Curso de Mestrado em Ciências Odontológicas
TÚLIO LUIZ DURIGAN BASSO
RESPOSTA ÓSSEA PERI-IMPLANTAR À APLICAÇÃO
TRANSCIRÚRGICA DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA. ANÁLISE
HISTOMORFOMÉTRICA EM RATOS
BARRETOS 2011
TÚLIO LUIZ DURIGAN BASSO
RESPOSTA ÓSSEA PERI-IMPLANTAR À APLICAÇÃO
TRANSCIRÚRGICA DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA. ANÁLISE
HISTOMORFOMÉTRICA EM RATOS
BARRETOS
2011
Dissertação apresentada ao Curso de Mestrado em Ciências Odontológicas do Centro Universitário da Fundação Educacional de Barretos, para obtenção do título de Mestre em Implantodontia.
Orientadora: Profa. Dra. Ana Emília Farias Pontes Co-orientadores: Prof. Dr.Raphael Carlos Comelli Lia Profa. Dra. Letícia Helena Theodoro
Dados Curriculares
Túlio Luiz Durigan Basso
Nascimento 05/11/1987 – BARRETOS/SP
Filiação Silvio Luiz Basso
Deise Aparecida Durigan Basso
2005 - 2008 Graduação em Odontologia
Centro Universitário da Fundação Educacional de Barretos.
2009 - 2011 Mestrado em Ciências Odontológicas
Dedicatória
Dedico este trabalho à minha família; meus pais, Deise Aparecida Durigan Basso e Silvio Luiz Basso, e meu irmão, Hugo Luiz Durigan Basso, que estão sempre presentes em minha vida, me apoiando incondicionalmente em quaisquer que sejam meus objetivos. A eles dedico muito mais que somente este trabalho, dedico tudo o que conquistei e que virei a conquistar em minha vida futura.
À Elisa Ferreira de Souza Baptista dedico meu amor, por estar ao meu lado nesta jornada, sempre amável, compreensiva, e paciente. Afinal uma grande mulher não deve estar por trás de um grande homem, e sim ao lado.
Epígrafe
Agradecimentos
À minha orientadora, Profª Drª Ana Emília Farias Pontes, pela confiança depositada em mim quando me aceitou como orientado ao longo destes 4 anos. Por sua inesgotável paciência diante da minha inevitável inexperiência, e por não ter desistido de mim mesmo quando eu parecia ausente. À ela também sou muito grato pela preciosíssima amizade.
Ao meu co-orientador, Prof. Dr. Raphael Carlos Comelli Lia, que desde a graduação me acolheu como um filho, por vezes me ensinando coisas que livro nenhum pode ensinar, sendo muito mais que um orientador, uma prova de que conhecimento científico e humildade moral devem crescer sempre proporcionalmente.
Ao Prof. Dr. Fernando Salimon Ribeiro, sou muito grato por todos os conhecimentos compartilhados, e todos os conselhos profissionais, científicos e pessoais.
Aos colaboradores: Juliano Milanezi de Almeida, Carolina Boldrini, Erivan Clementino Gualberto Júnior e Prof. Dr. Valdir Gouveia Garcia, pela importante participação na fase experimental.
Ao Prof. Dr. Adriano Piattelli e à Profa. Dra. Giovanna Iezzi, pela fundamental ajuda na confecção das lâminas histológicas utilizadas nas análises deste trabalho, e pela hospitalidade com que me acolheram durante a minha estada em Chieti/IT.
Aos meus parceiros de clínica, Dr. Marcelo Monteiro Bruno e Dr Rafael Pantano Camargo Neves, pela paciência que tiveram frente a minha inexperiência clínica na área de implantodontia.
Aos meus amigos, que conheci ao longo destes 2 anos, pelos conhecimentos compartilhados e também pelos momentos de descontração.
À Profa. Dra. Letícia Helena Theodoro, pela co-orientação e contribuições valiosas para este trabalho.
Por fim, à Reitoria e Pró-Reitoria de Pós-Graduação do Centro Universitário da Fundação Educacional de Barretos, na figura do Prof. Álvaro Fernandez Gomes e Prof. Dr. Luiz Paulo Geraldo; e à Coordenação do Curso de Mestrado em Ciências Odontológicas, na figura do Prof. Titular Benedicto Egbert Corrêa de Toledo.
SUMÁRIO Lista de Abreviaturas………...………9 Resumo...10 Abstract...11 Texto...12 Introdução...12 Revisão de Literatura...14
Efeito do LBP no tecido ósseo peri-implantar………...14
Material e Métodos...17 Resultados...26 Discussão...46 Conclusão...48 Referências ...49 Anexos...53
LISTA DE ABREVIATURAS
GaAlAs – Gálio-Alumínio- Arsênio COI – Contato osso-implante AO – Área de osso
J - Jaule
J/cm2 -Joule/centímetro quadrado LBP- Laser de baixa potência ML- mililitro MM- milímetro MW- miliwatt W - Watt N/cm – Newton/centímetro NM – nanômetros NO – Novo osso OA – Osso antigo
RESUMO
Basso T.L.D. Resposta óssea peri-implantar à aplicação transcirurgica do Laser de Baixa Potência. Análise histomorfométrica em ratos. [Dissertação de Mestrado]. Barretos: Curso de Mestrado em Ciências Odontológicas da UNIFEB; 2011.
