UNIVERSIDADE POSITIVO
MESTRADO PROFISSIONAL EM ODONTOLOGIA CLÍNICA
ASSOCIAÇÃO ENTRE BMP2, BMP4, SMAD6 E RUNX2 E LESÕES
PERIAPICAIS PERSISTENTES
NATASCHA DOUAT HANNEGRAF
Dissertação apresentada à Universidade
Positivo como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Odontologia Clínica pelo programa de Mestrado Profissional em Odontologia Clínica.
Orientador: Prof. Dr. Flares Baratto Filho Coorientadora: Profa. Dra. Erika Calvano Küchler
Curitiba
2020
A toda a minha família, que sempre me apoiou e incentivou nessa jornada.
Aos meus pais, Vlademir e Michelle, que me deram a oportunidade de realizar esse curso e me incentivaram a vida inteira com todo o amor, segurança e exemplo. A Nayara, minha irmã, que esteve presente e me aconselhou em tudo o que pode.
Ao Vitor, que me manteve motivada, me acompanhou por todo esse caminho, e que escolheu dividir sua vida e experiências comigo.
AGRADECIMENTOS
A Vida, por me proporcionar experiências incríveis onde posso crescer, aprender e evoluir como ser humano e como profissional.
Aos meus pais, Vlademir e Michelle, por se dedicarem por inteiro em minha formação como pessoa e profissional, por me darem exemplo de amor e garra diariamente, por tornarem possíveis meus sonhos e estarem sempre ao meu lado.
A minha irmã, Nayara, por não medir esforços em me fazer perceber que eu seria capaz, em me apoiar em minhas decisões com cuidado e amor.
Ao Vitor, meu amor, que desde 2012 está ao meu lado me incentivando, acalmando, aconselhando, ensinando, apoiando, acreditando no meu potencial e sendo um parceiro de vida que me entrega carinho e amor diariamente. Junto a ele, seus pais e irmãs que se tornaram também fonte diária de amor, incentivo e exemplo.
As minhas avós, Vó Rachel e Leni, que mesmo sem estar inteiramente cientes de como funcionavam as aulas e projetos, não deixaram de me apoiar e desejar meu sucesso.
As minhas amigas Maria Eduarda, Lorena e Micheli, que se fizeram presentes apoiando, torcendo, me amparando e desejando meu sucesso até o fim.
Aos meus amigos de longa data, que tornam minha vida mais leve e divertida.
Ao meu grande amigo Vitor Bozzola, que me ajudou na construção de tabelas e análise de dados da pesquisa.
A Rafaela de Lara, minha dupla de projeto e pesquisa de mestrado, que enfrentou o desconhecido da pesquisa acadêmica comigo desde o início e sempre esteve presente e ajudando no que foi preciso.
Aos colegas do mestrado, que tornaram as aulas e aprendizados mais divertidos. A Jessica Vavassori, amiga e excelente profissional que nunca mediu esforços para me ajudar, tirar dúvidas e incentivar para me aventurar no intercâmbio e área acadêmica.
Ao Prof. Dr. Flares Baratto Filho, que além de meu Orientador, é um dos responsáveis pelo meu envolvimento com a área acadêmica e abriu portas e possibilidades profissionais.
A minha coorientadora Prof.ª Dra. Erika Calvano Küchler, que desde o início se colocou disponível a ajudar, ensinar e não me deixou desistir mesmo nos momentos em que achei que não daria conta.
A Michele Meger, responsável pelo laboratório de genética da Universidade Positivo, que nos auxiliou na extração de DNA das amostras coletadas.
Ao Jardel Mazzi Chaves, da USP-FORP (Faculdade de Odontologia de Ribeirão Preto – USP), pela parceria e desenvolvimento da coleta das amostras dessa faculdade.
Ao Lucas Ramazzotto, da USP-FORP, pela parceria e desenvolvimento dos resultados da parte genética da pesquisa.
Ao Caio Luiz, aluno da Universidade Positivo que desenvolveu a segunda análise estatística.
Aos alunos da Universidade Federal do Rio de Janeiro que fizeram parta de coleta da amostra.
Ao Prof. Dr. João Armando Brancher, que contribuiu na banca de qualificação da pesquisa.
A Prof.ª Dra. Daniela Barroso, participante da banca examinadora, por toda a colaboração e por conceder seus ensinamentos e agregar ao trabalho.
“O conhecimento serve para encantar as pessoas, não para humilhá-las.” Mário Sergio Cortella
HANNEGRAF ND. Associação entre bmp2, bmp4, smad6 e runx2 e lesões periapicais persistentes. [dissertação de mestrado]. Curitiba: Universidade Positivo; 2020.
RESUMO
O tratamento endodôntico é uma terapia realizada quando ocorre colonização do sistema de canais radiculares por microrganismos e consequente inflamação da polpa. O insucesso dessa terapia pode ocorrer devido à interação de diversos fatores, inclusive fatores genéticos do paciente. O objetivo desse estudo é avaliar se a presença de polimorfismos genéticos associados em BMP2, BMP4, SMAD6 e RUNX2 estão associados com lesão periapical persistente. Para realizar o estudo, foi recrutada uma amostra de pacientes, os quais foram submetidos à necropulpectomia em pelo menos um dente permanente com lesão periapical. Após o mínimo de um ano após finalização, foi comparada a radiografia inicial com a de acompanhamento e avaliado se houve regressão, manutenção, ou aumento do tamanho da lesão. Foram coletadas amostras de saliva desses pacientes como fonte de DNA genômico para PCR em tempo real dos polimorfismos de nucleotídeo único (SNP) em BMP2 (rs1005464 e rs235768), BMP4 (rs17563), SMAD6 (rs2119261 e rs3934908) e RUNX2 (rs1200425 e rs59983488). Em seguida foram realizados os testes razão de chance (odds ratio), e o teste do qui-quadrado ou teste exato de Fisher que não permitiram associar os genes à cicatrização de lesões. Além disso, as amostras foram posteriormente submetidas à análise de redução de dimensionalidade multifatorial, que permitiu associar a relação de SNPs da combinação BMP2 com RUNX2 e combinação BMP4 com SMAD6 com a cicatrização óssea periapical. Não houve associação entre os genótipos e alelos com lesão periapical persistente (p>0,05). O MDR determinou que os polimorfismos rs235768 (BMP2) e rs59983488 (RUNX2) foram o melhor modelo de interação SNP-SNP (consistência CV = 10/10; TBC = 0,584; p = 0,026). Conclui-se que, nesse estudo, as combinações dos polimorfismos rs235768 (BMP2) com rs59983488 (RUNX2), e rs17563 (BMP4) com rs2119261 (SMAD6) foram associadas com um alto risco de ocorrer lesão periapical persistente.
