UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO
BIOLOGIA DE AGENTES INFECCIOSOS E PARASITÁRIOS
ASPECTOS BIOLÓGICOS E EPIDEMIOLÓGICOS DA CINOMOSE CANINA NA REGIÃO METROPOLITANA DE BELÉM/PA
MONIQUE ARAÚJO LUZ
2018
MONIQUE ARAÚJO LUZ
ASPECTOS BIOLÓGICOS E EPIDEMIOLÓGICOS DA CINOMOSE CANINA NA REGIÃO METROPOLITANA DE BELÉM/PA
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal do Pará como requisito parcial para obtenção do grau de Doutor em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários. Orientador: Prof. Dr. Evonnildo Costa Gonçalves
Belém-Pará 2018
MONIQUE ARAÚJO LUZ
ASPECTOS BIOLÓGICOS E EPIDEMIOLÓGICOS DA CINOMOSE CANINA NA REGIÃO METROPOLITANA DE BELÉM/PA
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal do Pará como requisito parcial para obtenção do grau de Doutor em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários.
Orientador: Prof. Dr. Evonnildo Costa Gonçalves Universidade Federal do Pará
Banca Examinadora: Profa. Dra. Elane Guerreiro Giese Universidade Federal Rural da Amazônia
Profa. Dra. Érika Renata Branco
Universidade Federal Rural da Amazônia
Profa. Dra. Hilma Lúcia Tavares Dias Universidade Federal do Pará
Prof. Dr. Luiz Fernando Almeida Machado Universidade Federal do Pará
AGRADECIMENTOS
Primeiramente a Deus por sempre se fazer presente em minha vida, me guiando e me dando forças para seguir em frente.
Aos meus pais, Miguel Tadeu Lopes Luz e Bolivan Mendes Araújo, e meus irmãos, Michelle Araújo Luz e Julio Thadeu Araújo Luz, por mesmo de longe me darem todo apoio e incentivo na minha formação.
Ao meu marido, companheiro e amigo, Jorge Matos de Loureiro Júnior por todo amor, carinho e dedicação e por aturar minhas crises de ansiedade, sempre me incentivando a seguir em frente.
A todos meus amigos que sempre estiveram presentes, mesmo quando ausentes, e que sempre me proporcionaram momentos de alegria e de descontração.
Ao meu orientador, Prof. Dr. Evonnildo Costa Gonçalves e a a toda equipe do Laboratório de Tecnologia Biomolecular (LTB) que me ajudou de alguma forma nesse estudo, em especial aos amigos Leopodo Moraes, Phamela Magalhães, Ana Larissa Alves e Bruna Moreira que sempre estiveram presentes nessa caminhada, alegrando os dias em que eu mais precisava.
Ao professor Ednaldo Da Silva Filho que disponibilizou grande parte do seu tempo me ajudando na finalização deste trabalho.
A todos as pessoas que contribuíram de forma direta e indireta para o desenvolvimento dessa pesquisa.
SUMÁRIO
RESUMO 3
ABSTRACT 4
1. INTRODUÇÃO 5
1.1. CONSIDERAÇÕES GERAIS 5
1.2. HISTÓRICO DA CINOMOSE CANINA 6
1.3. CARACTERIZAÇÃO DO VÍRUS E GENOMA 7
1.4. REPLICAÇÃO VIRAL DO VCC 10
1.5. TRANSMISSÃO, PATOGENIA E SINAIS CLÍNICOS 12
1.6. DIAGNÓSTICO DA CINOMOSE CANINA 17
1.7. TRATAMENTO DA CINOMOSE CANINA 19
1.8. PROFILAXIA E CONTROLE 20
1.8.1. Imunidade e vacinas contra o VCC 21
1.9. EPIDEMIOLOGIA DA CINOMOSE CANINA 24
1.10. DIVERSIDADE GENÉTICA DO VCC 27 2. OBJETIVOS 26 2.1. GERAL 29 2.2. ESPECÍFICOS 29 3. MATERIAL E MÉTODOS 27 3.1. AMOSTRAGEM 30 3.2. PROCESSAMENTO DO MATERIAL 30
3.2.1. Extração do genoma viral 30
3.2.2. Transcrição reversa 31
3.2.3. nested-PCR para o gene N do VCC 31
3.2.4. Análise dos fragmentos amplificados 32
3.2.5. nested-PCR para o gene H do VCC 32
3.2.6. Purificação, sequenciamento e caracterização molecular 33
3.3. ANÁLISES ESTATÍSTICAS 34
4. RESULTADOS 35
4.1 nested-PCR para o gene N do VCC 35
4.1.1. Detecção do VCC em cão assintomático 41
4.1.2. (Re) infecção com VCC associado a caso de TVT 42 4.1.3. Coinfecções de VCC com outros microrganismos infecciosos 43
4.2. nested-PCR para o gene H do VCC 43
4.3. Purificação, sequenciamento e caracterização molecular 44
5. DISCUSSÃO 49
6. CONCLUSÕES 59
RESUMO
A cinomose é uma doença infectocontagiosa grave de distribuição mundial, causada pelo vírus da cinomose canina (VCC), um membro da família Paramyxoviridae cujo gênero Morbillivirus engloba outros vírus importantes e intimamente relacionados. A vacinação é a medida profilática mais eficaz, ainda que casos de cinomose em animais vacinados sejam frequentemente relatados. O presente estudo teve como objetivo analisar os aspectos biológicos e epidemiológicos da cinomose canina na região metropolitana de Belém/PA, avaliar a prevalência da doença e os fatores de risco para sua ocorrência, bem como comparar as cepas obtidas na região com as cepas vacinais e com algumas já descritas em outros lugares do Brasil e do mundo. Foram analisadas 378 amostras de sangue de cães encaminhadas entre junho de 2014 a dezembro de 2016 ao projeto de extensão do Laboratório de Tecnologia Biomolecular (LTB) da Universidade Federal do Pará (UFPA). Foram realizados protocolos de nested-PCR para o gene N e para o gene H do VCC. Das 378 amostras analisadas, 86 (22,7%) foram positivas. Os sinais neurológicos foram os mais relatados, não havendo diferenças significativas entre o sexo, a raça e o status imunológico dos animais, no entanto, ocorrendo o inverso quanto a faixa etária destes e a sazonalidade do vírus. As amostras isoladas formaram dois grupos distintos separados do grupo das cepas vacinais, um somente com cepas do presente estudo e outro formado com cepas do Sul e Sudeste do Brasil.
ABSTRACT
Distemper is a serious, worldwide infectious and contagious disease caused by canine distemper virus (VCC), a member of the Paramyxoviridae family of the Morbillivirus family of other important and closely related viruses. Vaccination is the most effective prophylactic measure, yet cases of distemper in animals are still frequently reported. The objective of this study was to analyze the biological and epidemiological aspects of canine distemper in the metropolitan region of Belém, PA, to evaluate the prevalence of the disease and the risk factors for its occurrence, as well as to compare the obtained regional strain with the vaccine strains and with some already described in other places of Brazil and worldwide. A total of 378 blood samples from dogs were submitted between June 2014 and December 2016 and analyzed by the extension project of the Laboratory of Biomolecular Technology (LTB) of the Federal University of Pará (UFPA). Nested-PCR protocols were performed for the N gene and for the VCC H gene. Of the 378 samples analyzed, 86 (22.7%) were positive. Neurological signs were the most reported, and there were no significant differences between the sex, race and immunological status of the animals, however, the reverse of the age group and the seasonality of the virus occurred. The isolated samples formed two distinct groups separated from the group of the vaccine strains, one with the strains of the present study and another one formed with strains of the South and Southeast of Brazil.
1. INTRODUÇÃO
1.1. CONSIDERAÇÕES GERAIS
A Cinomose é uma doença viral multissistêmica, altamente contagiosa e potencialmente fatal, causada pelo vírus da cinomose canina (VCC), membro do gênero Morbillivirus, subfamília Paramyxovirinae, família Paramyxoviridae e ordem Mononegavirales (Amude et al., 2010; Maclachlan & Dubovi, 2011; Carvalho et al., 2012).
O gênero inclui outros vírus importantes e antigenicamente relacionados, como o vírus do sarampo (MV), vírus de peste bovina (RPV), vírus da peste dos pequenos ruminantes (PPRV), morbillivírus dos cetáceos (CeMV), vírus da cinomose focina (PDV) e o recente descoberto morbilivírus dos felinos (FeMV). Filogeneticamente, CDV e PDV são os mais estreitamente relacionados (Figura 1) (Radtanakatikanon et al.,2013; Macedo et al., 2015; Budaszewski & Von Messling, 2016).
