LUIZA HELENA GREMSKI
ANÁLISE DO TRANSCRIPTOMA DA GLÂNDULA
PRODUTORA DE VENENO DE Loxosceles intermedia
(ARANHA-MARROM): PERFIL DE EXPRESSÃO E
IDENTIFICAÇÃO DE NOVAS TOXINAS
São Paulo 2010
LUIZA HELENA GREMSKI
ANÁLISE DO TRANSCRIPTOMA DA GLÂNDULA
PRODUTORA DE VENENO DE Loxosceles intermedia
(ARANHA-MARROM): PERFIL DE EXPRESSÃO E
IDENTIFICAÇÃO DE NOVAS TOXINAS
Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo para obtenção do título de Doutor em Ciências.
São Paulo 2010
Gremski, Luiza Helena
Análise do transcriptoma da glândula produtora de veneno de Loxosceles intermedia (aranha-marrom): perfil de expressão e identificação de novas toxinas.
São Paulo, 2010. 120p.
Tese (Doutorado) – Universidade Federal de São Paulo, Escola Paulista de Medicina
1. Transcriptoma. 2. Aranha marrom. 3. Inibidor de serino protease. 4. Toxinas.
Tese preparada no Departamento de Bioquímica durante o Curso de Pós-Graduação em Biologia Molecular e apresentada à Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina, para obtenção do título de Doutor em Ciências.
Orientador: Prof. Dr. Silvio Sanches Veiga
Ao meu pai, Waldemiro, por me inspirar sempre como brilhante cientista, profissional e professor e pelo imenso afeto. À minha mãe e amiga, Lillian, sempre tão terna e cuidadosa. Aos meus irmãos, pelo carinho e exemplo de conduta.
Ao meu orientador Silvio pela confiança depositada em mim, por ter me inspirado com seu amor pela ciência e pelos anos de convivência. À minha co-orientadora Dra. Helena, pelo exemplo de dedicação incondicional à ciência. Meu afeto e gratidão a vocês.
AGRADECIMENTOS
Ao meu marido Guilherme pelo incondicional apoio em todos os momentos e decisões da minha vida profissional, e por tornar minha vida mais doce todos os dias.
A Profª Olga Meiri Chaim, colega de laboratório e amiga, pelo apoio, conselhos, idéias e exemplo de conduta. Obrigada por confiar em mim.
Aos inesquecíveis amigos Dilza, Youssef, Andrea, Katia, Márcia, Rafael, Valéria e Daniele por todos esses anos de ótima convivência, aprendizado e auxílio na elaboração deste trabalho. Pelo exemplo de conduta profissional que vocês me deram. A vocês, todo o meu afeto e respeito.
Aos professores Silvio Zanata, Lia Nakao, Adriana Mercadante e Oldemir Mangili da UFPR pela amizade de tantos anos e exemplo de conduta profissional e amor pela ciência.
Aos amigos do Laboratório de Matriz Extracelular, Fernando, Gabriel, Thiago, Adriana, Marianna, Fernanda, Jenifer, Reginaldo, Paulo Henrique, Larissa, Daniela, Ana Carolina, Soraya e Marta. Agradeço a doce convivência no dia-a-dia e por todo o auxílio na elaboração deste trabalho.
Aos funcionários Patrícia, Elsa e Marlene, pela paciência e disposição em ajudar; aos professores, estudantes e funcionários do INFAR, em especial à Profa. Leny Toma e aos colegas Juliana Dreyfuss e Tarsis Ferreira, pela atenção e disposição indispensável em vários momentos da execução desta tese.
Ao Prof. Christian M. Probst, pela disposição em me auxiliar nas análises de dados. Ao Prof. Humberto Madeira e suas orientadas Hellen e Daniele pelo auxílio fundamental e disposição incondicional essenciais para a elaboração deste trabalho.
A CAPES, CNPq, FAPESP e Fundação Araucária-PR e Secretaria de Estado de Ciência, Tecnologia e Ensino Superior do Paraná, pelos recursos financeiros essenciais à realização deste trabalho de tese.
A todos os brasileiros que, sem saber, foram fundamentais para a realização desta pesquisa. Espero que este trabalho contribua de alguma forma, para o crescimento do país.
ESTE TRABALHO DE TESE FOI DESENVOLVIDO DENTRO DAS NORMAS IMPOSTAS PELA LEGISLAÇÃO ATUAL, NO QUE DIZ RESPEITO AO USO DE ORGANISMOS GENETICAMENTE MODIFICADOS, COM O CERTIFICADO DE QUALIDADE EM BIOSSEGURANÇA N° 0028/97, PUBLICADO NO D.O.U. EM 31/03/1998.
ESTE TRABALHO DE TESE ESTÁ INSERIDO NO PROJETO “EFEITO DE DROGAS ANTITROMBÓTICAS NO VASO SANGUÍNEO” ANALISADO E APROVADO PELO COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA INSTITUCIONAL DA UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO E DOCUMENTADO NO PARECER DO COMITÊ DE ÉTICA INSTITUCIONAL CEP0685/05.
ÍNDICE GERAL
I – INTRODUÇÃO ... 1
1. Aranhas ... 1
2. Aranhas do gênero Loxosceles ... 2
3. Epidemiologia do loxoscelismo no Brasil ... 4
4. Loxoscelismo ... 5
4.1. Loxoscelismo cutâneo ... 6
4.2. Loxoscelismo cutâneo-visceral ... 7
4.3. Terapia aplicada no loxoscelismo ... 8
5. Veneno das aranhas do gênero Loxosceles ... 11
6. Inibidores de serino proteases ... 15
7. Toxinas recombinantes de L. intermedia ... 16
8. Aplicações biotecnológicas das toxinas loxoscélicas ... 18
9. Transcriptoma e venenos ... 19
II – OBJETIVOS ... 21
III – JUSTIFICATIVA ... 22
IV – RESULTADOS ... 23
A - Item 1: Um novo perfil de expressão da glândula de veneno da aranha Loxosceles intermedia demonstrado por análise transcriptômica .. 24
B - Item 2: Identificação, clonagem e expressão de um inibidor de serino protease do veneno de Loxosceles intermedia (aranha marrom).... 41
B.1. Material e métodos ... 42 B.2. Resultados ... 50 V – DISCUSSÃO ... 63 VI – CONCLUSÕES ... 79 VII – ABSTRACT ... 80 VIII – RESUMO ... 81
IX – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 82
X – ANEXOS ... 97
Curriculum vitae resumido ... 97
ÍNDICE DE FIGURAS
FIGURA 1: Aranha-marrom do gênero Loxosceles ... 2 FIGURA 2: Sequência da EST identificada pela análise do
transcriptoma da glândula de L. intermedia semelhante a um
inibidor de serino-protease ... 51 FIGURA 3: Obtenção do fragmento correspondente à sequência
completa do inibidor de serino-protease e clonagem ... 51 FIGURA 4: Sequências nucleotídicas e aminoacídicas do inibidor de
serino-proteases do veneno de L. intermedia ... 53 FIGURA 5: Alinhamento de sequências de inibidores de
serino-proteases pertencentes à família das serpinas de diferentes
organismos... 55 FIGURA 6: Porcentagem de positividade obtida a partir do
alinhamento das sequências dos diferentes membros da família
das Serpinas em relação à Serpina de L. intermedia ... 57 FIGURA 7: PCR de alta fidelidade para obtenção da sequência
codificante da Serpina ... 58 FIGURA 8: SDS-PAGE representativo do teste de expressão do
inibidor de serino proteinase recombinante em BL21(DE3) pLysS ... 59 FIGURA 9: Reação de Western Blot com anticorpo anti-HisTag
sobre amostra do teste de expressão da Serpina ... 60 FIGURA 10: Teste de solubilidade do inibidor de serino-protease
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I – INTRODUÇÃO
1. Aranhas
O filo Arthropoda inclui os subfilos Trilobitomorpha, Crustacea, Hexapoda, Myriapoda e Chelicerata. Os artrópodes estão entre as espécies mais bem sucedidas na terra e são encontrados em todos os tipos de ambientes (BRUSCA e BRUSCA, 2002; BARNES, 1990). Uma de suas características é a presença de um exoesqueleto composto de quitina, que fornece sustentação e proteção física (VARKI, 2008).