HANNEGRAF ND. Association between BMP2, BMP4, SMAD6 and RUNX2 and persistent periapical lesions. [Dissertação de Mestrado]. Curitiba: Universidade Positivo; 2020.
ABSTRACT
Endodontic treatment is a therapy performed when there is colonization of the root canal system by microorganisms and consequent inflammation. The failure of this therapy may occur due to the interaction of several factors, including patient’s genetic factors. The aim of this study is to evaluate whether the presence of genetic polymorphisms in BMP2,
BMP4, SDMAD6 and RUNX2 are associated with persistent periapical lesion. A sample of
patients was recruited, who underwent endodontic treatment of necrotic tooth in at least one permanent tooth with periapical lesion. At least one year after completion of the treatment, the initial and follow-up radiographs were compared and evaluated for regression, maintenance or increase of the lesion size. Saliva samples were collected from these patients as a source of genomic DNA for real-time PCR test of the single nucleotide polymorphisms (SNP) in BMP2 (rs1005464 and rs235768), BMP4 (rs17563), SMAD6 (rs2119261 and rs3934908) e RUNX2 (rs1200425 and rs59983488). Then, odds ratios and the chi-square test or Fisher's exact test were performed, which did not allow the association of genes with periapical healing. In addition, the samples were subsequently subjected to multifactorial dimensionality reduction analysis, which allowed the association of SNPs of the combination BMP2 with RUNX2 and combination BMP4 with SMAD6 with the periapical bone healing. There was no association between genotype and allele distribution and persistent apical periodontitis (p>0,05). The MDR determined that the polymorphisms rs235768 (BMP2) and rs59983488 (RUNX2) model of SNP-SNP interaction (consistency CV = 10/10; TBC = 0,584; p = 0,026). In conclusion, in this study the combinations of the polymorphisms rs235768 (BMP2) with rs59983488 (RUNX2) and rs17563 (BMP4) with rs2119261 (SMAD6) were associated with a higher risk of persistent apical periodontitis.
SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO ... 10 2. JUSTIFICATIVA ... 15 3. OBJETIVOS ... 16 3.1 Objetivo Geral ... 16 3.2 Objetivos específicos ... 16 4. MATERIAL E MÉTODOS ... 17 4.1 Aspectos éticos ... 17 4.2 Universo amostral... 17 4.3 Critérios de inclusão ... 18 4.4 Critérios de exclusão ... 18
4.5 Avaliação de parâmetros clínicos, sócio demográficos e radiográficos ... 18
4.6 Critérios para determinar lesão periapical persistente ... 18
4.7 Coleta de Saliva e Análise do DNA ... 19
4.8 Seleção dos Polimorfismos Genéticos e Genotipagem por PCR em tempo real ... 20
4.9 Análise estatística ... 21 5. RESULTADOS ... 23 6. DISCUSSÃO ... 28 7. CONCLUSÃO ... 31 REFERÊNCIAS ... 32 ANEXO 1 ... 43 ANEXO 2 ... 46 ANEXO 3 ... 51 ANEXO 4 ... 56
1. INTRODUÇÃO
A polpa dentária é um tecido conjuntivo frouxo altamente inervado e vascularizado que apresenta capacidade de defesa diante de estímulos nocivos, seja pela formação de dentina esclerótica por meio da calcificação dos túbulos dentinários, o que isola o dente do agente agressor, pela deposição de dentina reacionária pelos odontoblastos (Lee et al., 2006), ou pela diminuição da permeabilidade dentinária (Cohen & Hargreaves, 2007). Quando esse tecido é contaminado por microrganismos, por via periodontal, denominada anacorética ou exposição pulpar direta, ocorre uma reação inflamatória que, se não controlada, pode evoluir para uma infecção crônica dos tecidos periapicais (Graves et al., 2011).
A periodontite apical aguda é uma inflamação que acomete os tecidos perirradiculares, como uma resposta imunológica frente à progressão e manutenção de infecções endodônticas bacterianas sem tratamento ou com tratamento ineficiente (Hernádi et al., 2013). Essa condição apresenta mais de um desfecho possível: cicatrização espontânea; intensificação da infecção com disseminação para o osso (abscesso alveolar); exposição ao exterior (aparecimento de fístula); ou cronicidade (Nair, 2004). A evolução de cada caso dependerá de diversos fatores, desde a correta instrumentação mecânica durante o tratamento endodôntico, uso correto de soluções irrigantes para desinfecção do sistema de canais radiculares até a qualidade do protocolo restaurador e selamento final (Versiani et al., 2013; De Deus et al., 2015; Kang et al., 2016; Alves et al., 2016; Leoni et al., 2017; He et al., 2017). Sjögren et al. (1997) e Chugal e Spangberg (2001) mostraram que os dois principais fatores que tem tido impacto direto nos resultados do tratamento são infecção do canal radicular no momento da obturação e lesão periapical presente no pré-tratamento, e no pós operatório os motivos para insucesso podem se dar devido a presença de perfurações na raiz do dente, fratura de instrumentos e falta de qualidade na obturação, além da presença de biofilme dental no ápice do dente (Lin et al., 2005; Pedro et al., 2016; Chugal e Spangberg, 2001). Além dos cuidados durante o preparo biomecânico, o resultado final depende também da relação entre resistência do hospedeiro e virulência dos microrganismos, ou ainda fatores não microbianos (Lopes & Siqueira, 2004).