A doença é de ocorrência mundial e pode causar surtos letais em canídeos domésticos e selvagens, além de uma ampla variedade de hospedeiros terrestres e aquáticos das famílias Procyonidae, Pinnipedia, Mustelidae, Mephitidae, Hyaenidae, Ailuridae, Ursidae e alguns Viverridae e Felidae (Martinez et al., 2008; Elia et al.,2008; Martella et al., 2008; Arns et al., 2012; Headley et al., 2012; Temilade et al., 2015).
Apesar da suscetibilidade de algumas espécies de felinos selvagens, os felinos domésticos parecem ser resistentes à infecção natural, no entanto, infecções experimentais resultam em soro conversão sem apresentação de sinais clínicos nesses animais (Martella et al., 2008; Carvalho et al., 2012).
O vírus é eliminado principalmente nas secreções oronasais dos animais infectados, mas todas as suas secreções podem carrear o agente, infectando os animais saudáveis quando estes entram em contato ou inalam esses fluidos contaminados. Animais de todas as idades podem ser acometidos pela doença, sendo os animais mais jovens e não vacinados os mais suscetíveis à infecção, com a morbidade e mortalidade
variando de espécie para espécie (Fisher et al., 2013; Freitas-filho et al., 2014; Temilade et al.,2015;).
A doença apresenta uma progressão variável, as vezes de forma inaparente, mas geralmente apresenta-se de forma aguda, atingindo os sistemas gastrointestinal, respiratório e frequentemente o sistema nervoso central (SNC) (Amude et al., 2010 Temilade et al.,2015). Os sinais clínicos se manifestam poucos dias após a infecção e variam de acordo com a virulência da cepa viral, das condições ambientais e da idade e status imunológico do hospedeiro (Amude et al., 2010; Lempp et al., 2014).
A erradicação do VCC é considerada impossível devido à sua ampla variedade de hospedeiros distribuídos mundialmente, portanto, o controle da doença se dá principalmente por meio da vacinação de cães susceptíveis (Beineke et al., 2009; Amude et al., 2010; Temilade et al.,2015).
Em 1950, vacinas com o vírus vivo atenuado (isto é, "vírus vivo modificado" [MLV] ou vacinas atenuadas) foram desenvolvidas a partir das cepas clássicas (Onderstepoort, Snyder Hill e Lederle) e desde então, têm sido amplamente utilizadas. No entanto, apesar do uso de estratégias de vacinação para seu controle, surtos de cinomose continuam acontecendo em diversas áreas geográficas, sendo considerada a doença infecciosa viral mais importante entre os cães e causadora das maiores taxas de mortalidade entre eles, ficando atrás apenas da raiva (Lednicky et al., 2004; Martella et al., 2008; Zhao et al., 2010; Panzera et al., 2012; Fischer et al., 2013).
Dada a grande severidade desta doença viral, a aceleração do seu diagnóstico para isolamento e tratamento dos animais infectados é de extrema importância, no entanto, alguns destes animais são assintomáticos ou apresentam sinais clínicos inespecíficos que se confundem com enfermidades causadas por outros agentes infecciosos virais e/ou bacterianos e dificultam o diagnóstico clínico da doença (Leisewitz et al., 2001; Amude et al., 2007; Beineke et al., 2009; Fisher et al., 2013).
Diante disto, algumas técnicas laboratoriais foram desenvolvidas e vêm sendo empregadas para a detecção do VCC em diversas amostras clínicas, tais como o isolamento viral, técnicas imunológicas e técnicas de biologia molecular, envolvendo principalmente a reação em cadeia da polimerase precedida de transcrição reversa (RT-PCR) (An et al., 2008; Wang et al., 2011; Fisher et al., 2013).
Figura 1- Árvore filogenética das diferentes espécies virais do gênero Morbillivirus com seus respectivos hospedeiros. Fonte: adaptado de Budaszewski & Von Messling, 2016.
1.2. HISTÓRICO DA CINOMOSE CANINA
A cinomose canina foi primeiramente documentada no Peru em 1746 como uma doença altamente contagiosa em cães. A partir de então a doença se disseminou pela Europa vindo a atingir os Estados Unidos da América (EUA) em 1767, quando um
grande número de cães morreu em virtude da enfermidade, não ficando esclarecido se a disseminação da mesma no país ocorreu através de cães infectados oriundos da Europa ou da América do Sul (Blancou, 2004).
A etiologia viral da cinomose foi proposta em 1905 pelo veterinário Francês Henri Carré, no entanto, essa teoria não foi cientificamente aceita na época e a Bordetella bronchiseptica foi apontada como o agente etiológico, uma vez que essa bactéria era comumente encontrada em cães com manifestações clínicas da doença. Em 1926 a etiologia viral foi finalmente confirmada pelo patologista Patrick Ladlaw e pelo veterinário George Dunkin e a Bordetella bronchiseptica passou a ser compreendida como causa de infecção bacteriana secundária (Appel & summers, 1999).
Durante a década de 40 houve a produção de vacinas de vírus inativados, porém, essas vacinas não tiveram grande eficácia no controle da doença, que já era tida como uma enfermidade fatal para os cães e comumente relatada em todo o mundo. A diminuição no número de casos de cinomose somente ocorreu nos anos subsequentes, com o aparecimento das vacinas de vírus vivo modificado (Appel & Summers, 1999; Baumann, 2004).
1.3.CARACTERIZAÇÃO DO VÍRUS E GENOMA
A família Paramyxoviridae, da ordem Mononegavirales, é subdividida em duas subfamílias, a Pneumovirinae e a Paramyxovirinae, nesta última está contido o gênero Morbillivirus, no qual inserese o vírus da cinomose canina (Canine distemper vírus -CDV), um vírus pleomórfico, com diâmetro variando de 150 a 250 nm (Lamb & Parks, 2007; Amude et al., 2010; Maclachlan & Dubovi, 2011; Carvalho et al., 2012).
Por se tratar de um vírus envelopado, a sua infectividade é destruída por solventes lipídicos, como clorofórmio e éter. Os vírus são inativados também por calor, radiação ultravioleta (UV), formalina, fenol, agentes oxidantes e solução de hipoclorito. São instáveis em pH acima de 10.4 ou abaixo de 4.4 e podem ser destruídos quando expostos a temperaturas de 50ºC a 60ºC por 30 minutos, sobrevivendo, porém, por semanas entre 0-4ºC e até por sete anos a temperaturas menores que -75ºC (Zee, 2003; Quinn et al., 2005; Greene & Appel, 2006).
O genoma do VCC é constituído por uma molécula de RNA fita simples de polaridade negativa, não segmentada, com aproximadamente 15.900pb. Possui seis
unidades transcricionais que codificam oito proteínas virais, sendo seis estruturais e duas não estruturais. Dentre as estruturais estão a proteína do nucleocapsídeo (N), a fosfoproteína (P), a proteína da matriz (M), a proteína de fusão (F), a hemaglutinina (H) e a grande proteína (L) (Lamb & Parks, 2007; Maclachlan & Dubovi, 2011; Budaszewski & Von Messling, 2016). A Figura 2 representa um esquema da estrutura e genoma de um morbilivírus.
Figura 2- Esquema da estrutura da partícula viral e organização do genoma de um morbilívirus. Adaptado de Budaszewski & Von Messling, 2016.
O genoma é delimitado pela extremidade 3` denominada líder, com aproximadamente 50 nucleotídeos que sinaliza para o complexo polimerase o local de início da transcrição ou replicação, e pela extremidade 5` chamada trailer, também composta por 50 nucleotídeos e que representa o final do genoma viral. Estas regiões
controle são extracistrônicas e também estão presentes entre as unidades transcricionais do vírus (Lamb & Parks, 2007; Budaszewski & Von Messling, 2016).
Quase todos os genes são monocistrônicos, exceto o gene P, que além da fosfoproteína (P) também codifica as duas proteínas não estruturais denominadas C e V, que são expressas pela sobreposição do quadro de leitura e pela edição do RNA co-transcricional, respectivamente (Budaszewski & Von Messling, 2016).
Nos vírus intactos a única estrutura visível por microscopia eletrônica (ME) é o envelope, que possui projeções de superfície (peplômeros) formadas pelas glicoproteínas hemaglutinina (H) e de fusão (F), medindo 12 a 15 nm de comprimento por 2 a 4 nm de largura, ambas desempenhando papel importante na patogenia das infecções (Messling et al., 2001; Brown et al., 2005; Lamb & Parks, 2007; Maclachlan & Dubovi, 2011).
O nucleocapsídeo, com simetria helicoidal simples, mede 600 a 800 nm de comprimento por 13 a 18 nm de diâmetro e é composto pelo genoma associado à nucleoproteína (N), à fosfoproteína (P) e à grande proteína (L), formando o complexo ribonucléico (RNP). Preenchendo o espaço entre o envelope e o nucleocapsídeo viral encontram-se múltiplas cópias da proteína da matriz, promovendo a estabilização do vírus (Lamb & Parks, 2007; Arns et al., 2012).