Os organismos pertencentes ao subfilo Trilobitomorpha estão extintos. O subfilo Hexapoda é o mais numeroso, contendo cerca de 85% dos artrópodes hoje conhecidos. O subfilo Chelicerata inclui organismos como aranhas, escorpiões e ácaros (BARNES, 1990). O subfilo Chelicerata inclui entre outras classes, a classe Arachnida. Dentro desta classe, é a ordem Araneae que descreve as aranhas. Estão descritas até hoje 109 famílias de aranhas (PLATNICK, 2010).
As aranhas são animais predadores e, para isso, possuem um par de glândulas produtoras de veneno que lançam seu conteúdo por um canal que atravessa as quelíceras. As quelíceras têm um formato pontiagudo e são responsáveis pela inoculação do veneno nas vítimas. Além disso, estas estruturas também são utilizadas para macerar a presa e facilitar sua ingestão (BARNES, 1990).
Embora o veneno produzido por todas as aranhas seja eficiente para atordoar ou matar os organismos dos quais elas se alimentam, apenas algumas espécies produzem um veneno capaz gerar de um quadro danoso em seres humanos. As espécies mais perigosas pertencem à subordem Araneomorphae. As espécies pertencentes a esta subordem possuem as quelíceras perpendiculares ao eixo longitudinal do corpo e as movimentam de fora para dentro (ESCOUBAS, 2000 e APPEL et al, 2005). Mundialmente, dois gêneros são de importância médica significante: Latrodectus spp. (viúvas negras) e Loxosceles spp. (aranhas-marrons). Duas outras aranhas com
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localização geográfica mais restrita também causam envenenamento mais severo em humanos; estas pertencem aos gêneros Atrax e Hadronyche spp. (“funnel web spiders”) localizadas na Austrália, e Phoneutria spp. (armadeiras), localizadas no Brasil (ISBISTER et al, 2004).
2. Aranhas do gênero Loxosceles
A família SICARIIDAE (Keyserling, 1880) abrange o gênero Sicarius (Walckenaer, 1847) e o gênero Loxosceles (Heineken & Lowe, 1832).
As aranhas que pertencem ao gênero Loxosceles são popularmente denominadas aranhas-marrons. Este título se justifica pelo fato de que a coloração desses animais varia de marrom claro (como a espécie Loxosceles
laeta) a marrom escuro (Loxosceles gaucho). As aranhas desse gênero
também são conhecidas como aranhas violino já que possuem um desenho na parte posterior do cefalotórax que lembra o instrumento (Figura 1) (FUTRELL, 1992; DA SILVA et al, 2004).
FIGURA 1: Aranha-marrom do gênero Loxosceles. Em detalhe a disposição dos três pares de olhos (estrela vermelha) e a forma de um violino sobre o cefalotórax (seta branca).
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As aranhas-marrons têm um porte pequeno e o comprimento do seu corpo varia entre 4 e 15 mm. Suas pernas são longas, medindo entre 8 e 30 mm. Possuem seis olhos organizados em pares, com uma díade anterior e as outras díades localizadas em cada lado (DA SILVA et al, 2004); a disposição dos olhos em pares tem sido descrita como o melhor meio para distinção entre as espécies do gênero (VETTER AND VISSCHER, 1998). Uma descrição detalhada da glândula de veneno de Loxosceles intermedia mostrou que a organização deste órgão no gênero segue a arquitetura das aranhas em geral (DOS SANTOS et al, 2000). Além disso, DOS SANTOS (2000) descreveu que o epitélio secretor é revestido por uma membrana basal e rodeado por uma espessa camada de músculo estriado. As células do epitélio secretório são ricas em vesículas contendo veneno. Apesar de alguns autores destacarem que o veneno é produzido por células apócrinas, a morfologia das glândulas e das células indica que o tipo de secreção é holócrina (DOS SANTOS, et al, 2000).
As espécies do gênero Loxosceles podem resistir a temperaturas que variam entre 8 a 43°C e podem sobreviver por vários dias e até por alguns meses sem alimento ou água (DA SILVA et al, 2004). São aranhas retraídas, que não possuem comportamento agressivo e preferem viver em áreas escuras (MÁLAQUE et al, 2002). Com a diminuição do seu habitat natural, as aranhas-marrons adaptaram-se muito bem ao ambiente intra e peridomiciliar. O veneno das aranhas do gênero Loxosceles é usado para paralisar a presa (inseto) e também como mecanismo de defesa. Os acidentes com humanos geralmente acontecem quando a pessoa comprime inadvertidamente o animal contra a pele ao vestir-se, calçar-se ou até mesmo enquanto estão dormindo. Em todos os casos a picada ocorre somente como forma de defesa (FUTRELL, 1992; FISCHER, 1996). Como a picada é indolor, a vítima geralmente só percebe que foi picada horas depois, o que dificulta o tratamento.
Estas aranhas também possuem dimorfismo de gênero, sendo que as fêmeas possuem um corpo maior e pernas mais curtas que os machos (APPEL
et al , 2005). Estudos mostram que o veneno produzido pelas fêmeas deste
gênero é mais tóxico e produzido em maior quantidade (DE OLIVEIRA et al, 2005).
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Loxosceles spp. são aranhas cosmopolitas encontradas tanto em
regiões de clima tropical, quanto temperado. Cerca de 100 espécies foram descritas em todo o mundo, a maioria delas nas Américas, Índias Ocidentais e na África (BINFORD et al, 2009). O continente americano abriga a maior parte das espécies, sendo que cerca de 50 delas foram descritas somente na América do Norte (GOMEZ et al, 2001). Os acidentes provocados por aranhas deste gênero são considerados problema de saúde pública em determinadas regiões do Brasil, Chile e Peru (DA SILVA et al, 2004; SOUZA et al, 2008).
Segundo PLATNICK (2010), 10 espécies do gênero Loxosceles já foram descritas no Brasil. São elas: L. adelaida, L. amazonica, L. anomala, L. gaucho,
L. hirsuta, L. immodesta, L. intermedia, L. laeta, L. puortoi e L. similis. No
estado Paraná quatro espécies são comuns: L. intermedia; L. gaucho; L. laeta e L. hirsuta (MARQUES DA SILVA e FISCHER, 2000). No município de Curitiba (PR) a espécie predominante é a Loxosceles intermedia.
3. Epidemiologia do loxoscelismo no Brasil
O termo loxoscelismo descreve os acidentes envolvendo aranhas pertencentes ao gênero Loxosceles (DA SILVA et al, 2004). Em 1954, no Hospital Vital Brasil no Instituto Butantan (São Paulo – SP) foi descrito o primeiro caso de loxoscelismo no Brasil (CARDOSO et al, 1990). As regiões sul e sudeste são as que mais registram casos de acidentes com aranhas-marrons. Na maior parte das vezes as espécies envolvidas são L. intermedia,
L. gaucho e L. laeta (DA SILVA et al, 2004).
Dados do sistema de notificação de agravos do Ministério da Saúde revelam que quase 43% dos acidentes araneídeos (acidentes causados por aranhas) ocorridos no Brasil em 2008 são atribuídos a aranhas do gênero
Loxosceles (MS, 2008).
Segundo dados do Ministério da Saúde, 7.281 casos de loxoscelismo ocorreram no Brasil em 2008; deste total, 5.314 ocorreram no Paraná, o que perfaz um total de 67% dos acidentes do país. Nas áreas urbanas dos estados do Paraná e Santa Catarina a espécie predominante é a L. intermedia. Curitiba e Região Metropolitana concentram a maioria das ocorrências de loxoscelismo
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do estado do Paraná: em 2008 ocorreram 3.890 casos nestas localidades (SMS/CE/CVE-SINAM, 2009). Portanto, pode-se afirmar que Curitiba e Região Metropolitana são áreas endêmicas para os acidentes com aranhas-marrons e isso é, provavelmente, consequência de mudanças ambientais e desequilíbrios ecológicos que impedem a manutenção da densidade populacional das espécies em níveis estáveis (BARBARO; JARED; MOTA, 1995).
