Todas as manipulações das amostras biológicas foram realizadas em uma capela de fluxo laminar, com sua superfície descontaminada com álcool 70% e dodecil sulfato de sódio (SDS) 0,5%, seguida da descontaminação de pipetas, estantes, luvas e todos os equipamentos utilizados durante os procedimentos. Além disso, somente eppendorfs e ponteiras livres de RNases foram utilizadas, para evitar a degradação e perda de RNA viral.
3.2.1. Extração de RNA
O RNA total foi extraído a partir de 200 µL de sangue total de cada amostra previamente congelada a -80°C, seguindo o protocolo do Blood Total RNA Miniprep Kit, da Axygen Biosciences®.
Para o controle da extração, amostras positivas (DNA de cão sabidamente infectado) e negativas (Água bidestilada) e positivo foram extraídas juntamente com as amostras a serem testadas, a fim de se identificar falhas durante esse procedimento.
Ao final dessa etapa, alíquotas do RNA extraído foram estocadas a -80°C até a realização da técnica de transcrição reversa.
3.2.2. Transcrição Reversa
A transcrição reversa foi realizada utilizando-se o kit High Capacity cDNA Reverse Transcription, da Applied Biosystems, num volume final de 20 µL, sendo 10 µL dos reagentes, contendo oligonucleotídeos randômicos que compõem o kit, e 10 µL do RNA extraído, seguindo as instruções do fabricante. O mix foi submetido às seguintes condições de ciclagem: 25°C por 10 minutos, 37°C por 120 minutos, 85°C por 5 minutos em um único ciclo.
A partir dessa reação se obteve o DNA viral para a realização dos testes moleculares de detecção e diferenciação das cepas de VCC.
3.2.3. nested-PCR para o gene N do VCC
Para a detecção do VCC nas amostras analisadas, uma nested-PCR foi realizada a partir do DNA previamente obtido após a etapa de transcrição reversa. Esse protocolo baseia-se na amplificação de fragmentos do gene da proteína do nucleocapsídeo (N) utilizando-se os oligonucleotídeos externos CDV-1F e CDV-2F, que amplificam um fragmento de 480pb, seguida da reação de nested-PCR com os oligonucleotídeos internos CDV-3F e CDV-4R, que amplificam um fragmento de 287pb (Quadro 1).
A primeira reação ocorreu em um volume final de 25 µL, contendo 1 µL de cDNA de cada amostra teste e de cada controle (positivo e negativo) nas seguintes condições de ciclagem: 1 ciclo a 94°C por 2 minutos, 35 ciclos de desnaturação a 94°C por 20 segundos, anelamento a 55°C por 40 segundos, extensão a 72°C por 1 minuto e um ciclo de extensão final de 1 minuto a 72°C.
A partir de 1 µL da primeira reação realizou-se a nested-PCR, também em um volume final de 25 µL, seguindo as seguintes condições: ciclo inicial a 94°C por 3 minutos, 35 ciclos de desnaturação a 94°C por 20 segundos, anelamento a 59°C por 40 segundos, extensão a 72°C por 1 minuto e ciclo de extensão final a 72°C por 5 minutos.
VCC.
Primer Sequência (5`-3`) Posição no
genoma* Referência CDV-1F ACTGCTCCTGATACTGC 654-670 Castilho et al., 2007 CDV-2R TTCAACACCRACYCCC 1118-1133 CDV-3F ACAGRATTGCYGAGGACYTRT 769-789 Frisk et al., 1999 CDV-4F CARRATAACCATGTAYGGTGC 1055-1035
*Posição numérica no genoma da cepa Onderstepoort (GenBank: NC001921)
3.2.4. Análise dos fragmentos amplificados.
Para a detecção dos fragmentos amplificados, 4 µl de cada uma das reações foram misturados a 1 µl de GelRedTM Nucleic Acid stain (Biotium), e então submetidos à eletroforese em gel de agarose a 1,5% em tampão TAE (Tris-Acetato-EDTA) e visualização em fotodocumentador E-BOX VX2 (Vilber Lourmat®). O tamanho dos fragmentos amplificados foi estimado comparando-se com os marcadores de peso molecular 100 pb e/ou 1 Kb (DNA ladder Invitrogen®).