O objetivo deste estudo foi avaliar histologica e histométricamente o processo de reparo ósseo em áreas peri-implantares irradiadas e não irradiadas com Laser de Baixa Potência (LBP) em tíbias de ratos. Para este estudo foram selecionados 64 ratos machos adultos tipo Wistar que foram aleatoriamente distribuídos em dois grupos (teste e controle), contendo 8 (oito) animais por período de eutanásia (sete, 15, trinta e 45 dias) por grupo. O osso bicortical da tíbia proximal foi preparado usando uma fresa de 2,0mm de diâmetro. Nos animais do grupo teste, imediatamente após a preparação do osso, irradiações foram realizadas por duas vezes com LBP de GaAlAs (808nm, 0,125 W/cm², 11 J/cm²) durante 1 minuto e 23 segundos perfazendo um total de 22 J/cm². e no grupo controle não foram realizadas irradiações. Nos leitos preparados foram inseridos implantes de superfície tratada por jateamento e ataque ácido com 4,0mm de comprimento e 2,2mm de diâmetro. Nos períodos de sete, 15, trinta e 45 dias após instalados os implantes, as eutanásias foram realizadas, e as tíbias foram removidas e enviadas para a preparo das lâminas histológicas, utilizadas para a realização da análise histológica descritiva, e quantificação de Contato Osso-Implante (COI) e Área de Osso. Observou-se intensificação da atividade osteoblástica e maturação óssea, além de maior COI no período de sete dias no grupo teste (56,4 ±12,7%) em comparação com o controle (36,4 ±13,5%). Dentro dos limites deste estudo, pode-se concluir que o LBP foi benéfico, principalmente nos períodos iniciais, do processo de reparo ósseo.
ABSTRACT
Basso T.L.D. Periimplant bone response to the transoperative Low Power Laser application. Historphometric analysis in rats. [Dissertação de Mestrado]. Barretos: Curso de Mestrado em Ciências Odontológicas da UNIFEB; 2011.
The aim of this study was to evaluate histologically and histometrically the bone repair process in periimplant areas irradiated and unirradiated with LPL in rats tibiae comparatively. For this study were selected 64 adult male rats Wistar type that were randomly distributed in two groups (Test and Control) containing 8 (eight) animals each period (sete, 15, trinta and 45 days) by group. The twice cortical proximal tibia bone was prepared using a cutter with 2.0 mm diameter. In the animals of the test group, immediately after the bone preparation, irradiation was performed by two times with LPL GaAlAs (808nm, 0,125 W/cm², 11 J/cm²) during 1 minute and 23 seconds making a total of 22 J/cm², and in the Control group animals were not performed irradiations. In the prepared beds were inserted implants with surface treated by sandblasting and acid etching and 4.0 mm in length and 2.2 mm in diameter. At the following periods 7, 15, 30 and 45 days after the implants were inserted, the euthanasia procedures were realized, and their tibiae were removed and sent for histological preparation, used to realize the histological analysis and the quantification of Bone-Implant Contact (BIC) and Bone Area. Was observed increased osteoblastic activity and bone maturation, and BIC largest in seven days in the test group (56.4 ± 12.7%) compared with the control (36.4 ± 13.5%). Within the limits of this study, we can conclude that LBP was beneficial, especially during initial bone repair process.
INTRODUÇÃO
Com os sucessivos avanços da implantodontia é cada vez maior o índice de sucesso de implantes osseointegráveis apresentados na literatura, mesmo quando em longos períodos de acompanhamento. (Adell et al., 1990; Simonis et al., 2010) Entretanto, falhas ainda são relativamente comuns, principalmente em áreas de osso deficiente em qualidade e/ou quantidade, freqüentemente localizadas nas regiões posteriores de ambos os arcos. (Mordenfeld et al., 2004) Adicionalmente, existem condições que potencialmente ofereçem risco à osseointegração, como patologias sistêmicas ou protocololos de carregamento imediato. (Glösel et al. 2010)
Em busca de condições que estimulassem a reparação óssea nessas regiões, alternativas têm sido aplicadas desde então, como por exemplo, modificações na superfície do implante e associação de fatores de crescimento, potencializando a interação do implante com o tecido ósseo, aumentando assim consideravelmente o contato osso-implante. (Gotfredsen et al., 1992; Sykaras et al., 2001; Shibli et al., 2006) E dentre essas alternativas estão os Lasers de Baixa Potência (LBP) que atuam sobre o metabolismo do tecido ósseo, agindo nas células endoteliais, recrutamento de osteoblastos, regulação de osteócitos, diminuição da atividade osteoclástica (reabsorção), importantes no processo de remodelação óssea. (Dortbudack et al., 2000; Dortbudack et al., 2002)
Apesar do mecanismo de ação dos LBPs ainda não ser claramente compreendido, na literatura corrente existe uma série de estudos mostrando os parâmetros da resposta reparatória do tecido ósseo frente à estimulação por LBPs em diferentes condições experimentais. (Tang & Chai, 1986; Trelles & Mayoyo, 1987; Ozawa et al., 1998; Dominguez et al., 2009) Mais recentemente, a estimulação do tecido ósseo por meio de irradiações com LBPs vem sendo aplicada com a finalidade de modular a resposta dos tecidos ao redor de implantes osseointegráveis, buscando, assim, uma otimização do processo de osseointegração. (Guzzardella et al., 2003; Khadra et al., 2004; Khadra et al., 2005; Pereira et al., 2009) Contudo, na literatura ainda são escassos trabalhos que
avaliem de forma descritiva os eventos histológicos da reparação óssea frente à aplicação de LBPs em condições experimentais.
Desta forma, o objetivo deste estudo in vivo foi realizar uma descrição da resposta óssea peri-implantar à aplicação transcirúrgica do LBP, pela análise histológica descritiva, bem como a análise histométrica do processo de reparo ósseo em tíbias de ratos.