A hemaglutinina é responsável pela adsorção do vírus à célula hospedeira através da ligação à receptores celulares, tais como o CD150 (também conhecido com SLAM - molécula de sinalização para ativação linfocítica) e a nectina-4 (também conhecido como PVRL4 - poliovirus receptor-related 4 ou receptor relacionado a poliovirus 4) e desempenha papel importante na indução da imunidade específica pelo hospedeiro (Moss & Griffin, 2006; Sawatsky & Von Messling, 2010; Maclachlan & dubovi, 2011; Mühlebach et al., 2011; Noyce et al., 2011; Noyce et al., 2013).
O gene que codifica a proteína H é altamente variável e por essa razão tem sido alvo de estudos para avaliação de alterações genéticas entre os isolados de VCC. Como essa proteína desempenha um papel essencial no tropismo celular, variações antigênicas e de sequências podem afetar a virulência e a gama de hospedeiros do vírus (Pardo et al., 2005; McCarthy et al., 2007; Zhao et al., 2010; Denzin et al., 2013).
Após a ligação do vírus com os receptores celulares, a proteína F, uma glicoproteína do tipo II, promove a fusão do envelope viral com a membrana e permite a
entrada do nucleocapsídeo viral na célula, podendo também promover a formação de sincício (uma “célula gigante multinucleada”), por meio da fusão de membrana entre as células hospedeiras (Lamb et al., 2006; Moss & Griffin, 2006; Lamb & Parks, 2007; Zhao et al., 2014).
Essa proteína é sintetizada como um precursor inativo (F0) que precisa ser clivada por proteases presentes na célula do hospedeiro, processo essencial para a infectividade e fator determinante da patogenicidade (Lamb & Parks, 2007; Maclachlan & Dubovi, 2011). Isso ocorre no interior de vesículas do complexo de Golgi, nos estágios finais da replicação, originando as subunidades F1 e F2. A clivagem deficiente da F0 diminui a virulência da cepa viral, portanto, cepas que desempenham esse processo com mais eficiência tendem a ser mais virulentas e infecciosas (Arns et al., 2012).
A nucleoproteína (N) é uma proteína abundante e possui uma sequência nucleotídica altamente conservada. Desempenha um papel importante na replicação e transcrição, além de proteger o genoma através do empacotamento da cadeia de RNA nascente durante a replicação. Interações com a proteína da matriz (M) também têm sido observadas durante a montagem do vírion, demonstrando a participação da proteína N na morfogênese das novas partículas virais (Lamb & Kolakofsky, 2001; Arns et al., 2012).
A proteína M é a mais abundante do vírus e além de interagir com a nucleoproteína, interage também com o envelope e com as glicoproteínas H e F, desempenhando as funções de maturação e agrupamento das partículas virais e, além disso, é implicada também no controle do nível de síntese de RNA (Maclachlan & Dubovi, 2011; Arns et al., 2012).
A proteína L é a menos abundante do vírus (com aproximadamente 50 cópias) e a sequência de nucleotídeos do gene que a codifica é bastante conservada nos membros de uma mesma subfamília. Representa a subunidade catalítica da RNA-Polimerase dependente de RNA (RdRp), no entanto, somente se liga ao complexo ribonucleopreoteína (RNA:N) na presença da proteína P. Esta última regula a transcrição, replicação e a eficiência com que a nucleopreoteína se insere e monta os nucleocapsídeos (Moss & Griffin, 2006; Arns et al., 2012).
Embora as funções das proteínas não estruturais C e V não estejam totalmente esclarecidas, estudos in vitro demonstram que a primeira inibe seletivamente a síntese de RNA, auxiliando na transição da transcrição primária para a replicação do genoma viral, enquanto que a segunda possui influência na síntese de mRNA. Ambas também possuem participação na evasão da resposta imune inata pelo vírus (Arns et al., 2012).
1.4.REPLICAÇÃO VIRAL DO VCC
Como nos demais Mobillivirus a replicação do VCC ocorre no citoplasma da célula hospedeira. Após a ligação do vírus com receptores compatíveis na superfície celular e a fusão do envelope viral com a membrana plasmática da célula, ocorre a liberação do nucleocapsídeo intacto no citoplasma, dando início à transcrição viral. O receptor mais importante é o CD150, encontrado em macrófagos, linfócitos e células dendríticas, explicando o forte tropismo desse vírus por esses tipos celulares (Lamb & Parks, 2007; Maclachlan & Dubovi, 2011).
A transcrição é iniciada pela RNA polimerase viral com a formação de um RNA (+) intermediário seguido da cópia do genoma viral RNA (-), uma vez que esse vírus apresenta polaridade negativa. Os genes são transcritos a partir da extremidade 3`em seis mRNA individuais, seguindo a ordem que aparecem no genoma, por um mecanismo de síntese sequencial interrompida, devido a presença de uma região intergênica podendo desintegrar a polimerase (Lamb & Parks, 2007; Maclachlan & Dubovi, 2011).
Em cada gene há uma sequência de início de transcrição, que determina a adição da estrutura “quepe” no início do mRNA que será transcrito e, em cada junção gênica, a polimerase reconhece um sinal de terminação do gene (sequência de nucleotídeos específica) determinando a inserção da cauda poli A no final do mRNA, que é liberado após esse processo (Lamb & Parks, 2007).
Esse processo de terminação-reiniciação, em alguns casos, pode fazer com que a polimerase se desprenda do genoma não transcrevendo o gene seguinte, dessa forma a quantidade de mRNA individuais diminui com o aumento da distância da extremidade 3`do genoma, uma vez que os genes mais próximos dessa extremidade são transcritos em maior quantidade em relação aos da extremidade 5’ (Lamb & Parks, 2007; Maclachlan & Dubovi, 2011).
Todas as proteínas virais são traduzidas em ribossomos livres, com exceção das proteínas de superfície H e F que são sintetizadas no reticulo endoplasmático rugoso e posteriormente sofrem uma etapa final de processamento no complexo de golgi (Lamb & Kolakofsky, 2001; Lamb & Parks, 2007).
As etapas de transcrição e tradução prosseguem até ocorrer o acumulo de proteínas virais no citoplasma da célula infectada (Arns et al., 2012). Após a produção de certa quantidade de proteínas a polimerase não reconhece mais os sinais de início e de parada e cessa a transcrição dando início ao processo de replicação do genoma, amplificando consideravelmente a síntese de proteínas virais (Lamb & Parks, 2007; Arns et al., 2012; Maclachlan & Dubovi, 2011).
A montagem dos nucleocapsídeos ocorre ao mesmo tempo em que ocorre a síntese do RNA antigenômico e do RNA genômico e os RNAs virais somente são encontrados como nucleocapsídeos no interior da célula. Primeiramente ocorre a associação entre as proteínas N e o genoma seguido da adição do complexo L-P. Os nucleocapisídeos montados no citoplasma migram para a superfície celular se associando à membrana plasmática, onde são inseridas as glicoproteínas H e F transportadas em vesículas trans-Golgi (Lamb & Kolakofsky, 2001; Arns et al., 2012).
As moléculas de proteína M interagem com os nucleocapsídeos resultando na protusão e brotamento através da membrana plasmática da célula infectada, onde os vírions adquirem o envelope e são liberados (Arns et al., 2012). A Figura 3 ilustra um esquema de replicação do vírus da cinomose canina.
Figura 3 - Representação esquemática do ciclo replicativo do VCC. Adaptado de Moss & Griffin, 2006.
1.5.TRANSMISSÃO, PATOGENIA E SINAIS CLÍNICOS
A cinomose é uma enfermidade de evolução aguda ou subaguda, podendo também se manifestar de forma crônica. A excreção viral pode ocorrer nas fezes, saliva, urina e exudatos conjuntivais e nasais dos animais infectados, independente de manifestarem ou não sinais clínicos da doença. O VCC entra no novo hospedeiro pela via nasal ou oral, sendo a inalação de aerossóis com partículas virais a principal forma natural de infecção (Martella et al., 2008; Carvalho et al., 2012; Ke et al, 2015).
Assim como outros morbilívirus, o VCC tem um forte linfotropismo e é altamente imunossupressivo, devido a presença do receptor CD150 em vários tipos de células imunitárias. Esse receptor tem sua expressão aumentada nas células linfoides após a infecção pelo vírus, o que parece ser uma estratégia para intensificar a sua amplificação no hospedeiro (Beineke et al., 2009; Maclachlan & Dubovi, 2011).
