes táxons, as regiões variáveis, os ITS, apresentam maior frequência de mutações durante o processo evolutivo. Elas podem então ser mais utilizadas para discriminar espécies relacionadas ou até mesmo variedades de uma mesma espécie (Fungaro, 2000). Atualmente, mais de 170.000 sequências de ITS de fungos já foram depositadas no GenBank (Schoch et al., 2012).
As primeiras sequências de Morganella mencionadas na literatura, e consequentemente depositadas nos bancos de dados, foram feitas por Krueger et al. (2001) e Kruger & Kreisel (2003), a partir das espécies M. fuliginea, M. subincarnata e L. pyriforme. Estudos realizados por Krueger et al. (2001) com base em dados de sequências de rDNA, indicam que o gênero Lycoperdon é polifilético e questionam a estabilidade das fronteiras entre os gêneros Bovista, Lycoperdon e Morganella. Lycoperdon pyriforme não se agrupa com nenhuma outra espécie de Lycoperdon por apresentar hábito lignícola e possuir algumas características morfológicas, como a presença de paracapilícios, podendo assim, ser segredada. Entretanto, os autores decidiram não recombinar esta espécie em outro gênero, como Morganella, até que novos dados moleculares sobre Lycoperdaceae estivessem disponíveis (Kruger et al., 2001). Em 2003, Kruger & Kreisel propuseram a transferência de L. pyriforme para o gênero Morganella (como M. pyriformis), através de análises filogenéticas moleculares da região ITS que indicavam uma ampla separação de L. pyriforme e outras espécies de Lycoperdon. Esse estudo também propôs a criação do gênero Apioperdon como um novo subgênero para Morganella. A espécie tipo de Apioperdon é Morganella pyriformis, e atualmente encontra-se como um subgênero monotípico (Kruger & Kreisel, 2003).
Em análises filogenéticas realizadas por Bates (2004), Larsson & Jeppson (2008) e Kruger & Gargas (2008), a transferência de L. pyriforme para Morganella não foi apoiada, indicando que M. pyriformis poderia ser excluída do gênero Morganella, e que
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o subgênero Apioperdon seria mantido em Lycoperdon. Então, até o presente momento, não existem resultados conclusivos em relação a inclusão de L. pyriforme em Morganella. Lycoperdon pyriforme é conhecida por apresentar paracapilicios e eucapilícios abundantes na gleba madura, fazendo com que esta espécie ocupe uma posição de transição entre Morganella e Lycoperdon (Kreisel & Dring, 1967). Contudo, os estudos moleculares mencionados, se basearam em espécies do norte da Europa e da América do Norte, sem uma representatividade de espécies neotropicais. Desta forma, dados moleculares de espécies de Morganella oriundas de regiões neotropicais, poderão ajudar a esclarecer melhor esta questão (Bates et al., 2009).
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2 OBJETIVOS Geral:
Realizar estudos de filogenia molecular, baseados nas sequências do barcode ITS (nrDNA) com espécies do gênero Morganella, mediante a inclusão de dados de espécies tropicais, que permitirão delimitar as espécies descritas e ampliar o conhecimento sobre a filogenia do grupo.
Específicos:
1- Revisar espécimes herborizados de Morganella provenientes de herbários do Brasil e do exterior, incluindo espécies tipo;
2- Realizar extração de DNA genômico de representantes do gênero Morganella;
3- Amplificar, por reação de PCR, os fragmentos de DNA que correspondem às regiões ITS definidas como barcode universal para fungos, a partir de amostras de DNA genômico dos espécimes;
4- Gerar sequências de DNA dos produtos da amplificação;
5- Gerar árvores filogenéticas a partir das sequencias obtidas bem como a partir das sequencias disponíveis nos bancos de dados;
6- Analisar as árvores filogenéticas geradas, interpretando e discutindo a organização dos clados.
