Pró-Reitoria de Pós-Graduação e Pesquisa
Stricto Sensu em Ciências Genômicas e Biotecnologia
Estudo da interação
Brassica oleracea
-
Xanthomonas
campestris
pv.
campestris
utilizando
técnicas
proteômicas
Brasília - DF
2013
Gabriela Rabelo Conde Villeth
Estudo da interação
Brassica oleracea
-Xanthomonas campestris
pv.
campestris
utilizando técnicas proteômicas
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação Stricto Sensu em Ciências Genômicas e Biotecnologia da Universidade Católica de Brasília, como requisito para obtenção de título de Mestre em Biotecnologia. Orientador: Dr. Octavio Luiz Franco
Co-orientadora: Dra. Angela Mehta
7,5 cm 7,5cm
Ficha elaborada pela Biblioteca Pós-Graduação da UCB
06/08/2013
V748e Villeth, Gabriela Rabelo Conde
Estudo da interação brassica oleracea-Xanthomonas campestris pv. campestris utilizando técnicas proteômicas. / Gabriela Rabelo Conde Villeth – 2013.
108f. : il ; 30 cm
Dissertação (mestrado) – Universidade Católica de Brasília, 2013. Orientação: Prof. Dr. Octavio Luiz Franco.
Coorientação: Profa. Dra. Angela Mehta
1. Brassica camnpestris. 2. Horticultura. 3. Economia agrícola. 4.
Eletroforese. I. Franco, Octavio Luiz, orient. II. Mehta, Angela, coorient. III. Título.
Dissertação de autoria de Gabriela Rabelo Conde Villeth, intitulada “Estudo da
interação Brassica oleracea-Xanthomonas campestris pv. campestris utilizando
técnicas proteômicas”, apresentada como requisito parcial para obtenção do
grau de Mestre em Ciências Genômicas e Biotecnologia da Universidade Católica de Brasília, defendida e aprovada pela banca examinadora abaixo assinada:
________________________________________________ Prof. Dr. Octavio Luiz Franco
Orientador
Universidade Católica de Brasília- UCB.
_______________________________________________ Prof. Dra. Angela Mehta
Co-orientador
Universidade Católica de Brasília- UCB.
_______________________________________________ Dr. Ludovico Migliolo
Universidade Católica de Brasília- UCB
_______________________________________________ Dr. Sébastien Olivier Charneau
Universidade de Brasília- UnB
Dedico esta dissertação ao meu maior exemplo de vida e maior incentivador meu avô, Ruy Cardoso Rabello, que valorizava o estudo
imensamente e sempre me
estimulou a dar grandes passos na vida como este. Esta pessoa com muita sabedoria esteve sempre me conduzindo para o bem e para o alcance dos meus objetivos e mesmo não estando mais entre nós deixou os seus caminhos trilhados
com afinco como exemplo.
Escrever esta dissertação de Mestrado foi uma experiência enriquecedora e de extrema superação. Alcançar o sonho de fazer um mestrado e de trabalhar com pesquisa só foi possível com a ajuda de pessoas que contribuíram de forma decisiva direta ou indiretamente, para a sua concretização.
Agradeço primeiramente ao meu orientador Dr. Octavio Franco e co-orientadora Dr. Angela Mehta respectivamente por todo incentivo e encorajamento, pela paciência e compreensão. Pela oportunidade que me concederam e por serem excelentes orientadores em tempo integral. Obrigada Octavio, por resolver tantos problemas burocráticos sem que nem eu mesma soubesse deles e por ser tão exigente nas correções extraindo sempre o melhor de mim. Obrigada Angela, por confiar tantos anos de projetos e pesquisas a mim, por acreditar que eu era capaz e por ser uma profissional tão competente e dedicada, sendo sempre o meu maior exemplo.
Agradeço a equipe do laboratório LGP, por fazerem minha jornada mais fácil todos os dias, pela ajuda, risos e companhia, Obrigada Lílian, Juan, Bianca, Giovana, Sara, Roberta e Marcela por serem acima de tudo grandes amigos e a melhor equipe e a Luciana por ser a melhor analista de todas, sempre tão gentil e solicita.
Agradeço a minha família por terem me fornecido uma base sólida para que eu pudesse trilhar e construir meu futuro sem muitas atribulações, por secarem meu pranto quando o experimento dava errado e por me encorajar a continuar. Principalmente meu irmão Jorge Lucas que me ajudou a desenhar as lindas figuras presentes ao longo do texto de revisão, e a minha Mãe que financeiramente e emocionalmente sempre me apoiou.
Finalmente gostaria de agradecer ao meu namorado Pedro, por ser tão querido e permanecer ao meu lado nas atribulações, me amando e respeitando diariamente.
Referência: Villeth, Gabriela Título: Estudo da interação Brassica oleracea-Xanthomonas campestris pv. campestris utilizando
técnicas proteômicas Ano de defesa: 2013 Ciências genômicas e biotecnologia. Universidade Católica de Brasília. Brasília, 2013.
As Brassicáceas ocupam um lugar proeminente na olericultura no Brasil, principalmente na região Centro-Sul, sendo o repolho, a couve-flor e a couve manteiga de maior relevância econômica. Uma das principais doenças que atingem as brássicas é a podridão negra causada pela
bactéria Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc). Desta forma, o
objetivo deste trabalho consistiu em identificar proteínas moduladas pela
presença da bactéria Xcc em dois genótipos de B. oleracea. Plantas de
repolho do genótipo resistente e suscetível foram inoculadas com Xcc e analisadas através de 2-DE. A comparação do genótipo resistente União inoculado com o seu controle revelou 36 proteínas diferenciais, sendo 1 exclusiva, 18 aumentados e 16 diminuídas na planta inoculada e 1 exclusiva na condição controle. Na análise do genótipo suscetível Kenzan inoculado comparado com o controle, foram obtidas 32 proteínas diferenciais sendo 19 aumentadas, 3 diminuídas e 6 exclusivas da planta inoculada e 4 proteínas exclusivas da condição controle. As proteínas foram identificadas por espectrometria de massa, incluindo proteínas envolvidas no metabolismo energético e fotossíntese. Uma comparação entre os genótipos resistente e suscetível inoculados foi também realizada e os resultados revelaram proteínas associadas à fotossíntese aumentadas no genótipo resistente, sugerindo que a fotossíntese tem papel importante no processo de resistência da planta a Xcc. Neste estudo foram também analisados os perfis proteicos totais de Kenzan e União através de MALDI
profiling utilizando o software Biotyper (Bruker Daltonics). Os resultados
mostraram que as variações entre a condição inoculada e controle são mais intensas no genótipo suscetível que no resistente. Além disso, a técnica de
MALDI Imaging foi também utilizada para determinar a distribuição e a
localização das proteínas no tecido foliar das duas cultivares. Os resultados obtidos neste estudo demonstram pela primeira vez o uso de ferramentas
como MALDI Imaging e Profiling para a determinação do perfil proteíco
durante a interação planta-patógeno.
The Brassicaceae family comprises several economically important cruciferous plants such as cabbage and cauliflower. One of the main diseases that affects all cruciferous plants is black rot, caused by the
bacterium Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc). This bacterium
causes serious plant damage, leading to severe yield losses. This work aims to identify proteins modulated by the presence of the bacterium Xcc in two
genotypes of B. oleracea. Plants from the resistant (União) and susceptible
(Kenzan) cabbage genotypes were inoculated with Xcc and analyzed by 2-DE. The analysis of the resistant genotype revealed 36 differential protein spots, including 1 exclusive, 18 increased and 16 decreased in inoculated plants, when compared to the control condition. In the analysis of the susceptible genotype Kenzan, 32 differentially expressed proteins were observed, including 19 increased and 3 decreased in the inoculated plants, as well as 6 proteins exclusive to the inoculated plants and 4 to the control condition. Several proteins were identified by mass spectrometry, including proteins involved in metabolism and photosynthesis. Comparisons between the 2DE maps of inoculated plants from the resistant and susceptible genotypes were also performed. Data revealed that proteins associated to photosynthesis were increased in the resistant genotype, suggesting the photosynthesis may have an important role in the resitance to Xcc. In this study, the protein profiles of Kenzan and União were also performed by
MALDI profiling using the Biotyper software (Bruker Daltonics). The results
showed that the variations between the inoculated and control conditions were higher in the susceptible plant than in the resistant plants. Another
approach used in this study was MALDI Imaging in an attempt to determine
protein localization and distribution in the leaf tissue. The resutls obtained showed for the first time the use of approaches such as MALDI Profiling and Imaging to determine the protein profile during a plant-pathogen interaction.
