BIOLOGIA MOLECULAR
Bases moleculares e fisiológicas
da resistência à insulina
Autores:
José Barreto Campello Carvalheira Henrique Gottardello Zecchin
Médicos e Pós-Graduandos do Departamento de Clínica Médica – Faculdade de Ciências Médicas, Universidade Estadual de Campinas
Mario José Abdalla Saad*
Professor Livre-Docente do Departamento de Clínica Médica – Faculdade de Ciências Médicas, Universidade Estadual de Campinas
hormônio, era o mecanismo fisiopatológico em muitos diabé-ticos. Essa idéia foi desacreditada até o desenvolvimento do radioimunoensaio por Berson e Yalow2, que mostraram defi-nitivamente que pacientes com diabete iniciado na vida adulta (tipo 2) tinham altos níveis de insulina circulante. Estudos posteriores de Roth3, Reaven4,5, Olefsky6, e outros sedimenta-ram as bases para a idéia de que a resistência à insulina é es-sencial para o desenvolvimento do diabete.
Atualmente, acredita-se que a fisiopatologia do diabete tipo 2 envolve alterações em três sistemas orgânicos que cons-piram para produzir um metabolismo anormal de glicose e lipídeos7: fígado, tecidos periféricos (músculo e adiposo) e cé-lula β, apesar de existir certa incerteza em relação à lesão pri-mária e à importância relativa dos diferentes tecidos. A resis-tência à insulina, que é definida como um estado de menor resposta metabólica aos níveis circulantes de insulina, é agora reconhecida como uma característica inerente do DM-2 e con-tribui para as anormalidades em todos os tecidos acima menci-onados.
Vários estudos epidemiológicos prospectivos em diversos grupos populacionais indicaram que o DM-2 progride em para-lelo com a piora da ação insulínica, começando com resistência periférica à insulina e terminando com a redução na secreção de insulina (figura 1). Na maioria dos pacientes, a resistência à insu-lina pode ser detectada muito antes da deterioração do metabolis-mo glicídico. Resistência à insulina é um estado comum associa-do a obesidade, envelhecimento, hábito de vida sedentário, bem como a predisposição genética. O desequilíbrio da regulação do metabolismo de carboidratos e lipídeos decorrente da resistência à insulina gera um círculo vicioso com maior redução da sensibi-lidade à insulina. As células β pancreáticas inicialmente compen-sam o estado de resistência à insulina aumentando a secreção desse hormônio. Com o avançar da resistência, as células β fa-lham em responder apropriadamente à glicose, levando ao de-senvolvimento de intolerância à glicose. Anualmente, 5% a 10% dos pacientes intolerantes à glicose desenvolvem diabete com a piora da resistência à insulina.
Mesmo na ausência de diabete, a resistência à insulina é uma característica marcante de outras doenças. Resistência à insulina e hiperinsulinemia estão associadas a anormalidades, tais como: hipertrigliceridemia, baixos níveis de HDL, aumen-to na secreção de VLDL, distúrbios de coagulação, aumenaumen-to da resistência vascular, mudanças nos níveis de hormônios esteróides e aumento de peso. Desse modo, a resistência à in-sulina está freqüentemente associada com obesidade central, hipertensão, síndrome dos ovários policísticos, dislipidemia e
*Endereço para correspondência:
Departamento de Clínica Médica – Faculdade de Ciências Médicas – Universidade Estadual de Campinas
Rua Tessália Vieira de Camargo, 126 13081-970 – Campinas – SP Tel.: (19) 3788-8950 E-mail: msaad@fcm.unicamp.br
FIGURA
1
ESTÁGIOS DO DESENVOLVIMENTO DO DM-2Introdução
Após a descoberta da insulina por Banting e Best em 1922, o diabete em humanos foi considerado uma doença causada exclusivamente pela deficiência de secreção desse hormônio. Entretanto, dez anos depois, Himsworth1 notou variações nas respostas de pacientes diabéticos à insulina e sugeriu que a insensibilidade à insulina, e não a deficiência na secreção desse
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aterosclerose. Essa constelação de sintomas é chamada de sín-drome plurimetabólica8. Não está claro se a resistência à insu-lina é a responsável direta por todos esses sintomas. Entretan-to, a associação de resistência à insulina e essas alterações metabólicas é aceita universalmente.