REVISÃO DE LITERATURA
Efeito do LBP no tecido ósseo peri-implantar
Diante dos resultados benéficos do laser sob o tecido ósseo, e do crescimento da busca de novas alternativas para a otimização da osseointegração surgem então os primeiros estudos avaliando o efeito do LBP sob o tecido ósseo peri-implantar.
Em 2002, Dörtbudak et al. avaliaram o efeito do LBP ao redor de implantes inseridos na crista ilíaca de babuínos machos. Foram utilizados implantes de superfície jateada e submetida a ataque ácido. Os sítios foram irradiados com 690 nm, 100 mW por 1 minuto (6J) imediatamente após o preparo do leito ósseo com fresa e inserção dos implantes. Foi realizada a análise histológica de contagem dos osteócitos e quantificação da reabsorção óssea. Nas amostras, os osteócitos viáveis foram encontrados em 41,7% das lacunas no grupo submetido à irradiação, enquanto que no grupo não-irradiado foram encontrados em 34,4% das lacunas, existindo diferença estatisticamente significante. Além disto, não houve diferença estatisticamente significante entre os grupos com relação à área total de reabsorção óssea. Concluiu-se então que a irradiação teve efeito positivo na integração dos implantes in vivo, enquanto que a taxa de reabsorção não foi influenciada pela irradiação.
Guzzardella et al. (2003) observaram por meio da análise histométrica, que aplicações do LBP de GaAlAs (780nm, 2500mW) a 300 J/cm², 1 W e 300Hz por 10 minutos e durante 5 dias consecutivos, aumentou o contato osso-implante em implantes de hidroxiapatita inseridos em fêmures dos coelhos. Nos animais irradiados foi observada maior formação de matriz osteóide em comparação aos não irradiados. Nas amostras do período de três semanas foi observado maior porcentagem de contato osso-implante.
Khadra et al. (2004) avaliaram o efeito do LBP ao redor de discos de titânio inseridos em tíbia de coelhos, realizando aplicações de laser de GaAlAs
por 10 dias consecutivos com 830 nm, 150 mW, 23 J/cm2 (9 aplicações de 3 J). As análises incluíram avaliação do torque de remoção, histomorfometria, e microanálise por energia dispersiva de raios X. Os autores observaram maior torque de remoção nos sítios submetidos à irradiação (14,35 N) em comparação com o controle (10,27 N), e a porcentagem de cálcio e fósforo foi maior no grupo irradiado. Além disto, considerando especificamente o contato osso-implante, apenas quatro implantes foram utilizados nesta análise, sendo que os autores não apresentaram resultados numéricos, tendo apenas estimado que o aumento nos sítios irradiados foi de 10%. Desta forma os autores concluíram que a irradiação teve um efeito favorável no processo de cicatrização de implantes de titânio.
Em busca de uma análise mais detalhada dos eventos metabólicos do tecido ósseo peri-implantar diante da aplicação de LBP, Kim et al. (2007) avaliaram a expressão de mediadores do metabolismo ósseo durante o processo de osseointegração em sítios ao redor de implantes inseridos em tíbias de ratos, submetidos ou não a radiação com LBP. Foram avaliados, por meio de imunohistoquímica o ativador do receptor do fator nuclear Kb (com sigla em inglês RANK), seu ligante (com sigla em inglês RANKL), e osteoprotegerina. Os autores observaram um aumento da expressão em todos os mediadores, concluindo que a radiação promoveu um aumento da atividade metabólica e aumento da atividade das células ósseas.
Jakse et al. (2007) estudaram o efeito do LBP no tratamento da regeneração em sítio com enxerto ósseo no seio maxilar de ovinos. A elevação bilateral do seio maxilar juntamente com enxertia de osso da crista ilíaca foi realizada em uma primeira fase cirúrgica. Implantes foram inseridos nos enxertos num segundo estágio. Um grupo após quatro semanas de enxertia e o outro grupo após 12 semanas, dezesseis semanas após a inserção dos implantes, os animais foram sacrificados. O laser de diodo (75 mW, 680 nm) foi utilizado unilateralmente durante o segundo estágio cirúrgico, na fase intra-operatória e três vezes durante a primeira semana pós operatória num total de 3 a 4 J/cm2. A análise histomorfométrica e regeneração óssea diferiram pouco entre o controle e
o teste em ambos os lados quatro e 12 semanas após o enxerto, mas observou-se um aumento no contato osso-implante no grupo irradiado.
Pereira et al. (2009) analisaram o processo de reparo ósseo em implantes inseridos em tíbias de coelhos, irradiados com GaAlAs (780nm, 7,5 J/cm2 por 10s em cada ponto, sendo quatro pontos ao redor de cada implante a cada 48 horas durante 14 dias), enquanto na tíbia da esquerda não foi aplicado LBP. Com relação à porcentagem de contato osso-implante, esta foi significativamente maior no grupo irradiado, tanto três semanas quanto seis semanas em comparação com o controle. Entretanto, quando os valores obtidos no período de três semanas foram comparados aos de seis semanas, diferenças estatisticamente significantes não foram detectadas. Portanto, considerando a área do osso dentro das espiras do implante, os autores não reportaram nenhuma diferença significativa foi encontrada para o tratamento, com ou sem laser.