DAI - Dias após a inoculação...
HR - hypersensitive response...
KC - Kenzan controle………
KI - Kenzan inoculado……….
M – Molar... m/z - Massa/carga...
mA – miliampére...
MALDI-Matrix-assisted laser desorption/ionization ………
mL – Mililitro... mm – Milímetro... mM – Milimolar...
MS - Mass spectrometry………
MSI - Mass Spectrometry Imaging……….
PAMPS - Pathogen-Associated Molecular Patterns...
pH – Potencial hidrogeniônico... SAR - systemic acquired resistance...
SDS - Sodium Dodecyl Sulfate...
SDS-PAGE - Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis
TOF- Time-of-flight ………
UC – União controle... UI - União inoculado...
WC-MS - Whole-cell mass spectrometry……….
Xcc- Xanthomonas campestris pv. campestris...
Figura 1. Alimentos pertencentes à família das brássicas: couve (Brassica oleracea var. acephala), brócolis (Brassica oleracea var. italica), couve-flor
(Brassica oleracea var. botrytis) e repolho (Brassica oleracea var. capitata) .
... Erro! Indicador não definido.
Figura 2. Planta do genótipo Kenzan infectada com Xcc. Manchas amareladas e necroses nas extremidades da folha e próximo à nervura central caracterizam os sintomas de podridão negra. ... Erro! Indicador não definido.
Figura 3. X. campestris pv. campestris em imagem obtida por meio de
microscopia eletrônica de varredura. ... Erro! Indicador não definido.
Figura 4. Figura representativa das reações que ocorrem durante a interação
planta-patógeno. Baseado no esquema de Slater (2003).Erro! Indicador não
definido.
Figura 5. Reações que ocorrem durante o processo fotossintético ... Erro!
Indicador não definido.
Figura 6. (A) Maceração das folhas coletadas para a aquisição do material vegetal para extração de proteínas. (B) Extração de proteínas utilizando fenol e tampão de extração. (C) Focalização isoelétrica das proteínas. (D) Gel bidimensional. ... Erro! Indicador não definido.
Figura 7. Esquema representativo referente ao delineamento experimental. Análise 01 corresponde à comparação entre genótipo União inoculado e controle. Análise 02 corresponde a comparação do genótipo Kenzan e controle. Análise 03 corresponde à comparação entre o genótipo União inoculado e Kenzan inoculado. ... Erro! Indicador não definido.
Figura 8. Plantas de B. oleracea inoculadas com Xcc. (A) Planta do genótipo
resistente (União) na condição controle e (B) 15 dias após a inoculação, apresentando sintomas de leve clorose. C) Planta do genótipo suscetível (Kenzan) na condição controle e D) 15 dias após a inoculação, apresentando
sintomas típicos de podridão negra. ... Erro! Indicador não definido.
Figura 9. SDS-PAGE de proteínas totais (40 µg) de B. oleracea. (A) União inoculado, (B) Kenzan inoculado, (C) União controle e (D) Kenzan controle. O
gel foi corado utilizando Coomassie Blue. ... Erro! Indicador não definido.
Figura 10. Gel bidimensional com 600 µg de amostra do genótipo resistente (União). (A representa o gel referente ao inoculado e B representa o gel referente ao controle), destacando-se as proteínas diferenciais identificadas neste genótipo. ... Erro! Indicador não definido.
Figura 11. Variações na expressão das proteínas identificadas. Os valores
vermelhas indicam as proteínas diminuídas e as azuis representam as aumentadas. ... Erro! Indicador não definido.
Figura 12. Gel bidimensional conduzido utilizando 600 µg de amostra do genótipo suscetível (Kenzan). (A representa o gel referente ao genótipo susceptível inoculado com Xcc e B representa gel referente ao genótipo
suscetível contole) destacando-se as proteínas diferenciais identificadas ... Erro!
Indicador não definido.
Figura 13. Variações na expressão das proteínas identificadas. Os valores
foram calculados baseados na razão da intensidade dos spots na condição
inoculada com Xcc (KI) em relação à condição controle (KC), obtidos a partir da
análise de imagem com o programa Platinum℗ (GE Healthcare). As barras
vermelhas indicam as proteínas diminuídas e as azuis representam as aumentadas. ... Erro! Indicador não definido.
Figura 14. Gel bidimensional conduzido utilizando 600µg de amostra do genótipo suscetível (Kenzan) e resistente (União). (A representa o gel referente ao genótipo resistente inoculado com Xcc e B representa gel referente ao genótipo suscetível inoculado com Xcc), destacando-se as proteínas diferenciais identificadas. ... Erro! Indicador não definido.
Figura 15. Variações na expressão das proteínas identificadas. Os valores
foram calculados baseados na razão da intensidade dos spots do genótipo
resistente inoculado (UI) em relação ao genótipo suscetível inoculado (KI),
obtidos a partir da análise de imagem com o programa Platinum℗ (GE
Healthcare). As barras vermelhas indicam as proteínas diminuídas e as azuis representam as aumentadas. ... Erro! Indicador não definido.
Figura 16. Placa de aço para espestrometria de massa com os discos retirados
das folhas afixados, que foram utilizados para análise de MALDI imaging. . Erro!
Indicador não definido.
Figura 17. Folhas de brássica após a aquisição de imagem obtida por espectrometria de massa em uma faixa de m/z 9260 a 9966. Na coluna da direita, estão as folhas antes da aquisição. O número 1 representa a primeira planta da triplicata coletada, o número 2 representa a repetição da segunda planta coletada e o número 3 representa a repetição da terceira planta coletada. ... Erro! Indicador não definido.
Figura 18. Folhas de brássica após a aquisição de imagem obtida por espectrometria de massa em uma faixa de m/z 6061 a 6190. Na coluna da direita, estão as folhas antes da aquisição. O número 1 representa a primeira planta da triplicata coletada, o número 2 representa a repetição da segunda planta coletada e o número 3 representa a repetição da terceira planta coletada. ... Erro! Indicador não definido.
planta da triplicata coletada, o número 2 representa a repetição da segunda planta coletada e o número 3 representa a repetição da terceira planta coletada. ... Erro! Indicador não definido.
Figura 20. Diferenças entre densidade ótica média do íon vermelho das amostras refentes ao tempo 10 dias e 24 horas obtidas através da analise das imagens obtidas por espectrometria de massa. c representa diferença significativa da amostra KC 10 dias. a representa diferença significativa da amostra UC 10 dias. b representa diferença significativa (anova p<0.05) da amostra UI 10 dias ... Erro! Indicador não definido.
Figura 21. Diferenças entre densidade ótica média do íon verde das amostras refentes ao tempo 10 dias e 24 horas obtidas através da analise das imagens obtidas por espectrometria de massa. c represnta diferença significativa da amostra KC 10 dias. a representa di dias. a representa diferença significativa da amostra UC 10 dias. b reprenta diferença significativa da amostra UI 10 dias. d representa diferença significativa (anova p<0.05) da amostra KI 10 dias.
... Erro! Indicador não definido.