A lesão periapical é uma resposta imunoinflamatória localizada, decorrente da contaminação dos canais radiculares por microrganismos, e é composta por um infiltrado inflamatório misto, composto basicamente por neutrófilos, linfócitos T e B, plasmócitos e
macrófagos (Yu & Stashenko, 1987; Stashenko & Yu, 1989; Yamasaki et al., 1994; Kawashima & Stashenko, 1999; Liapatas et al., 2003). Durante a resposta inflamatória, vários tipos de células de defesa especializadas invadem o local e liberam citocinas pró-inflamatórias, quimiotáticas, leucotrienos e prostaglandinas, as quais intensificam a resposta vascular local, reabsorção e degradação óssea, podendo colocar o corpo em alerta para tentar se defender. Após a inflamação periapical, o objetivo do tratamento endodôntico é a regeneração do tecido periapical perdido, que apenas será alcançado com nova deposição óssea, novo cemento e novo ligamento periodontal na região por parte do sistema imune (Maeda et al., 2004).
Quando ocorre uma lesão em tecido ósseo o sistema imune humano tende a recorrer a um processo de regeneração espontânea que, quando bem sucedida, restabelece a anatomia e função do local agredido. A regeneração óssea é um processo dependente de diversos fatores, como a existência de vascularização adequada, estabilidade mecânica, dimensão da área a ser regenerada e ausência de células que dificultem o processo. Além dessas condições, é necessário que haja a presença de células osteogênicas percursoras, fatores de crescimento e também de elementos osteoindutores, como, por exemplo, as proteínas morfogenéticas ósseas (BMPs – Bone Morphogenetic Protein) (Sousa, 2011).
O processo de regeneração óssea ocorre em fases, sendo que uma delas é denominada “osteoindução”. Esse mecanismo faz a diferenciação de células osteoprogenitoras maduras e de células induzíveis, as quais estão em menor estado de diferenciação e necessitam da ação de osteoindutores, como as BMPs. Com a ação das proteínas morfogenéticas ósseas essas células sofrerão diferenciação para osteoblastos (células maduras que fazem formação e deposição óssea) e posteriormente proliferação (Aldecoa, 2001; Sousa 2011).
As BMPs foram citadas em 1960 na investigação de Marshall Urist, que descobriu a capacidade dessas proteínas de induzir a formação óssea. Elas pertencem à superfamília dos TGF-β (Transforming Growth Factor β – Fator Transformador de Crescimento Beta) e, para que atuem corretamente na remodelação óssea, dependem também da atuação de seus antagonistas que levam a um equilíbrio entre reabsorção e deposição óssea (Abe, 2006). A família BMP é composta da BMP2 à BMP18, sendo que, segundo Sieber et al. (2009), quando há ausência das BMP2 e BMP4 no corpo humano são encontrados múltiplos defeitos no sistema esquelético, concluindo sua importância no processo de formação óssea.
Diversos estudos tem mostrado a eficiência da BMP2 no processo de indução e formação óssea (Sawada et al., 2009; Ko et al., 2010; Tada et al., 2010; Miyaji et al., 2010; Maeda et al., 2010; Barnouti et al., 2011; Matsumoto et al., 2014), levando a crer que essa proteína é indispensável nos processos de lesões endodônticas crônicas, onde é necessário que o sistema imune tenha força para recuperar o osso periapical perdido no processo de infecção.
A proteína morfogenética óssea 4 (BMP4) também tem se mostrado presente em alguns processos de diferenciação de células e desenvolvimento ósseo e dental. Quando se trata de desenvolvimento dental, a BMP4 aparece no processo de diferenciação de
odontoblastos (Aberg, Wozney e Thesleff, 1997;Nakashima et al., 1999; Heikinheimo, 1994)
e na indução de dentina reparadora (Nakashima, 1990; Nakashima, 1994; Nakashima, 1994; Lianjia, Yuhao e White, 1993; Rutherford et al., 1993; Rutherford et al., 1994; Six, Lasfargues e Goldberg, 2002; Decup et al., 2000; Goldberg et al., 2001). Além disso, promove o desenvolvimento do osso alveolar a partir do estímulo do folículo dental (Ou et
al., 2014), participa do desenvolvimento dentário, indução óssea (Bandyopadhyay et al.,
2006; Pregizer e Mortlock, 2014; Swarup et al., 2018; Hughes et al., 1995; Barnouti et al., 2011)e reparo de fraturas (Swarup et al., 2018).