A infecção inicia-se com a replicação viral em tecidos linfoides do trato respiratório superior. Após esta replicação local, entre o quarto e sexto dia, ocorre a viremia primária e o patógeno é então disseminado pelo sistema linfático e circulatório para tecidos hematopoiéticos e linfoides distantes, como baço, timo, linfonodos e medula óssea, além de se disseminar para tecidos linfáticos associados ao trato gastrointestinal e para macrófagos teciduais, tais como as células de Kupffer no fígado (Baumann, 2004; Vandevelde & Zurbriggen, 2005; Beineke et al., 2009; Maclachlan & Dubovi, 2011; Greene, 2012).
Nessa fase ocorre o primeiro pico febril devido à alta taxa de multiplicação viral nos órgãos linfoides, bem como uma leucopenia levando a um quadro de imunossupressão, o que torna o animal menos capaz de combater tanto a infecção primária pelo vírus quanto infecções bacterianas secundárias (Kerdiles et al., 2006; Carvalho et al., 2012).
Os sinais clínicos iniciais observados, além do pico febril, são letargia, desidratação, descarga nasal, tosse, anorexia e perda de peso. Animais capazes de montar uma resposta imune rápida e efetiva conseguem eliminar o vírus e se recuperar completamente, no entanto, uma falha na resposta imune do hospedeiro promove uma viremia secundária ocorrendo entre o sexto e o nono dia da infecção (Vandevelde & Zurbriggen, 2005; Arns et al., 2012) e coincidindo com o segundo pico febril (Maclachlan & Dubovi, 2011).
A viremia secundária resulta na infecção de vários tecidos epiteliais e mesenquimais, assim como do SNC. Neste estágio, o VCC infecta principalmente as mucosas conjuntival, nasal, traqueal, bronquial e dos tratos urinário, reprodutor e gastrointestinal, e, adicionalmente, pode ser encontrada nos queratinócitos, fibroblastos, trombócitos, diferentes subconjuntos de células linfóides e células endoteliais de vários parênquimas (Beineke et al., 2009; Carvalho et al., 2012).
Nessa fase, além de anorexia, conjuntivite e depressão, ocorrem sinais relacionados ao acometimento do trato gastrointestinal e à inflamação do trato respiratório superior, como vômito, diarreia aquosa, descarga nasal serosa ou mucopurulenta, tosse produtiva, bronquite e pneumonia intersticial. O acometimento dermatológico é caracterizado por pústulas abdominais e hiperqueratose do focinho e das almofadas plantares (Maclachlan & Dubovi, 2011; Arns et al., 2012).
O VCC promove a fusão das células adjacentes, permitindo que o genoma viral se espalhe de célula a célula sem nunca ser exposto a mediadores imunológicos do hospedeiro, num processo importante para a propagação viral, principalmente dentro do SNC (Murphy et al., 1999).
A infecção do SNC ocorre de forma tardia e apenas naqueles animais que não desenvolvem resposta imune protetora suficientemente rápida para evitar essa propagação (Maclachlan & Dubovi, 2011).
O vírus chega ao cérebro através do líquido cefalorraquidiano ou através das células mononucleares infectadas que atravessam a barreira hematoencefálica (Vandevelde & Zurbriggen, 2005) e a infecção dos neurônios e células gliais também pode ocorrer por meio do receptor nectina-4, independente de CD150 (Pratakpiriya et al., 2012).
Embora, na maioria dos casos, os cães com comprometimento nervoso apresentem sinais multifocais, em outros a doença pode apresentar iníco agudo com sinais nervosos focais, o que pode confundir o clínico veterinário (Amude et al., 2010)
O VCC pode afetar tanto a matéria branca quanto a matéria cinzenta do SNC, desse modo vários sinais neurológicos podem ser observados, incluindo mudanças de comportamento, convulsões, sinais cerebelares e vestibulares, déficits visuais, paresia, paralisia, fraqueza muscular, tremores e mioclonias. Convulsões e mioclonias são alterações tipicamente relacionadas a matéria cinzenta, enquanto déficits visuais e diferentes formas de comprometimento motor são sinais principalmente de disfunções da matéria branca (Martella et al., 2008; Maclachlan & Dubovi, 2011).
As mioclonias já foram consideradas patognomônicas da cinomose canina, no entanto, um diagnóstico clínico baseado nessas manifestações deve ser feito com cautela, uma vez que as mioclonias são comumente relatadas em outras desordens
inflamatórias do SNC, embora bem menos frequentes (Jones et al., 2000; Koutinas et al., 2002; Amude et al., 2010).
Um resultado raro de infecção por VCC é a encefalomielite crônica de cães adultos, denominado encefalite do cão velho (ODE), apresentando-se como um desarranjo cortical progressivo com uma vasta gama de sinais clínicos. As lesões frequentemente associadas são encefalite linfoplasmocitária parênquimal e perivascular multifocal nos hemisférios cerebrais (Martella et al., 2008; Maclachlan & Dubovi, 2011).
A ODE parece se desenvolver em cães após a infecção aguda por VCC, quando o vírus adquire a capacidade de persistir nos tecidos nervosos. Os mecanismos moleculares que desencadeiam a persistência de VCC no SNC não são claros, no entanto, alterações nas proteínas H, F e M, ou em suas interações, podem afetar a fusogenicidade do VCC in vitro e provavelmente estão envolvidos na gênese da doença (Plattet et al., 2005; 2007).
O período de incubação da cinomose pode variar de 1 a 4 semanas, com as manifestações clínicas e o curso da enfermidade variando de acordo com a amostra viral, idade e status imunológico do animal afetado, além da localização das lesões e das complicações causadas por infecções bacterianas secundárias (Martella et al., 2008).
1.6. DIAGNÓSTICO DA CINOMOSE CANINA
O diagnóstico da cinomose geralmente baseia-se nos sinais clínicos típicos da doença em um cão jovem (2-6 meses) que tenha um histórico de vacinações inadequadas e possibilidades de exposição ao vírus. Portanto, identificar esses sinais continua a ser o passo inicial e mais importante de diagnóstico, uma vez que a doença geralmente tem um prognóstico ruim e tem um elevado potencial infeccioso, sendo preferível a confirmação ante-mortem (Arns et al., 2012).
No entanto, por possuir sintomas inespecíficos, o diagnóstico clínico confiável continua a ser bastante difícil e o diagnóstico diferencial deve ser realizado para outras enfermidades como tosse dos canis, hepatite canina, parvovirose, coronavirose, leptospirose e outras doenças neurológicas como toxoplasmose, neosporose, raiva e intoxicação por chumbo e (Tilley & Smith, 2008; Amude et al.,2010).
O VCC deve ser considerado o agente etiológico em qualquer filhote com doença febril e sinais multissistêmicos, bem como na ocorrência de lesão cutânea, doença respiratória e digestiva em cães jovens, associada ou não com sinais neurológicos sendo difícil o diagnóstico clínico em cães sem sinais sistêmicos precedentes ou concomitantes (Tilley & Smith, 2008; Arns et al., 2012)
Os exames hematológicos comumente revelam linfopenia durante a fase inicial da infecção, monocitose, trombocitopenia e anemia (Greene & Appel, 2006; Tilley & Smith, 2008). A presença de inclusões descritas por Lentz em 1907 e Sinigaglia em 1912, denominadas Inclusões de Lentz ou de Sinigaglia-Lentz, não apresentam a mesma frequência nos diversos tecidos, além de terem seu número reduzido em linfócitos e principalmente em neutrófilos e hemácias, sendo, portanto, necessária precaução para confirmação do diagnóstico de cinomose baseado na presença dessas inclusões (Corrêa, 1992).
A análise do líquido cefalorraquidiano (LCR) pode ser muito útil e baseia-se no aumento de proteínas e pleocitose com predomínio de linfócitos, que são achados não específicos, mas que sugerem etiologia viral, como o VCC. No entanto, durante a fase aguda desmielinizante da doença, as reações inflamatórias são escassas e o teor de proteínas e de células pode estar dentro da normalidade (Amude et al., 2006).
O isolamento viral representa a metodologia preferencial, uma vez que amostras de tecidos ou de secreções dos animais infectados são introduzidos em células permissivas ao VCC e após determinado período de incubação, é observado o efeito citopático (ECP), caracterizado pela formação de sincícios, fornecendo material suficiente para diversas análises, como sorológicas, morfológicas e moleculares. No entanto, essa técnica pode se tornar demorada e difícil de ser utilizada para o diagnóstico de rotina (Lamb & Kolakofsky, 2001; Fisher et al., 2013).
A avaliação sorológica não tem sido útil no diagnóstico de cinomose, uma vez que altos títulos de anticorpos anti-VCC não diferenciam infecção natural de imunidade passiva adquirida pela vacinação e os baixos títulos podem ser decorrentes às propriedades imunossupressoras do VCC (Tilley & Smith, 2008).