Figura 22. Diferenças entre densidade ótica média do íon azul das amostras refentes ao tempo 24 horas obtidas através da analise das imagens obtidas por espectrometria de massa. Não houve diferenças significativas (anova p<0.05) entre as amostras. ... Erro! Indicador não definido.
Figura 23. Dendrograma gerado apartir das analises geradas atravez da técnica de WC-MS avaliando um faixa de (m/z) 3 a 15000. Amostras do tempo 24 horas inoculado e controle dos genótipos Kenzan e União e um grupo
extreno correspondente a amostras extraídas de Brassica Oleracea var.
Acephala foram utilizadas. ... Erro! Indicador não definido.
Figura 24. Dendrograma gerado a partir das analises geradas através da técnica de WC-MS avaliando uma faiza de (m/z) 2000 a 20000. Amostras do tempo 24 horas inoculado e controle dos genótipos Kenzan e União e um grupo externo foram utilizadas. ... Erro! Indicador não definido.
Tabela 1. Valor nutricional de alguns alimentos em 100 g do produto cru, quando comparado ao repolho... 21
Tabela 2. Proteínas diferencialmente expressas detectadas a partir da análise 01 referente à comparação do genótipo resistente (União) e seu respectivo controle, identificadas através de espectrometria de massa... 51
Tabela 3. Proteínas diferencialmente expressas detectadas a partir da análise 02 referente à comparação do genótipo suscetível (Kenzan) e seu respectivo controle, identificadas por espectrometria de
massa... 56
INTRODUÇÃO...17
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 1. IMPORTÂNCIA ECONÔMICA DAS BRASSICAS...19
2. PODRIDÃO NEGRA DAS CRUCÍFERAS...21
3. CARACTERIZAÇÃO DO PATÓGENO...23
4. INTERAÇÃO PLANTA-PATÓGENO...25
5. FOTOSSÍNTESE NO PROCESSO DE DEFESA DA PLANTA...30
6. ANÁLISE PROTEÔMICA (2-DE) E ESPECTROMETRIA DE MASSA...33
7. MALDI Imaging ...34
8. MALDI Profiling...36
JUSTIFICATIVA...38
HIPÓTESE...39
OBJETIVO GERAL...40
OBJETIVOS ESPECÍFICOS...40
CAPÍTULO 1 MATERIAL E MÉTODOS 1. MATERIAL VEGETAL E CULTIVO DE XANTHOMONAS CAMPESTRIS PV CAMPESTRIS...42
2. INOCULAÇÃO DAS PLANTAS E COLETA DO MATERIAL VEGETAL...42
3. EXTRAÇÃO, QUANTIFICAÇÃO DAS PROTEÍNAS E SDS-PAGE...42
4. ELETROFORESE BIDIMENSIONAL (2-DE)...43
5. ANÁLISE DE IMAGEM...44
6. DIGESTÃO DAS PROTEÍNAS E ESPECTROMETRIA DE MASSA...45
RESULTADOS 1. CARACTERIZAÇÃO DOS SINTOMAS...47
2. ANÁLISE PROTEÔMICA...48
INTRODUÇÃO
As Brassicáceas são importantes fontes de alimento em vários países. Estas plantas são amplamente cultivadas em todas as regiões do mundo e ocupam uma posição de destaque na olericultura brasileira. A família Brassicaceae é a
mais numerosa dentre as culturas olerícolas, sendo o repolho (Brassica
oleracea var. capitata) uma das culturas mais importantes (Filgueira, 2000). As
plantações de brássicas são constantemente atacadas por pragas, causando
grandes perdas na produção. A podridão negra, causada pela bactéria
Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc), pode ser considerada umas das
doenças mais destrutivas das crucíferas, sendo responsável por grandes prejuízos econômicos. O principal sintoma desta doença consiste no
aparecimento de áreas cloróticas em forma de “V” partindo das bordas foliares em direção ao centro da folha. A infecção das nervuras pode ser sistêmica progredindo para o pecíolo e talo da planta. As folhas infectadas geralmente
amarelecem de forma rápida e tendem a murchar e as áreas em forma de “V”
progridem para a necrose (Azevêdo et al., 2002).
A prevenção da podridão negra tem sido de suma importância para o
controle da infecção. Entretanto, este controle tem sido dificultado por se tratar
de uma doença sistêmica, além de ser transmitida através das sementes
contaminadas (Vicente, 2004). Embora apenas 0,03% das sementes usadas
possam resultar em epidemia no campo, uma infecção de 0,05% em casa de vegetação ou viveiro pode progredir para 65% em apenas três semanas
(Roberts et al., 2007). As formas de controle mais comuns são o uso de
sementes sadias, controle biológico, rotatividade de cultura e principalmente o uso de plantas resistentes que tem se mostrado a forma de controle mais eficiente. A obtenção de cultivares resistentes ou tolerantes a doenças tem sido amplamente buscada nos programas de melhoramento, com o objetivo de
aumentar a produção e melhorar a qualidade das plantas (Wulff et al., 2002;
Massomo et al., 2004; Carisse et al., 2008).
uma área crucial de investigação. Com o aumento dos estudos genômicos e pós-genômicos, uma grande quantidade de informação está disponível e avanços têm sido obtidos no conhecimento dos mecanismos de defesa das plantas assim como das estratégias de patogenicidade utilizadas pelos micro-organismos patogênicos. A análise proteômica é uma técnica robusta e bastante utilizada para verificar a expressão das proteínas em diversas
condições biológicas (Wilkins et al., 1997). Existem muitos estudos proteômicos
recentes com o objetivo de identificar proteínas relacionadas com os processos
de defesa da planta contra diversos tipos de patógenos (Asano et al., 2012; Di
Carli et al., 2012; Monavarfeshani et al., 2013; Sinha et al., 2013), entretanto,
estudos da interação B. oleracea-Xcc tem sido pouco relatados (Mehta e
Rosato, 2003; Andrade et al., 2008; Villeth et al., 2009). A técnica de imaging
(MALDI-MSI) tem o potencial de fornecer novos insights sobre a análise
molecular de plantas, fornecendo informações de alta resolução espacial sobre as proteínas e as alterações quantitativas envolvidas durante o desenvolvimento da planta ou aqueles induzidos pela variação ambiental
(Grassi et al., 2011). A eletroforese bidimensional, MALDI-MSI e MALDI
profiling associados fornecem informações completas sobre a expressão
protéica. Este trabalho teve como objetivo analisar as proteínas
diferencialmente expressas durante a interação de B. oleracea suscetível e
resistente a Xcc através de técnicas proteômicas a fim de identificar proteínas potencialmente envolvidas na resistência a Xcc.
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
1. IMPORTÂNCIA ECONÔMICA DAS BRÁSSICAS
O Brasil possui uma posição de destaque na agricultura mundial. Segundo o ministério da agricultura, desde o final dos anos 90, poucos países tiveram um crescimento no comércio internacional do agronegócio como o Brasil. O país tem sido um dos líderes mundiais na produção e exportação de vários produtos agropecuários, sendo o primeiro produtor e exportador de café, açúcar, etanol e suco de laranja. Porém, a agricultura brasileira precisa aumentar a quantidade e a qualidade dos produtos agropecuários para atender à crescente demanda por alimentos.
O cultivo de hortaliças em sistemas intensivos é relativamente recente. Nos sistemas agrícolas mais antigos, as hortaliças eram basicamente colhidas dentre as ervas que cresciam espontaneamente nas áreas de cultivo ou próximas à habitação (Khatounian, 1997). A pesquisa formal em olericultura foi iniciada no Brasil com a criação do Campo Experimental de Horticultura em 1938, instalada no Rio Grande do Sul. Com a criação da EMBRAPA em 1974, a pesquisa em olericultura teve um novo impulso face à determinação da diretoria da empresa em 1976 de que a UEPAE de Brasília se dedicasse exclusivamente à pesquisa de hortaliças (Couto, 1997).