Em 2010 Boldrini analisou o reparo ósseo em implantes inseridos em tíbias de coelhos irradiados transcirurgicamente com laser de GaAlAs (808nm, 0,125 W/cm², 11 J/cm²) durante 1 minuto e 23 segundos perfazendo um total de 22 J/cm². Para tanto foi realizada a mensuração dos valores de torque de remoção aos sete, 15, trinta e 45 dias. Desta forma observou-se que nos períodos de trinta e 45 dias os valores de torque de remoção eram estatisticamente maiores no grupo tratado em comparação ao grupo controle, concluindo então que o laser agiu acelerando o processo de reparo ósseo.
MATERIAIS E MÉTODOS
O presente estudo foi submetido e aprovado pelo Comitê de Ética Experimental em Animais da Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, campus Araçatuba (protocolo 2008-004251). (Anexo 1) Para a realização do estudo foram utilizados 64 ratos machos adultos Wistar com aproximadamente três meses de idade e pesando cerca de 300g. Durante o período experimental os animais foram mantidos em gaiolas de propileno e alimentados com ração padrão laboratorial e água ad libitum, em ambiente com temperatura de 25ºC, umidade relativa de 55%, e foram expostos a 12,5 horas de luz alternando com 11,5 horas de escuridão.
Os animais foram aleatoriamente distribuídos em dois grupos experimentais, teste e controle, contendo oito animais por período de eutanásia (sete, 15, trinta e 45 dias) em cada um dos grupos.
Previamente ao procedimento cirúrgico, cada animal foi anestesiado com administração intramuscular de uma combinação de cloridrato de ketamina (Ketamina Ager, Agener União, São Paulo, SP, Brasil) a uma concentração de 0,04 mL / 100g e xilazina a 2% (Rompum, Bayer, São Paulo, SP, Brasil) na concentração de 0,08 mL / 100g de massa corporal. A seguir, a tíbia esquerda foi tricotomizada (Figura 1a) e realizada a antissepsia com auxílio de solução tópica de iodopovidona a 10 %, e na sequência uma incisão de aproximadamente 30 mm foi realizada com lâmina de bisturi 15 C (Figura 1b e 1c), pelo lado medial na tíbia esquerda.
Figura 1. Procedimento cirúrgico. Tricotomia (a), incisão (b, c) e exposição do tecido ósseo da tíbia (d).
Após a dissecção, feita com auxílio de um descolador de periósteo (Figura 1d), o tecido ósseo foi exposto e um leito bicortical foi preparado na metáfise proximal, usando uma fresa de 2,0 mm de diâmetro (Titanium Fix A.S Technology, São José dos Campos, São Paulo, Brasil) montada em motor
cirúrgico com 900 rpm (Ômega, Dentscler Indústria de aparelhos Odontológicos Ltda, Ribeirão Preto, Brasil), acompanhado por irrigação constante com solução salina e o líquido aspirado com sugador de alta potência. (Figura 2a)
Nos animais do grupo teste, imediatamente após o preparo do leito, foi realizada a irradiação por duas vezes com LBP de GaAlAs (Thera laser, DMC, São Carlos, SP, Brasil). (Figura 3a) O feixe do laser foi posicionado perpendiculamente em contato com o leito preparado, com comprimento de onda de 808 nm, com potência de 50 mW, com feixe colimado de 0,4 cm2 (0,125 W/cm2) durante 1 minuto e 23 segundos, e com densidade de energia de 11 J/cm2 em modo contínuo, perfazendo 22 J/cm2. Nos animais do grupo controle não foram realizadas irradiações.
Nos leitos preparados (Figura 2b) de ambos os grupos foram inseridos implantes (Titanium Fix A.S Technology, São José dos Campos, São Paulo, Brasil) com superfície tratada na fabricação, por meio de jateamento e ataque ácido, nas dimensões de 4,0 mm de comprimento e 2,2 mm de diâmetro. (Figura 3b) A instalação foi realizada com auxílio de uma chave digital (1,2 mm de diâmetro) acoplada ao hexágono do implante até que o mesmo fosse inserido no nível da crista óssea. Em seguida, o tecido mole foi suturado internamente com fio 4.0 de poliglactina 910 (Johnson & Johnson do Brasil Ind. Com. Prod. Para Saúde Ltda, São Bernardo do Campo, Brasil), e externamente com fio de seda 4.0 (Johnson & Johnson). (Figura 3d) Por fim, os animais receberam uma injeção intramuscular de penicilina e estreptomicina na dose de 0,5 mL para 5 kg de peso (Pentabiótico Pequeno Porte, Fort Dodge Saúde Animal Ltda, Campinas, SP, Brasil).
Figura 2. Procedimento cirúrgico. Fresagem (a) e leito após o preparo (b).
Aos sete, quinze, trinta e quarenta e cinco dias após a instalação dos implantes, os animais foram sacrificados com uma dose letal intraperitoneal de hidrato de cloral a 20%.
As lâminas histológicas foram preparadas de acordo com o método previamente descrito por Piattelli et al. (1997). Resumidamente, as peças fixadas foram desidratadas usando concentrações crescentes de álcool de 60% a 100%. Posteriormente, a embebição em resina foi realizada com banhos em concentrações decrescentes de álcool e crescentes de resina (Technovit 7200 VLC. Kulzer, Wehrheim, Alemanha).
Figura 3. Procedimento cirúrgico. Aplicação do LBP (a) no grupo teste, instalação do implante (b), implante já instalado (c) e sutura (d)
Figura 4. Processamento do material para análise. Posicionamento do espécime em um recipiente (a), recipientes contendo os espécimes acomodados em uma estufa (b) para polimerização durante 24 horas a aproximadamente 60ºC (c) e o bloco esquadrado e posicionado na lâmina base (d).