Nesta revisão, será abordada a fisiopatologia da resistên-cia à insulina, mas antes de considerar as bases moleculares desse estado é essencial que se compreenda a ação insulínica em células normais.
Transmissão intracelular
do sinal insulínico
A figura 2 mostra um esquema simplificado das etapas de sinalização intracelular desde a ligação da insulina ao seu recep-tor até a ativação do transporte de glicose. A sinalização intrace-lular da insulina começa com a sua ligação a um receptor especí-fico de membrana, uma proteína heterotetramérica com ativida-de quinase, composta por duas subunidaativida-des α e duas subunidades
β. A ligação da insulina à subunidade α estimula a autofosforilação da região intracelular da subunidade β do receptor.
Uma vez ativado, o receptor de insulina fosforila vários subs-tratos protéicos em tirosina, incluindo membros da família dos substratos dos receptores de insulina (IRS1/2/3/4), Shc, Gab-1 e Cbl. A fosforilação em tirosina das proteínas IRS cria sítios de reconhecimento para moléculas contendo domínios com homo-logia a Src 2 (SH2). Dentre essas, destaca-se a fosfatidilinositol 3-quinase (PI 3-quinase). As funções fisiológicas do IRS-1/2 fo-ram recentemente estabelecidas através da produção de camun-dongos sem os genes que codificam o IRS-1 e IRS-2 (“knockout” de IRS-1 e IRS-2). O camundongo que não expressa IRS-1 apre-senta resistência à insulina e retardo de crescimento, mas não é hiperglicêmico9. Foi demonstrado que o IRS-2 poderia compen-sar parcialmente a ausência de IRS-1, o que explicaria o fenótipo de resistência à insulina sem hiperglicemia do camundongo “knockout” de IRS-1. O camundongo que não expressa o IRS-2 foi recentemente gerado10 e apresentou um fenótipo diferente do camundongo sem IRS-1: hiperglicemia acentuada devido a di-versas anormalidades na ação da insulina nos tecidos periféricos e falência da atividade secretória das células β acompanhada de redução significativa da massa de células β pancreáticas.
A fosforilação das proteínas IRSs cria sítios de ligação para a PI quinase, promovendo sua ativação. Atualmente, a PI 3-quinase é a única molécula intracelular inequivocamente consi-derada essencial para o transporte de glicose11. As proteínas-alvo conhecidas dessa enzima são a AKT e as isoformas atípicas da PKC (ζ e λ), porém a função das proteínas-alvos da PI 3-quinase no transporte de glicose ainda não está bem estabelecida12–16.
Permanecem obscuros os mecanismos pelos quais as etapas iniciais da sinalização insulínica convergem para as vesículas que contêm GLUT4 incitando o transporte dessas vesículas para a superfície celular. No estado basal, GLUT4 é continuamente reciclado entre a membrana celular e os vários compartimentos intracelulares. Após o estímulo com insulina, a taxa de exocitose das vesículas contendo GLUT4 aumenta intensamente, além de ocorrer uma pequena diminuição na taxa de internalização. A exocitose estimulada por insulina é similar à exocitose de
vesícu-las sinápticas17,18. As vesículas de GLUT4, em particular, contêm as proteínas V-SNARE, VAMP2 e VAMP3, que fisicamente inte-ragem com seus pares t-SNARE (sintaxina 4 e SNAP23) na mem-brana celular durante a translocação das vesículas de GLUT4. Apesar dessas interações serem essenciais para a translocação do GLUT4, nenhuma dessas proteínas parece ser alvo da insulina. É tentador especular que alterações específicas dos complexos de proteína SNARE e/ou vias de sinalização que atuam paralela-mente à via da PI 3-quinase também contribuem para a resistên-cia à insulina.
Mecanismos celulares de
resistência à insulina
A seguir, serão abordados alguns dos avanços recentes no entendimento da gênese da resistência à insulina. Inicialmente, avaliaremos o efeito da obesidade e da hipertensão na modula-ção da sensibilidade à insulina e em seguida a influência dos fatores genéticos na indução da resistência à insulina.