A família das brássicas possui diversas culturas de grande importância econômica (Figura 1), cultivadas para diversos fins como alimentação, preparo de condimentos e plantas ornamentais. As brassicas são conhecidas como um grupo monofilético de cerca de 338 generos e 3709 espécies distribuídas em todo o mundo. Essa família inclui importantes culturas e espécies ornamentais
sendo Arabidopsis thaliana uma das plantas mais conhecidas e utilizadas como
Figura 1. Alimentos pertencentes à família das brássicas: couve (Brassica oleracea var. acephala), brócolis (Brassica oleracea var. italica), couve-flor (Brassica oleracea var. botrytis) e repolho (Brassica oleracea var. capitata) .
O repolho (Brassica oleracea var. capitata) pode ser considerado uma
das brássicas mais importantes tanto pela sua movimentação econômica no mercado de hortaliças, pois pode possuir alta taxa de crescimento e grande valor nutritivo (Silva e Yokoyama, 1988). Outra condição de destaque do repolho deve-se ao fato de possuir um elevado teor de ácido ascórbico (vitamina C) e baixo nível de açúcares (Tabela 1), além de ser um alimento de
fácil digestão e bastante versátil à mesa (Lédo et al., 1996). O repolho é uma
hortaliça anual herbácea e possui como região de origem a Costa Norte Mediterrânea, Ásia Menor e Costa Ocidental Européia. Na América, o repolho
foi trazido pelos conquistadores europeus por volta do século XV (Fracaro et
al., 1999). No Brasil, o repolho tem sido cultivado principalmente no
sementes híbridas, importadas principalmente do Japão (Giordano, 2005). As condições climáticas apresentam uma forte influência na produção e qualidade do repolho. Temperaturas elevadas associadas à alta precipitação pluviométrica retardam o crescimento das plantas e dificultam uma boa formação da cabeça, contribuindo para uma maior incidência de doenças,
principalmente da podridão negra (Lédo et al., 1996). No ano de 1976, foram
efetuados cruzamentos entre cultivares e híbridos de repolho, visando à obtenção de uma população de repolho da qual pudessem ser extraídas linhagens endogâmicas, com o objetivo de produzir híbridos com cabeças pequenas, arredondadas, compactas e com resistência à podridão negra das crucíferas causada por Xcc. O resultado deste trabalho conjunto entre a Embrapa Hortaliças e a Faculdade de Ciências Agronômicas Campus de
Botucatu resultou no desenvolvimento do repolho "União" (Giordano et al.,
1988), que vem sendo amplamente utilizado pelos produtores.
Tabela 1. Valor nutricional de alguns alimentos em 100 g do produto cru, quando comparado ao repolho.
Alimento Caloria Proteína (g) Carboidrato (g) Ca (mg) P (mg) Fe (mg) B1 (mg) B2 (mg) B5 (mg) C (mg) A (U.I.)
Repolho
95
4,6
17,5
152
102
1.7
0,23
0,21
0,9
173
270
Tomate
91
4
16,6
44
108
2,4
0,24
0,16
2,5
93
4380
Alface
57
3,8
9,1
69
78
1,6
0,2
0,21
0,5
24
1710
Leite
312
15,9
22,2
536
422
0,3
0,16
0,78
0,5
6
720
Ovo
636
51,7
2,8
218
848
10,9
0,47
1,35
0,3
0
4590
Laranja
164
2,9
36,6
36,6
75
1,3
0,25
0,08
0,8
162
620
Vitaminas
Fonte: (Silva, 1987).
2. PODRIDÃO NEGRA DAS CRUCÍFERAS
A produtividade agrícola das brássicas vem sendo gravemente afetada
por diversos tipos de doenças causadas por bactérias do gênero Xanthomonas,
resultando em perdas substanciais na produtividade e na economia (Maringoni,
1997). A podridão negra das crucíferas, causada pela bactéria X. campestris pv
(Williams, 1980), com registros de reduções na produtividade mundial de até 60% (Dzhalilov e Tiwari, 1995). A infecção por Xcc é especialmente favorecida em climas temperados e tropicais, particularmente sob condições de alta
umidade e calor (Agrios, 2004). Os sintomas dessa doença podem ser
observados em qualquer estágio do desenvolvimento da planta. As plantas
infectadas apresentam folhas com lesões amarelas em forma de “V”, com o
vértice voltado para o centro (Figura 2), que progridem para a nervura principal, tornando-se necrosadas (Rodrigues e Malavolta, 1995). Existem casos em que se podem observar características como subdesenvolvimento, murcha, queda prematura das folhas e por fim apodrecimento das plantas afetadas (Maringoni, 1997). Desta forma, a podridão negra tem sido considerada uma das doenças mais destrutivas das crucíferas, com incidência em todas as regiões produtoras, causando perdas totais e danos à produção. A disseminação do patógeno ocorre através de sementes contaminadas, mudas doentes, por respingos de água de chuva ou de irrigação e pelos ventos. A podridão negra
também pode ser disseminada durante tratos culturais (Kimati et al., 1997).
Formas de controle tradicionais são pouco eficientes, porém o uso de plantas resistentes tem se mostrado útil no controle da infecção.
A bactéria Xcc possui alta taxa de crescimento com temperaturas entre
28oC e 30oC em presença de água. Ambientes com essas características são
favoráveis para penetração da bactéria, que ocorre através de aberturas naturais das plantas como, por exemplo, os estômatos e hidatódios ou por
ferimentos provocados na superfície da parte aérea (Kimati et al., 2005). As
principais formas de controle da podridão negra consistem no emprego de sementes sadias, tratamento térmico de sementes, eliminação de plantas daninhas que servem de hospedeiras para o patógeno e a rotação de culturas (Mcgrath, 1994). Existem também alguns estudos visando o controle biológico
da podridão negra (Assis et al., 1999; Schultz et al., 2006). Entretanto, o
Figura 2. Planta do genótipo Kenzan infectada com Xcc. Manchas amareladas e necroses nas extremidades da folha e próximo à nervura central caracterizam os sintomas de podridão negra.
3. CARACTERIZAÇÃO DO PATÓGENO X. campestris pv. campestris.
Xanthomonas campestris é uma bactéria fitopatogênica Gram-negativa
aeróbica, em formato de bastonete e possui apenas um flagelo responsável
pela sua mobilidade (Pelczar et al., 1981). Inicialmente, a taxonomia de
bactérias era dominada pela abordagem fenotípica. Apesar da introdução de técnicas moleculares em anos recentes para auxiliar neste processo, ainda existem muitas dificuldades e controvérsias na classificação de bactérias,
especialmente as fitopatogênicas. O gênero Xanthomonas foi primeiramente
classificado baseado na especificidade de hospedeiro sendo geneticamente
diferenciado em mais de 141 patovares (pv.) (Dye et al., 1980; Swings e
Civerolo, 1993).
A Xanthomonas possui uma taxonomia complicada, primeiramente a
(Burkholder, 1957). A morfologia e outras coracterísticas fisiológicas e
bioquímicas foram usada para classificar os isolados de Xanthomonas em oito
grupos fenotípicos (Van Den Mooter e Swings, 1990). Por fim as espécies de
Xanthomonas foram reclassificada com base em hibridação de DNA-DNA. Em
1995, Vauterin (1995) reclassificou o genêro Xanthomonas utilizando a técnica
de hibridização DNA:DNA de 183 estirpes do genero Xanthomonas. Segundo
Vauterin (1995), este genero inclui 20 grupos de homologia de DNA que são
consideradas espécies genômicas. A espécie Xanthomonas campestris foi
dividida em 16 grupos de homologia de DNA (Vauterin et al., 1995). Um desses
grupos apresentou um nível elevado de homologia de DNAcom Xanthomonas
axonopodis e foi reclassificado para esta espécie. Outros 62 patovares foram
analisados e associados às espécies correspondentes baseado nos dados de hibridização DNA:DNA.