Sendo assim, vários autores salientam uma necessidade crescente de estudos envolvendo aranhas deste gênero, assim como o veneno produzido por elas. Além disso, esta predominância do loxoscelismo no Brasil exige também a avaliação de fatores ambientais que favorecem essa condição estatística como, por exemplo, desequilíbrio ambiental e ausência de predadores (RIBEIRO et al., 1993; MARQUES DA SILVA, 2002; MARQUES-DA-SILVA e FISCHER, 2005).
4. Loxoscelismo
O conjunto de manifestações clínicas causadas por acidentes envolvendo aranhas do gênero Loxosceles é denominado loxoscelismo (FUTRELL, 1992; DA SILVA et al, 2004; APPEL et al, 2005). Existem quatro categorias de loxoscelismo: (a) Sem efeitos, (b) Injúria mínima com edema e eritema, cicatrização sem cuidado auxiliar, (c) lesão dermonecrótica com desenvolvimento de uma úlcera rígida que se desprende, deixando uma escara e (d) efeitos sistêmicos algumas vezes com hemólise que gera uma coagulação intravascular disseminada e, em casos raros, falência renal e morte, ocorrendo, na maior parte das vezes em crianças (VETTER E ISBISTER, 2008). Os quadros de relevância clínica, no entanto, manifestam-se de duas formas: loxoscelismo cutâneo e loxoscelismo cutâneo-visceral, esta última muito menos comum que a primeira. Os dois quadros compartilham características clínicas no local da picada (ISBISTER et al, 2004). Acredita-se que a evolução e a gravidade dos acidentes loxoscélicos assim como o desenvolvimento de um ou ambos os quadros clínicos depende da quantidade de veneno inoculado, localização da picada e da possível inclusão de componentes digestivos no veneno (SINGLETARY et al, 2005). Além disso, a
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espécie de aranha-marrom envolvida, o estágio de desenvolvimento do animal e o tempo que a vítima leva para procurar auxílio médico também influenciam na gravidade do acidente (DE OLIVEIRA et al., 1999, DE OLIVEIRA et al., 2005, BARBARO et al., 1994).
4.1. Loxoscelismo cutâneo
A picada em si é geralmente indolor e o ferimento que ela causa é mínimo. Dentro das primeiras 12 a 24 horas o local da picada torna-se eritematoso, levemente edemaciado, dolorido e pode desenvolver uma hemorragia que torna o local sarapintado, o que corresponde à área de necrose iminente (ISBISTER et al, 2004). Denomina-se esta área de placa marmórea: uma área isquêmica, circundada por um halo vermelho e zonas pálidas ao centro.
Com o decorrer do tempo a lesão necrótica adquire uma coloração escura e um nítido espalhamento gravitacional, o que aumenta ainda mais a área de necrose tecidual. Esta lesão dermonecrótica que se espalha gravitacionalmente é a marca registrada do chamado quadro cutâneo ou dermonecrótico (FUTRELL, 1992 e DA SILVA et al, 2004).
Quando sem tratamento a lesão evolui em três a sete dias para uma ferida rígida que pode expor uma escara de difícil cicatrização ao longo do tempo (3 a 8 semanas) (APPEL et al, 2005). A úlcera resultante é geralmente dolorosa e lenta para cicatrizar, com ciclos de cicatrização parcial seguido de colapso, às vezes se estendendo por alguns meses (ISBISTER et al, 2004). Dependendo da evolução deste quadro, uma cirurgia plástica reparadora pode ser necessária para remoção do tecido necrosado e substituição por enxerto (FUTRELL, 1992 e DA SILVA et al, 2004). Muitas vezes a lesão dermonecrótica pode ser agravada por uma infecção secundária. A presença de bacilos anaeróbios, tais como o Clostridium perfringens, já foi descrita nas quelíceras e no veneno da aranha-marrom. Estes agentes podem complicar o efeito dermonecrótico do veneno (MONTEIRO et al, 2002).
Estudos das características histopatológicas de biópsias de pele de coelhos inoculados experimentalmente com veneno de Loxosceles intermedia
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revelam que já após quatro horas de exposição, uma rede intravascular de fibrina se forma. Observam-se também trombose em vasos da derme, vasos sangüíneos degenerados, intenso infiltrado inflamatório na derme e mesmo na musculatura esquelética da hipoderme. Um quadro de edema também pode ser observado na derme, caracterizado pela desorganização das fibras de colágeno. Além disso, quadros como hemorragia e necrose são também descritos. Este conjunto de características pode ser classificado como uma necrose coagulativa asséptica que se instala entre 24 horas e cinco dias após a exposição ao veneno (OSPEDAL et al, 2002). ELSTON e colegas (2000) demonstraram infiltrado inflamatório misto na derme, vasculite e necrose coagulativa da pele em biópsias de pele de coelhos expostos ao veneno de L.
reclusa, após 14 dias da inoculação.
Um aspecto bastante interessante do quadro cutâneo do loxoscelismo é que ele não se desenvolve macroscopicamente em camundongos. No entanto, entre 4 a 6 horas após a inoculação, biópsias da pele desses animais revelam alterações histológicas como infiltrado de células inflamatórias, edema na derme e alterações visíveis nos vasos sanguíneos que afetam sua integridade (SUNDERKOTTER et al., 2001).
4.2. Loxoscelismo cutâneo-visceral
A forma sistêmica do loxoscelismo é bem menos comum do que a cutânea, ocorrendo em menos de 1% dos acidentes com aranhas do gênero (VETTER e ISBISTER, 2008; TAMBOURGI et al, 2010). No entanto é um quadro muito mais grave do que as injúrias cutâneas e os sintomas incluem hemólise intravascular, agregação plaquetária, coagulação intravascular e falência renal aguda a qual é a maior responsável pelos casos de óbito no loxoscelismo. Os sinais e sintomas sistêmicos relacionados ao sistema nervoso central tais como astenia, episódios eméticos, cefaléia, convulsão e coma, são sugestivos de alteração sistêmica (FUTRELL, 1992).
Demonstra-se efeito hemolítico do veneno com base em dados clínicos e laboratoriais observados nas vítimas dos acidentes loxoscélicos. Estas características incluem níveis elevados de creatino-quinase, hematúria,
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hemoglobinúria, proteinúria e choque (FRANÇA et al, 2002; CHAVES-MOREIRA et al, 2009). Estes efeitos em conjunto com a agregação plaquetária podem gerar anemia hemolítica, trombocitopenia e coagulação intravascular disseminada (FUTRELL, 1992; DA SILVA et al, 2004).
O efeito nefrotóxico do veneno de Loxosceles intermedia é demonstrado em camundongos expostos experimentalmente ao veneno total. A caracterização histopatológica mostra hialinização e eritrócitos no espaço de Bowman, colapso glomerular, citotoxicidade de células epiteliais tubulares e deposição de material proteináceo no lúmen tubular (LUCIANO et al, 2004). Os mecanismos pelos quais o veneno exerce essa atividade nefrotóxica ainda não foram completamente elucidados. No entanto, já é sabido que a família de fosfolipases-D presentes no veneno, induz nefrotoxicidade pela interação com a membrana das células e atividade fosfolipásica direta e pela geração de mediadores inflamatórios específicos que tornam as células do tecido renal mais vulneráveis ao estresse fisiológico, culminando em uma injúria renal (KUSMA et al, 2008).
Muitas condições clínicas são erroneamente diagnosticadas como acidente loxoscélico, portanto deve ser realizado diagnóstico diferencial para uma série de doenças como vasculite, infecções bacterianas e herpes, entre outras. O diagnóstico precoce da picada abre caminho para evitar o desenvolvimento da lesão, porém, após certa evolução da dermonecrose, o tratamento é apenas sintomático (APPEL et al., 2005; SWANSON e VETTER, 2006).
4.3. Terapia aplicada no loxoscelismo
Para a maioria dos acidentes com aranhas do gênero Loxosceles, a terapia que envolve descanso, gelo, compressão e elevação do membro afetado é considerada apropriada, pois a maioria dos acidentes desenvolve um quadro mínimo. No entanto, um tratamento conservador é aplicado na maioria dos casos.