Obesidade
O impacto negativo do aumento da quantidade de gordu-ra corpogordu-ral sobre a sensibilidade à insulina pode ser clagordu-ra- clara-mente demonstrado na maioria dos indivíduos, assim como a redução da resistência à insulina observada com a perda de peso e o exercício físico19,20. Assim, pesquisadores vêm sendo atraídos pela procura de um fator produzido pelo tecido adi-poso que module a sensibilidade insulínica. Inicialmente os ácidos graxos livres (AGL) foram implicados nesse processo, mas nos últimos anos vários hormônios produzidos por adipócitos foram descritos, bem como o papel que desempe-nham no desenvolvimento da resistência à insulina.
n O papel dos ácidos graxos livres (AGL) na resistência à
insulina relacionada à obesidade. Dentre as moléculas
sinalizadoras produzidas por adipócitos, os AGL têm sido implicados na patogênese da resistência à insulina. Os AGL são gerados através da lipólise, principalmente nos adipócitos. Em indivíduos obesos insulino-resistentes
pode-FIGURA
2
efeitos antilipolíticos da insulina. Outro mecanismo através do qual a obesidade poderia contribuir para a maior produ-ção de AGL é a hiperatividade do sistema nervoso simpáti-co, o que já foi demonstrado tanto em pacientes obesos como em diabéticos tipo 2. Os AGL são captados pelo fígado e músculo esquelético e se contrapõem aos efeitos da insuli-na, inibindo a captação e oxidação de glicose.
Estudos recentes21–23 propuseram que a elevação de AGL plasmático resultaria em ativação da proteína quinase C-θ
(PKC-θ), uma serina-quinase, levando à fosforilação em serina do IRS-1, o que reduz a capacidade do IRS-1 de se ligar e ativar a PI 3-quinase, resultando em transmissão reduzida do sinal de insulina em direção à translocação de GLUT4 para a membrana celular. Dessa forma, os ácidos graxos livres podem reduzir a captação de glicose celular interferindo diretamente na cascata de proteí-nas envolvidas na transmissão do sinal de insulina, e não através da inibição da atividade da hexoquinase (figura 3).
n Adipocinas: TNF-ααααα, leptina, adiponectina e resistina.
Além de sua função de depósito de lipídeos, os adipócitos produzem e secretam hormônios, coletivamente chamados de adipocinas, que podem influenciar intensamente o meta-bolismo e o gasto energético. O TNF-α foi primeiro identi-ficado como uma citocina endógena produzida por macró-fagos e linfócitos após estímulo inflamatório. O TNF-α é expresso em muitos tipos de células, incluindo o tecido adi-poso. Adipócitos de animais obesos e humanos hiperexpres-sam TNF-α em quantidades positivamente correlacionadas ao índice de massa corporal e à hiperinsulinemia, e a redu-ção de peso diminui a expressão do TNF-α24. Embora a li-beração local de TNF-α exerça pouco efeito sobre as con-centrações sistêmicas dessa citocina, as concon-centrações lo-cais de TNF-α livre e ligado à membrana estão aumentadas na obesidade. Spiegelman et al. recentemente propuseram que o TNF-α é capaz de alterar a transmissão do sinal de insulina através do aumento da fosforilação em serina do IRS-1 e possivelmente de outras proteínas IRS25. O IRS-1 fosforilado em serina inibe a atividade tirosino-quinase do receptor de insulina e é também menos fosforilado em tiro-sina, reduzindo assim a sinalização de insulina. Foi elabora-da a hipótese de que a fosforilação do IRS-1 em serina indu-zida pelo TNF-α ativa um fator inibitório adicional sobre o receptor de insulina, provavelmente uma tirosina fosfatase ou um inibidor de serina-fosfatase, inibindo ainda mais a atividade tirosina quinase do receptor de insulina26. Camun-dongos com ausência total do receptor de TNF-α (princi-palmente das isoformas p55 e p75 do receptor) apresentam melhora da sensibilidade à insulina27.
Em 1994, Friedman28 identificou a leptina como um hor-mônio derivado de adipócitos e permitiu classificar o tecido adiposo como parte do sistema endócrino. A leptina reduz o peso corporal através de receptores específicos em áreas hipotalâmicas que regulam o gasto energético e a saciedade29.