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3 MATERIAL E MÉTODOS 3.1 Espécimes estudados
Os espécimes utilizados neste trabalho, tanto para as extrações de DNA quanto para a revisão morfológica foram obtidos a partir de herbários brasileiros e estrangeiros. Para isso, foi feita uma busca no INCT-Herbário Virtual da Flora e Fungos (http://inct.florabrasil.net/herbario-virtual) bem como no Species Link Network (http://www.splink.org.br) das espécies de Morganella, para os herbários brasileiros. Os Herbários contatados para empréstimo foram: Herbario da Universidade de Harvard – HUH (Estados Unidos), Herbário UFRN (Rio Grande do Norte), Herbário Anchieta – PACA (Rio Grande do Sul), Herbário INPA (Amazônia), Herbário New York Botanical Garden – NY (Estados Unidos) e Herbário – ICN (Rio Grande do Sul). As extrações de DNA foram realizadas mediante autorização dos herbários de origem, incluindo material tipo, que pode ser visualizado na figura 3.
Fonte: Julieth Souza (DBZ-UFRN)
Figura 4: Exsicatas dos parátipos de Morganella mexicana. A- ficha descritiva do herbário
New York Botanical Garden de Morganella mexicana. B- Parátipo de Morganella mexicana (NY00839022). C- Parátipo de Morganella mexicana (NY00839023).
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3.2 Estudo morfológico
O estudo dos espécimes foi realizado no Laboratório de Biologia de Fungos do Departamento de Botânica e Zoologia – Centro de Biociências da Universidade Federal do Rio Grande do Norte.
Todos os espécimes estudados foram analisados morfologicamente com base na literatura pertinente (Alfredo et al., 2012, Alfredo et al., 2014; Alfredo & Baseia, 2014; Alves & Cortez, 2012; Kreisel & Dring, 1967; Ponce de Léon, 1969, 1971; Suárez & Wright, 1996) e comparados com material tipo sempre que possível. Foram observados caracteres macro e microscópicos relevantes para a taxonomia do grupo, como dimensão e forma dos basidiomas; natureza do exoperídio, paracapilícios e presença ou ausência de eucapilícios; dimensões, formas e ornamentação dos basidiosporos. Além disso, foi analisado o tipo de substrato onde os basidiomas se desenvolveram e se ocorriam solitários, em grupos ou cespitosos.
Para a análise das microestruturas foi utilizado microscópio esteriocóspico (marca Nikon, modelo SMZ1500) e microscópio óptico (marca Olympus, modelo BX41TF) sendo seguida a metodologia usual adotada em estudos deste grupo (Kreisel & Dring, 1967; Ponce de Léon, 1969; Ponce de Léon, 1971; Suárez & Wright, 1996), ou seja, para a confecção das lâminas o perídio foi cortado transversalmente à mão livre, utilizando lâmina cortante, e com duas pinças de ponta fina as camadas foram separadas e colocadas sobre lâminas distintas, contendo KOH a 5%; para análise de paracapilícios e/ou eucapilícios foi utilizado azul de algodão para observar reação cianofílica (Miller & Miller, 1988). Os basidiosporos foram observados em basidiomas maduros. Para a visualização do padrão de ornamentação dos basidiosporos foi utilizado microscopia eletrônica de varredura (MEV).
3.3 Análise Molecular
As análises moleculares foram realizadas no Laboratório de Genética Molecular de Plantas do Departamento de Biologia Celular e Genética, localizado no Centro de Biociências da Universidade Federal do Rio Grande do Norte.
- Extração de DNA
Uma vez que o material herborizado era constituído por basidiomas muito antigos e outros mais recentes, foram utilizados dois métodos diferentes para a extração
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de DNA. Para o material herborizado mais antigo, foi utilizado o kit FTA™ Cards - GE Healthcare, seguindo o trabalho de Telleria et al. (2014). Neste protocolo, um pequeno fragmento do material foi hidratado em presença de KOH 5%, e em seguida aplicado no cartão FTA, a partir do qual pequenos discos foram coletados para extração. Este disco passa por repetidas lavagens com tampões de extração e de ressuspensão para obtenção do DNA. Para o material mais recente, as amostras foram trituradas em microtubos de centrífuga de 1,5 ml, com o auxílio de um pistilo, em presença de tampão líquido e, em seguida, incubadas à noite toda (mais de 8 horas) à 60°C, seguindo Whiting et al. (1997). Este material foi então extraído utilizando-se o kit de extração DNeasy® Plant Mini Kit – Quiagen (ref. 69106) que consiste basicamente no uso de tubos com colunas onde se fixa o DNA, e tubos coletores. O DNA é eluído em volume final de 200 µL com tampão pré-aquecido à 60°C.