Esse tratamento é ainda um assunto que gera discussão em virtude, muitas vezes, da dificuldade de diagnóstico e do desenvolvimento de quadros clínicos semelhantes a outras condições patológicas (PAULI et al, 2006).
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Recentemente um caso clínico que descreve o quadro de um paciente que desenvolveu loxoscelismo cutâneo e sistêmico foi publicado (DE SOUZA et
al., 2008). Segundo os autores, o paciente desenvolveu lesão dermonecrótica
com espalhamento gravitacional no local da picada, bem como, hemólise intravascular, rabdomiólise, coagulopatia e insuficiência renal aguda. O acompanhamento do quadro clínico assim como os resultados dos exames laboratoriais comprovou a severidade do envenenamento. O próprio paciente quando admitido no hospital, trouxe consigo o espécime, identificado como pertencente ao gênero Loxosceles. Neste caso a administração de soro antiloxoscélico foi realizada, como indicado. No entanto, além dessa, diferentes terapias têm sido propostas, como utilização de dapsona, esteróides, tratamento com câmara hiberbárica de oxigênio e terapia com soro antiveneno (HOGAN; BARBARO; WINKEL, 2004).
A eficácia da terapia com soro antiloxoscélico depende que ele seja administrado nas primeiras horas após a picada. Sendo assim, a maior barreira para a administração do soro antiveneno é o fato de que a maioria dos pacientes demoram a procurar auxílio médico, uma vez que a picada geralmente não é percebida de imediato. Muitas vezes o paciente procura atendimento médico entre 24 e 72 horas após a picada, quando os sintomas locais já estão instalados e, muitas vezes, em estado avançado (PAULI et al., 2006). Apesar de não existirem estudos que permitam correlacionar o tipo de tratamento com a evolução dos casos de loxoscelismo, estudos em modelos animais mostram que a aplicação do soro antiveneno possui potencial terapêutico. A administração do soro minimiza os efeitos cutâneos e sistêmicos do envenenamento, quando empregada até 12 horas após a picada. A utilização de soro até 48 horas após a picada mostrou redução da área da lesão dermonecrótica (PAULI et al., 2006; PAULI et al., 2009). Os estudos foram realizados somente em modelos animais; mais estudos são, portanto, necessários para avaliar a real eficiência dos soros tanto nos quadros de loxoscelismo cutâneo, quanto sistêmico. No entanto, países que já incluíram a soroterapia no protocolo de tratamento, a mortalidade de crianças e jovens diminuiu significativamente (PAULI et al., 2009; ISBISTER et al., 2003).
A dapsona vem sendo largamente utilizada no tratamento do loxoscelismo. No entanto, em alguns casos essa droga não tem se mostrado
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efetiva (VETTER e ISBISTER, 2008). A utilização de corticóides é muito discutida, porém, no Brasil, eles são preferencialmente administrados em pacientes que desenvolvem o quadro sistêmico. Entretanto, quando a aranha é identificada como L. intermedia ou L. laeta deve-se iniciar o tratamento com Prednisona, mesmo sem a existência de uma lesão aparente. O papel imunossupressor dos corticóides teria importância fundamental na redução da resposta inflamatória exacerbada gerada pelo envenenamento (DA SILVA et
al., 2004; HOGAN; BARBARO; WINKEL, 2004).
Estudos demonstraram que tetraciclinas inibem ou, até mesmo, previnem a lesão dermonecrótica induzida pelo veneno de Loxosceles em modelos in vivo e in vitro (PAIXÃO-CAVALCANTE et al, 2007). Além disso, o mesmo estudo mostra uma redução na expressão da metaloprotease de matriz MMP-2 exercida pela tetraciclina. Os autores sugerem que a tetraciclina pode ser um agente terapêutico eficiente no tratamento do loxoscelismo cutâneo (PAIXÃO-CAVALCANTE et al, 2007).
MONTEIRO e colaboradores (2002) mostraram a possibilidade de infecção secundária das lesões causadas pelas aranhas da espécie
Loxosceles intermedia com a bactéria Clostridium perfringens. No mesmo
trabalho, os autores identificaram e isolaram esta bactéria anaeróbia, potencialmente patogênica no veneno e nas quelíceras das aranhas. Isso indica que C. perfringens é um fator importante na exacerbação das lesões dermonecróticas causadas pelo veneno. Sendo assim, uma terapia eficiente para o tratamento do loxoscelismo, que poderia incluir a administração de antibióticos, deve levar em conta essa possibilidade de infecção.
O aumento da eficiência dos tratamentos depende de uma melhor compreensão da composição do veneno e dos mecanismos de ação das toxinas presentes no veneno produzido pelas aranhas do gênero Loxosceles (PAIXÃO-CAVALCANTE et al, 2007).
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5. Veneno das aranhas do gênero Loxosceles
Aranhas adultas do gênero Loxosceles inoculam um volume de apenas alguns microlitros na vítima, contendo cerca de 30 µg de proteína (TAMBOURGI et al, 2010). O veneno loxoscélico é um líquido cristalino, composto basicamente por proteínas enzimáticas e não enzimáticas e é produzido por um par de glândulas situadas no cefalotórax das aranhas-marrons (da SILVA et al., 2004). O veneno é rico em muitas enzimas como hidrolases, hialuronidases, lipases, peptidases, colagenases, fosfatase alcalina, proteases, entre outras.
As moléculas que compõem o veneno dessas aranhas são predominantemente proteínas de baixa massa molecular (5 – 40 kDa) com ação tóxica e/ou enzimática (MOTA; BARBARO, 1995; da SILVEIRA et al., 2002; da SILVA et al., 2004; APPEL et al., 2005). Muitos autores sugerem que a toxicidade do veneno de aranhas é decorrente de efeitos danosos sinérgicos e/ou somatórios de todos os seus componentes (GEREN et al., 1976; da SILVA
et al., 2004; APPEL et al., 2005).
Muitos estudos focam na identificação dos constituintes dos venenos loxoscélicos e, portanto, algumas das toxinas presentes no veneno já estão bem caracterizadas bioquímica e biologicamente (da SILVA et al., 2004, APPEL et al., 2005). Já foram descritas enzimas como fosfatase alcalina, 5’ ribonucleotídeo fosfohidrolase, peptídeos com atividade inseticida, hialuronidases, fosfolipases-D, serino-proteases e metalo-proteases em venenos de diferentes espécies de Loxosceles (FUTRELL, 1992; FEITOSA et
al., 1998; VEIGA et al., 2000a, 2000b; YOUNG; PINCUS, 2001; VEIGA et al.,
2001a; da SILVA et al., 2004; DE CASTRO et al, 2004; BARBARO et al., 2005; DA SILVEIRA et al., 2007a e 2007b).
As toxinas chave para o desenvolvimento da lesão dermonecrótica são as fosfolipases-D. A maioria dos efeitos tóxicos descritos no loxoscelismo, como reação inflamatória intensa no local da picada, desequilíbrio hemostático, lesão renal, agregação plaquetária e a lesão dermonecrótica típica podem ser experimentalmente reproduzidas com toxinas dermonecróticas de forma isolada.
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As toxinas dermonecróticas são muito conservadas entre as diferentes espécies do gênero Loxosceles. Atualmente, mais de dez sequências completas de toxinas dermonecróticas desse gênero foram depositadas em bases de dados de sequências nucleotídicas. Essas toxinas foram bioquimicamente caracterizadas como membros da família das esfingomielinases-D devido à sua habilidade de catalizar a hidrólise da esfingomielina (CHAVES-MOREIRA et al, 2009). Em um trabalho de 2005, LEE e LYNCH sugerem que uma denominação mais acurada para a família das toxinas dermonecróticas seria o termo fosfolipases-D, devido à sua habilidade adicional de catalisar a hidrólise de glicerofosfolipídeos.
MURAKAMI e colaboradores (2006) demonstraram que as fosfolipases-D se dobram para formar um barril (α/β)8 com a inserção de fitas-β, α-hélices e vários loops conectores adicionais. O loop catalítico, em conjunto com outros
loops forma a face interfacial (i-face) da enzima onde o sítio ativo está
localizado. O sítio ligante de Mg2+ junto com Trp230, Ly93 e os dois resíduos de histidina catalíticos (His12 e His47) formam o sítio ativo que é altamente conservado nas fosfolipases-D de aranhas e bactérias.