Ainda em relação ao processo de funcionamento das BMPs, existe a subclasse proteica das SMADs, as quais são proteínas de vias de sinalização divididas em R-Smad (Smad regulada pelo receptor), Co-Smad (Mediador comum de Smad) e I-Smad (Smad inibitória) (Abe, 2006; Bessa et al., 2008; Sieber et al., 2009). Quando da ligação das BMPs aos seus receptores específicos, pode haver ativação dessas vias de sinalização. Essas proteínas possuem dois domínios, um responsável pela ligação do DNA e a outras proteínas, e outro domínio que intervém na especificidade das R-smads, reconhecimento do receptor, importação para o núcleo, oligomerização da Smad e fosforilação da zona C-terminal da proteína (Sieber et al., 2009). As R-Smads, quando ativadas, se unem às Co-Smads (Smad4) e se translocam para o núcleo onde se ligam a uma série de promotores para regular a transcrição de alguns genes específicos. As I-smads competem com as R-Smads pela zona de ligação, podendo causar conflito com a Smad4 e diminuir sua disponibilidade. A Smad6 faz parte da família das I-Smads e pode inibir a sinalização das BMPs no núcleo por interagir com repressores de transcrição (Bessa et al., 2008; Sieber et al.2009).
O RUNX2 é um fator de transcrição específico para osteoblastos, necessário para a diferenciação de células mesenquimais pluripotentes em osteoblastos (Ducy et al., 1997) e é
ativo também em osteoblastos maduros para manter a expressão dos genes de proteínas da matriz óssea (Ducy et al., 1999). A presença de RUNX2 em células totalmente diferenciadas apoia o conceito de que o RUNX2 também é necessário para manter células totalmente funcionais, pelo menos no osso (Ducy et al., 1997; Ducy et al., 1999; Quack et al., 1999). RUNX2 é regulado, em parte, através de um loop de feedback negativo pela atividade da proteína RUNX2 em seu próprio promotor, para controlar variações na expressão e função dos genes durante a osteogênese. Esse fator de transcrição desempenha um papel central na coordenação de várias vias de sinalização que afetam a diferenciação dos osteoblastos, e consequente presença ou ausência de formação óssea (Derynck et al., 1998).
Em resumo, quando existe a necessidade da formação óssea ocorre diferenciação dos osteoblastos, a qual é regulada por citocinas e moléculas sinalizadoras associadas. As BMPs e o TGF-β atuam nas células mesenquimais não diferenciadas e fosforilam o R-Smad através de seus receptores, que irá interagir com o Smad4 e translocar-se para o núcleo (Derynck et al., 1998; Shi e Massague, 2003). Em seguida, o RUNX2, fator de transcrição essencial para a diferenciação de osteoblastos, será induzido nas células osteogênicas e haverá a regulação da expressão de proteínas da matriz óssea e posterior formação e alinhamento de tecido ósseo (Lian et al., 2004).
Em endodontia, quando há a presença das lesões crônicas supracitadas, acredita-se que quando há resolução da inflamação apical, via tratamento endodôntico, a atividade de reabsorção óssea é cessada. A partir desse momento, o processo de cicatrização óssea se inicia provavelmente devido à presença de células com potencial para se diferenciar em células osteogênicas e seus devidos meios de ação (Maeda et al., 2004).
Diferenças na sequência do DNA são consideradas normais, e quando são encontradas em mais de 1% da população mundial recebem o nome de polimorfismos genéticos. O tipo mais comum de polimorfismo genético é chamado de polimorfismo de nucleotídeo único, polimorfismo de transição ou SNPs, do inglês Single Nucleotide Polymorphism, onde ocorre a substituição de um nucleotídeo por outro, acarretando a troca de um único par de bases, podendo afetar a expressão de proteínas, a estrutura e função de um gene. A maioria dos SNPs ocorrem em espaços intergênicos ou em componentes não codificadores de genes, não ocasionando repercussão funcional. Entretanto, alguns polimorfismos podem ser encontrados em regiões promotoras, codificadoras ou regulatórias do genoma, afetando a expressão gênica e proteica, influenciando a estabilidade do RNAm (Messenger Ribonucleic Acid) e a
eficiência do processo de tradução, alterando a síntese de uma proteína e podendo alterar algum processo biológico, como a resposta inflamatória para um agente microbiano específico, o que pode ter íntima relação com a etiopatogenia das alterações pulpares e periapicais, uma vez que SNPs de alguns genes podem aumentar ou diminuir o risco do paciente na expressão fenotípica da doença (Chasman e Adams, 2001; Takashiba e Naruishi, 2006).
Apesar de estudos prévios terem avaliado a influência de polimorfismos genéticos na etiopatogenia das lesões periapicais (de Sá et al., 2003; de Sá et al., 2007; Siqueira et al., 2009; Morsani et al., 2011; Siqueira et al., 2011; Salazar-Pelaéz et al., 2012; Menezes-Silva
et al., 2012; Pasqualini et al., 2012; Amaya et al., 2013; Rôças, 2014; Dill et al., 2015;
Evrosimovska et al., 2015; Trombone et al., 2016; Maheshwari et al., 2016; Özan, 2016; Salles et al., 2018) , poucos avaliaram o papel das BMP2, BMP4, SMAD6 e RUNX2 e seus polimorfismos genéticos na resposta do hospedeiro ao tratamento endodôntico (Maeda et
al.¸2004, Xia et al., 2013; Park et al., 2019). Atualmente, pouco se sabe sobre os mecanismos
moleculares durante a resposta, progressão ou regressão das lesões ósseas decorrentes de infecção bacteriana via canal radicular (Maheshwari et al., 2016; Virtej et al., 2016). Por isso há necessidade de novas pesquisas buscando o melhor entendimento desses mecanismos e seus efeitos biológicos, bem como sua influência na resposta do hospedeiro frente a esse tipo de agressão ao organismo.
2. JUSTIFICATIVA
Estudos têm mostrado a expressão e função das BMP2, BMP4, SMAD6 e RUNX2 no processo de formação e regeneração óssea, que agem inclusive em casos de lesões periapicais crônicas em endodontia. Mesmo cumprindo todo o protocolo do tratamento endodôntico e seus requisitos desejados, existe ainda uma parcela de pacientes que não apresenta sucesso no tratamento endodôntico, fazendo-se necessário o estudo de fatores intrínsecos ao paciente, relacionados ao sucesso ou insucesso do tratamento, ou ainda ausência ou deficiência dos fatores supracitados.