Dentre os testes sorológicos, a imunofluorescência direta ou indireta, a imunoperoxidase, o ensaio imunoenzimático (ELISA), a soroneutralização e a imunohistoquímica são os mais comumente utilizados (Macedo et al., 2015).
Um kit comercial de ensaio imunocromatográfico para detecção da proteína F do VCC é utilizado em clínicas e consultórios veterinários a partir de amostras de secreção ocular (conjuntiva), secreção nasal (mucosa), saliva, urina, soro, plasma ou líquor. (Curti et al., 2012).
Esse kit oferece resultado rápido, seguro, com leitura visual de fácil interpretação e pode ser utilizado em cães vacinados desde que seja respeitado o intervalo de 15 dias entre a vacinação e a sua realização, período em que os antígenos virais da vacina não são mais detectados, evitando assim um resultado falso-positivo (Curti et al., 2012).
Além disso, diferentes protocolos de RT-PCR foram desenvolvidos para a detecção de VCC em amostras biológicas de cães com suspeita clínica de cinomose (Frisk et al., 1999; Gebara et al., 2004; Shin et al., 2004; Castilho et al., 2007; Arns et al., 2012; Fisher et al., 2013; Macedo et al., 2015).
Estes ensaios são direcionados ao gene da nucleoproteína (N), que é altamente conservado e dessa forma parece ser o melhor alvo para a amplificação de todas as espécies de VCC (Macedo et al., 2015).
Os três principais esquemas de amplificação descritos como ferramentas de diagnóstico práticas, são: RT-PCR com eletroforese, nested RT-PCR com eletroforese e RT-PCR em tempo real (Fisher et al., 2013).
O protocolo de nested RT-PCR é o mais utilizado por fornecer maior positividade em todas as amostras testadas, quando comparada a técnica de RT-PCR (Shin et al., 2004). Do mesmo modo, a RT-PCR em tempo real demonstra alta sensibilidade e é capaz de quantificar as partículas virais nas amostras clínicas dos cães infectados (Elia et al., 2006; 2008; Tozato et al., 2016).
1.7.TRATAMENTO DA CINOMOSE CANINA
Não há nenhum tratamento antiviral eficaz contra a cinomose e, portanto, comumente se realiza um tratamento sintomático e de suporte dos animais infectados. (Baumann, 2004; Martella et al., 2008). Antes de dar início à terapia, os proprietários dos animais devem ser esclarecidos sobre a natureza infecciosa da doença, seu prognóstico e a possibilidade do desenvolvimento de sinais neurológicos (Leisewitz et al., 2001).
Devido à perda de líquidos causada pelos sinais clínicos gastrointestinais, é necessária a fluidoterapia parenteral para o equilíbrio de fluidos e eletrólitos, incluindo o uso de antieméticos e antidiarreicos, além da restrição de alimentos para redução do trânsito intestinal e irritação da mucosa. Antibióticos de amplo espectro também devem ser utilizados para o controle das infecções bacterianas secundárias que são frequentes em animais imunossuprimidos (Sherding, 2003; Martella et al., 2008).
Como os macrófagos e seus produtos são importantes na indução da destruição do tecido nervoso, antioxidantes como vitamina C e vitamina E podem ser administrados conjuntamente e para a redução de um possível edema cerebral, pode-se utilizar corticosteroides, como a dexametasona, por via intravenosa (Baumann, 2004; Vandevelde & Zurbriggen, 2005).
Animais que se apresentam com quadro neurológico podem receber anticonvulsivantes e relaxantes musculares como fenobarbital e diazepam, no entanto, na encefalite multifocal progressiva causadora de tetraplegia, semicoma ou outras alterações que comprometam a qualidade de vida do animal, a eutanásia é recomendada (Leisewitz et al., 2001; Sherding, 2003).
No mais, bons cuidados de enfermagem são importantes, como manter o animal quente e seco e realizar a limpeza de secreções nasal e oculares. Tratamentos homeopáticos também já foram descritos, no entanto sem fundamentação científica (Leisewitz et al., 2001).
1.8. PROFILAXIA E CONTROLE
Devido à distribuição mundial do VCC e a existência de uma grande diversidade de hospedeiros susceptíveis, a eliminação do vírus se torna praticamente impossível, sendo a imunização através da vacinação a única medida profilática eficaz, ainda que as medidas de higiene clássicas devam ser aplicadas em paralelo (Gencay et al., 2004; Amude et al., 2010; Temilade et al.,2015).
Ainda assim o controle do vírus se torna difícil devido a cobertura vacinal ser insuficiente em diversas regiões menos desenvolvidas, fato esse que além de estar relacionado com a ampla gama de hospedeiros susceptíveis, está relacionado também com o tamanho da população canina, o grande número de cães não domiciliados e o
pequeno volume de doses vacinais vendidas anualmente nessas regiões (Arns et al., 2012).
Embora seja difícil obter números precisos, mesmo nos países desenvolvidos estima-se que apenas 30-50% da população de animais de estimação seja vacinada, e este valor é significativamente menor nas nações em desenvolvimento. A vacinação individual dos animais de estimação é importante, não só para proteger o indivíduo, mas para reduzir o número de animais suscetíveis na população regional e, desse modo, a prevalência da doença (Day et al.,2016)
No entanto, mesmo a vacinação sendo o meio mais seguro de diminuir o núrmero de casos de cinomose, não se deve esquecer que a vacina não é 100% eficaz em 100% dos animais e que em indivíduos que apresentam sinais clínicos sugestivos de infecção por VCC, a doença não pode ser excluída com base apenas em um histórico adequado de vacinação (Leisewitz et al., 2001).
1.8.1. Imunidade e Vacinas contra o VCC
A proteção contra infecção natural durante as primeiras semanas de vida, quando o sistema imune do animal ainda não está perfeitamente capacitado para suportar uma infecção por um vírus altamente virulento e patogênico, é dada pela transferência passiva de imunoglobulinas (Hass et al., 2008).
Apenas 3% dos anticorpos maternos contra o vírus da cinomose são transferidos através da placenta e 97% através do colostro, resultando em um titulo inicial no recém-nascido normalmente igual a 77% do titulo da mãe. Há uma variação individual no nível de proteção, dependendo da imunidade materna (título de anticorpos) e da quantidade de colostro ingerido pelo filhote (Biazzono et al., 2001; Monti, 2004).
A duração da imunidade adquirida passivamente é de cerca de nove a doze semanas, havendo baixa significância da sexta à sétima semana de vida, ou duração maior, com níveis de anticorpos detectáveis até a 12ª ou 14ª semana de idade. Quando o nível de anticorpos atinge o limiar mínimo, os cães se tornam susceptíveis à infecção natural (Martela et al., 2008)
Nessa fase a proteção contra a enfermidade pode ser obtida mediante a utilização de vacinas que possuam adequada capacidade imunogênica e gerem uma combinação de respostas imunológica humoral e celular (Hass et al., 2008).
As vacinas contra o VCC, assim como aquelas que conferem proteção contra a infecção pelo adenovírus canino (CAV) e o parvovírus canino (CPV), são condiseradas pelo Grupo de Diretrizes de Vacinação (VGG) da Associação Veterinária Mundial de pequenos animais (WSAVA) como vacinas essenciais, ou seja, aquelas que todos os cães em todo o mundo devem receber rotineiramene, nos intervalos recomendados, para fornecer proteção por toda a vida contra doenças infecciosas de significância global (Day et al., 2016)
A partir da década de 1950, vacinas MLV foram desenvolvidas com as cepas clássicas de VCC causando uma drástica redução no impacto da cinomose na população canina (Martella et al., 2008).
As vacinas MLV estimulam tanto a resposta imune celular quanto a humoral e se tornaram atenuadas após passagens seriadas em cultivos celulares (Leisewitz et al., 2001; Valli et al., 2010).
Esses organismos atenuados possuem reduzida virulência, porém estão intactos e viáveis e promovem imunidade induzindo uma baixa infecção ao se replicarem dentro do animal, sem produzir patologia tecidual significativa ou sinais clínicos de doença infecciosa (Day et al., 2016).
A maioria das vacinas contra cinomose comercializadas, tanto em clínicas veterinárias quanto em lojas de produtos agropecuários, possuem as cepas clássicas atenuadas Onderstepoort (mais utilizada), Snyder Hill e Lederle (Martella et al., 2008). A cepa Rockborn ainda é encontrada em algumas formulações no mercado, apesar de relatos de reter patogenicidade (Martella et al., 2011).