A Xanthomonas produz um polissacarídeo que é secretado para o meio extracelular na forma de muco, conhecido como xantana. A xantana é constantemente utilizada como um biopolímero industrial, comercialmente produzido com a fermentação aeróbica de Xcc (Jeanes, 1974). A goma
xantana é produzida por vários patovares de X. campestris, entretanto, no
Brasil, a Xcc tem sido a mais utilizada comercialmente para a produção desta goma, utilizada como um agente capaz de proporcionar viscosidade e
estabilização (Moreira et al., 2001).
A bactéria Xcc (Figura 3) é a responsável pela podridão negra em crucíferas e sua transmissão ocorre através de restos vegetais contaminados, sementes de plantas doentes e ervas daninhas. Além disso, Xcc pode sobreviver por vários anos em resíduos de culturas doentes que se apresentam enterrados ou sobre o solo (Goto, 1992), mas é incapaz de sobreviver mais de 60 dias livres
no solo. O genoma completo de Xcc foi determinado em 2002 (Da Silva et al.,
2002) e vários estudos de genômica funcional vêm sendo desenvolvidos
(Mehta e Rosato, 2001; 2003; Qian et al., 2005; He et al., 2006; He et al., 2009;
Villeth et al., 2009; White e Yang, 2009; Song e Yang, 2010) visando a
Figura 3. X. campestris pv. campestris em imagem obtida por meio de microscopia
eletrônica de varredura.
4. INTERAÇÃO PLANTA-PATÓGENO
O entendimento das bases genéticas e moleculares da interação planta-patógeno foi possível após os primeiros trabalhos de Harold Henry Flor (1971). Flor conceituou que para cada gene que condiciona uma reação de resistência no hospedeiro existe um gene complementar no patógeno que condiciona a avirulência. Essa interação ficou conhecida como teoria da interação gene-a-gene (Flor, 1971). Na interação gene-a-gene-a-gene-a-gene, o alelo de avirulência (avr) codifica uma molécula elicitora, que é reconhecida por um receptor específico na planta hospedeira dando início à transdução de sinais que ativam genes envolvidos na resposta de hipersensibilidade (Figura 4) (Flor, 1942).
Apesar da teoria gene-a-gene ainda vigorar geralmente a relação de interação planta-patógeno é bem mais complexa do que se imaginava e na maioria das vezes cascatas de reações com vários genes envolvidos estão envolvidas como, por exemplo, o gene XccR, um regulador do tipo LuxR de
Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc) que ativa o gene de virulência
expressão do gene XccR é modulada por um regulador de resposta do tipo NtrC, conhecido como XerR, formando assim a cascata de reação,
xerR/xccR/pip (Wang et al., 2011).
Figura 4. Figura representativa das reações que ocorrem durante a interação planta-patógeno. Baseado no esquema de Slater (2003).
O reconhecimento do fitopatógeno e seus produtos são fundamentais
para a indução da resposta e expressão dos mecanismos de resistência ou
suscetibilidade nas plantas (Cervone et al., 1989). Esse reconhecimento
Elicitor é definido como uma molécula capaz de induzir qualquer resposta de defesa (Graham e Graham, 1996). As bactérias fitopatogênicas secretam proteínas distintas em diferentes compartimentos celulares de seus hospedeiros para contornar os circuitos de defesa do hospedeiro e beneficiar a colonização do parasita (Bhavsar, Guttman e Finlay, 2007). Essa proteínas
secretadas pelos patógenos são chamadas de efetores (Hogenhout et al.,
2009). A função principal dos efetores consiste em suprimir a resposta de defesa da planta interagindo com a transdução de sinal e vias envolvidas com
as vias de reconhecimento do patógeno conhecidas como PAMPS (“ Pathogen-Associated Molecular Patterns”) (Chisholm et al., 2006). Esses efetores são
também conhecidos como genes avr (“avirulence genes”). Algumas variedades
de plantas expressam proteínas R (de resistência) que atuam contra os genes avr e desencadeiam uma resposta específica definida como reação de hipersensibilidade (HR). A HR é caracterizada pela ocorrência de morte celular
ao redor do sítio de infecção, (Staskawicz et al., 1995) além de diferentes
perturbações bioquímicas, incluindo mudanças no fluxo de íons, hiperperoxidação de lipídeos, fosforilação de proteínas, geração de óxido nítrico e uma explosão de espécies reativas de oxigênio e componentes antimicrobianos. Esta rápida resposta efetivamente impede a invasão do patógeno e previne o desenvolvimento da doença (Alfano e Collmer, 2004).
As interações planta-patógeno podem ser compatíveis ou incompatíveis. Nas interações incompatíveis, o sistema de defesa da planta é eficientemente ativado, conduzindo à resistência, enquanto que nas reações compatíveis este sistema é tardiamente ativado ou não ativado, condicionando a doença. As plantas geralmente expressam os genes de resistência (R) ao reconhecer invasores para prevenir a propagação do organismo patogênico. As plantas aperfeiçoaram mecanismos basais de resistencia, adquirindo uma imunidade
inata, tornando–as capaz de reconhecer padrões moleculares associados a
organismos patogênicos como: lipopolissacarídeos, flagelinas, quitina fúngica, oomiceto Pep-13 heptaglicosideos, transglutaminases e proteínas de bactéria
altamente conservadas (Zipfel e Felix, 2005; Halim et al., 2009; Liu et al., 2010;
Danna et al., 2011). Este mecanismo geral de defesa basal tem sido observado
maioria dos patógenos. Os agentes patôgenicos por sua vez desenvolveram estratégias para driblar essa imunidade inata impedindo a transdução de sinal, feita quando a planta é infectada (McDowell & Simon, 2008). Na interação gene-a-gene, o alelo de avirulência (avr) do patógeno codifica uma molécula elicitora, que é reconhecida por um receptor específico na planta hospedeira dando início à transdução de sinais que ativam genes envolvidos na resposta de hipersensibilidade (Figura 4.). Porém, se o patógeno não possuir o gene de avirulência, não será reconhecido pelo hospedeiro, resultando em interação compatível, a resistência ocorre quando o hospedeiro possui o gene de resistência (R) e o patógeno o gene de avirulência (avr) correspondente, levando a uma reação de hipersensibilidade, no qual as células do hospedeiro morrem logo após a infecção (Flor, 1942).
Os genes R já foram amplamente descritos na literatura, a proteína quinase Adi3, por exemplo, consiste em um supressor de morte celular e a perda da sua função tem sido correlacionada com a indução da morte celular durante a
resistência do tomate (Solanum lycopersicum) em resposta ao patógeno
Pseudomonas syringae pv. tomate. Estudos recentes demonstraram que Adi3
pode inibir a atividade quinase do complexo SnRK1 do tomate (Avila et al.,
2012). A dentificação de reguladores do processo de morte celular por hipersensibilidade (HCD) aparentemente é essencial para entender os mecanismos moleculares subjacentes à resistência a doenças de plantas. Xu (2012) conduziu um estudo, combinando proteômica e RNA interferente (RNAi). As análises foram utilizadas para identificar os genes necessários para a HCD conferida pelo gene de resistência de tomate Cf-4 e o gene de avirulência
Cladosporium fulvum Avr4. Foram encontradas quarenta e nove proteínas
diferencialmente expressas nas plântulas de tomate entre elas a Cistéina protease, Pip1, que demontrou que essas proteínas podem desempenhar um
papel geral na HCD e na imunidade da planta (Xu, Q. F. et al., 2012).