Para o presente estudo as peças foram polimerizadas e cortadas em secções de aproximadamente 150 µm usando o sistema Precise 1 Automated System (Assing, Rome, Itália), sendo as mesmas lixadas até uma espessura aproximada de 100 µm. (Figuras 4 e 5) Uma lâmina representativa de cada bloco foi obtida, observando a porção mais central do implante. As lâminas foram coradas com Azul de Toluidina e Fucsina Ácida.
Figura 5. Processamento do material para análise. Colagem da lâmina ao bloco com adesivo adequado (a), posicionamento do conjunto (lâmina base - bloco - lâmina) no equipamento para corte (b,c), e mensuração da espessura do corte (d)
As lâminas preparadas foram analisadas por um avaliador experiente, cego para o grupo ambos os grupos e treinado para identificar os sucessivos eventos teciduais e seus parâmetros de modulação. A calibração intra-examinador foi avaliada pelo cálculo da porcentagem de COI e cálculo da AO em 10% da amostra (sete implantes, mesial e distal), examinados duas vezes cada com intervalo de 24 horas entre as medições, sendo os resultados submetidos a análise estatística tanto para as mensurações de COI (erro-padrão de 5,90% e coeficiente de correlação de Spearman de 0,91), como para as de AO (erro-padrão de 1,18% e coeficiente de correlação de Pearson de 0,99).
As imagens histológicas foram obtidas por uma câmera acoplada a um microscópio óptico. As mensurações de COI e AO foram realizadas nas três primeiras roscas de cada implante, utilizando-se um programa apropriado (ImageJ 1.34, National Institutes of Health, Bethesda, MA, EUA), tendo o pixel como unidade de medida, uma vez que os dados posteriormente seriam processados e apresentados no formato de porcentagem.
Figura 6. Programa utilizado para mensuração das imagens (ImageJ 1.34, National Institutes of Health, Bethesda, MA, EUA).
Os dados das mensurações de COI e AO foram submetidos a análise estatística, inicialmente ao teste de normalidade de Shapiro Wilk e posteriormente ao teste de hipótese ANOVA com comparação múltipla de Bonferroni, com significância de 5%.
Quanto à análise descritiva dos eventos teciduais foram considerados os seguintes critérios:
a) Atividade Osteoblástica (formação): Tendo sua intensidade determinada pela coloração dos núcleos dos osteoblastos, bem como sua concentração e disposição em rimas e quantidade de matriz osteóide.
b) Atividade Osteoclástica (reabsorção): Concentração de superfícies irregulares compatíveis com áreas de reabsorção óssea.
c) Maturação óssea: Organização lamelar bem definida, bem como um a organização do arranjo vascular.
d) Infiltrado inflamatório: Concentração e localização de células inflamatórias.
RESULTADOS
Todos os animais responderam bem ao procedimento cirúrgico e às aplicações do laser, entretanto, dois espécimes foram excluídos devido à fratura na tíbia. A distribuição dos valores de COI e de AO de cada grupo estão apresentados nas Tabelas 1 e 2 e nas Figuras A1 e A2, em anexo.
Análise histológica quantitativa
Na análise da porcentagem de COI, quando na intergrupos (teste e controle) foi encontrada diferença estatisticamente significante no período de 7 dias dos grupos controle e teste (36,3± 18,6% e 56,4 ±12,7%, respectivamente), bem como diferenças estatisticamente significantes foram encontradas quando comparados os períodos de cada grupo isoladamente. (Tabela 1)
No grupo controle, quando comparados os resultados dos períodos existem diferenças significantes entre sete dias (36,3± 18,6%) e trinta dias (59,5± 8,8%), e entre sete dias e 45 dias (63,4± 17,5%). Já no grupo teste as diferenças entre os períodos estudados foram entre sete dias (56,4 ±12,7%) e trinta dias (71,4%± 12,8%), sete dias e 45 dias (71,8± 15,4%), entre 15 dias (50,7± 24,7%) e trinta dias, e entre 15 dias e 45 dias.
Tabela 1: Média e desvio-padrão da porcentagem de COI.
Controle Teste
Animal 7dias 15dias 30dias 45dias 7dias 15dias 30dias 45dias
1 70,0 41,8 52,8 67,8 68,4 31,9 77,9 100,0 2 41,3 27,6 67,0 83,2 55,5 63,5 69,5 53,3 3 15,9 35,2 63,2 85,8 65,9 80,8 73,5 54,0 4 17,9 64,6 49,9 58,1 40,3 30,3 79,4 81,0 5 33,2 48,1 73,9 36,9 51,4 22,0 75,1 69,6 6 32,7 48,4 53,0 41,7 41,8 68,3 71,3 66,8 7 54,7 61,6 57,0 66,0 71,6 29,0 82,6 68,8 8 24,4 62,3 * 67,6 * 79,5 41,6 81,0
Média 36,3a,b, c 48,7d 59,5b 63,4c, d 56,4a,e,f 50,7g,h 71,4e,g 71,8f,h
Desvio-padrão ± 18,6 ± 13,5 ± 8,8 ± 17,5 ± 12,7 ± 24,7 ± 12,8 ± 15,4
Letras idênticas representam diferenças estatisticamente significantes (p=0,0009, teste ANOVA com comparação múltipla de Bonferroni).
* Espécimes excluído, devido a fratura da tíbia.