A deficiência na produção de leptina, bem como mutações no seu receptor em roedores, causa obesidade acentuada com hi-perglicemia e resistência à insulina. Em alguns desses camun-dongos, a administração de leptina exógena melhora a tole-rância à glicose e a sensibilidade à insulina, independente-mente de seus efeitos na ingestão alimentar, provavelindependente-mente por modular vias neuroendócrinas que controlam as ações da insulina no fígado30,31, embora a leptina possa exercer alguns de seus efeitos de forma direta nos hepatócitos32.
A adiponectina é um hormônio derivado de adipócitos. A redução da expressão dessa proteína está implicada no desenvol-vimento de resistência à insulina em modelos animais de obesi-dade e lipoatrofia33. A adiponectina reduz a resistência à insulina através da redução do conteúdo intracelular de triglicérides no músculo e fígado em camundongos obesos. Esse efeito é resulta-do resulta-do aumento da expressão de moléculas envolvidas tanto na metabolização de ácidos graxos quanto na dissipação de energia no músculo. Além disso, a resistência à insulina em camundon-gos lipoatróficos foi completamente revertida com a combina-ção de doses fisiológicas de adiponectina e leptina, mas apenas parcialmente pela adiponectina ou leptina isoladas. Esses dados indicam um possível papel terapêutico da reposição de adiponec-tina na resistência à insulina e diabete tipo 2.
Resistina é a adipocina mais recentemente descoberta. Es-tudos iniciais sugeriram que a resistina poderia causar resistência à insulina, uma vez que seus níveis estavam aumentados em ca-mundongos obesos e eram reduzidos por drogas antidiabéticas da classe das tiazolidinodionas. Além disso, a administração de anticorpo anti-resistina parecia melhorar a glicemia e a ação in-sulínica em camundongos obesos34. Entretanto, estudos subsequentes não confirmaram esses achados iniciais35.
Hipertensão arterial
Pacientes com hipertensão arterial apresentam intolerân-cia a carboidratos, hiperinsulinemia e resistênintolerân-cia à insulina em relação aos controles normotensos. Essas alterações po-dem persistir, independentemente do sucesso do tratamento farmacológico da hipertensão, e estão presentes em indiví-duos obesos e não-obesos. Entretanto, há diferenças raciais importantes, e foi demonstrada a associação da resistência à
EFEITO DOS AGL NAS VIAS DE TRANSMISSÃO DO SINAL DE INSULINA
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insulina/hiperinsulinemia e hipertensão arterial (HA) em cau-casóides, mas não em negróides ou índios Pima. Além dessas possíveis diferenças raciais, a presença de resistência à insuli-na só é observada em 50% dos indivíduos hipertensos.
Atualmente, o mecanismo mais aceito para o desenvol-vimento de hipertensão em pacientes com resistência à insuli-na é a existência de resistência à ação insulínica no endotélio vascular, podendo dificultar a ação vasodilatadora desse hor-mônio e/ou facilitar a vasoconstrição36. Estudos em indivíduos com obesidade, ou com hipertensão arterial e resistência à in-sulina na utilização de glicose, demonstram que o aumento dos níveis de insulina nesses pacientes não é acompanhado de vasodilatação como em indivíduos normais.
Além dos efeitos metabólicos da insulina, a ativação da PI 3-quinase, pelo menos em célula endotelial, estimula a produção de óxido nítrico (NO), fato que pode explicar a ação vasodilata-dora da insulina. Assim, a insulina ativa seu receptor, que induz a fosforilação em tirosina dos IRSs, que, por sua vez, ligam-se à PI 3-quinase e a ativam; a PI 3-quinase, atuando através de outra enzimas vai finalmente estimular a produção de NO, que é um potente vasodilatador37. Nesse sentido, é possível que mecanis-mos reguladores da PI 3-quinase no fígado, músculo e tecido adi-poso venham a induzir resistência à ação insulínica na utilização de glicose. A diminuição da atividade da PI 3-quinase no endoté-lio pode induzir resistência à ação vasodilatadora da insulina e contribuir para a HA. Em resumo, a regulação das vias de trans-missão do sinal insulínico em diferentes tecidos unifica os meca-nismos moleculares que induzem resistência à insulina e HA. Corroborando esses dados, o camundongo sem IRS-1 apresenta redução da produção de NO, e, conseqüentemente, o relaxamen-to da aorta endotélio-dependente está reduzido nesse animal37. Assim, na ausência de IRS-1, observa-se resistência à insulina associada a alterações hemodinâmicas encontradas na síndrome plurimetabólica. Isso reforça a hipótese de que defeitos molecu-lares comuns possam induzir resistência à insulina e HA. Fatores genéticos
Existem fortes evidências para um papel importante de fatores genéticos no desenvolvimento de resistência à insuli-na38, entretanto a identificação dos genes responsáveis pelo desenvolvimento da resistência à insulina têm sido extrema-mente difícil. Talvez a análise do genoma humano auxilie a revelar os fatores genéticos envolvidos nesse estado.