3. OBJETIVOS
3.1 Objetivo Geral
Avaliar a associação de polimorfismos genéticos em BMP2, BMP4, SMAD6 e RUNX2 com o reparo de lesões periapicais persistentes após o tratamento endodôntico.
3.2 Objetivos específicos
Avaliar os fatores associados à lesões periapicais persistentes.
Avaliar a associação de BMP2, BMP4, SMAD6 e RUNX2 com lesões periapicais
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Aspectos éticos
O projeto da pesquisa foi inicialmente encaminhado para aprovação no comitê de ética da Universidade Positivo (UNICENP), e foi aprovado através do parecer substanciado do CEP (3.045.889) (Anexo 1). Os pacientes e/ou responsáveis foram informados sobre a pesquisa e seus objetivos por meio da Carta de Informação ao Participante da Pesquisa e foram incluídos neste estudo após lerem e assinarem o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) (Anexo 2) e, no caso de participantes menores de 18 anos de idade, o Termo de Assentimento (Anexo 3).
4.2 Universo amostral
A amostra foi constituída de 272 pacientes que realizaram tratamento endodôntico nas dependências da Universidade Positivo (UP), na Faculdade de Odontologia de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo (FORP/USP) e na Universidade Federal Fluminense (UFF) (Figura 1), caracterizando-se como um estudo multicêntrico.
4.3 Critérios de inclusão
O participante precisou apresentar ao menos um dente permanente com tratamento endodôntico radical e com lesão periapical na radiografia inicial (necropulpectomia II), sendo que o tratamento deve ter sido finalizado há pelo menos um ano. Caso não haja regressão ou houver apenas pequena diminuição do tamanho da lesão após 1 ano do final do tratamento, pode-se considerar como deficiência de reparo (European Society of Endodontology, 2006), o que definimos como lesão periapical persistente nesse trabalho.
4.4 Critérios de exclusão
Pacientes portadores de síndromes, ou com condição sistêmica grave como neoplasias malignas, doenças degenerativas, ou doenças de origem neurológica, e pacientes com necessidade de tratamento endodôntico em dentes decíduos.
4.5 Avaliação de parâmetros clínicos, sócio demográficos e radiográficos
Foram preenchidas fichas com dados referentes à anamnese, exame físico intrabucal, história médica atual e pregressa, e sócio demográficos (Anexo 4). Imagens radiográficas pré e pós-operatórias foram utilizadas para a análise dos casos.
4.6 Critérios para determinar lesão periapical persistente
Foram consideradas lesões periapicais persistentes aquelas em que, após no mínimo de um ano, na avaliação radiográfica observou-se aparentemente o sistema de canais bem obturado e não houve regressão completa da lesão radiograficamente, ou que a lesão manteve o mesmo tamanho ou aumento de tamanho, ou ainda presença de algum sinal clínico típico decorrente de lesão periapical, ou seja, sintomatologia dolorosa, fístula ou edema. Quando
não há regressão ou houver apenas pequena diminuição do tamanho da lesão após 1 ano do final do tratamento, pode-se considerar como deficiência de reparo (European Society of Endodontology, 2006), o que definimos como lesão periapical persistente nesse trabalho.
4.7 Coleta de Saliva e Análise do DNA
Para esta etapa, foram coletadas amostras de saliva como fonte de DNA genômico, seguindo protocolo previamente publicado (Küchler et al.; 2012). Para a coleta, os indivíduos realizaram um bochecho com 5mL de solução salina 5% durante 1 minuto, e todo o volume do bochecho foi acondicionado em tubos para centrífuga de 15 mL (Corning Inc., Corning, NY, EUA) e mantidos em geladeira.
Para a extração do DNA, cada tubo contendo a coleta de saliva foi então centrifugado a 3500 rpm durante 10 minutos para sedimentação do pellet de células. O sobrenadante foi descartado em hipoclorito de sódio de 2,5% e o pellet ressuspendido em 1mL de tampão de extração (Tris-HCl 10mM, pH 7.8; EDTA 5mM; SDS 0.5%). Posteriormente, a amostra foi transferida para um tubo eppendorf de 1,5mL e então congelado a -20º C até o momento da extração do DNA.
Posteriormente, as amostras foram descongeladas e incubadas com 100ng/mL [4µL de Proteinase K (Fungal, Invitrogen Laboratories, Cat nº25530-015) à 25mg/mL] em banho-maria a 56º C overnight e então submetidas a processos de precipitação utilizando-se 400µL de solução de acetato de amônio a 10M. A seguir, todos os tubos foram: agitados manualmente por 5 minutos; centrifugados por 15 minutos em 12000 rpm e o sobrenadante dividido em dois tubos eppendorf de 700µL cada. O mesmo volume de álcool isopropílico gelado (700µL) foi adicionado em cada tubo e agitado vigorosamente.
A formação de "nuvem de DNA” foi observada após período de incubação a -20ºC, posteriormente os tubos foram submetidos a centrifugação por 20 minutos em 12000 rpm a 4ºC. O sobrenadante foi então descartado com cuidado para não deslocar o pellet de DNA e 1mL de etanol 70% gelado foi adicionado para posterior centrifugação por 15 minutos em 12000 rpm 4ºC. Posteriormente o sobrenadante foi descartado e o tubo ficou aberto e emborcado em papel para secar por pelo menos 30 minutos e evaporar o excesso de etanol
70%. O pellet de DNA foi ressuspendido em 50 µL de tampão de extração (TE) e congelado a -20ºC.