O mecanismo catalítico proposto para as fosfolipases-D baseia-se numa reação ácido-base combinada com uma estabilização pelo íon metálico e envolve dois resíduos de histidina, His12 e His47. Nos passos intermediários do mecanismo, o resíduo His12 é desprotonado para o ataque nucleofílico subseqüente de uma molécula de água. Segue-se a liberação final de ceramida-1-fosfato (C1P) do substrato esfingomielina ou ácido lisofosfatídico (LPA) de um lisofosfolipídeo (MURAKAMI et al, 2005).
Recentemente, KUSMA e colaboradores (2008) descreveram a produção de uma isoforma mutada de fosfolipase-D recombinante de
Loxosceles intermedia. No domínio catalítico dessa molécula um resíduo de
histidina (um aminoácido básico e positivamente carregado) na posição 12 foi substituído por um resíduo de alanina (aminoácido não polar). No entanto essa mutação não produziu mudanças significativas na estrutura secundária. A isoforma produzida foi denominada LiRecDT1 H12A e sua atividade esfingomielinásica foi drasticamente reduzida, bem como a capacidade de desenvolver lesão dermonecrótica em pele de coelhos. Estudos envolvendo toxicidade renal e capacidade de desenvolver hemólise mostraram que a
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isoforma mutada não produziu os mesmos efeitos tóxicos que a LiRecDT1 original, concluindo portanto, que a atividade das fosfolipases-D das aranhas
Loxosceles spp. é dependente da sua atividade catalítica (KUSMA et al, 2008;
CHAVES-MOREIRA et al, 2009). Estudos também demonstram que a atividade hemolítica das fosfolipases-D também pode ser desencadeada por mecanismos dependentes do sistema complemento. Em um estudo, TAMBOURGI e colaboradores (2007) demonstram que o tratamento de eritrócitos com esfingomielinases-D de Corynebacterium pseudotuberculosis e do veneno de L. intermedia levam à ativação da via clássica do sistema complemento, por intermédio da ligação direta da proteína C1q (uma das três proteínas do complexo C1 do sistema complemento), o que culmina no processo de hemólise.
Acreditamos que as fosfolipases-D, presentes nos venenos das aranhas do gênero Loxosceles, possam atuar sobre os fosfolipídios das membranas celulares, liberando compostos como a ceramida-1-fosfato (C1P) e/ou ácido lisofosfatídico, como já descrito anteriormente. Perfis de expressão gênica de fibroblastos humanos tratados com a isoforma I da toxina recombinante de L.
reclusa (SMD) mostraram uma expressão mais alta de genes relacionados à
citocinas e genes envolvidos na via de metabolismo de glicoesfingolipídeos. Além disso, os autores sugeriram que a atividade esfingomielinásica sobre membranas celulares, que resulta na produção de ceramida-1-fosfato, induz a expressão de moléculas pró-inflamatórias como NF-κB e interleucina-8 e que esse processo pode estar ligado à histopatologia típica do loxoscelismo, mostrando massivo infiltrado de neutrófilos, necrose, edema e proliferação de fibroblastos (DRAGULEV et al, 2007). Sendo assim, esclarecimentos do ponto de vista do envolvimento das fosfolipases-D na liberação de mediadores inflamatórios e sua relação com os sintomas do loxoscelismo ainda se fazem necessários para complementar o entendimento da ação do veneno e identificar novas possibilidades de intervenção terapêutica.
As proteases existentes nos venenos loxoscélicos também têm sido foco de muitos estudos. As metaloproteases são as proteases mais bem caracterizadas no veneno loxoscélico. Elas foram inicialmente descritas em venenos de L. intermedia por FEITOSA e colaboradores (1998) que identificaram duas metaloproteases: a Loxolisina A (20-28kDa) com atividade
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fibronectinolítica e atividade fibrinogenolítica parcial e a Loxolisina B (32-35kDa) com atividade gelatinolítica. O trabalho foi bastante criticado na época já que se cogitava a possibilidade de que essas metaloproteases identificadas fossem oriundas do conteúdo gástrico das aranhas, considerando que a obtenção do veneno era feita utilizando-se o método do eletrochoque. Neste procedimento, um choque de 12V é aplicado na região do cefalotórax do animal, fazendo com que suas glândulas se contraiam e o veneno seja expelido. Porém, DA SILVEIRA e colaboradores (2002) comprovaram que metaloproteases são realmente constituintes do veneno de L. intermedia através de estudo comparativo do perfil protéico e da atividade metaloproteásica realizada entre veneno obtido por eletrochoque e o extrato de glândulas de veneno de espécimes de L. intermedia. Com esse estudo, mostrou-se que a atividade metaloproteásica está presente no extrato de glândulas de veneno e que é totalmente livre de contaminantes gástricos. Posteriormente, outros trabalhos também descreveram metaloproteases nos venenos de L. reclusa, L. deserta, L. rufescens e L. laeta. (YOUNG; PINCUS, 2001; BARBARO et al., 2005; FERNANDES-PEDROSA et al., 2008).
As hialuronidases também estão possivelmente relacionadas com os efeitos nocivos do veneno de aranha-marrom. Foram descritas hialuronidases de diferentes massas moleculares, em diferentes espécies do gênero
Loxosceles (no caso da L. intermedia foram descritas duas hialuronidases, com
massas de 41 e 43 kDa). A enzima possui atividade de hidrolase e é capaz de degradar ácido hialurônico e condroitin sulfato, presentes na matriz extracelular, funcionando como um fator de espalhamento do veneno. Da mesma maneira, proteases que degradam componentes da matriz extracelular ou de membranas basais podem estar envolvidas com distúrbios hemorrágicos, agravamento da lesão dermonecrótica e aumento da permeabilidade vascular. (DA SILVA et al., 2004; DA SILVEIRA et al, 2007; CHAIM et al., 2007).
Uma vez que a função do veneno é paralisar e matar a presa, grande parte de seus componentes são toxinas que atuam no sistema nervoso. Até o momento, as neurotoxinas identificadas nos venenos de aranhas pertencem a um dos três grupos: proteínas, polipeptídios e acilpoliaminas. Proteínas de alta massa molecular (cerca de 110 kDa), como as latrotoxinas, são responsáveis pela liberação de neurotransmissores. As acilpoliaminas possuem alta
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atividade inseticida, causando a paralisação de insetos mediante bloqueio da transmissão neuromuscular. Polipeptídios, com massa entre 3 e 8 kDa têm como alvo canais iônicos de membrana (ESCOUBAS; DIOCHOT; CORZO, 2000; RASH; HODGSON, 2002).
As fosfolipases-D são os componentes do veneno loxoscélico mais bem estudados. Mas outras toxinas isoladas e caracterizadas nos levam a concluir que os mecanismos pelos quais o veneno loxoscélico induz a lesão dermonecrótica e demais distúrbios sistêmicos são bastante complexos e precisam ser investigados com maior profundidade.
6. Inibidores de serino-proteases
Inibidores de serino-proteases são classificados em pelo menos 23 famílias baseadas na sua sequência primária, motivos estruturais e mecanismos de ligação. Essas famílias são agrupadas em três superfamílias de acordo com seu mecanismo de ação: os inibidores canônicos, os inibidores não-canônicos e as serpinas (OTLEWSKI et al., 1999; KROWARSCH et al., 2003).
Os inibidores canônicos são o maior grupo em quantidade de famílias representadas, sendo proteínas pequenas, de 3 a 21 kDa, encontradas em diferentes organismos. Interagem com a protease alvo por meio de um loop catalítico altamente conservado entre as diferentes famílias sem sofrer nenhuma alteração conformacional (KROWARSCH et al., 2003). Venenos de diferentes animais contêm inibidores de serinoproteases e geralmente membros da superfamília dos inibidores canônicos, são descritos. No veneno de diversas espécies de serpentes da família Viperidae e Elapidae foram isolados e sequenciados inibidores de serino-protease, principalmente da família Kunitz (SHAFQAT et al., 1990; CHEN et al., 2001; HE et al., 2008; LU
et al., 2008) e em menor proporção, da família BPTI (CHANG et al., 2001;
ZHOU et al., 2004). Inibidores desse tipo também têm sido descritos em vespas (YANG et al., 2009), anêmonas (ANDREEV et al., 2008) e tarântulas (YUAN et al., 2008). Embora bem caracterizados quanto a sua estrutura, muitas das atividades desses inibidores permanecem obscuras, sendo que em
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serpentes, o grupo mais bem estudado, tem sido demonstrado sua participação nos processos de coagulação, fibrinólise e inflamação por interações ainda não completamente definidas com diversas moléculas (HE et al., 2008).