O estudo de formas raras de diabete tem sido a forma mais efetiva para definir genes que causam resistência à insulina. Em-bora resistência à insulina seja o defeito mais precoce detectado na maioria dos pacientes com DM-238, mutações do receptor de insu-lina são muito raras e são usualmente observadas em pacientes com diferentes síndromes de resistência grave à insulina39. Em tor-no de 0,1%–1% do DM-2 de herança materna, associado com de-feitos na audição, têm mutações do DNA mitocondrial. Algumas formas de diabete lipoatrófico são causadas por mutações de laminas nucleares A/C40, enquanto a síndrome de Wolfram (diabete, atrofia óptica e surdez) é causada por uma proteína ainda não caracteriza-da que possui dez segmentos transmembrana41.
Tentativas de identificar diabetogenes responsáveis pelas formas mais comuns de DM-2 dependem de estudos de “linkage”
ou estudos de genes candidatos. A fase de pré-seqüenciamento do projeto genoma humano42 permitiu rastreamento do genoma para identificação de regiões cromossômicas que estão ligadas com o DM-2 (cosegregação). Um locus na posição 2q37, desig-nado NIDDM1, está ligado ao diabete e corresponde a um poli-morfismo de um único nucleotídeo no gene que codifica a calpaina 1043. Esse locus parece agir junto com outro gene no cromosso-mo 15 para aumentar a suscetibilidade para o DM-244. Outros
loci envolvidos com DM-2 são o 20q12 e 1q21-24, mas os
diabetogenes específicos ainda não foram determinados45,46. Muitos genes candidatos envolvidos na ação insulínica têm sido examinados na procura de genes de suscetibilidade a resistên-cia à insulina. Embora algumas formas variantes de muitos destes genes tenham sido identificadas, alguns desses mostraram asso-ciação com resistência à insulina ou diminuição da função da pro-teína estudada. Polimorfismos do IRS-1 e mutações do PPARγ apre-sentam redução da sensibilidade insulínica21,22. Entretanto, para a maioria dos indivíduos, os genes envolvidos no desenvolvimento de resistência à insulina permanecem desconhecidos.
Resistência à insulina e diabete tipo 2 –
processo inflamatório subclínico
Estudos transversais têm demonstrado que marcadores inflamatórios e de disfunção endotelial podem predizer o de-senvolvimento do diabete e ganho de peso em adultos49. As associações mais significativas com marcadores inflamatórios são observadas com o índice de massa corporal. De fato, os adipócitos, especialmente nos obesos, produzem uma grande variedade de citocinas pró-inflamatórias e outros mediadores, como a leptina, TNF-α, IL-6 e PAI-1.
Há mais de 100 anos, Williamson et al. mostraram que o tratamento com altas doses de salicilatos, incluindo salicilato sódico e aspirina, reduzia a intensidade da glicosúria em pacien-tes diabéticos e, em 1957, Reid et al. demonstraram que o trata-mento com aspirina por 10 a 14 dias melhorava os resultados dos testes de tolerância à glicose oral em pacientes diabéticos50. O mecanismo através do qual o salicilato pode afetar a homeostase de glicose permaneceu desconhecido até que Yin et al. descobri-ram que essa droga inibe a atividade de uma serina-quinase co-nhecida por IkB quinase-β (IKK-β)51. Essa serina-quinase parti-cipa da via de transmissão do sinal de TNF-α e IL-1, importantes no desenvolvimento do processo inflamatório, que culmina com a regulação de fatores de transcrição, como o NF-κB.