3.2.5. nested-PCR para o gene H do VCC
Para avaliar a diversidade das cepas circulantes em Belém/PA e definir os genótipos em que essas cepas se agrupam, foi realizada amplificação do gene completo da hemaglutinina (H) nas amostras que foram positivas pela técnica de nested-PCR para o gene N, utilizando-se o DNA previamente obtido e estocado a -80°C, após transcrição reversa.
Para a amplificação do gene H foram utilizados os oligonucleotídeos externos RH3-F/RH4-R, que amplificam um fragmento de 871pb, seguindo-se com uma nested-PCR utilizando-se os oligonucleotídeos internos H1F/H1R, H2F/H2RB, CDVF10B/ CDVR10 e H3FB/H3R, que amplificam fragmentos de 788pb, 525pb, 870pb e 253pb, respectivamente (Quadro 2).
A primeira reação foi realizada para um volume final de 25 µL, contendo 2 µL de cDNA de cada amostra teste e de cada controle (positivo e negativo) nas seguintes condições de ciclagem: 1 ciclo a 94°C por 3 minutos, 35 ciclos de desnaturação a 94°C por 30 segundos, anelamento a 50°C por 40 segundos, extensão a 72°C por 1 minuto e um ciclo de extensão final de 10 minutos a 72°C.
A partir de 1 µL da primeira reação, em um volume final de 50 µL, realizou-se a nested-PCR com os oligonucleotídeos internos, seguindo as mesmas condições de ciclagem da primeira reação.
Os métodos de análise dos fragmentos amplificados para o gene H foram os mesmos descritos para o gene N no item 3.2.4.
Quadro 2 - Oligonucleotídeos sintetizados para a amplificação completa do gene H do VCC
Primer Sequência (5`-3`) Posição no
genoma* Referência RH3-F AGGGCTCAGGTACTCCAGC 7059-7077 Harder et al., 1996 RH4-R AATGCTAGAGATGGTTTAATT 8975-8995 H1F ATGCTCTCCTACCAAGACAA 7079-7098 An et al., 2008 H1R CATGTCATTCAGCCACCGTT 7848-7867 H2F AATATGCTAACCGCTATCTC 7730-7749 An et al., 2008
H2RB TTTGGTTGCACATAGGGTAG 8236-8255 Budaszewski et al.,
2014
H3FB CATATGATATATCCCGGGGC 8649-8668 Budaszewski et al.,
2014 H3R TCARGGWTTTKAACGRYYAC 8883-8902 An et al., 2008 CDVF10B TAYCATGAYAGYARTGGTTC 7991-8010 Hashimoto et al., 2001 CDVR10 ARTYYTCRACACTGRTKGTG 8842-8861
*Posição numérica no genoma da cepa Onderstepoort (GenBank: NC001921)
Os amplicons dos genes N e H a serem sequenciados foram purificados com a enzima Illustra ExoProStar 1-Step (GE Healthcare – UK), seguindo as recomendações do fabricante. Os produtos purificados foram sequenciados automaticamente em um 3500 XL Genetic Analyzer (Applied Biosystems), seguindo orientações do fabricante.
As sequências obtidas foram alinhadas manualmente e editadas utilizando-se o programa BioEdit (Hall, 1999). Comparações com sequências depositadas no GenBank foram feitas usando a ferramenta Basic Local Alignment Search Tool – BLAST (Altschul iet al., 1990).
A análise filogenética das amostras obtidas no presente estudo, em comparação com sequências depositadas no GenBank foi realizada no programa MEGA 7.0, baseada no método de distância Neighbor-Joining (Saitou & Neil, 1987) e Tamura-3-parâmetros (Tamura, 1992). O teste de Bootstrap com 1000 pseudoréplicas foi realizado para estimar a confidência do padrão de agrupamento da árvore Neighbor-Joining. (Felsenstein, 1985).