Com relação à análise da AO não houve diferenças estatisticamente significantes intergrupos (teste e controle), diferenças estatisticamente significantes foram encontradas quando comparados os períodos de cada grupo.(Tabela 2)
Na comparação entre os períodos do grupo controle diferenças siginificantes foram detectadas entre os sete dias (36,4 ±13,5%) e 45 dias (57,1 ±13,7%) e entre 15 dias (36,3±13,0%) e 45 dias. Quando comparados os períodos experimentais no grupo teste foram encontradas diferenças entre sete dias (33,3± 8,8%) e trinta dias (52,1± 13,2%), sete dias e 45 dias (64,0± 19,0%), e entre 15 (40,6± 21,0%) dias e 45 dias.
Tabela 2: Média e desvio padrão da porcentagem de AO.
Controle Teste
Animal 7dias 15dias 30dias 45dias 7dias 15dias 30dias 45dias
1 36,5 22,0 30,1 51,0 43,6 25,6 64,1 93,2 2 32,5 31,2 55,3 77,6 36,5 46,1 38,3 54,1 3 11,7 19,5 50,1 65,6 42,2 69,8 59,6 49,8 4 39,1 42,1 41,5 53,0 22,6 30,2 59,2 92,1 5 33,0 28,0 50,7 40,8 25,3 10,8 64,5 65,0 6 60,6 48,8 42,5 40,7 24,8 55,7 48,9 58,9 7 42,6 55,3 61,7 55,3 37,9 23,8 54,9 41,1 8 35,2 43,6 * 72,4 * 62,5 27,4 58,1
Média 36,4a 36,3b 47,4 57,1a,b 33,3c,d 40,6e 52,1c 64,0d,e
Desvio-padrão ±13,5 ±13,0 ±10,4 ±13,7 ±8,8 ±21,0 ±13,2 ±19,0
Letras idênticas representam diferenças estatisticamente significantes (p=0,0008, teste ANOVA com comparação múltipla de Bonferroni).
Análise histológica descritiva
Grupo Controle sete dias:
Neste período inicial foi observada uma quantidade variável de osteoblastos em alta atividade e células osteogênicas contrapondo a atividade osteoclástica existente. Na interface encontravam-se escassas as áreas de contato do osso diretamente no implante, sendo observada nessa região uma reabsorção inicial e por vezes até o rompimento da cortical apical. (Figura 8)
Ainda neste período, observou-se uma lenta e discreta formação de novo osso na interface osso-implante, sugerindo osteogênese de contato, porém com predominância de tecido conjuntivo nestas regiões. (Figura 7)
Nas áreas corticais foram observadas irregularidades na superfície óssea características de atividade osteoclástica, que provavelmente se deu pela pressão na instalação do implante; ao passo que as regiões medulares se apresentavam de forma habitual.
Também foi identificado um infiltrado inflamatório moderado comum neste período.
Figura 7. Imagem representativa do grupo 7 dias controle em aumento de 40x, evidenciando as regiões de osso antigo (OA) e de osso novo (NO).
Figura 8. Imagem representativa do grupo 7 dias controle em aumento de 60x, evidenciando as regiões de osso antigo (OA) e de osso novo (NO), e rimas de osteoblastos em atividade (setas).
Grupo Teste sete dias:
Neste grupo foi observada uma maior atividade osteoblástica que no grupo controle observada pela presença de uma rima contínua de osteoblastos ativos e quanto à formação de osso novo, foram observados pólos de formação tanto junto à interface osso-implante, quanto distante dela, caracterizando um padrão de osteogênese de contato. (Figura 9)
A formação de novo osso foi variável, porém neste grupo (sob o efeito do laser) este novo osso se apresentava um grau de maturação maior que no grupo controle.(Figura 10 e 11)
A intensidade da atividade osteoclástica observada, também foi variável entre as lâminas deste grupo, porém, sempre interposta por atividade osteoblástica
predominante. O infiltrado inflamatório foi predominantemente mononuclear e discreto, sempre localizado na região da cabeça do implante.
Figura 9. Imagem representativa do grupo 7 dias teste em aumento de 40x; evidenciando as regiões de osso antigo (OA) e de osso novo (NO), visivelmente mais maduro comparativamente ao controle.
Figura 10. Imagem representativa do grupo 7 dias teste em aumento de 40x; evidenciando as regiões de osso antigo (OA) e de osso novo (NO), visivelmente mais maduro comparativamente ao controle.
Figura 11. Imagem representativa do grupo 7 dias teste em aumento de 60x (a,b); mostrando regiões de osso novo com maior grau de maturação comparativamente ao controle, evidenciando uma rima de osteoblasto em atividade (setas)
.
Grupo Controle 15 dias:
Atividade osteoclástica estava mais evidente nas adjacências do osso cortical, com interposição predominante e progressivamente crescente da atividade osteoblástica (formação), bem como aumento da quantidade de células osteogênicas quando comparado ao período inicial. Ainda comparativamente ao período inicial, na região medular, a atividade osteoblástica apresentou-se mais moderada, porém sempre crescente. (Figura 13)
A quantidade de osso junto ao implante, em comparação com tecido conjuntivo encontrou-se equilibrada neste grupo, mas quando comparado ao período de sete dias, esta quantidade foi maior em toda a extensão do implante, demonstrando evolução na formação óssea. (Figura 12)
Infiltrado inflamatório moderado estava localizado na região da cabeça e no ápice do implante, por vezes estavam presentes células gigantes.
Existiu uma proporção maior de osso, tanto em contato com o implante como distante, comparativamente aos sete dias, demonstrando uma evolução no processo de osteogênese.
Figura 12. Imagem representativa do grupo 15 dias controle em aumento de 40x; evidenciando as regiões de osso antigo (OA) e de osso novo (NO).