Também existem diversos trabalhos relatados na literatura sobre genes avr de Xanthomonas (Chakrabarty et al., 1997; Castañeda et al., 2005; Potnis et al., 2012), como por exemplo o gene LuxR-OryR que consiste em um regulador
transcricional do patógeno Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo). Esse gene
do genoma. Além disso, o gene OryR foi responsável por regular positivamente diversos genes, incluindo 30 genes flagelares, responsáveis pela motilidade do
patógeno (González et al., 2013). Um estudo recente demonstrou que a super
expressão do gene AvrBsT em Arabidopsis pode reduzir a susceptibilidade à infecção, já que superexpressão deste gene induz significativamente alguns
genes relacionados com a defesa a X. campestris pv. vesicatoria (Xcv) em
folhas de Arabidopsis (Hwang et al., 2012). Outro estudo baseado na técnica
de proteômica identificou proteínas envolvidas no processo de defesa pimenta
ao patógeno X. campestris pv. vesicatoria, como “ABR1” e “GRAM domain–
containing ABA-responsive protein” (Choi e Hwang, 2011). Porém os
mecanismos de ação e funcionamento desses genes na patogenicidade ainda são pouco conhecidos. Estudos mostram que a secreção de efetores tipo III por
X. campestris pv. campestris aparentemente pode ser um elemento critico para
patogenicidade (Alfano e Collmer, 2004). Os efetores tipo III da família AvrBs3 já foram relatados na literatura por contribuírem aditivamente com a
patogeniciade da X. campestris pv. armoraciae. (Kay, Boch e Bonas, 2005).
Os genes da família AvrBs3 variam em tamanho de 1,5 kb a 4,3 kb e são únicos entre os genes avr que compartilham homologias de seqüência de 95%
-98% em todo o seu comprimento (Yang et al., 1996). Em X. campestris pv.
vesicatoria o gene avrBs2 contribui para sua agressividade na infecção em
pimenta. Genes homólogos ao avrBs2 encontrados em outras Xanthomonas
também afetam a agressividade do patógeno (Kearney e Staskawicz, 1990).
Para o gene avrBs1 de Xcc foram atribuídas funções de elicitor ou podendo
modificar algumas proteínas ou outros metabólitos para produzir um elicitor sugerindo assim um papel importante na colonização do hospedeiro e na
patogênese (Brencic e Winans, 2005; Delannoy et al., 2005).
Em diversas espécies de planta sobinfecção viral, fungica ou bacteriana o desenvolvimento dos sintomas é acompanhado pelo aparecimento de uma
ou mais proteínas novas conhecidas como PRs (pathogenesis related) (Van
Loon, 1985). Tais proteínas foram primeiramente identificadas em plantas de
tabaco (Nicotiana tabacum) quando passavam por uma reação de
hipersensibilidade ao vírus TMV (tobacco mosaic virus) (Van Loon, 1985). As
PR (“pathogenesis-related”) são as proteínas de defesa em plantas mais
peroxidases e quitinases observadas em vários patosistemas (Mehta et al.,
2008). Algumas dessas PR-Proteínas encontram-se expressas, embora em baixos níveis, de forma constitutiva em plantas, ou seja, sob condições normais. Entretanto, seus níveis são aumentados quando as plantas são submetidas a condições de estresses. Há outras que, embora não sejam detectadas em condições fisiológicas normais, têm seus genes correspondentes ativados, vindo a ser detectadas nos tecidos vegetais após injúria, após o ataque de patógenos e/ou pragas e sob condições de estresses
ambientais do tipo salinidade, seca e temperaturas adversas (Colas et al.,
2012; Xu, J. et al., 2013; Xu, P. et al., 2013). Alguns estudos comprovam que
existe uma gama de proteínas que são consideradas como proteínas de defesa induzidas pelo patógeno, capazes de atenuar, controlar ou eliminar a invasão
da bactéria, fungos entre outros patógenos (Jøhnk et al., 2005; Zhang et al.,
2008; Feng et al., 2012).
Com o passar do tempo os agentes fitopatogenicos vêm desenvolvendo estratégias cada vez mais elaboradas para suprimir as respostas de defesa das plantas, tornando cada vez mais difícil o controle. O controle químico ainda tem
sido extremamente difundido. Entretanto o mesmo ainda tem sido realizado de
maneira abusiva e indevida, gerando poluição ambiental e seleção de patógenos resistentes a esses produtos (Ghni e Kimati, 2000). O uso de cultivares resistentes a patógeno consiste em uma das alternativas tecnológicas com maior eficiência e sustentabilidade.
5. FOTOSSÍNTESE NO PROCESSO DE DEFESA DA PLANTA
O crescimento das plantas é impulsionado pela fotossíntese. As folhas
usam a energia da luz para converter o CO2 em sacarose, que é exportado
Na reação dependente de luz, a energia solar é captada pelos complexos-antena e direcionada aos fotossistemas para a produção de ATP e redução de NADPH. Na reação independente de luz, estes dois produtos são consumidos pelo ciclo de redução fotossintética do carbono (Berg., 2002) a fim de reduzir o
CO2 em carboidrato. As reações dependentes de luz acontecem ao longo da
membrana do tilacoide nos cloroplastos das plantas, ao passo que as reações independentes de luz são confinadas à fase dentro do estroma do cloroplasto
(Berg et al.,2002).
Toda matéria orgânica acumulada na planta durante seu crescimento tem origem no processo fotossintético, que representa um percentual de 95% de toda sua fitomassa desidratada. Desta forma, é possível afirmar que qualquer fator ambiental ou biótico que afetar a fotossíntese afetará o crescimento e o acúmulo de fitomassa (Syvertsen e Lloyd, 1994). A maior parte do processo fotossintético realizado pelas plantas ocorre nas folhas (Larcher). Por esse motivo os danos causados nessa estrutura reduzem sua área afetando assim sua capacidade fotossintética, formando uma barreira ao desenvolvimento vegetativo e reprodutivo. Os principais agentes responsáveis pelos danos foliares são patógenos como fungos, bactérias, vírus e herbívoros
Figura 5. Reações que ocorrem durante o processo fotossintético
Diversos trabalhos mostram a alteração da fotossíntese mediante o estresse. Nebauer (2013) verificou diferenças no desempenho fotossintético e sua correlação com o crescimento entre cultivares de tomate em resposta a diferentes sais. Com a possibilidade de transformação do genoma do plastideo de tabaco, foi possível abrir o caminho para manipular o processo da fotossíntese e incorporar novos genes para o genoma de plastos em plantas (Svab e Maliga, 1993).
Um trabalho recente, relacionou a resposta fotossíntética à indução de ácido
jasmônico (JA) por herbivoria, relacionada com defesa em Nicotiana attenuata.
Concluindo que a herbivoria reduziu a fotossíntese nos dois genótipos
estudados (Nabity et al., 2013) . Kocal e colaboradores (2008) por sua vez
estudou o desenvolvimento de sintomas e inibição da fotossíntese durante a
interação compatível de tomate e X. campestris pv vesicatoria e concluiu que a
bactéria pode estar se beneficiando da baixa atividade fotossintética para
colonizar a planta hospedeira (Kocal et al., 2008).
Recentemente a melhoria do processo de fotossíntese tem sido reconhecida como uma opção adicional para que se consiga maiores rendimentos na
produção (Long et al., 2006; Parry et al., 2011).
6. ANÁLISE PROTEÔMICA ATRAVÉS DE ELETROFORESE BIDIMENSIONAL (2-DE)
Existem várias ferramentas moleculares que estão disponíveis e sendo rotineiramente utilizadas em estudos de interação planta-patógeno, como por exemplo, a análise proteômica. O termo proteômica foi introduzido no ano de 1996 e teve por definição a técnica que caracteriza em larga escala o
conjunto de proteínas expressas por um tecido ou célula (Wilkins et al.,
1997). Inicialmente, a proteômica foi utilizada para a caracterização de perfis protéicos, e posteriormente evoluiu para focar outros aspectos como a quantificação de proteínas, as interações entre proteínas e as modificações pós-traducionais (Salvato e Carvalho, 2010).