Os inibidores de serino-protease da superfamília das serpinas são proteínas maiores, tipicamente entre 350-500 aminoácidos, distribuídas desde vírus até mamíferos. A peculiaridade que define essa superfamília são as mudanças conformacionais que ocorrem no processo de inibição das enzimas alvos (LAW et al., 2006). Estas moléculas são consideradas de grande interesse porque atuam como moduladoras em uma variedade de funções fisiológicas, como na coagulação sanguínea, fibrinólise, apoptose, desenvolvimento, inflamação e ativação do sistema complemento (IRVING et
al., 2004). Em secreções venenosas animais, foram descritas no veneno da
lagarta Lonomia obliqua e na pele do sapo Bufo andrewsi, mas sem a caracterização da sua função especifica (VEIGA et al., 2005; ZHAO et al., 2005).
7. Toxinas recombinantes de L. intermedia
Nos últimos anos, uma biblioteca de cDNA foi construída a partir de RNAm extraído de glândulas produtoras de veneno de L. intermedia, espécie predominante na cidade de Curitiba e região metropolitana. Inicialmente, a varredura desta biblioteca de cDNA foi feita por sequenciamento aleatório dos clones obtidos. O resultado desta varredura foi o isolamento de cDNAs codificantes para 6 isoformas de toxinas dermonecróticas (bioquimicamente caracterizadas como fosfolipases-D) e 3 isoformas de metaloproteases (CHAIM
et al, 2006; DA SILVEIRA et al, 2006; DA SILVEIRA et al, 2007b; DA SILVEIRA et al, 2007c; RIBEIRO et al, 2007; APPEL et al, 2008; TREVISAN-SILVA et al,
2010).
Os principais cDNAs estudados na sequencia, foram os das esfingomielinases (fosfolipases-D ou toxinas dermonecróticas). Todos os 6 cDNAs das toxinas dermonecróticas foram subclonados em vetor de expressão pET-14b e as proteínas recombinantes foram expressas e purificadas na sua forma solúvel e ativa. Um estudo comparativo, envolvendo 2 destas isoformas recombinantes (DA SILVEIRA et al., 2006), mostrou atividades biológicas
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(dermonecrose, reação inflamatória, agregação plaquetária e permeabilidade capilar) semelhantes, para as toxinas recombinantes obtidas, porém em diferentes intensidades, de acordo com a atividade enzimática exibida, apesar das 3 isoformas apresentarem os aminoácidos do sítio catalítico conservados. Este estudo também mostrou uma reatividade imunológica cruzada diferencial destas três isoformas, além de uma relação estrutural inter e intra-espécie. Outro estudo (CHAIM et al., 2006) mostrou que a isoforma recombinante 1 (LiRecDT1) foi capaz de causar nefrotoxicidade direta (sem a presença de infiltrado inflamatório nos rins), em camundongos, tanto in vivo, quanto in vitro, em cultura de células epiteliais tubulares. Em relação às isoformas 4, 5 e 6, as proteínas recombinantes expressas em bactérias foram utilizadas em experimentos comparativos, com relação ao veneno total, no que se refere às suas atividades bioquímicas (atividade fosfolipásica) e biológicas (dermonecrose, resposta inflamatória, agregação plaquetária, permeabilidade vascular e mortalidade em camundongos). A semelhança estrutural destas, com as demais isoformas de toxinas dermonecróticas previamente estudadas, também foi analisada (DA SILVEIRA et al., 2007b; APPEL et al., 2008).
DA SILVEIRA e colaboradores (2007c) clonaram, identificaram e caracterizaram uma metaloprotease da família das astacinas, a LALP1 (Loxosceles Astacin-like Protease). A identificação da LALP1 foi a primeira descrição de um membro da família das astacinas em um veneno animal (da SILVEIRA et al., 2007c). Em um estudo recente, TREVISAN-SILVA e colaboradores (2010) clonaram, identificaram e caracterizaram duas isoformas da LALP1, produzidas pelas aranhas da espécie L. intermedia, denominadas LALP 2 e LALP3. Além disso, o mesmo trabalho, por meio da identificação e clonagem de sequências de metaloproteases da família das astacinas presentes nos venenos das espécies L. gaucho e L. laeta, descreveu que essa classe de metaloproteases é uma família conservada nos venenos da aranhas do gênero Loxosceles. Isso demonstra e sugere que o papel desta classe de moléculas é bastante relevante para a ação do veneno, tanto na captura de presas, quanto para a defesa.
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8. Aplicações biotecnológicas das toxinas loxoscélicas
Pesquisas envolvendo toxinas loxoscélicas vêm ganhando especial atenção nos últimos anos. Diante da diversidade de toxinas presentes nos venenos loxoscélicos, com as mais variadas atividades bioquímicas e farmacológicas, fica cada vez mais evidente o potencial destas moléculas no seu emprego como insumos biotecnológicos, como ferramentas de estudo ou diagnóstico e como modelos para a descoberta e desenvolvimento de novos fármacos (SOUTAR e GINSBERG, 1993, MARKLAND, 1998; KEMPARAJU e GIRISH, 2006).
Já na década de 60, o interesse em componentes bioativos isolados de venenos era notável. No final dessa década, pesquisadores brasileiros descreveram e isolaram um peptídeo com atividade anti-hipertensiva (fator potencializador da bradicinina) do veneno da serpente Bothrops jararaca, que foi utilizado, posteriormente, como modelo para a síntese do Captopril (FERREIRA e VANE, 1967).
Um produto biotecnológico desenvolvido a partir de um veneno loxoscélico, denominado ARACHnase® (Hemostasis Diagnostics International Co., Denver, CO) foi desenvolvido e é atualmente bastante utilizado em laboratórios de diagnóstico. O produto é um plasma normal que contém o extrato de veneno da aranha marrom Loxosceles reclusa, que mimetiza o anticoagulante lúpico, advindo daí um controle positivo para o teste da presença desse composto (MCGLASSON et al, 1993).
Testes pré-clínicos foram realizados, utilizando um soro anti-loxoscélico com fosfolipases-D recombinantes de aranhas do gênero Loxosceles (DE ALMEIDA et al, 2008). Os testes de neutralização mostram que o soro feito com fosfolipases-D recombinantes têm uma maior atividade contra os efeitos tóxicos dos venenos das aranhas do gênero. Este é um exemplo de produto biotecnológico que possui um alto potencial de aplicabilidade na terapia contra o loxoscelismo.
Nos últimos anos, utilizando técnicas de biologia molecular, cientistas têm obtido diferentes toxinas recombinantes e material suficiente para gerar um entendimento mais profundo na atividade molecular destas toxinas. Uma compreensão maior das toxinas, em seu aspecto mecanístico, assim como a
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sua utilização como drogas ou modelos moleculares, vai depender de uma classificação bioquímica das toxinas, da determinação de estruturas tridimen-sionais, da elucidação de atividades biológicas das toxinas baseada na sua organização molecular e, finalmente, do seu modo de ação sobre diferentes modelos celulares e seus receptores (SENFF-RIBEIRO, et al, 2008).