Para a verificação da qualidade do DNA extraído de cada amostra, foi realizada uma eletroforese em gel de agarose (1,0%). As amostras de 5 µL de DNA foram depositadas juntamente com 2 µL de Tampão de Corrida (Blue/Orange 6X Loading Dye G190A, Promega) adicionados de 2 µL de GelRed (ref. 41003, Uniscience). A visualização das bandas foi realizada através da exposição do gel em transiluminador de luz ultravioleta e fotografados com equipamento de fotodocumentação (Cleaver). As extrações de DNA foram estocadas em freezer a -20 ºC para posterior utilização nas reações de amplificação de PCR.
- Escolha de primers
Para as amplificações de PCR a partir das extrações de DNA realizadas, foram utilizados primers do espaçador ITS definido como o barcode universal de fungos (SCHOCH et al. 2012). Vários iniciadores são utilizados para amplificar a totalidade ou partes da região do ITS. Inicialmente foram testados os pares de primers que amplificam a região inteira do gene: ITS1F/ITS4, ITS1/ITS4, ITS5/ITS4, ITS1/ITS4B e ITS1F/ITS4B (White et al., 1990; Gardes & Bruns, 1993) nas amostras de DNA, com o objetivo de avaliar qual seria o par mais eficiente para o grupo. Foi escolhido o par que apresentou a maior eficiência: ITS5/ITS4 para amplificação da região que contém o espaçador interno transcrito 1 (ITS1), o gene 5.8S, e o espaçador interno transcrito 2 (ITS2) do nrDNA. Esses primers amplificam regiões de aproximadamente 700pb. Para a amplificação de DNA do material mais antigo, essa combinação de primers não foi eficiente, sendo necessário a utilização de primers internos que amplificam partes da
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região do ITS: ITS1/ITS2 e ITS3/ITS4B (White et al., 1990; Gardes & Bruns, 1993), que amplificam respectivamente, as regiões ITS1 e ITS2 do rDNA, totalizando a região alvo estudada.
Os primers utilizados para as amplificações de PCR foram os mesmos utilizados para sequenciamento. Todos eles foram adquiridos sob encomenda, e fabricados pela Prodimol Biotecnologia e IDT (Integrated DNA Technologies). A região alvo dos pares de primers escolhidos para o estudo está ilustrada na figura4, e as sequências na tabela 2.
Fonte: Mariana Pires (PPGSE – UFRN)
Figura 5: Representação esquemática de uma unidade de repetição do nrDNA, indicando as
regiões gênicas (em preto) e espaçadoras (cinza), e os primers utilizados para a amplificação do marcador ITS.
Tabela 2 – Sequência dos primers utilizados
Primer sequencia 5’->3’ Autor
Forward primers
ITS1 TCCGTAGGTGAACCTGCGG White et al., 1990 ITS3 GCATCGATGAAGAACGCAGC White et al., 1990 ITS5 GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG White et al., 1990
Reverse primers
ITS2 GCTGCGTTCTTCATCGATGC White et al., 1990 ITS4 TCCTCCGCTTATTGATATGC White et al., 1990
ITS4B CAGGAGACTTGTACACGGTCCAG Gardes & Bruns, 1993
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- Condições de Amplificações de PCR
Para a realização das amplificações de PCR a partir das amostras de DNA genômico obtidas, foram utilizados dois métodos diferentes. Para as amplificações de DNA de amostras antigas, foi utilizado o kit PureTaq Ready-To-Go PCR Beads/GE Healthcare (ref. 27955901) que contêm aproximadamente 2,5 unidades de PureTaqTM DNA polymerase, 10mM Tris-HCl, 50mM KCl, 1,5mM MgCl2, 200μM dATP, dCTP, dGTP e dTTP e estabilizadores, incluindo BSA. A cada pérola foram adicionados 1μl de cada primer e 23μl de DNA, seguindo Martín & Winka (2000). Para as demais amostras, foi preparado um “mix” de reação em um tubo contendo: a enzima Taq DNA Polimerase (Invitrogen) a 5 U/μl, tampão 10x de PCR, MgCl2, desoxirribonucleotídeos fosfatados (dNTP), primers foward e reverse a 10 pmol, completando com água. Ao final, 20μl do mix foi distribuído em um novo tubo e adicionado 5μl de DNA, para o volume final de 25μl.