A quantificação do DNA por densidade óptica foi realizada em espectrofotômetro NanoDrop™One (Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, EUA) utilizando-se 1 µL do produto da extração. A concentração de RNA foi determinada a partir de análise de absorbância a 260 nm e, com base nas leituras a 280 nm, a qualidade da amostra foi avaliada usando a razão A260/A280, com valores dessa razão próximos a 2,0 sendo considerados como indicativos de alta pureza.
4.8 Seleção dos Polimorfismos Genéticos e Genotipagem por PCR em tempo real
Foram selecionados polimorfismos em BMP2 (rs1005464 e rs235768), BMP4 (rs17563), SMAD6 (rs2119261 e rs3934908) e RUNX2 (rs1200425 e rs59983488) que se classificaram como potencialmente funcionais, com frequência do alelo menor (Minor Allele Frequency), ou seja, a frequência apresentada pelo alelo menos presente nessa população, de pelo menos 10%. Desta forma, o ensaio de genotipagem dos polimorfismos selecionados foi executado segundo o método de PCR em tempo real utilizando ensaios Taqman® de discriminação alélica adquiridos da empresa Applied Biosystems (Foster City, Califórnia, EUA) em conjunto com uma solução denominada Taqman™ Genotyping Master Mix®. Cada ensaio inclui um par de primers flanqueadores da região do polimorfismo, bem como sondas específicas para a identificação dos alelos, compostas de dois oligonucleotídeos – desenhados para cada sequência resultante da mudança de base – conjugados com fluoróforos que emitem fluorescência em comprimentos de ondas diferentes, denominados VIC™ e FAM™.
As amostras previamente quantificadas foram utilizadas com a concentração de 4 ng/µL. Foram usados 1,5 µL, pipetados individualmente diretamente no fundo de placas de 96 poços e postos para secar em temperatura ambiente. Cada placa ainda contava com um poço que permaneceu vazio nessa etapa para poder atuar como controle negativo da reação. Após secagem completa, cada poço recebeu 0,08 µL do ensaio TaqMan®, 1,5 µL de TaqMan™ Genotyping Master Mix® e 2,52 µL de água deionizada purificada em sistema Milli-Q ® (Millipore Corporation, Burlington, Massachusetts, EUA). Cada placa preenchida foi selada com filme transparente e submetida ao equipamento de RT-PCR para o processo de
termociclagem. O protocolo para a ciclagem da temperatura seguiu a programação já estabelecida no aparelho sob o nome de Genotyping, que consistia de quatro etapas: a etapa pré-PCR, composta de um aquecimento até 60ºC ficando estável nessa temperatura por 30 segundos para uma leitura inicial; a etapa de desnaturação, que aqueceu as amostras até 95ºC e manteve a temperatura por 10 minutos para que ocorresse a desnaturação da dupla fita de DNA e ativação da enzima DNA polimerase; a etapa de ciclagem de temperatura, caracterizada por 40 ciclos em que a temperatura era alternada entre 95ºC por 15 segundos e 60ºC por 1 minuto – durante essa etapa ocorre a hibridização dos primers e sondas (fase de anelamento) seguida da síntese da nova fita (fase de extensão) e consequente liberação do sinal fluorescente, que é captado pelo aparelho ao fim de cada ciclo – e por fim uma última etapa de leitura pós-PCR a 60ºC por 30 segundos.
Foi utilizado o aparelho StepOnePlus™ Real-Time PCR System (Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, EUA) para a termociclagem e detecção de fluorescência, sendo que a partir dela o software fornecido junto com o equipamento permitiu efetuar a discriminação alélica das amostras.
4.9 Análise estatística
Para a análise estatística de genética epidemiológica foi utilizado o software Epi Info 3.5. Foram utilizados a razão de chance (odds ratio), o teste do qui-quadrado ou teste exato de Fisher para avaliar se algum perfil genotípico foi preferencialmente associado com algum determinado grupo (‘sem lesão periapical’ e ‘com lesão periapical persistente’). O nível de significância utilizado foi o de 5%.
Além disso, posteriormente foi utilizado o método de redução de dimensionalidade multifatorial (MDR), proposto inicialmente por Ritchie et al., (2001), o qual foi aplicado para identificar com precisão as interações SNP-SNP (interações dos polimorfismo de nucleotídeo único entre si). Resumidamente, o MDR é um método sem modelo e não paramétrico que analisa todas as combinações possíveis de SNPs (polimorfismos de nucleotídeos únicos), para determinar um status de doença dicotômica. O MDR realiza 10 vezes a validação cruzada (CV) e calcula a proporção de casos a serem controlados para cada combinação, diferenciando-se nos genótipos de risco "alto" ou "baixo" para a doença. Além disso, a análise
mostra o teste de precisão balanceada (TBC), que calcula a proporção de indivíduos que são classificados corretamente como um caso ou um controle. O teste de permutação de 1000 determinou significância estatística para os modelos. Neste estudo, modelos com consistência 9/10 ou 10/10 CV, TBC> 0,55 ep ≤ 0,05 foram considerados os melhores modelos. O valor de OR dos genótipos foi calculado seguindo o método descrito por Chung et al., (2007).
5. RESULTADOS
A Figura 2 apresenta a distribuição das características da amostra de acordo com os grupos LPP (Lesão periapical persistente) e reparado. No total, 110 pertencem ao grupo LPP e 162 ao grupo Reparado. Dentro do grupo LPP, 76 são do gênero feminino e 34 do masculino, e no grupo Reparado são 114 do gênero feminino e 48 do masculino.