NF-κB corresponde a uma família de fatores de transcrição celulares envolvidos na expressão de uma grande variedade de genes que regulam a resposta inflamatória52. NF-κB permanece seqüestrado no citoplasma por proteínas inibitórias, IkB, que são fosforiladas por um complexo de quinases conhecidas por IKK. IKK é composto de 2 quinases, IKK-α e IKK-β, as quais fosforilam IκB desencadeando a sua degradação e permitindo assim a translocação do NF-κB para o núcleo. A atividade quina-se de IKK é estimulada pelo TNF-α e pela hiperexpressão de MEKK1 e NIK; por outro lado, os agentes antiinflamatórios as-pirina e salicilato sódico inibem especificamente a IKK-β, evi-tando assim a ativação, pela NF-kB, de genes envolvidos na res-posta inflamatória (figura 4).
Para testar a hipótese de que a resistência à insulina pode en-volver a ativação induzida por lipídeos de uma cascata de serina-quinases envolvendo a IKK-β, Kim et al.53 estudaram a transmis-são do sinal de insulina em ratos durante clamps
euglicêmicos-hiperinsulinêmicos após infusão de lipídeos, antecedida ou não de
tratamento com salicilato. A infusão de lipídeos reduziu a captação de glicose estimulada por insulina e a ativação da PI 3-quinase associada ao IRS-1 no músculo esquelético, mas o pré-tratamento com salicilato evitou esses efeitos induzidos por lipídeos. Para exa-minar o mecanismo de ação do salicilato, o autor estudou os efei-tos da infusão de lipídeos na sinalização de insulina em camundon-gos “knockout” de IKK-β. Ao contrário da resposta observada no animal controle, o camundongo que não expressa IKK-β não apre-sentou a alteração na sinalização de insulina observada após a infu-são de lipídeos. Em resumo, altas doses de salicilatos e inativação da IKK-β evitaram a resistência à insulina induzida por lipídeos no músculo esquelético, bloqueando defeitos induzidos por lipídeos na sinalização e ação da insulina, e representam uma classe tera-pêutica potencial para diabete tipo 2.
sinalização intermediárias. Tal ativação, por sua vez, indiretamente aumenta o número de resíduos de serina e treonina fosforilados no IRS-1, transformando-o em uma proteína com ação inibitória sobre o sinal de insulina. Na presença de salicilatos, a atividade do IKK é inibida, reduzindo a fosforilação do IRS-1 em serina e treonina e permitindo que esse substrato seja mais fosforilado em tirosina, podendo se ligar e ativar a PI 3-quinase, iniciando vias de sinalização reguladoras do metabolismo54.
Recentemente Yuan et al.55 investigaram o efeito de altas do-ses de salicilatos na resistência à insulina de animais obesos (ca-mundongos ob/ob) e demonstraram uma melhora acentuada da resistência a esse hormônio, associada à redução dos níveis de AGL e triglicerídeos. Nesse mesmo estudo, o uso de outros antiinflama-tórios que inibem as cicloxigenases não alterou a sensibilidade à insulina, sugerindo que o efeito independe da inibição dessas enzi-mas. O efeito dos salicilatos parece ser conseqüência da inibição da serina-quinase IKK-β. Tais dados sugerem que pode ocorrer um fenômeno inflamatório (provavelmente subclínico) na patogê-nese da resistência à insulina, na obesidade e no diabete tipo 2, e a serina-quinase IKK-β aparece como uma molécula com grande potencial terapêutico para melhora da sensibilidade à insulina.
Perspectivas
Houve um progresso científico considerável na compreen-são dos mecanismos de ação da insulina e nas alterações molecu-lares que levam à resistência à insulina. No entanto, muitas lacu-nas permanecem. É necessário definir algumas das etapas das vias de transmissão do sinal de insulina, elucidar os mecanismos de inter-relação (“cross-talk”) com outros hormônios, determi-nar a suscetibilidade genética da resistência à insulina e as intera-ções entre os genes e o ambiente. Esses estudos irão propiciar novos “insights” em relação a diabete e resistência à insulina, talvez permitindo uma abordagem terapêutica individualizada, incluindo a prevenção dessas doenças.
VIAS DE COMUNICAÇÃO DO SINAL DE TNF-ααααα E IL-1
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