Enquanto a genômica oferece contribuições potenciais para a função celular, a proteômica fornece contribuições mais concretas. A proteômica fornece continuidade experimental entre a informação de seqüência do genoma e o perfil de proteínas em um tecido, célula ou compartimento celular específico sob diferentes condições ou tratamentos. Com o aprimoramento das técnicas de eletroforese bidimensional e espectrometria foi possível um grande avanço nos estudos de proteínas em larga escala, fortalecendo conceito de análise proteômica (Tyers e Mann, 2003).
A análise proteômica representa uma abordagem valiosa para estudar a expressão diferencial, uma vez que as diferenças reais em abundância de
proteínas no momento da amostragem podem ser observadas (Villeth et al.,
2009). Além disso, os resultados provenientes dos estudos na área de proteômica são de extrema importância para validação expressão e função a partir dos estudos de genômica e transcriptômica.
a técnica de eletroforese bidimensional identificou proteínas envolvidas na interação entre brassica e Xcc, incluindo algumas proteínas envolvidas na
fotossíntese como a ribulose 1,5-bisfosfato carboxilase / oxigenase (Villeth et
al., 2009). Outro trabalho interessante identificou, através da análise do
genoma/proteoma, treze proteínas pertencentes ao domínio Per-ARNT-Sim (PAS) que são importantes módulos de sinalização que monitoram mudanças na luz, capazes de interferir no crescimento, motilidade e
virulência da Xcc (Mao et al., 2012).
Vários estudos proteômicos foram reportados visando à identificação de proteínas relacionadas com os processos de defesa da planta. Dois estudos, por exemplo, reportaram a identificação proteínas diferencialmente
expressas durante a interação arroz e X. oryzae pv. oryzae(Chen et al.,
2007; Yu et al., 2008), e em outro trabalho, verificou-se a expressão de
proteínas de X. axonopodis pv. citri em resposta a diferentes condições de
crescimento (Mehta e Rosato, 2001). Neste trabalho objetivou-se avaliar a
resposta de plantas de repolho inoculadas com X. campestris pv. campestris
usando a técnica de eletroforese bidimensional em gel (Mehta e Rosato, 2001). Os conhecimentos sobre as interações entre Xcc e as brassicas são ainda limitados, sendo assim, este trabalho poderá elucidar o funcionamento dessa interação podendo assim futuramente ajudar no combate a infecção.
Mais recentemente, foram desenvolvidas metodologias alternativas à utilização de 2-DE, que se baseiam em técnicas de cromatografia acopladas à espectrometria de massa. O uso desta abordagem tem sido crescente, entretanto, a eletroforese bidimensional (2-DE) permanece como principal
método de escolha em análise proteômica (Abdallah et al., 2012), já que os
métodos mais novos possuem diversas limitações como por exemplo, a falta de genomas completos seqüenciados e os métodos para as validações estatísticas que ainda não estão perfeitamente estabelecidas.
7. MALDI Imaging
disponíveis conseguem responder as perguntas propostas pelos pesquisadores. A técnica de imagem por espectrometria da ionização por
dessorção a laser assistida por matriz (MALDI Imaging) é uma tecnologia
emergente que permite a investigação simultânea do teor e da distribuição espacial de uma grande variedade de determinadas biomoléculas diretamente
sobre os tecidos (Caprioli et al., 1997). Tem sido possível avaliar diferentes
tipos de moléculas através desta técnica como, por exemplo, lipídeos (Gode e
Volmer, 2013), peptídeos (M T et al., 2012) e proteínas (Mainini et al., 2013).
Essa técnica foi introduzida por Richard Caprioli e sua equipe no ano de 1997 e possui um alto desempenho em termos de resolução espacial, sensibilidade para biomoléculas intactas, permitindo avaliar alterações de estados
fisiológicos, patologias e distribuição de xenobióticos. Com o MALDI Imaging é
possivel determinar a distribuição de centenas de compostos desconhecidos em uma única medição, e a obtenção de perfis de expressão celular enquanto se mantêm a integridade celular e molecular (Meding e Walch, 2013).
Em estudos de doeças humanas o MALDI Imaging já tem sido amplamente
ultilizado em analises de tumores (Alexandrov et al., 2013; Chughtai et al.,
2013; Meding et al., 2013). No entanto, o uso de MS Imaging em estudos de
tecido vegetal permanece longe de ser um trabalho de rotina, pois ainda existe a necessidade de se adaptar protocolos de acordo com tecidos específicos a
serem analisados (Kaspar et al., 2011). Em um trabalho recente a técnica de
Imaging foi empregada em raízes e nódulos de raízes durante a fixação de
nitrogênio permitindo a detecção de uma grande variedade de ácidos orgânicos, aminoácidos, açúcares, lipídios, flavonóides e seus conjugados, destacando os benefícios do uso de MSI para detectar diferenças nas
distribuições de metabólitos em biologia vegetal (Ye et al., 2013). Outro
trabalho usou esta técnica para mostrar a distribuição espacial de
glucosinolatos em folhas de A. thaliana, mostrando que este metabolito ajuda a
controlar a herbivoria por H. armigera larvae (Shroff et al., 2008). Mais
recentemente um estudo, através de MALDI Imaging, conseguiu associar a
localização de ciclotides em maiores concentrações moduladas atraves do
comportamento alimentar herbívoro (Poth et al., 2012). Os estudos revelaram
Atualmente existem várias barreiras como o preparo da amostra, boa resolução e alta sensibilidade, que limitam o potencial da tecnologia de MALDI
imaging. Os parâmetros de análise devem ser cautelosamente escolhidos,
sendo estes passos fundamentais para que se obtenham bons resultados (Lee
et al., 2012).
8. MALDI Profiling
A espectrometria de massa (MALDI-ToF MS) possui diversas aplicações, sendo uma das aplicações mais recentes a possibilidade da
utilização para gerar “impressões digitais” de proteínas a partir de células
inteiras de micro-organismos, e identificá-los por comparação com uma base
de dados de espectros de referência (Claydon et al., 1996), também conhecida
como WC-MS (Whole-cell matrix-assisted laser desorption ionization-time of
flight mass spectrometry) (Tani et al., 2012). Estudos recentes apontam essa
técnica como uma técnica rápida e viável para a classificação e identificação de
micro-organismos (Kornienko et al., 2012; Kurokawa et al., 2013; Stets et al.,
2013). Com o software MALDI Biotyper (Bruker Daltonics) é possível obter um
perfil das proteínas abundantes encontradas em todos os organismos. Estes padrões característicos destas proteínas altamente abundantes são usados para identificar com confiabilidade e com precisão um micro-organismo particular, comparando o respectivo padrão com uma vasta base de dados. A Identificação de micro-organismos baseada em WC-MS pode resolver com precisão a identidade bacteriana no gênero, espécie e em nível de subespécie para alguns táxons dependendo da deposição de informação destas espécies no banco de dados (Welker e Moore, 2011). Esta técnica é amplamente utilizada para micro-organismos de interesse clínico com máxima eficiência (Jordana-Lluchet al., 2012). Para a identificação de micro-organismos fitopatogênicos, ainda há limitações, uma vez que o banco de dados ainda não está suficientemente alimentado com um grande número de espécies de importância para o ambiente ou sanidade vegetal. Mesmo com esta limitação,
já há relatos na literatudo sobre o uso do MALDI Profiling para identificação de
O MALDI Profiling consiste em uma técnica versátil e já foi utilizada para
diferenciação de amostras vegetais. Picariello (2012) utilizou esta técnica para diferenciar rapidamente 23 variedades diferentes de uvas através da
antocianina presente em cada variedade de uva (Picariello et al., 2012). Apesar
da utilização do MALDI Profiling para diferenciar amostras vegetais ter sido
reportado, não há ainda relatos na literatura do uso do software biotyper
JUSTIFICATIVA
As brássicas compreendem culturas de grande importância econômica e agronômica, sendo o repolho uma das mais importantes no mercado de hortaliças. A podridão negra consiste em uma doença
bacteriana causada por X. campestris pv. campestris, responsável por
grandes prejuízos na qualidade e produção de diversas hortaliças. A podridão negra é uma doença de difícil controle e fácil disseminação, e devido à ineficiência associada às formas de controle, o uso de plantas resistentes é considerada atualmente a melhor alternativa para evitar a
infecção por Xcc. Neste trabalho, foram utilizadas técnicas proteômicas
para o estudo da interação B. oleracea-Xcc. Os conhecimentos gerados
HIPÓTESE
As brássicas ao serem infectadas pelo patógeno modulam a sua expressão protéica com a finalidade de conter a infecção e por conseguinte
OBJETIVO GERAL
O objetivo deste trabalho foi analisar as proteínas diferencialmente
expressas durante a interação de B. oleracea suscetível e resistente a Xcc
através de técnicas proteômicas a fim de identificar proteínas potencialmente envolvidas na resistência a Xcc.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1. Obter plantas de B. oleracea suscetíveis e resistentes inoculadas com
Xcc.