As amplificações por PCR foram feitas considerando as características específicas da temperatura de anelamento para os primers escolhidos, em termociclador Techne TC-512. Foram utilizados dois protocolos diferentes, dependendo do método de preparação da reação, para a obtenção dos produtos de PCR. Os parâmetros de PCR para os tubos que continham o “mix” de reações foram 94°C por 5 min; 5 ciclos de 94°C por 30 s, 62°C por 30s, 72°C por 1 min; 33 ciclos de 94°C por 30 s, 58°C por 30s, 72°C por 1 min; extensão final à 72 °C por 10 min. Para as reações efetuadas com o kit PCR Beads, as condições de amplificação foram 94°C por 5 min; 5 ciclos de 94°C por 30 s, 54°C por 30s, 72°C por 1 min; 33 ciclos de 94°C por 30 s, 48°C por 30s, 72°C por 1 min; extensão final à 72 °C por 10 min, de acordo com Martín & Winka (2000).
Para visualização dos produtos amplificados foi utilizada eletroforese em gel de agarose como descrito anteriormente para as amostras de DNA genômico.
- Purificação dos produtos de PCR
A correta purificação de produtos de PCR é necessária para garantir uma boa qualidade da sequência de DNA a ser gerada na reação de sequenciamento. Para a purificação de produtos de PCR, foi utilizado o kit de colunas Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System (ref A9281), da Promega, seguindo as instruções fornecidas. Igualmente para a purificação dos produtos de PCR, utilizou-se a enzima ExoSAP-IT® For PCR Product Cleanup (ref. 78200/01/02/05/50), método de purificação de
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produtos de PCR que utiliza Exonuclease I (Exo I) para digerir o excesso de primers e Shrimp Alkaline Phosphatase (SAP) para degradar o excesso de nucleotídeos e primers provenientes da PCR. Em seguida, as amostras de DNA foram quantificadas em espectrofotômetro NanoDrop® 2000, para saber a quantidade exata de DNA existente. - Sequenciamento de DNA e análise das sequências
O sequenciamento dos fragmentos de PCR amplificados foi realizado pela Macrogen Inc. (Seul, Coréia do Sul). Para a reação de sequenciamento foram enviadas pelo correio amostras em tubos contendo individualmente 20 μl do produto purificado a uma concentração de 20 ng/μl do produto de PCR a ser sequenciado e um dos primers ITS a 10 μM (foward e reverse). O resultado do sequenciamento foi obtido via email contendo eletroferograma e sequências em arquivo texto.
A análise das sequências obtidas consistiu num primeiro momento, juntar as sequências consenso. Para isso, foi utilizado o programa Sequencher 5.2.4 (Gene Codes Corp., Ann Arbor, Michigan), observando os parâmetros de qualidade das sequências. Cada sequência consenso foi então submetida à busca por similaridade no GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), através da ferramenta BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) (Altschul et al., 1990), para observar se as sequências geradas correspondiam às regiões desejadas, através da similaridade com outras sequências depositadas. Sequências de ITS de espécies de Morganella e de espécies da família Lycoperdaceae foram retiradas do GenBank para as análises filogenéticas. Assim, tanto as sequências geradas, quanto as sequências retiradas do GenBank foram submetidas ao alinhamento que foi realizado manualmente com auxílio do programa Seaview (Gouy et al., 2010).
Foram realizados dois alinhamentos. No alinhamento 1, foram incluídas 85 sequências do GenBank e se utilizou sequências de Tulostoma como grupo externo. O alinhamento 2, é um alinhamento reduzido no qual foram incluídos apenas algumas sequências de Lycoperdon do GenBank e duas sequências de Bovista foram consideradas como grupo externo, para eliminar ao máximo as zonas ambíguas.