Embora as vacinas MLV sejam seguras e eficazes em cães, podem se tornar perigosas para uma variedade de animais selvagens de vida livre ou de cativeiro, pois mesmo atenuadas podem permanecer patogênicas para as espécies altamente suscetíveis à infecção, com risco de causar doença induzida pela vacinação. Para a imunização de animais de zoológico, vacinas inativadas foram utilizadas, no entanto demonstrando baixa eficácia (Maclachlan & Dubovi, 2011).
Para atender a essa necessidade Vacinas recombinantes contra VCC (rVCC) utilizando poxvírus aviário como vetor, os quais induzem a expressão das proteínas H e F da cepa Onderstepoort foram desenvolvidas e estão disponíveis comercialmente (Maclachlan & Dubovi, 2011).
Elas são consideradas seguras e eficazes, pois o vírus não replica eficientemente em linfócitos e no SNC de mamíferos e não há risco de reversão à virulência (Welter et al., 2000; Arns et al., 2012).
Desde 1950, são utilizadas as mesmas cepas vacinais nas formulações das vacinas atualmente comercializadas e a incidência da doença em todo o mundo parece ter aumentado nas últimas décadas, com muitos relatos de episódios de infecção em animais vacinados sugerindo o surgimento de VCCs com diferentes propriedades antigênicas das cepas vacinais (Parks et al., 1992; Curran et al., 1993; Yoshida et al.,1998; Castilho et al, 2007; Calderon et al., 2007; Sarute et al., 2011; Fisher et al., 2013)
Isso indica que esses cães que foram infectados, mesmo protegidos pelas vacinas atenuadas, podem ter sido contaminados mediante a exposição de um tipo selvagem de VCC, levantando a dúvida de se as vacinas atuais protegem efetivamente os cães contra estirpes geneticamente divergentes das estirpes vacinais, ou não (Si et al., 2010; Sarute et al., 2011).
Apesar dos diversos relatos publicados de doença em cães vacinados, ainda não está esclarecido se as falhas vacinais são decorrentes de baixa reatividade cruzada entre as cepas atenuadas e as cepas de campo circulantes, ou devido a falhas em protocolos vacinais e/ou armazenamento dos produtos (Budaszewski et al., 2016).
Animais vacinados com vacina MLV desenvolvem forte resposta humoral e celular de longa duração, semelhante à infecção natural, e estão protegidos contra o desafio por pelo menos 3-4 anos, sendo que 100% dos animais sobrevivem ao desafio e 90% não desenvolvem sinais clínicos de cinomose (ABDELMAGID et al., 2004; GORE et al., 2004) e segundo Day et al. (2016), quando administrada a um animal que não possui anticorpos derivados da mãe (MDA), geralmente induz proteção com uma dose única.
Resquícios da imunidade passiva interferem na vacinação dos animais, por ser o antígeno vacinal neutralizado pelos anticorpos circulantes que bloqueiam a replicação
deste no organismo hospedeiro, condição considerada essencial para a adequada resposta imune (Biazzono et al., 2001). Os filhotes com baixo MDA podem ficar vulneráveis (e capazes de responder à vacinação) em uma idade mais precoce, enquanto que outros possuem MDA em títulos tão altos que são incapazes de responder à vacinação até ≥12 semanas de idade (Day et al., 2016).
Como na prática é impossível determinar quando isto ocorre, nenhuma política de vacinação primária única cobrirá todas as situações possíveis e, portanto, o VGG recomenda a vacinação inicial dos cães às 6-8 semanas de idade e então a cada 2-4 semanas até as 16 semanas de idade ou mais. De acordo com esta recomendação, quando a vacinação é iniciada às 6 ou 7 semanas de idade, uma série de quatro vacinas essenciais primárias seria administrada com um intervalo de 4 semanas, mas somente três seriam necessárias com início às 8 ou 9 semanas de idade e intervalo similar de 4 semanas (Day et al., 2016).
Assim, assegura-se que o filhote receba pelo menos uma dose vacinal em uma idade em que a imunidade materna é insuficiente para impedir a imunização ativa. A primovacinação com qualquer agente infeccioso antes das 6 semanas de idade, mesmo na ausência de imunidade passiva, não é recomendada devido à imaturidade imunológica (Welborn et al., 2011).
A prática de revacinação anual foi estabelecida a mais de 30 anos atrás e não é de hoje que esse protocolo vem sendo questionado. Para alguns pequisadores a vacinação, apesar de fundamental, não é um procedimento inócuo, tem riscos inerentes e pode provocar reações adversas no animal. O aumento da incidência de algumas doenças imunomediadas levou a se suspeitar da existência de uma ligação entre a vacinação frequente e a ocorrência de problemas imunitários tais como: alergias, poliartrite, doenças da tiróide, reacções de hipersensibilidade, anemia hemolítica, trombocitopénia, osteopatias, etc. (Monti, 2004; Almendra et al., 2005).
Dessa forma, atualmente o VGG recomenda que após a última da série primária de vacinas dos filhotes seja dado um reforço com 26 ou 52 semanas e as revacinações subsequentes sejam dadas em intervalos de três anos ou mais e não mais anualmente como era de costume no passado, uma vez que a duração da imunidade (DI) é de vários anos, podendo durar até o fim da vida do animal de estimação (Day et al., 2016).
Um cão adulto que tenha recebido uma série completa de vacinações essenciais quando filhote, incluindo um reforço às 26 ou 52 semanas, mas que pode não ter sido vacinado regularmente quando adulto, requer apenas uma única dose de vacina essencial para reforçar a imunidade. Similarmente, um cão adulto (ou filhote com mais de 16 semanas de idade) adotado, com histórico de vacinação desconhecido, requer apenas uma única dose de vacina essencial para gerar uma resposta imune protetora (Day et al., 2016).
Existem várias razões, além da anulação da vacina por MDA e diferenças genéticas entre cepas circulantes e cepas utilizadas em vacinas, para as falhas vacinais ocorrerem, que incluem desde problemas na aplicação, refrigeração incorreta, ineficácia da vacina e resposta imune antiviral inadequada, imunocomprometimento do cão por parasitas internos e estresse (Welborn et al., 2011).
1.9. EPIDEMIOLOGIA DA CINOMOSE CANINA
A cinomose canina é uma doença infectocontagiosa de distribuição mundial relevantemente importante, uma vez que resulta em alta mortalidade dos animais infectados (30 a 70%), só perdendo em gravidade para a raiva (Swango, 1997; Lamb & Parks, 2007; Alcade et al., 2013; Ke et al., 2015; Temilade et al., 2015).
Acomete principalmente cães domésticos e tornou-se relativamente rara em muitos países desenvolvidos devido à vacinação, no entanto, apesar da extensa vacinação em muitas regiões continua a ser uma das principais doenças em cães, com relatos de infecção tanto em animais vacinados e não vacinados em países desenvolvidos ou em desenvolvimento (Greene & Appel, 2006; Lan et al., 2006; Larson & Schultz, 2006; Calderon et al., 2007; Elia et al., 2008; Simon-Martınez et al., 2008; Amude et al., 2010; Martella et al., 2010; Woma et al., 2010; Zhao et al., 2010; Maclachlan & Dubovi, 2011; Panzera et al., 2012; Panzera et al., 2014; Temilade et al., 2015).
A constante urbanização com a consequente fragmentação de habitats promoveu a aproximação de animais selvagens com os animais domésticos, que são potenciais reservatórios de agentes patogênicos e, dessa forma, o vírus vem se disseminando em
um amplo espectro de hospedeiros no chamado efeito spill-over (Sherding, 2003; Medina-Vogel, 2010; Headley et al., 2012; Megid et al., 2013).
O efeito de spill-over é caracterizado como a transmissão de agentes infecciosos de animais de reservatório (espécies mais frequentemente domesticadas) para espécies selvagens simpatizantes e freqüentemente resulta em doenças infecciosas emergentes que podem ser fatais para novos hospedeiros e colocar em risco espécies ameaçadas de extinção (Headley et al., 2012).
Com isso, o número de relatos da infecção por VCC em hospedeiros não concencionais vêm aumentando em todo o mundo e além da infecção em cães domésticos, o vírus tem sido isolado em outros membros da família Canidae, bem como em membros das famílias Procyonidae, Pinnipedia, Mustelidae, Mephitidae, Hyaenidae, Ailuridae, Ursidae, Viverridae, Tayassuidae, Phocidae, em alguns primatas não-humanos (Cercopithecidae) e em felídeos selvagens (Felidae) (Greene & Appel, 2006; Elia et al., 2008; Megid et al ., 2009; Megid et al., 2010; Quiu et al., 2011; Megid et al., 2013).
Embora a doença já tenha sido relatada em grandes felinos, o vírus ainda não foi detectado em gatos domésticos. No entanto, esses animais já foram infectados experimentalmente, resultando em soroconversão, mas não em doença clínica (Martella et al., 2008; Carvalho et al., 2012).