2. Analisar a expressão diferencial de proteínas através de eletroforese bidimensional (2-DE)
3. Identificar as proteínas diferencialmente expressas por espectrometria de massa
4. Investigar a distribuição de proteínas através da análise in situ de
secções de tecido através da técnica de MALDI Imaging
MATERIAL E MÉTODOS
1. MATERIAL VEGETAL E CULTIVO DE X. campestris pv. campestris
Os genótipos de B. oleracea União (resistente à Xcc) e Kenzan, um híbrido
japonês precoce que apresentou suscetibilidade à podridão negra (Giordano,
Silva e Cordeiro, 1985) foram utilizados nesse estudo. As plantas foram
mantidas em casa de vegetação.Xcc foi cultivada em meio NYG, composto por
5 g de peptona, 3 g de extrato de levedura, 10 g de ágar e 20 mL de glicerol por
litro (Daniels et al., 1984) a 28 ºC.
2. INOCULAÇÃO DAS PLANTAS E COLETA DO MATERIAL VEGETAL
Três réplicas biológicas foram realizadas neste estudo e em cada réplica, 10 plantas de cada genótipo foram cultivadas. Quando a planta atingiu 45 dias de idade, 5 plantas de cada genótipo foram inoculadas com Xcc e 5 com água destilada (controle negativo). Para inocular as plantas, uma solução de água destilada foi utilizada e aproximadamente uma alça de platina cheia (aproximadamente 10 mg) de Xcc cultivada no meio sólido, resultando em uma
solução bacteriana com OD de aproximadamente A600 nm= 0,8 Os pecíolos das
folhas foram inoculados com esta solução, utilizando uma agulha de 12,7 mm de comprimento e 0,33 mm de calibre. Foi realizado um furo no pecíolo das folhas e depositado uma gota da solução contendo a bactéria Xcc. O material vegetal foi coletado aos 5, 10 e 15 dias após a inoculação. Todas as folhas coletadas foram imediatamente congeladas em nitrogênio líquido e armazenadas a -80 ºC (Figura 6).
3. EXTRAÇÃO DE PROTEÍNAS, QUANTIFICAÇÃO E SDS-PAGE
8.0 foi adicionado e após 15 min de agitação, as amostras foram centrifugadas por 3 min a 10.000 x g. A fase fenólica foi resgatada e transferida para outro tubo e esta etapa repetida três vezes. As proteínas foram precipitadas com 5 volumes de acetato de amônio 0,1 M em metanol, lavadas com acetona 80% e depois de secos os precipitados foram suspendidos em um tampão de solubilização (7 M uréia; 1 M tioureia; 4 % (m/v) chaps; 2 % IPG buffer com pH 4-7 L; 40 mM DTT). A quantificação da concentração final das proteínas foi realizada segundo Bradford (1976), seguida da leitura espectrofotométrica a 595 nm. Para confirmação da homogeneidade e integridade das amostras, foi realizado SDS-PAGE em gel 12% (2 mL acrilamida-Bis 30%, 1,25 ml de Tris-HCl 1,5 M pH 8,8, 50 µl de SDS 10%, 25 µL de persulfato de amônia 10 %, 3 µL de TEMED e 1,67 mL de água milli Q) (Laemmli, 1970). A eletroforese foi executada com a utilização de tampão glicina (Tris-HCl 20 mM, glicina 0,192 mM e SDS 0,1% pH 8,3).
4. ELETROFORESE BIDIMENSIONAL (2-DE)
A hidratação das tiras (Immobiline DryStrip, 11 cm, pH 4-7) foi realizada
por um período de 16 h com aproximadamente 600 μg de proteínas em 250 μl
de tampão de solubilização (7 M uréia; 2 M tioureia; 2% chaps; 2% IPG Buffer
pH 4-7 NL; 0,002% azul de bromofenol). A separação das proteínas por ponto
isoelétrico foi realizada pelo sistema de eletroforese Multiphor II (GE
Healthcare). A eletroforese foi realizada por cerca de 4:30 h, sendo que a
a utilização de tampão glicina (Tris-HCl 20 mM, glicina 0.192 mM e SDS 0.1%
pH 8.3), e do marcador de massa molecular “Benchmark Protein Ladder”
(Invitrogen). A eletroforese foi realizada por um período de aproximadamente 6 horas à temperatura ambiente. Pelo menos 5 géis de cada amostra foram preparados (Figura 6).
Figura 6. (A) Maceração das folhas coletadas para a aquisição do material vegetal para extração de proteínas. (B) Extração de proteínas utilizando fenol e tampão de extração. (C) Focalização isoelétrica das proteínas. (D) Gel bidimensional.
5. ANÁLISE DE IMAGEM.
A análise dos mapas de 2-DE foi realizada através do programa de análise
de imagem Image Master 2D Platinum℗ (GE Healthcare). Para todas as
entre as amostras utilizando um valor de p<0.05.
Figura 7. Esquema representativo referente ao delineamento experimental. Análise 01 corresponde à comparação entre genótipo União inoculado e controle. Análise 02 corresponde a comparação do genótipo Kenzan e controle. Análise 03 corresponde à comparação entre o genótipo União inoculado e Kenzan inoculado.
6. DIGESTÃO DAS PROTEÍNAS E ESPECTROMETRIA DE MASSA
A digestão das proteínas foi realizada de acordo com o protocolo descrito
por Shevchenko (1996). Os spots considerados diferenciais foram excisados
dos géis e posteriormente lavados por 15 min em 50% de acetonitrila e 25 mM
de bicarbonato de amônio (NH4HCO3), seguido de acetonitrila a 100%, por 10
min. Após a lavagem com acetonitrila, os fragmentos de géis foram secos e
reidratados por adição de 15 μL de tripsina. Aproximadamente 650 ng de
tripsina Sequencing Grade (Promega) foram previamente diluídos em 20 uL de
RESULTADOS
1. CARACTERIZAÇÃO DOS SINTOMAS
Neste trabalho, genótipos de B. oleracea resistente e suscetível a Xcc foram
avaliados. As plantas resistentes (União) apresentaram poucos sintomas após a infecção, com leve clorose em algumas folhas. No genótipo suscetível, foram observados sintomas de intensa clorose, com rápida evolução para necrose. As lesões atingiram grande parte da folha e foram observadas em todas as folhas da planta (Figura 8).
Figura 8. Plantas de B. oleracea inoculadas com Xcc. (A) Planta do genótipo