- Análises filogenéticas
A partir dos dois alinhamentos das sequências foram realizadas as inferências filogenéticas através da análise de máxima parcimônia e Bayesiana, a fim de entender a
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relação de ancestralidade do grupo estudado. A análise de Máxima Parcimônia foi realizada pelo programa PAUP 4.0b10 (Phylogenetic Analysis Using Parsimony – Swofford, 2002). Foi utilizada busca heurística, pois o número de taxa nas análises excedeu o número viável para busca exaustiva (onde todas as árvores possíveis são visitadas pelo programa em busca da mais parcimoniosa), com a árvore inicial obtida por adição de taxa passo a passo (“stepwise addition”) e TBR (“Tree Bisection and Reconection”) como método de rearranjo dos ramos, com a opção Multrees em efeito. “Gaps” foram tratados como dados ausentes. A robustez dos ramos das árvores foi estimada por bootstrap (BS) (Felsenstein, 1985) empregando 10000 replicações para cada análise, usando a opção fast-step.
As análises filogenéticas através de inferência bayesiana foram realizadas no programa MrBayes v3.0 b4 (Huelsenbeck & Ronquist, 2001). O modelo para variação das taxas de substituição entre os sítios e o número de tipos de substituição para cada conjunto de dados foram determinados no programa MrModeltest 2.3 (Nylander, 2004). Foram geradas 2 milhões de gerações a partir de uma arvore inicial, com doze cadeias de MCMC (Monte Carlo via Cadeias de Markov) cada. As árvores foram amostradas a cada 100 ciclos e salvas em arquivo. As 1000 arvores iniciais foram descartadas (burn in) antes de calcular as probabilidades posteriores (PP). Usando o comando “sumt”, a árvore consenso foi calculada após uma amostragem de 30001 árvores. As árvores filogenéticas foram visualizadas com o programa Treeview (Page, 1996) e editadas no Adobe Illustrator CS3 11.0.2. (Adobe Systems Incorporated).
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4 RESULTADOS
Foram realizadas extrações de DNA de um total de 100 amostras do gênero Morganella, dentre elas 3 holótipos e 2 parátipos, como pode ser visto na tabela 4 (Apêndice). Como descrito no item Material e Métodos, foram seguidos dois protocolos diferentes, conforme o tempo de coleta do material herborizado utilizado. Além destes, diversos testes anteriores foram desenvolvidos para tentar ampliar a precisão metodológica, na busca de um DNA de boa qualidade. O gel de agarose utilizado para visualização do DNA extraído, pode ser visto na Figura 5.
Figura 6: Eletroforese em gel de agarose 1% de amostras de DNA genômico; 1-4: M.
arenicola, 5-7: M. fuliginea, 8: M. arenicola, 9-10: M. albostipitata.
Das 100 amostras de DNA genômico obtidas, 75 delas permitiram à amplificação de fragmentos de PCR passíveis de serem sequenciados. A figura 6 mostra bandas de DNA amplificadas a partir de mix de reação. Para os parátipos de Morganella, empregando-se PCR beads como método de amplificação, foram utilizadas diferentes combinações de primers para as amplificações (figura 7).
Figura 7: Amplificações de ITS, mostrando bandas de aproximadamente 700bp. M. marcador
DNA Ladder 100bp evidenciando banda de 500bp; 1-5: M. arenicola, 6-10: M. fuliginea, 11: M.
nuda.
M
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
30
Figura 8: Amplificações dos parátipos de Morganella utilizando os pares de primers internos.
A – amplificação dos parátipos (NY00839022) e (NY00839023) usando os primers internos ITS1/ITS2. B – amplificação dos parátipos (NY00839022) e (NY00839023) usando os primers internos ITS3/ITS4B.
Das 75 amplificações realizadas, 63 fragmentos geraram sequências em condições de serem aproveitadas para a realização da análise filogenética. A busca por similaridade no banco de dados GenBank, através da ferramenta BLAST, mostrou que as sequências obtidas correspondiam de fato às regiões de ITS desejadas. As sequências obtidas com as amplificações utilizando primers internos dos parátipos não foram utilizadas na filogenia, uma vez que as amostras estavam contaminadas por Cadophora sp.