A média de idade da amostra foi de 46 (dp13,5) anos, onde no grupo de LPP a média foi 45 (dp13,2) e no grupo Reparado a média foi 47 (dp13,8). Quando avaliado a presença ou não de doenças sistêmicas, houve presença de doença sistêmica em 68 pacientes e ausência em 121, sendo que no grupo LPP 29 possuem alguma doença e 50 não possuem, e no grupo Reparado 39 possuem alguma doença e 71 não possuem doença sistêmica, conforme mostra a tabela 1.
A tabela 2 apresenta a distribuição genotípica dos polimorfismos genéticos em BMP2 (rs1005464 e rs235768), BMP4 (rs17563), SMAD6 (rs2119261 e rs3934908) e RUNX2 (rs1200425 e rs59983488). Não houve associação estatística com a distribuição genotípica de nenhum dos polimorfismos estudados (p>0,05).
Figura 2 - Distribuição das características da amostra
CARACTERÍSTICAS N (Total = 272) LPP (n = 110) Reparado (n = 162) IDADE Média (desvio-padrão) 46 (13,5) 45 (13,2) 47 (13,8) (mín-máx) (16-83) (18-83) (16-83) DOENÇA SISTÊMICA Sim 83 (31%) 36 (33%) 47 (29%) Não 189 (69%) 74 (67%) 115 (71%)
Tabela 2. Distribuição genotípica de acordo com os grupos
Gene
(Polimorfismo) Grupos Genótipos, n (%) p-valor
BMP2 AA AG GG (rs1005464) LPP Reparado 3 (2,78%) 6 (3,92%) 25 (23,15%) 48 (31,37%) 80 (74,07%) 99 (64,71%) 0,275 AA AT TT (rs235768) LPP Reparado 8 (7,27%) 13 (8,44%) 53 (48,18%) 61 (39,61%) 49 (44,55%) 80 (51,95%) 0,382 BMP4 AA AG GG (rs17563) LPP Reparado 32 (29,63%) 46 (29,87%) 57 (52,78%) 86 (55,84%) 19 (17,59%) 22 (14,29%) 0,758 RUNX2 AA AG GG (rs1200425) LPP Reparado 23 (20,91%) 31 (20,00%) 57 (51,82%) 71 (45,81%) 30 (27,27%) 53 (34,19%) 0,474 GG GT TT (rs59983488) LPP Reparado 77 (70,00%) 114 (74,03%) 28 (25,45%) 38 (24,68%) 5 (4,55%) 2 (1,30%) 0,257 SMAD6 CC CT TT
(rs2119261) LPP Reparado 40 (36,36%) 48 (30,97%) 48 (43,64%) 75 (48,39%) 22 (20,00%) 32 (20,65%) 0,286 CC CT TT (rs3934908) LPP Reparado 30 (27,52%) 38 (24,68%) 60 (55,05%) 85 (55,19%) 19 (17,43%) 31 (20,13%) 0,800
O MDR determinou que os polimorfismos rs235768 (BMP2) e rs59983488 (RUNX2) foram o melhor modelo de interação SNP-SNP (consistência CV = 10/10; TBC = 0,584; p = 0,026). No entanto, este estudo também considerou os modelos rs17563 (BMP4) e rs2119261 (SMAD6) para análise devido ao bom escore (consistência CV = 10/10; TBC = 0,580; p = 0,031) e forte interação no modelo epistático. Mais detalhes na tabela 3.
Os genótipos de alto e baixo risco para cada modelo são demonstrados na figura 3, e os valores de OR estão na tabela 4. No modelo rs235768 (BMP2) e rs59983488 (RUNX2), os genótipos de alto risco mais representativos foram TT + TT (OR = 4,36) e TT + GT (OR = 1,53), enquanto os principais genótipos de baixo risco foram AT + GT (OR = 0,61) e TT + GG (OR = 0,73). No modelo rs17563 (BMP4) e rs2119261 (SMAD6), GG + TT (OR = 2,63) e Tabela 3. Resumo dos resultados da análise MDR
Número do
locus Melhor combinação CV* TA**
Valor p*** 2 rs235768 (BMP2) x rs59983488 (RUNX2) 10/10 0,584 0,026 rs17563 (BMP4) x rs2119261 (SMAD6) 10/10 0,580 0,031 3 rs17563 (BMP4) x rs3934908 (SMAD6) x rs2119261 (SMAD6) 5/10 0,5478 0,204 4 rs17563 (BMP4) x rs1200425 (RUNX2) x rs3934908 (SMAD6) x rs2119261 (SMAD6) 4/10 0,4754 0,964 5 rs1005464 (BMP2) x rs17563 (BMP4) x rs1200425 (RUNX2) x rs3934908 (SMAD6) x rs2119261 (SMAD6) 2/10 0,511 0,754 6 rs235768 (BMP2) x rs1005464 (BMP2) x rs17563 (BMP4) x rs1200425 (RUNX2) x rs3934908 (SMAD6) x rs2119261 (SMAD6) 9/10 0,4467 0,999 7 rs235768 (BMP2) x rs1005464 (BMP2) x rs17563 (BMP4) x rs59983488 (RUNX2) x rs1200425 (RUNX2) x rs3934908 (SMAD6) x rs2119261 (SMAD6) 10/10 0,4579 0,999 * Cross-validation consistency ** Testing Accuracy
GG + CC (OR = 1,54) foram os genótipos de alto risco mais representativos, e AG + TT (OR = 0,36) e GG + CT (OR = 0,40) foram os principais genótipos de baixo risco.
Figura 3. Distribuição dos genótipos de alto e baixo risco nos modelos rs235768 (BMP2) x rs59983488 (RUNX2) (A) e rs17563 (BMP4) x modelo rs2119261 (SMAD6) (B). Os genótipos de alto risco estão em um tom mais escuro, enquanto os genótipos de baixo risco estão em um tom de cinza claro. A barra cinza escuro da esquerda nas caixas representa a porcentagem de indivíduos com LPP e a barra cinza claro da direita representa a porcentagem de indivíduos reparados.