Figura 13. Imagens representativas do grupo 15 dias controle em aumento de 60x; evidenciando, uma região de irregularidade resultante de atividade osteoclástica (a) (setas) e uma região de novo osso (b).
Grupo Teste 15 dias:
Atividade osteoclástica, osteoblástica, e quantidade de células osteogênicas semelhantes ao grupo controle do mesmo período. Na região medular, as atividades celulares apresentaram-se mais evidentes, tanto osteoclástica moderada como osteoblástica mais intensa, observando-se uma maior interação do osso medular quando comparado ao controle. (Figura 14)
Novo osso foi observado em quase toda extensão dos implantes, crescente em quantidade, havendo predomínio na região média do implante demonstrando um padrão de ossificação constante no osso medular. (Figura 15)
Em algumas lâminas foi observado um processo de substituição de osso compacto por medular na região das corticais apicais e cervicais do implante, um infiltrado inflamatório moderado e, por vezes, estavam presentes células gigantes.
A principal diferença quando comparado ao grupo controle não está na quantidade óssea, mas na interação do implante com o osso adjacente, e na formação de osso novo discretamente mais maduro no grupo teste.
Figura 14. Imagem representativa do grupo 15 dias teste em visão panorâmica do implante de 1,5x de aumento; evidenciando a interação da região medular neste grupo.
Figura 35: Imagem representativa do grupo 15 dias teste em aumento de 60x, evidenciando uma área de novo osso.
Grupo Controle trinta dias:
A atividade osteoclástica diminuiu consideravelmente neste período quando comparado aos anteriores. O osso presente em geral é de boa qualidade, com áreas de atividade osteoblástica na superfície mantendo um padrão de renovação. Os osteoplastos mostram-se dispostos aleatoriamente, exibindo em sua maioria osteócitos em seu interior. (Figura 17)
Neste grupo observou-se uma quantidade consideravelmente maior de tecido ósseo em contato com as roscas do implante, quando comparado aos períodos anteriores, sendo mais evidente nas regiões de osso cortical, além de diminuição progressiva dos espaços medulares. (Figura 16)
Neste período o infiltrado inflamatório foi, em geral, reduzido a quase zero, apresentando somente células inflamatórias dispostas em um padrão fisiológico habitual.
Também constante é a rima de osteoblastos na parte junto ao tecido ósseo da camada interna periosteal, assim foram observadas regiões com osteoblastos ativos seguintes a outros de padrão quiescente.
Figura 4. Imagem representativa do grupo trinta dias controle em visão panorâmica do plante de 1,5x de aumento; evidenciando a interação da região cortical neste período.
Figura 17. Imagem representativa do grupo trinta dias controle em aumento de 40x; evidenciando as regiões de osso novo (NO) e uma rima de osteoblastos.
Grupo Teste trinta dias:
Aos trinta dias, o grupo irradiado com laser apresentou uma quantidade óssea aparentemente menor quando comparado ao controle do mesmo período, apresentando mais áreas de substituição do osso compacto por medular nas regiões corticais, resultando também nesta comparação, em uma qualidade óssea inferior. (Figura 18) Entretanto a interação do implante ao tecido ósseo se mostrou semelhante, por vezes havendo formação óssea no interior do encaixe utilizado para a inserção do implante.
Ao longo da extensão do corpo do implante observa-se maior quantidade de espaços medulares em contato com o implante, porém o tecido ósseo formado é de qualidade, apresentando maior grau de maturidade. (Figura 19)
As camadas de osteoblastos ativos são visivelmente menores que no grupo controle, caracterizando um quadro de menor volume ósseo, apesar de seguir o mesmo padrão de crescimento ósseo (osteogênese de contato).
O padrão inflamatório neste grupo também é mais acentuado, sendo esta condição dependente da proliferação do tecido conjuntivo em contato com o implante.
Figura 18. Imagem representativa do grupo trinta dias teste em aumento de 40x; evidenciando um área de substituição de osso compacto cortical por osso medular.
Figura 19. Imagem representativa do grupo trinta dias teste em aumento de 60x; evidenciando um área de novo osso, exibindo espaços medulares em contato com o implante.
Grupo Controle 45 dias:
Neste período a interação do osso medular é pouco expressiva, sendo semelhante em comparação ao período de trinta dias, porém existe uma evolução da interação das corticais com o implante, seguindo o padrão do período anterior, porém mais exacerbado, havendo uma migração de osso compacto que segue das extremidades (regiões das corticais) do implante para a porção média. (Figura 20 e 21) A atividade osteoblástica vista neste período também foi expressivamente maior que no período anterior.
Este padrão de crescimento foi unânime em todas as lâminas deste grupo, mostrando uma evolução progressiva do quadro observado no período de trinta dias. Não houve presença de infiltrado inflamatório.
Figura 20. Imagem representativa do grupo 45 dias controle mostrando uma vista panorâmica do implante em aumento de 1,5x, evidenciando a interação do osso cortical (setas) e a pouco desenvolvimento do osso medular.
Figura 21. Imagem representativa do grupo 45 dias controle mostrando uma vista panorâmica do implante em aumento de 40x, evidenciando áreas de osso antigo (OA) e novo
osso (NO).
Grupo Teste 45 dias:
Aos 45 dias do grupo irradiado observou-se a existência de um equilíbrio entre a quantidade, qualidade e organização (maturação) do crescimento ósseo, porém comparativamente ao grupo controle em quantidade sutilmente menor, porém semelhante. (Figuras 23a e 23b) Aparentemente, há uma maior quantidade de osso próximo às roscas do implante quando comparado aos grupos controle, bem como ao período anterior.