Ao todo, foram sequenciadas e analisadas morfologicamente 65 exsicatas, pois foram incluídas as exsicatas parátipos de M. mexicana (Tabela 3). Foram analisadas cinco espécies do gênero Morganella: M. arenicola, M. fuliginea, M. nuda, M. albostipitata e M. velutina. O resultado da análise morfológica pode ser visualizado na tabela 3 e figura 8 e 9. Os espécimes provenientes de outras coletas e/ou localidades foram comparados com as espécies tipo a fim de confirmar a real identidade do material. Nas exsicatas que foram analisadas morfologicamente existiam espécimes provenientes do herbário ICN, que estavam identificadas como espécies do gênero Morganella (ICN177033, ICN177032, ICN177118, ICN154534) na qual foram observados presença de paracapilícios e eucapilícios, e além disso, na análise molecular estas espécies se agrupam com espécies do gênero Lycoperdon, e não com Morganella. Dessa forma, estas exsicatas foram tratadas como espécies do gênero Lycoperdon nesse trabalho.
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Tabela 3- Resultado da análise morfológica
Caráter
Espécies
Esporo Capilicios Paracapilicios Substrato Exoperídio (macro) Pseudoestipe
M. arenicola verrugoso presente presente solo/ madeira
efêmero no ápice (na maturidade)
inconspícuo
M. fuliginea equinulado ausente presente madeira persistente inconspícuo
M. nuda equinulado ausente presente madeira efêmero inconspícuo
M. albostipitata equinulado ausente presente madeira persistente conspícuo
M. velutina equinulado ausente presente madeira persistente inconspícuo
Também foi comparado o padrão de ornamentação dos basidiósporos, que pode ser visualizado na figura 9. Os espécimes de Morganella arenicola analisados (Tabela 4), além de paracapilícios apresentam eucapilícios e ocorrem predominantemente em solo arenoso (Figura 8). A presença de eucapilícios e ocorrência em solo são incomuns para espécies do gênero. Diversos espécimes de Morganella fuliginea e M. nuda foram analisados (Tabela 4) e constatamos grande similaridade morfológica entre estes dois táxons, seja pelos caracteres macroscópicos como pelas microestruturas. O caráter que melhor diferencia estas duas espécies é a natureza efêmera do exoperídio em M. nuda, que cai quase por completo na maturidade (Figura 8d). Todos os espécimes de M. albostipitata (Tabela 4), apesar de apresentarem muitas similaridades com espécimes de M. fuliginea, demonstraram um padrão morfológico distinto, tendo sido analisado o holótipo e outros espécimes oriundos da localidade tipo que é a Floresta Amazônica. O principal caráter que diferencia M. albostipitata é a porção basal do basidioma formando um pseudoestipe esbranquiçado (Figura 8c). Na espécie M. sp. 1 também podemos encontrar a presença de um pseudoestipe, no entanto, nesta espécie, o pseudoestipe encontra-se reduzido, diferentemente do encontrado na espécie M. albostipitata. Além disso, em M. albostipitata as hifas do exoperídio se encontram em cadeias subglobosas, o que não é visto em M. sp.1.
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Figura 9: Basidiomas. A – Morganella arenicola. B – M. fuliginea. C – M. albostipitata. D –
M. nuda.
Figura 10: Basidiósporos de gênero Morganella em microscopia eletrônica de varredura
(MEV). A – Morganella arenicola: basidiósporos verrugosos. B – M. fuliginea: basidiosporos equinulados. C – M. albostipitata: basidiosporos equinulados. D – M. nuda: basidiosporos equinulados.
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Para o alinhamento 1 (total), as sequências geradas no presente trabalho foram alinhadas com outras 85 sequências encontradas no GenBank pertencentes a família Lycoperdaceae, utilizando duas espécies do gênero Tulostoma como grupo externo, T. kotlabae Pouzar e T. squamosum Pers. Totalizando 148 sequências neste alinhamento.