No Brasil, os venenos de diferentes espécies de aranhas-marrons são utilizados na produção de imunobiológicos para a soroterapia em casos graves de loxoscelismo, levando em consideração a reatividade imunológica cruzada dos diferentes venenos de Loxosceles (GOMEZ et al., 2001, BARBARO et al., 1994a, BARBARO et al., 1996, ARAUJO et al., 2003). O Instituto Butantan, na cidade de São Paulo, é responsável pela produção de um soro polivalente anti-aracnídico, utilizando os venenos brutos de L. gaucho, Phoneutria nigriventer (aranha “armadeira”), Tityus serrulatus e Tityusbahiensis (escorpiões). No Paraná, dada a ocorrência dos acidentes com aranhas-marrons, um soro anti-loxoscélico é produzido pelo Centro de Produção e Pesquisa de Imunobiológicos (CPPI), utilizando-se como antígenos os venenos de L.
gaucho, L. intermedia e L. laeta. Além da produção de imunoterápicos e do
próprio uso de anticorpos para o diagnóstico diferencial e correto do loxoscelismo (CHAVEZ-OLORTEGUI et al., 1998, MILLER et al., 2000, KRYWKO e GOMEZ, 2002), a expressão recombinante de toxinas dermonecróticas favorece também um amplo aprendizado dos mecanismos moleculares do loxoscelismo, bem como evidencia o enorme potencial destas toxinas como ferramentas moleculares, possivelmente úteis no estudo de processos de resposta inflamatória, distúrbios da hemostase e agregação plaquetária (SENFF-RIBEIRO, et al, 2008).
9. Transcriptoma e venenos
ESTs – do inglês “Expression Sequence Tags” são sequências que representam total ou parcialmente, um gene expresso em um tecido, num determinado momento (STERKY & LUNDEBERG, 2000). ESTs são sequências curtas (200 a 800 pares de base em comprimento), não editadas, randomicamente selecionadas, sequenciadas de forma “single-pass” e derivadas de bibliotecas de cDNA (NAGARAJ et al, 2007).
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As ESTs e as sequências do DNA complementar (cDNA) fornecem uma evidência direta de todos os transcritos amostrados e eles são atualmente as mais importantes fontes de exploração dos transcriptomas. O cDNA resultante é clonado para formar bibliotecas que representam um conjunto de genes transcritos da célula, tecido ou organismo original. Subsequentemente, estes clones de cDNA são sequenciados randomicamente em uma direção, numa corrida “single-pass” gerando, na maioria das vezes, sequências incompletas (não “full-lenght”) (NAGARAJ et al, 2006).
Só recentemente, o grande potencial dos venenos como fonte de novos compostos com aplicações potenciais agroquímicas, farmacológicas ou biotecnológicas foi percebido (ESCOUBAS, 2006). Diversos trabalhos têm descrito nos últimos anos, as análises de transcriptomas de glândulas produtoras de venenos de serpentes, escorpiões e aranhas (JUNQUEIRA-DE-AZEVEDO e HO, 2002; KASHIMA et al, 2004; CIDADE et al, 2006; NEIVA et
al, 2009; WAGSTAFF e HARRISON, 2006; ZHANG et al, 2010; SCHWARTZ et al, 2007; PAHARI et al, 2007; FERNANDES-PEDROSA et al, 2008; CHEN et al, 2008; VALENTE et al, 2009; BOLDRINI-FRANÇA et al, 2009; MA et al,
2009; SIANG et al, 2010). Estudos com esta ênfase têm demonstrado a grande utilidade da técnica de análise de ESTs para a identificação de moléculas com aplicabilidade biotecnológica potencial. A maioria desses trabalhos descreve o transcriptoma de serpentes. Poucos trabalhos foram publicados com glândulas produtoras de veneno de aranhas. Segundo ESCOUBAS (2006) os estudos de catálogos de transcritos de glândulas de veneno de aranhas são exemplo de potencial de novas toxinas com aplicabilidade biotecnológica. Elas compõem um grupo altamente bem sucedido e diversificado de artrópodes, mas carecem de estudos mais aprofundados.
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II – OBJETIVOS
1. Objetivo geral
Descrever o perfil de expressão das proteínas e identificar novas toxinas da glândula de veneno de Loxosceles intermedia, utilizando a análise do transcriptoma.
2. Objetivos específicos
1. Construir uma biblioteca de cDNA representativa de glândulas produtoras de veneno de Loxosceles intermedia e caracterizar funcionalmente os transcritos para descrever o perfil de expressão da glândula e identificar novas toxinas.
2. Clonar e expressar o gene codificante para um inibidor de serino-protease da família das Serpinas, identificado no transcriptoma.
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III – JUSTIFICATIVA
Considerando a grande complexidade e o crescente interesse nos venenos de animais peçonhentos, o estudo da atividade bioquímica e biológica de toxinas isoladas é de grande valia para o aprofundamento dos conhecimentos dos mecanismos de ação dos diferentes constituintes dos venenos “in natura”. A partir da clonagem molecular e a expressão heteróloga de toxinas, torna-se possível o desenvolvimento de ferramentas para o estudo refinado, desde a descrição bioquímica estrutural e funcional, até os efeitos biológicos e farmacológicos. Hoje em dia, técnicas modernas de biologia molecular para manipulação de DNA e RNA permitem a construção de bibliotecas bastante amplas que auxiliam na compreensão do comportamento dos processos biológicos complexos pela identificação dos seus constituintes moleculares. Além disso, bibliotecas oferecem uma visão global do veneno e possibilitam a descoberta de moléculas de interesse biotecnológico. É fato consensual que o loxoscelismo é um problema de saúde pública, dado à elevada frequência dos acidentes e aos hábitos intradomiciliares adquiridos pelas aranhas do gênero. Isso justifica a relevância de conhecimentos científicos adicionais sobre este assunto, que vêm otimizar o esclarecimento de questões fundamentais como o desenvolvimento dos quadros de envenenamento, mecanismos de ação do veneno, etc. O uso de técnicas de biologia molecular associadas à bioinformática em toxinologia também é importante no que diz respeito à aplicação biotecnológica das toxinas estudadas, já que o uso de produtos purificados de venenos e outras secreções de animais peçonhentos, plantas e microrganismos, seja de forma direta ou indireta, tem sido uma tendência internacional. A biotecnologia de toxinas não se restringe apenas à descoberta de novos insumos terapêuticos na indústria farmacêutica, mas também visa à descoberta de novas ferramentas de estudo em bioquímica e biologia celular, tais como peptídeos que atuam em canais iônicos, podendo auxiliar o entendimento do mecanismo desses canais e a compreensão molecular dos envenenamentos.
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IV – RESULTADOS
O presente trabalho relata os resultados relativos à análise do transcriptoma da glândula produtora de veneno da aranha Loxosceles
intermedia. O trabalho descreve também as etapas para a produção de um
inibidor de serino-protease recombinante identificado no transcriptoma.
Os dados são apresentados na forma de um artigo aceito (Item 1) e na descrição das etapas para clonagem e expressão do inibidor de serino-protease recombinante (Item 2).
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A – Item 1: “Um novo perfil de expressão da glândula de veneno da aranha Loxosceles intermedia demonstrado por análise transcriptômica ”
Autores: Luiza Helena Gremski, Rafael Bertoni da Silveira, Olga Meiri Chaim, Christian Macagnan Probst, Valéria Pereira Ferrer, Jenifer Nowatzki, Hellen Chris Weinschutz, Humberto Maciel França Madeira, Waldemiro Gremski, Helena Bonciani Nader, Andrea Senff-Ribeiro, Silvio Sanches Veiga
Revista: Molecular Biosystems
DOI: 10.1039/c004118a – artigo convidado para ilustrar a capa do volume. Com o intuito de descrever o perfil de expressão da glândula produtora de veneno de L. intermedia, foi gerada uma biblioteca de cDNA representativa e os transcritos foram funcionalmente analisados. Após processamento inicial dos dados, 1.843 ESTs produziram sequências com qualidade suficiente para serem analisadas. Estas foram agrupadas em 538 clusters, 281 dos quais eram singletons. 53% das ESTs combinaram com proteínas conhecidas. A análise de similaridade mostrou que transcritos que codificam para toxinas perfazem 43% da biblioteca. As toxinas mais frequentes são da família de toxinas inseticidas denominadas LiTx. Os transcritos codificantes para fosfolipases-D e metaloproteases do tipo astacina perfazem, cada um, aproximadamente 9% do total de transcritos. Componentes tóxicos tais como inibidores de serino-proteases, hialuronidases e alérgenos de venenos foram também identificados, porém com menor representatividade. Quase 10% das ESTs codificam para proteínas envolvidas em processos celulares. Esses dados fornecem uma visão global do perfil de expressão da glândula de veneno de L. intermedia e revelou diferenças significantes em relação à perfis de outras aranhas do gênero Loxosceles. Além disso, estes resultados também confirmam que este veneno constitui uma extraordinária fonte de novos compostos com potenciais aplicações agroquímicas, industriais e até mesmo farmacológicas.