O processo de ossificação neste grupo segue como no grupo controle, partindo das corticais, sendo visível a capacidade de indução óssea nas regiões corticais, sendo que na maioria dos casos o osso cortical apical responde melhor
que o cervical.(Figura 22a e 22b) Neste grupo o infiltrado inflamatório também era insignificante.
Figura 22. Imagens representativas do grupo 45 dias teste mostrando uma vista panorâmica do implante em aumento de 1,5x (a); e em 40x evidenciando as regiões de osso antigo (OA) e de osso novo (NO).
Figura 23 Imagens representativas do grupo 45 dias teste em um aumento de 60x mostrandoáreas de osso novo. Evidenciando novo vaso sanguineo (a) (asterisco) e formação óssea compatível com sistema de Havers (b) (seta), sugerindo maior grau de maturação.
DISCUSSÃO
A resposta tecidual óssea à aplicação de LBPs em sítios peri-implantares vem sendo estudada em diversos modelos experimentais, assim como em diferentes tipos de análise. (Blay, 2001; Dörtbudak et al., 2002; Guzzardella et al., 2003; Khadra et al., 2004; Khadra et al., 2005; Kim et al., 2007, Jakse et al., 2007; Pereira et al., 2009; Boldrini, 2010) Dentre estes, um protocolo simplificado foi descrito, com irradiação em apenas uma sessão, garantindo grande acessibilidade e praticidade para profissional e paciente. (Dörtbudak et al., 2002; Boldrini, 2010)
Sendo assim, presente estudo foi desenvolvido para descrever as alterações histológicas decorrentes de um protocolo de irradiação em única sessão. Optou-se ainda por incluir variados períodos de avaliação objetivando melhor observar a dinâmica de formação tecidual sob o efeito do LBP.
Ao final da pesquisa, os achados mais importantes foram que aos sete dias observou-se maior valor de COI no grupo teste comparativamente ao controle, e diante da análise histológica descritiva observou-se maior atividade osteoblástica e um processo de maturação tecidual melhor intensificado no grupo tratado comparativamente ao controle em todos os períodos estudados. De acordo com o exposto, tal protocolo poderia ser então considerado no plano de tratamento como uma alternativa para biomodular o processo de osseointegração em curto prazo, em áreas de osso deficiente em quantidade e/ou qualidade, bem como em casos de protocolos de carregamento imediato.
Nos períodos iniciais, os resultados obtidos corroboram os de Dörtbudak et al. (2002), que realizaram irradiação em única sessão, imediatamente após fresagem do leito ósseo e após a instalação do implante (690 nm, 100 mW por 1 minuto, totalizando 6J). Depois de cinco dias, a porcentagem de osteócitos viáveis era estatisticamente maior nos sítios do grupo teste comparado ao controle. No entanto, vale ressaltar que no presente estudo observou-se aumento da atividade
osteoblástica, que desempenha papel importante na síntese e mineralização de matriz osteóide.
Por outro lado, Boldrini (2010) avaliou o torque reverso de sítios submetidos ao mesmo tratamento e com os mesmos períodos de acompanhamento do descrito no presente estudo. Aos sete e 15 dias, não foi observada diferença entre os grupos, possivelmente por tal método ter sido influenciado pela imaturidade óssea e do estágio inicial do embricamento entre osso e implante. Todavia, nos períodos mais avançados, de trinta e 45 dias de acompanhamento, houve um aumento da porcentagem de COI, AO, e maturação do tecido ósseo, e por consequência, a força necessária para romper tridimensionalmente o embricamento aumentou, e diferenças estatisticamente significantes entre os grupos foram evidenciadas, com maiores valores de torque no grupo teste em comparação com o controle. Porém, no presente estudo o teste estatístico usado para análise dos dados obtidos por meio da histomorfometria não revelou diferenças entre os grupos, provavelmente em decorrência dos elevados desvios-padrões.
Considerando estudos que fizeram avaliação histológica de sítios irradiados em várias sessões com LBP, no estudos de Guzzardella et al. (2003), Khadra et al. (2004), Jakse et al. (2007), e Pereira et al. (2009) observou-se maior COI nos sítios do grupo teste comparativamente ao controle. Apenas no estudo de Torres e Teixeira (2008) não foi detectada a diferença entre os grupos, o que foi explicado pelos autores como tendo sido em decorrência da amostra limitada.
Por fim, como sugestão para realização de estudos futuros, está a avaliação imunohistoquímica dentro deste protocolo simplificado, para esclarecer os efeitos do LBP sob mediadores do metabolismo ósseo envolvidos no processo de remodelação, e como próximo passo, a realização de estudos em humanos.
CONCLUSÃO
Dentro dos limites do estudo, pode-se concluir que o LBP aplicado transcirurgicamente interferiu no aumento da osseointegração apenas em um curto período. Além de interferir de forma benéfica no processo de reparo ósseo periimplantar, promovendo uma maior atividade celular, observada principalmente nos períodos iniciais (sete e 15 dias), bem como um maior grau de maturação do tecido ósseo neoformado em todos os períodos.
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ANEXO 2
Figura A1. Gráfico Box-plot incluindo valores de média e desvio padrão da análise de COI
ANEXO 3
Figura A2. Gráfico Box-plot incluindo valores de média e desvio padrão da análise de AO (p=0,0008, teste ANOVA com comparação múltipla de Bonferroni).
Autorizo a reprodução deste trabalho. (Direitos de publicação reservados ao autor)
Barretos, 16 de março de 2011, Túlio Luiz Durigan Basso