Para o alinhamento total na análise de Máxima Parcimônia, 24 caracteres foram excluídos, por se tratar de zonas muito variáveis, permanecendo 765 caracteres dos quais 427 são constantes, 100 caracteres são variáveis não informativos para parcimônia e 238 caracteres são informativos para parcimônia. Todos os caracteres foram considerados como não ordenados, com pesos iguais para as mudanças. Conforme a busca heurística, 100 arvores parcimoniosas foram obtidas com uma quantidade de 1.147 passos, índice de consistência (IC) igual a 0.4786, índice de homoplasia (IH) igual a 0.5214 e índice de retenção (IR) igual a 0.8588. A árvore consenso (Figura 10) suporta o gênero Morganella como um grupo monofilético em relação a Lycoperdon. Os gêneros Calvatia e Bovista também formaram clados monofiléticos. Para o gênero Lycoperdon, a monofilia não foi observada, indicando uma condição parafilética. No clado de Morganella pode-se encontrar 5 principais clados terminais (a-e). O clado terminal a (BS 100%) é formado por representantes de M. arenicola, incluindo o holótipo, os demais espécimes são provenientes da localidade tipo, o ambiente se caracteriza pela vegetação de mata atlântica sobre dunas no estado do Rio Grande do Norte. Contudo, o clado que une esta espécie as demais deste clado possui um suporte muito baixo (BS <50%), indicando que sua inserção no gênero é incerta. No clado b (BS 100%) temos M. fuliginea e M. nuda, indicando não existir uma delimitação muito clara entre estes dois táxons. Por outro lado, as amostras de M. albostipitata encontram-se bem definidas no clado c com um bom valor de suporte (BS 100%). O clado d (BS 97%) contém as espécies M. velutina e M. sp. 2. O clado e (BS 100%) consiste de M. sp. 1 e uma sequência de M. subincarnata (AJ237626). Além disso, os resultados indicam que a espécie L. pyriforme (= M. pyriformis) não se agrupa com outras espécies de Morganella.
Para a análise Bayesiana, o modelo escolhido pelo MrModelTest foi o GTR+I+G, para os dois alinhamentos gerados. A análise Bayesiana do alinhamento total (Figura 11) resultou em topologia que indica os gêneros Disciseda, Calvatia e Bovista como monofiléticos com um apoio muito alto (PP 1.00). Pode-se encontrar um clado muito bem suportado (PP 1.00) com os gêneros Lycoperdon e
34 Morganella, com as espécies do gênero Morganella se separando de Lycoperdon com um suporte alto (PP 0.95), indicando que o gênero é monofilético. Entretanto, Morganella arenicola se separa do resto das espécies de Morganella, formando um grupo próprio entre as espécies de Lycoperdon, com um suporte máximo (PP 1.00), sugerindo que a espécie possa ser inserida no gênero. Podemos encontrar 5 clados terminais (a-e) para Morganella, todos com alto valor de suporte, e também o clado terminal f para M. arenicola. O clado terminal a que inclui M. fuliginea e M. nuda embora bem suportado (PP 1.00), não se observam dois grupos bem delimitados. Além disso, na análise Bayesiana, vê-se que a espécie L. pyriforme também não está agrupada com as espécies de Morganella, mostrando se tratar provavelmente de um representante de outro gênero.
Para o alinhamento 2 (reduzido) foram incluídas 15 sequências do GenBank, utilizando como grupo externo duas espécies do gênero Bovista, B. plumbea Pers. e B. nigrescens Pers. como grupo externo, totalizando 78 sequências. Para a análise de máxima parcimônia, neste alinhamento não foi excluída nenhuma região, foram utilizados 769 caracteres dos quais 508 são constantes, 70 caracteres são variáveis não informativos para parcimônia e 191 caracteres são informativos para parcimônia. Todos os caracteres foram considerados como não ordenados, com pesos iguais para as mudanças. Conforme a busca heurística, 100 arvores parcimoniosas foram obtidas com uma quantidade de 559 passos, índice de consistência (IC) igual a 0.6386, índice de homoplasia (IH) igual a 0.3614 e índice de retenção (IR) igual a 0.9173. A árvore consenso (Figura 12) têm como grupo externo duas espécies de Bovista, e mostra topologia semelhante à da figura 10 com Morganella formando um grande clado, enquanto que as espécies de Lycoperdon se agrupam em clados distintos. Morganella arenicola (clado a) está próxima de algumas espécies de Lycoperdon com um valor de suporte alto (BS 100%). No clado terminal b pode-se encontrar espécimes M. fuliginea e M. nuda, sem uma delimitação muito clara entre si (BS 100%). No clado c encontra-se M. velutina e M. sp. 2 (BS 93%) com grande similaridade. No clado d M. albostipitata (BS 100%) como um grupo bem definido. Enquanto no clado e, M. sp. 1 (BS 100%) se agrupa com M. subincarnata (AJ237626).
