Workshop do Projeto Própolis. Cultivo Celular aplicado à Oncologia

Cultivo Celular aplicado à

Oncologia

Cultivo celular aplicado à Oncologia

• Infraestrutura:

 Laboratório 8 – Laboratório de Embriologia Molecular e Transgênese  Laboratório 9 – Laboratório de Genômica Funcional

Laboratório de Cultivo Celular

 Sala do Cultivo:

Banco de Células GPO

Linhagens de Células Humanas

A549 Carcinoma de Pulmão 5637 Carcinoma de Bexiga

HT-29 Adenocarcinoma de Colorretal MCF-7 Adenocarcinoma de Mama MDA-MB-231 Carcinoma de Mama

MG-63 Osteossarcoma

HeLa Adenocarcinoma Cervical SH-SY5Y Neuroblastoma

LNCap Carcinoma de Prostata

HL-60 Leucemia Promielocítica Aguda

Outras Linhagens Celulares

Banco de Célula do Rio de Janeiro -BCRJ

www.bcrj.hucff.ufrj.br/

• estabelecida a partir do carcinoma da bexiga primário (grau II) de um paciente por Dr. G. Cannon em 1974;

• Meio: RPMI + 10% SFB, 37°C em 5% de CO₂

• Adenocarcinoma alveolar de células epiteliais basais

• Esta linha foi iniciado em 1972 por D.J. Giard, através da cultura de tecido de

carcinoma pulmonar de um homem;

• Meio de cultivo: DMEM + 10% SFB, a 37°C em 5% CO₂

A549 – Carcinoma de Pulmão

• Adenocarcinoma de Mama, retirada de mulher caucasiana de 69 anos, isolada em 1970;

• Possui expressão de receptores de estrogenio; • Meio: RPMI + 20% SFB, 37°C em 5% de CO₂

• Adenocarcinoma colorretal, retirada de mulher, caucasiana de 44 anos;

• Isolada em 1964 por J. Fogh de tumor primário; • Meio: DMEM + 10% SFB, 37°C em 5% de CO₂

HT-29– Adenocarcinoma de Colorretal

Realização de Experimentos no Cultivo Celular

1. Novas drogas antitumorais:

 Chalconas

2. Drogas antitumorais modificadas estruturalmente:

 Disseleneto de Difenila

3. Drogas antitumorais Nanoencapsuladas:

 Metotrexato

4. Compostos com ação antitumoral:

1. Morfologia

2. Ensaio de MTT

3. Colorações

4. Citometria de fluxo

5. Expressão Gênica

6. Western blotting

 Brometo de 3-[4,5-dimetil-tiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazólio

 Avalia a atividade metabólica das células;

• Teste de triagem:

 amplamente utilizado na avaliação do efeito

antiproliferativo de drogas tumorais;

• Baseado na capacidade das células viáveis reduzirem

metabolicamente o sal de MTT;

• Formação de cristais de formazan de cor azul-púrpura, que se

acumulam no citoplasma celular;

Cultura de células com determinado composto

Incubação do reagente MTT

Lise das células e diluição dos cristais com DMSO

Leitura por espectrofotometria

 LIVE/DEAD® Viability/Cytotoxicity Kit

• Determina a viabilidade de células de uma população com

base na integridade da membrana plasmática e atividade

intracelular de esterase;

Colorações para viabilidade celular

• Células discriminadas:

 Vivas com coloração verde da

calceína-AM (atividade esterase intracelular);

 Mortas com coloração vermelha do

etídio homodímero-1 (perda de

Controle Meio + Soro

 Guava Nexin Reagent

 Guava Cell Cycle Reagent

 Guava Multi Caspase SR Kit

 Guava® TUNEL Assay

 Membrane Permeability/Dead Cell Apoptosis Kit with

YO-PRO®-1 and PI for Flow Cytometry

 Guava Nexin Reagent

 Avaliação de apoptose inicial;

 O ensaio baseia-se na translocação da fosfatidilserina para a superfície externa da membrana celular → associado ao início da apoptose;

 Anexina V possui alta afinidade por fosfatidilserina;

 Na Apoptóse Inicial, as moléculas de fosfatidilserina são translocadas para a superfície externa da membrana celular, então Anexina V liga-se facilmente;

 O ensaio baseia-se em duas estratégias:

1) Anexina V-PE detecta fosfatidilserina na membrana de células apoptóticas;

2) 7-AAD (corante impermeável na membrana celular íntegra) penetra na membrana celular de células mortas e em apoptose tardia,

indicando integridade de membrana;

 Guava Nexin Reagent

 Céls. não apoptóticas: Annexin V(-) e 7-AAD(-)