No Brasil o VCC já foi encontrado infectando lobo-guará (Chrysocyon brachyurus), furão (Galictis vittata), cachorro-do-mato (Cerdocyon thous) graxaim-do-campo (Pseudalopex gymnocercus), raposa do campo (Lycalopex vetulus), onça-pintada (Panthera onca) puma (Puma concolor) e jaguatirica (Leopardus pardalis) (Rego et al., 1997; Nava et al., 2008; Megid et al., 2009; 2010; 2013; Hübner et al., 2010)
Como reservatórios virais, os cães domésticos representam um risco significativo para as espécies de animais selvagens livres ou de cativeiro por causa da sua abundância e capacidade de percorrer longas distâncias (Fiorello et al., 2006).
Os cães sem raça definida (SRD) são frequentemente associados com a disseminação viral, o que está diretamente relacionado a seu estilo de vida, pois são mais propensos a vagarem pelas ruas em zonas urbanas e semi rurais, têm status vacinal desconhecido, apresentando maiores chances de entrarem em contato com o patógeno
proveniente de outros cães já contaminados, além de que, os cães de raça pura são mais rigorosamente vacinados contra o VCC do que os sem raça definida (Headley et al., 2012; Freitas-Filho et al.,2014).
A capacidade do vírus de passar de hospedeiro para hospedeiro é considerada como uma das causas para o sucesso da sua disseminação, sendo caracterizada como uma doença enzootica em vários países e endêmica no Brasil (Fiorello et al., 2006).
No Brasil a epidemiologia da cinomose canina ainda é pouco estudada, porém, casos da doença vem sendo frequentemente relatados em várias regiões do país, embora o desenvolvimento de estudos epidemiológicos e filogenéticos se concentrem na sua grande maioria nas regiões sul e sudeste (Headley & Graça, 2000; Borba et al., 2002; Gebara et al., 2004; Amude et al., 2006; 2007; Castilho et al., 2007; Negrão et al., 2013; Budaszewski et al., 2014).
A doença atinge animais de qualquer idade, raça e sexo, no entanto filhotes entre três a quatro meses de idade são mais acometidos, devido ao declínio da taxa de anticorpos maternos (Sherding, 2003; Baumann, 2004; Martella et al., 2008).
Apesar de ocorrer em qualquer época do ano, estudos anteriores já demonstraram uma tendência sazonal da doença, com o maior número de casos ocorrendo no inverno (Borba et al., 2002; Greene & Appel, 2006). Dados obtidos aqui na cidade de Belém/PA demonstraram que o número de casos foi mais acentuado durante o período frio, úmido e chuvoso (Guedes et al., 2009).
Embora a influência que as variações sazonais exercem na infecção por VCC ainda não estejam totalmente claras, essa ocorrência maior durante os meses frios pode estar relacionada a um ambiente mais propício para a manutenção e sobrevivência do vírus, facilitando a infecção dos hospedeiros susceptíveis (Headley & Graça, 2000; Borba et al., 2002; Greene & Appel, 2006; 2012).
1.10. DIVERSIDADE GENÉTICA DO VCC
A análise das sequências de diferentes genes tem sido realizada para caracterizar as cepas de VCC circulantes em várias regiões do mundo, sendo notável na literatura que a maioria das cepas atualmente caracterizadas são geneticamente divergentes daquelas comumente utilizadas na produção de vacinas comercializadas mundialmente (Pardo et al., 2005; Castilho et al., 2007; Demeter et al., 2010; Zhao et al., 2010;2014;
Martella et al., 2011; Radtanakatikanon et al., 2013; Sarute et al., 2013; Budaszewski et al., 2016).
Algumas variações do gene N entre isolados de VCC já foram observadas, não obstante ao fato de que essa proteína compõe a região conservada do genoma do VCC, levando-se a acreditar que maiores polimorfismos podem ser encontrados em genes mais variáveis, tais como os genes H e F (Blixenkrone-Moller et al., 1992; Sarute et al., 2011).
O gene H é o mais amplamente utilizado porque tem a maior variabilidade dentro do genoma do VCC, com aproximadamente 10% de variação nas sequências de seus aminoácidos). Sua análise permitiu identificar linhagens (genótipos) geográficas proporcionando avanços importantes para o conhecimento da evolução do VCC em todo o mundo (Bolt et al., 1997; Martella et al., 2006; Kapil et al., 2008; Panzera et al., 2014; Budaszewski et al., 2016).
O termo genótipo foi usado no agrupamento de VCCs, mas uma análise formal ainda não foi publicada, sendo as estirpes que apresentam mais de 95% de homologia de aminoácidos consideradas pertencentes ao mesmo genótipo (Mochizuki et al., 1999).
Análises filogenéticas das cepas VCC circulantes na América do Sul já foram realizadas anteriormente, visando o estabelecimento dos padrões evolutivos do vírus na região. Os primeiros estudos realizados no Brasil, Argentina e Uruguai revelaram que as cepas de campo diferiram claramente em relação às cepas vacinais (Saito et al., 2006; Calderón et al., 2007; Sarute et al., 2011).
Existe apenas um sorotipo de VCC e, até onde se tem conhecimento, as análises filogenéticas baseadas no gene H permitiram a definição de pelo menos 15 genótipos separados de acordo com a região geográfica de origem (Martella et al., 2006; Calderón et al., 2007; Panzera et al., 2012; Woma et al., 2010). Desses, quatro estão circulantes na América do Sul: EU1/SA1 (formado por cepas argentinas, uruguaias e brasileiras), SA2 (distribuído exclusivamente na Argentina), SA3 e SA4, onde estão agrupadas cepas equatorianas e colombianas, respectivamente (Panzera et al., 2014).
Segundo relatos anteriores, todas as cepas brasileiras de cães domésticos, que foram caracterizadas filogeneticamente, pertencem à linhagem EU1/SA1. Embora esta linhagem tenha sido anteriormente descrita na Europa, não é possível determinar a direção do fluxo genético entre os dois continentes. No entanto, a alta homologia
genética entre a as estirpes europeias e sul-americanas é indicativo de um ancestral comum (Budaszewski et al., 2014; Panzera et al., 2014).
Budaszewski et al. (2014), analisando o genótipo EU1/SA1 separadamente, sugeriram a sua divisão em oito sub-genótipos distintos (A-H), definidos com base nas propriedades filogenéticas da sequência neocleotídica do gene H. Classificação que, segundo os autores, não havia sido sugerida previamente.
Resumindo, os genótipos circulantes atualmente em todo o mundo são: America-I (cepas vacinais clássicas), America-II, America-III, America-IV, Asia-I, Asia−II, Asia-III, Asia−IV, Europa-I/América do Sul-I (EU1/SA1), Ártico, Europa Selvagem (EW), América do Sul-II (SA2), América do Sul-III (SA3), América do Sul-IV (SA4), Africa-I e o Rockborn-like. MARTELLA et al., 2011; BUDASZEWSKI et al., 2014;2016; KE et al., 2015).
2. OBJETIVOS
2.1. GERAL
- Analisar os aspectos biológicos e epidemiológicos da cinomose canina na região metropolitana de Belém/PA
2.2. ESPECÍFICOS
- Avaliar a prevalência da cinomose canina na região metropolitana de Belém/PA.
- Avaliar a relação entre o sexo, idade, raça, status vacinal dos animais, sazonalidade do vírus e o risco de infecção pelo VCC nessa região.
- Identificar os sinais clínicos mais frequentes associados aos casos de infecções pelo VCC em Belém/PA.
- Caracterizar as relações filogenéticas das cepas do VCC circulantes em Belém/PA, em comparação com aquelas circulantes em outras regiões do país e do mundo e com as cepas presentes em vacinas comercialmente utilizadas na prevenção da doença.
3.1. AMOSTRAGEM
Foram utilizados no presente estudo amostras de sangue total de cães encaminhadas ao Laboratório de Tecnologia Biomolecular (LTB) da Universidade Federal do Pará (UFPA), campus Belém, no âmbito do projeto de extensão coordenado pelo prof. Dr. Evonnildo Costa Gonçalves. Este laboratório recebe amostras de diversas clínicas da região metropolitana de Belém/PA para a investigação quanto à presença de diferentes enfermidades infecciosas e parasitárias, sendo incluídas na presente pesquisa todas as amostras encaminhadas ao referido serviço para pesquisa do vírus da cinomose canina durante o período compreendido entre junho de 2014 a dezembro de 2017, resultando em um total de 378 amostras sanguíneas.
As amostras recebidas possuíam volume compreendido entre 1 a 3 mL, coletadas em tubos contendo o anticoagulante ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA). Após o registro das amostras, alíquotas foram armazenadas a -80°C onde foram mantidas até o momento da extração do RNA, realizada em até no máximo dois dias.