Na análise Bayesiana podemos perceber o clado Morganella/Lycoperdon com um apoio muito alto (PP 1.00), e novamente o grupo Morganella está bem definido em relação a Lycoperdon, exceto M. arenicola que aparece em um clado de união com L.
35 perlatum/L. novergium, indicando mais uma vez que essa espécie pode ser um Lycoperdon. Os clados terminais (a-e) se confirmam como Morganella, com altos valores de suporte (Figura 13).
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Figura 11: Árvore consenso do alinhamento total, a partir da análise de Máxima Parcimônia realizada pelo
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Figura 12: Árvore consenso da análise Bayesiana do alinhamento total gerada pelo programa MrBayes. Os valores
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Figura 13: Árvore consenso do alinhamento reduzido, a partir da análise de Máxima Parcimônia realizada pelo
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Figura 14: Árvore consenso de análise Bayesiana do alinhamento reduzido gerada pelo programa MrBayes. Os
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5. DISCUSSÃO
A revisão do gênero Morganella, com base em um estudo mais detalhado sobre sua filogenia molecular baseado na região ITS nrDNA, constituiu o objetivo principal deste trabalho. Analisar espécies deste gênero que foi estabelecido por Zeller (1948) e posteriormente emendado por Kreisel & Dring (1967) e revisado por Ponce de León (1967), focando espécies de ocorrência tropical e fazendo uso das ferramentas moleculares disponíveis no momento. A questão principal, dentre muitas observações e precisões pontuais quanto à classificação das espécies de Morganella, é a definição do grupo como um clado independente de Lycoperdon. Com a definição dos marcadores ITS como barcode universal para fungos (Schoch et al., 2012), tornou-se relevante abordar essa classificação com base na filogenia molecular. Isto porque estudos moleculares anteriores questionaram as relações filogenéticas entre espécies e gêneros da família Lycoperdaceae, do norte da Europa, utilizando marcadores ITS e 28S (Larsson & Jeppson, 2008), sugerindo um posicionamento de Morganella como um subgênero de Lycoperdon. No entanto, estes autores têm como base exclusivamente amostragens restritas de espécies nórdicas, deixando uma grande lacuna com relação aos táxons de regiões tropicais e subtropicais; e também incluíram apenas duas espécies de Morganella.
Neste trabalho, foram amplificadas e geradas sequencias ITS para os principais integrantes de Morganella, de regiões tropicais, e geradas árvores filogenéticas. Nossos resultados mostram consistentemente que, apesar de Morganella e Lycoperdon estarem agrupados em um mesmo clado ancestral, o gênero Morganella provavelmente não constitui um subgênero de Lycoperdon, como proposto por Larsson e Jeppson (2008), uma vez que as espécies de Morganella estão em clados separados das espécies de Lycoperdon, o que nos fornece grandes evidencias sobre a monofilia de Morganella. No entanto, isto deve ser confirmado com análises adicionais utilizando outros marcadores, como por exemplo, 28S, RPB1, RPB2, ATP6 e EF-1alfa, porque, apesar das análises de ITS permitirem estabelecer a filogenia em distintos gêneros de fungos (ex. Hypochnicium em Telleria et al., 2010, Astraeus em Phosri et al., 2013), e serem um bom marcador para delimitar espécies de fungos em geral (Schoch et al., 2012), diferente autores consideram que ITS é limitado em alguns grupos de fungos para inferir relações filogenéticas ( Voigt & Kirk, 2011; Nilsson et al., 2008).