 Céls. em Apoptose Inicial: Annexin V(+) e 7-AAD(-)  Céls. em Apoptose Tardia: Annexin V(+) e 7-AAD(+) • Gráfico:

 quadrante inferior esquerdo: céls. viáveis;

 quadrante inferior direito céls em apoptose inicial;

 Guava Cell Cycle Reagent

• Determina a percentagem de células em: G0/G1, S e G2/M com

base no conteúdo de DNA;

• Através da coloração do DNA celular com iodeto de propídio (PI);

 Células em repouso (G0/G1) contêm duas cópias de cada

cromossomo, assim como as em S: permitindo intercalação PI com

intensidade 1x de fluorescência;

 Células em Fase G2/M possuem o DNA duplicado, portanto com

intensidade 2x de fluorescência;

 Guava Cell Cycle Reagent

• Histograma:

 M1: células em G0/G1

 M2: células em S

 Guava Multi Caspase SR Kit

• Diferencia células apoptóticas de células não-apoptóticas;

• As caspase desempenham um papel central na morte celular por

apoptose;

• Caspases iniciadoras: -2, -8, -9, -10; Caspases efetoras: -3, -6, -7;

• Fluorocromos:

 sulforrodamina-valil-alanil—aspartilfluoromethylketone

(SR-VAD-FMK); a intensidade de fluorescência vermelha é proporcional a atividade de caspases;

 7-AAD é um indicador da integridade da membrana;

 Guava Multi Caspase SR Kit

• Céls. vivas: SR-VAD-FMK (-) e 7-AAD (-) → verde-azulado

• Apotose inicial: SR-VAD-FMK (+) e 7-AAD (-) → azul

• Apoptose tardia: SR-VAD-FMK (+) e 7-AAD (+) → rosa

 Guava® TUNEL Assay

 Distingue duas populações: células não apoptóticas (TUNEL-negativo) de células apoptóticas (TUNEL-positivo), através da fragmentação da cromatina nuclear;

 cadeias de DNA com a extremidade 3'-hidroxila exposta são

enzimaticamente marcadas, Desoxinucleotidil-transferase terminal (TdT) catalisa a incorporação de bromo-desoxiuridina (BrdU), TRITC conjugado anticorpo anti-BrdU marca estas fragmentações;

 M1: céls não-apoptóticas; M2: céls. apoptóticas;

 PCR em Tempo Real

1. Genes relacionados a apoptose

2. Genes relacionados ao ciclo celular

3. Genes de enzimas antioxidantes



_qRT-PCR

1. Genes apoptóticos:

 Bax  Bcl-2  Survivin

2. Genes relacionados ao ciclo celular:

 p53  p21

3. Genes de enzimas antioxidantes:

 CAT (Catalase)

 GPx (Glutationa Peroxidase)  TRX (Thioredoxina redutase-1)  GST (Glutationa-S-transferase)

 CuZn-SOD (Cobre-Zinco Superóxido Dismutase)  Mn-SOD (Manganês Superóxido Dismutase)

 AIF

 Endo G



_qRT-PCR

2. Genes relacionados ao ciclo celular:



_qRT-PCR

3. Genes de enzimas antioxidantes:

 CuZn-SOD (Cobre-Zinco Superóxido Dismutase)  Mn-SOD (Manganês Superóxido Dismutase)  CAT (Catalase)

• Avaliação do efeito antitumoral de disseleneto de difenila e duas modificações deste composto em adenocarcinoma de cólon (HT-29);

• Objetivo: testar uma cepa auxotróficas de BCG recombinante superexpressando Ag85B (BCG ΔleuD /Ag85B) na citotoxicidade em carcinoma de bexiga (5637); • Resultados: sugerem que esta modificação aumenta a citotoxicidade do BCG

• Objetivo: sintetizar e testar a citotoxicidade de seis derivados de

Nanobiotecnologia

A aplicação da Nanotecnologia na liberação de drogas possibilita a criação de novas estratégias terapêuticas, capazes de alterar o cenários

das indústrias farmacêutica e biotecnológica.

Metotrexato

Nanoformulação contendo diéster etilíco de

metotrexato

Faculdade de Farmácia da Universidade Federal do Rio Grande do Sul

Avaliação da atividade antitumoral in vitro de tretinoina

nanoencapsulada em linhagem tumoral de

adenocarcinoma de pulmão (A549)

Faculdade de Farmácia da Universidade Federal do Rio Grande do Sul

• Delineamento experimental

• Resultados Preliminares

Avaliação da atividade antitumoral in vitro da

Própolis Vermelha

Profa_{. Fabiana K Seixas}

Priscila Marques Moura de Leon

primleon@gmail.com

www.ufpel.edu.br/cenbiot

PPGB (Programa de Pós - graduação em Biotecnologia)- UFPel