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Fw: Article Ref : C004118A - Molecular BioSystems
From: MOLBIOSYST (shared)
Sent: Wednesday, April 07, 2010 5:29 AM
Subject: Article Ref : C004118A - Molecular BioSystems
Dear Professor Dr Veiga Paper Ref.: C004118A
Title : A novel expression profile of the Loxosceles intermedia venomous gland revealed by transcriptome analysis
I am writing to inform you that I have now received a full set of referee reports for your submission and that based on these reports I will be pleased to publish your
manuscript in Molecular BioSystems subject to its satisfactory revision in light of the reports below.
I look forward to hearing from you and thank you for submitting your work to Molecular BioSystems.
Best wishes, Nikki Moran
Publishing Editor, Molecular BioSystems
Royal Society of Chemistry, Thomas Graham House, Science Park , Cambridge , CB4 0WF , UK
Tel +44 (0)1223 432657 http://www.rsc.org
Report A
The manuscript (C004118A) by Veiga et al., presents very interesting results of the transcriptome analysis of L. intermedia venom gland. A literature search indicates that the research group of Veiga has considerable experience in the field of spider venom proteins and their action.
The experiments have been carefully conducted and the results have been properly interpreted.
The introduction presents results to date, the manuscript is very well written, is concise, presents the results in a very clear manner, and the discussion along with the figures provides a clear view.
Conclusion: Manuscript should be accepted without corrections.
Report B
This is an interesting and important study in which the authors performed a detailed and thorough transcriptome analysis of the L.intermedia venomous gland. Comparison of these data with the results of the analysis of other spiders from the Lexosceles genus revealed a number of noticeable differences and clearly indicated the highly specialized nature of the spider venom gland on producing toxins. This work adds significantly to the field and will have a noticeable impact. The manuscript is nicely written and in addition to the very important transcriptome analysis provides a focused overview of major toxins found in the spider venom.
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Fw: c004118a cover invitation
From: MOLBIOSYST (shared)
To: '[email protected]'
Sent: Wednesday, June 30, 2010 10:57 AM Subject: c004118a cover invitation
Dear ProfD Silvio Veiga
Your paper has been highly rated by the reviewers, and therefore we would like to invite you to submit some artwork for consideration for the cover of Molecular BioSystems.
If chosen for the front cover (outside / inside), we will also promote your article and increase its visibility in a number of ways:
• It will be made free to access to all for 6 weeks
• It will be highlighted in the contents pages of the journal online and in print • The cover will be featured in the journal gallery
• Your article may be selected for a news piece in an RSC magazine
(http://www.rsc.org/Publishing/Magazines/index.asp) You will also receive:
• A free print copy of the issue which features your cover • Several high-quality prints of the cover
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article that is published in the issue for readers to download will contain your cover as the first page
• An electronic copy of the finished image to use in presentations or display on
your desk top
We usually request a contribution of £250 (plus applicable tax) to help contribute towards the cost of producing a cover.
If you would like to be considered to have your work featured, then please could you let me know as soon as possible and provide some eye-catching artwork for
consideration. I would be grateful if you could submit the cover artwork as soon as possible.
If I can be of any assistance please do not hesitate to contact me. Best Wishes
Nikki Moran
Publishing Editor, Molecular BioSystems
Royal Society of Chemistry, Thomas Graham House, Science Park , Cambridge , CB4 0WF , UK
Tel +44 (0)1223 432657 http://www.rsc.org
This journal is c The Royal Society of Chemistry 2010 Mol. BioSyst.
A novel expression profile of the Loxosceles intermedia spider venomous
gland revealed by transcriptome analysis
Luiza Helena Gremski,aRafael Bertoni da Silveira,bOlga Meiri Chaim,ac Christian Macagnan Probst,dVale´ria Pereira Ferrer,cJenifer Nowatzki,c Hellen Chris Weinschutz,eHumberto Maciel Madeira,eWaldemiro Gremski,e Helena Bonciani Nader,aAndrea Senff-Ribeirocand Silvio Sanches Veigaac
Received 10th March 2010, Accepted 15th April 2010 DOI: 10.1039/c004118a
Spiders of the Loxosceles genus are cosmopolitan, and their venom components possess remarkable biological properties associated with their ability to act upon different molecules and receptors. Accidents with Loxosceles intermedia specimens are recognized as a public health problem in the south of Brazil. To describe the transcriptional profile of the L. intermedia venom gland, we generated a wide cDNA library, and its transcripts were functionally and structurally analyzed. After initial analyses, 1843 expressed sequence tags (ESTs) produced readable sequences that were grouped into 538 clusters, 281 of which were singletons. 985 reads (53% of total ESTs) matched to known proteins. Similarity searches showed that toxin-encoding transcripts account for 43% of the total library and comprise a great number of ESTs. The most frequent toxins were from the LiTx family, which are known for their insecticidal activity. Both phospholipase D and astacin-like metalloproteases toxins account for approximately 9% of total transcripts. Toxins components such as serine proteases, hyaluronidases and venom allergens were also found but with minor representation. Almost 10% of the ESTs encode for proteins involved in cellular processes. These data provide an important overview of the L. intermedia venom gland expression scenario and revealed significant differences from profiles of other spiders from the Loxoscelesgenus. Furthermore, our results also confirm that this venom constitutes an amazing source of novel compounds with potential agrochemical, industrial and pharmacological applications.
Introduction
The Loxosceles genus is one of four groups of spiders capable of causing human fatality.1 They are distributed worldwide, and specifically in Brazil, only three species have been impli-cated in envenoming: L. intermedia, L. gaucho and L. laeta. The bites of brown spiders (Loxosceles genus) led to several clinical manifestations such as necrotic skin degeneration and gravitational spread at the bite site, renal failure and hemato-logical disturbances.2Loxoscelism is the term used to describe the set of symptoms that commonly appear after accidents with brown spiders. The molecular and physiological mechanisms of loxoscelism are currently under investigation.
Several studies conducted over the past 30 years concerning the structural and biological roles of various venom components have shown the complex nature of these secretions.3Likewise, the venom of Loxosceles spiders is a complex mixture of
protein toxins with a molecular mass profile ranging from 5 to 40 kDa.4
Today, it is evident that venom constituents are endowed with remarkable biological properties associated with their ability to act upon a number of specific and non-specific molecules and receptors in order to incapacitate their target organisms.3Spider venom has received less attention than the venom produced by other animals due to their minimal impact on human health.5Alternatively, spider venom constitutes an amazing putative source of novel compounds with potential agrochemical, industrial and pharmacological applications. Spiders are highly successful and one of the most diversified groups of arthropods, but only a few species have had their venom investigated.6
In Loxosceles venom, many proteins have been identified and biochemically characterized. Some of the components are not involved in the noxious activities of the venom, and others, such as members of the phospolipase D family (also known as dermonecrotic toxins) can produce deleterious effects that contribute significantly to the typical response after envenoming.7 Despite this accumulated knowledge, it is essential to conduct a wider study concerning the nature of venom components and their proportion in the mixture. Today, modern molecular biology techniques for DNA and RNA manipulation allow the construction of vast transcript libraries that further the
a
Department of Biochemistry, Federal University of Sa˜o Paulo, Sa˜o Paulo, Brazil
bDepartment of Structural, Molecular Biology and Genetics,
State University of Ponta Grossa, Parana´, Brazil
cDepartment of Cell Biology, Federal University of Parana´,
Parana´, Brazil
dInstituto Carlos Chagas, Fiocruz, Parana´, Brazil e
Catholic University of Parana´, Health and Biological Sciences Institute, Parana´, Brazil
PAPER www.rsc.org/molecularbiosystems | Molecular BioSystems
Downloaded on 12 August 2010
Published on 19 July 2010 on http://pubs.rsc.org | doi:10.1039/C004118A
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