3.2. PROCESSAMENTO DO MATERIAL
Todas as manipulações das amostras biológicas foram realizadas em uma capela de fluxo laminar, com sua superfície descontaminada com álcool 70% e dodecil sulfato de sódio (SDS) 0,5%, seguida da descontaminação de pipetas, estantes, luvas e todos os equipamentos utilizados durante os procedimentos. Além disso, somente eppendorfs e ponteiras livres de RNases foram utilizadas, para evitar a degradação e perda de RNA viral.
3.2.1. Extração de RNA
O RNA total foi extraído a partir de 200 µL de sangue total de cada amostra previamente congelada a -80°C, seguindo o protocolo do Blood Total RNA Miniprep Kit, da Axygen Biosciences®.
Para o controle da extração, amostras positivas (DNA de cão sabidamente infectado) e negativas (Água bidestilada) e positivo foram extraídas juntamente com as amostras a serem testadas, a fim de se identificar falhas durante esse procedimento.
Ao final dessa etapa, alíquotas do RNA extraído foram estocadas a -80°C até a realização da técnica de transcrição reversa.
3.2.2. Transcrição Reversa
A transcrição reversa foi realizada utilizando-se o kit High Capacity cDNA Reverse Transcription, da Applied Biosystems, num volume final de 20 µL, sendo 10 µL dos reagentes, contendo oligonucleotídeos randômicos que compõem o kit, e 10 µL do RNA extraído, seguindo as instruções do fabricante. O mix foi submetido às seguintes condições de ciclagem: 25°C por 10 minutos, 37°C por 120 minutos, 85°C por 5 minutos em um único ciclo.
A partir dessa reação se obteve o DNA viral para a realização dos testes moleculares de detecção e diferenciação das cepas de VCC.
3.2.3. nested-PCR para o gene N do VCC
Para a detecção do VCC nas amostras analisadas, uma nested-PCR foi realizada a partir do DNA previamente obtido após a etapa de transcrição reversa. Esse protocolo baseia-se na amplificação de fragmentos do gene da proteína do nucleocapsídeo (N) utilizando-se os oligonucleotídeos externos CDV-1F e CDV-2F, que amplificam um fragmento de 480pb, seguida da reação de nested-PCR com os oligonucleotídeos internos CDV-3F e CDV-4R, que amplificam um fragmento de 287pb (Quadro 1).
A primeira reação ocorreu em um volume final de 25 µL, contendo 1 µL de cDNA de cada amostra teste e de cada controle (positivo e negativo) nas seguintes condições de ciclagem: 1 ciclo a 94°C por 2 minutos, 35 ciclos de desnaturação a 94°C por 20 segundos, anelamento a 55°C por 40 segundos, extensão a 72°C por 1 minuto e um ciclo de extensão final de 1 minuto a 72°C.
A partir de 1 µL da primeira reação realizou-se a nested-PCR, também em um volume final de 25 µL, seguindo as seguintes condições: ciclo inicial a 94°C por 3 minutos, 35 ciclos de desnaturação a 94°C por 20 segundos, anelamento a 59°C por 40 segundos, extensão a 72°C por 1 minuto e ciclo de extensão final a 72°C por 5 minutos.
VCC.
Primer Sequência (5`-3`) Posição no
genoma* Referência CDV-1F ACTGCTCCTGATACTGC 654-670 Castilho et al., 2007 CDV-2R TTCAACACCRACYCCC 1118-1133 CDV-3F ACAGRATTGCYGAGGACYTRT 769-789 Frisk et al., 1999 CDV-4F CARRATAACCATGTAYGGTGC 1055-1035
*Posição numérica no genoma da cepa Onderstepoort (GenBank: NC001921)
3.2.4. Análise dos fragmentos amplificados.
Para a detecção dos fragmentos amplificados, 4 µl de cada uma das reações foram misturados a 1 µl de GelRedTM Nucleic Acid stain (Biotium), e então submetidos à eletroforese em gel de agarose a 1,5% em tampão TAE (Tris-Acetato-EDTA) e visualização em fotodocumentador E-BOX VX2 (Vilber Lourmat®). O tamanho dos fragmentos amplificados foi estimado comparando-se com os marcadores de peso molecular 100 pb e/ou 1 Kb (DNA ladder Invitrogen®).
3.2.5. nested-PCR para o gene H do VCC
Para avaliar a diversidade das cepas circulantes em Belém/PA e definir os genótipos em que essas cepas se agrupam, foi realizada amplificação do gene completo da hemaglutinina (H) nas amostras que foram positivas pela técnica de nested-PCR para o gene N, utilizando-se o DNA previamente obtido e estocado a -80°C, após transcrição reversa.
Para a amplificação do gene H foram utilizados os oligonucleotídeos externos RH3-F/RH4-R, que amplificam um fragmento de 871pb, seguindo-se com uma nested-PCR utilizando-se os oligonucleotídeos internos H1F/H1R, H2F/H2RB, CDVF10B/ CDVR10 e H3FB/H3R, que amplificam fragmentos de 788pb, 525pb, 870pb e 253pb, respectivamente (Quadro 2).
A primeira reação foi realizada para um volume final de 25 µL, contendo 2 µL de cDNA de cada amostra teste e de cada controle (positivo e negativo) nas seguintes condições de ciclagem: 1 ciclo a 94°C por 3 minutos, 35 ciclos de desnaturação a 94°C por 30 segundos, anelamento a 50°C por 40 segundos, extensão a 72°C por 1 minuto e um ciclo de extensão final de 10 minutos a 72°C.
A partir de 1 µL da primeira reação, em um volume final de 50 µL, realizou-se a nested-PCR com os oligonucleotídeos internos, seguindo as mesmas condições de ciclagem da primeira reação.
Os métodos de análise dos fragmentos amplificados para o gene H foram os mesmos descritos para o gene N no item 3.2.4.
Quadro 2 - Oligonucleotídeos sintetizados para a amplificação completa do gene H do VCC
Primer Sequência (5`-3`) Posição no
genoma* Referência RH3-F AGGGCTCAGGTACTCCAGC 7059-7077 Harder et al., 1996 RH4-R AATGCTAGAGATGGTTTAATT 8975-8995 H1F ATGCTCTCCTACCAAGACAA 7079-7098 An et al., 2008 H1R CATGTCATTCAGCCACCGTT 7848-7867 H2F AATATGCTAACCGCTATCTC 7730-7749 An et al., 2008
H2RB TTTGGTTGCACATAGGGTAG 8236-8255 Budaszewski et al.,
2014
H3FB CATATGATATATCCCGGGGC 8649-8668 Budaszewski et al.,
2014 H3R TCARGGWTTTKAACGRYYAC 8883-8902 An et al., 2008 CDVF10B TAYCATGAYAGYARTGGTTC 7991-8010 Hashimoto et al., 2001 CDVR10 ARTYYTCRACACTGRTKGTG 8842-8861
*Posição numérica no genoma da cepa Onderstepoort (GenBank: NC001921)
Os amplicons dos genes N e H a serem sequenciados foram purificados com a enzima Illustra ExoProStar 1-Step (GE Healthcare – UK), seguindo as recomendações do fabricante. Os produtos purificados foram sequenciados automaticamente em um 3500 XL Genetic Analyzer (Applied Biosystems), seguindo orientações do fabricante.
As sequências obtidas foram alinhadas manualmente e editadas utilizando-se o programa BioEdit (Hall, 1999). Comparações com sequências depositadas no GenBank foram feitas usando a ferramenta Basic Local Alignment Search Tool – BLAST (Altschul iet al., 1990).
A análise filogenética das amostras obtidas no presente estudo, em comparação com sequências depositadas no GenBank foi realizada no programa MEGA 7.0, baseada no método de distância Neighbor-Joining (Saitou & Neil, 1987) e Tamura-3-parâmetros (Tamura, 1992). O teste de Bootstrap com 1000 pseudoréplicas foi realizado para estimar a confidência do padrão de agrupamento da árvore Neighbor-Joining. (Felsenstein, 1985).
3.3. ANÁLISES ESTATÍSTICAS
Os dados foram categorizados em forma dicotômica (positivo e negativo). Em seguida, foram estabelecidas as frequências absolutas e relativas dos casos positivos de cinomose canina. As variáveis foram submetidas ao teste qui-quadrado para comparar as prevalências, seguido do teste odds ratio para determinar a probabilidade de ocorrência de animais positivos entre as variáveis e foram determinados os intervalos de confiança de 95%. Todas as análises foram realizadas pelo PROC FREQ do programa SAS (Edição Universitária) com nível de significância de 0,05.