Tabela 4. Valores de OR – Valores para cada melhor modelo.
rs235768 (BMP2) x rs59983488 (RUNX2) rs17563 (BMP4) x rs2119261 (SMAD6) rs235768 (BMP2) rs59983488 (RUNX2) Frequência de célula* ODDS RATIO rs17563 (BMP4) rs2119261 (SMAD6) Frequência de célula* ODDS RATIO TT GG 28:57 0,73 GG TT 6:3 2,63 TT GT 18:17 1,53 GG CC 10:8 1,54 TT TT 3:1 4,36 AA CT 20:20 1,35 AT GG 39:41 1,33 AG CC 20:24 1,26 AT GT 9:19 0,61 AG CT 24:40 0,88 AT TT 0:1 - AA CC 7:14 0,66 AA GG 6:11 0,81 AA TT 5:12 0,53 AA GT 1:1 1,35 GG CT 3:10 0,40 AA TT 1:0 - AG TT 10:17 0,36
As medidas de entropia entre os SNPs foram calculadas para obter efeitos epistáticos. Na figura 4, o dendograma (A) e o mapa de interação (B) mostram forte interação e sinergia entre os melhores modelos selecionados.
Figura 4: Efeitos da epistasia.
A) O dendograma é construído de tal maneira que a chave dos SNPs que interagiu fortemente está mais para a direita, em vez da chave dos SNPs que interagiram fracamente, que estão mais à esquerda.
B) O mapa de interação descreve o ganho de informação, que é a porcentagem da entropia. Os valores dentro dos nós são a entropia percentual dos SNPs individuais sobre a lesão periapical persistente e os valores entre os nós indicam a entropia percentual resultante da combinação. A sinergia é indicada pelas linhas vermelha e laranja. Isso significa que o efeito da interação SNP-SNP é maior que a soma dos efeitos de cada SNP fornecido isoladamente. O oposto, indicado pelas linhas verde-amarela ou verde, é chamado de redundância.
6. DISCUSSÃO
Esse estudo teve como objetivo investigar o papel de SNPs nos genes BMP2, BMP4,
RUNX2 e SMAD6 avaliando sua associação com a cicatrização óssea periapical em dentes
tratados endodonticamente, onde os resultados não permitiram associar esses genes com a reparação.
Em se tratando de resultados em endodontia, pode-se dizer que essa situação é multifatorial, pois diversos detalhes prévios, durante e após o tratamento têm que ser considerados. Situações como presença de doença periodontal, biofilme periapical, sanificação suficiente do sistema de canais radiculares, obturação sem falhas, uso ou não de medicação intracanal entre sessões, correta restauração após a finalização da endodontia, condição sistêmica e imune do paciente, entre outros fatores podem interferir no resultado final da cicatrização ou não de lesões periapicais. Em alguns casos, mesmo sendo severamente seguidos os protocolos de endodontia, com sucesso na obturação e restauração, e ausência de doença periodontal, alguns casos não cicatrizam após algum tempo de acompanhamento. Sabendo dessa multifatorialidade, tem se pesquisado a possibilidade de fatores genéticos também interferirem nessa condição, como foi o caso desse estudo.
A ação das proteínas morfogenéticas ósseas 2 e 4 como auxiliares e formadores de matriz óssea inicia-se na formação do esqueleto humano (Pregizer e Mortlock, 2014). Além da formação óssea do esqueleto, Ou et al. (2014) realizaram um estudo onde fizeram tratamento de germes dentários de ratos com soluções de BMP2 e BMP4, o que resultou em aceleração da formação de osso alveolar da região. Além dessa análise, os mesmos pesquisadores encontraram aumento da produção de RUNX2 nos folículos tratados com BMP2 e BMP4 mostrando sua importância na produção e maturação óssea. Além disso, outros estudos mostraram que o uso de alguns cimentos endodônticos ou ainda de materiais para capeamento pulpar podem induzir a produção de BMP2 e BMP4 e auxiliar também na cicatrização óssea (Tada et al., 2010 e Maeda et al., 2010; Xia et al., 2013). Somado a isso, outros estudos também mostraram a associação de BMP2 com formação óssea relacionada à região de cabeça (Maeda et al., 2010; Barnouti et al., 2011; Sousa, 2011; Hughes et al., 2014).
Em 2019, Park et al. mostraram em sua pesquisa que outro elemento importante na cicatrização de osso alveolar é o RUNX2, pois analisaram que uma bactéria presente em lesão
periapical é capaz de diminuir a produção de RUNX2, resultando em ausência de formação óssea. Além disso, Maeda et al. (2004) demonstraram alguns componentes que precisam estar presentes para cicatrização óssea de lesões periapicais e o RUNX2 foi uma das moléculas necessárias.
Para que as proteínas morfogenéticas ósseas possam exercer suas funções e gerar osso elas dependem de algumas vias de sinalização, e uma molécula importante para esse funcionamento é a SMAD6, onde sua ausência irá gerar defeito na produção óssea. Portanto, diversos estudos mostraram também sua importância na cicatrização de lesões ósseas (Bandyopadhyay et al., 2006; Sieber et al., 2009; Sousa, 2011; Pregizer e Mortlock, 2014; Swarup et al., 2018).
Alguns estudos recentes têm mostrado a relação de polimorfismos genéticos com a cicatrização periapical, porém em sua maioria estudam as ações de interleucinas (Dill et al., 2015; Popovska et al., 2017; Mazzi-Chaves et al., 2018; Petean et al., 2019) e não os genes
BMP2, BMP4, RUNX2 e SMAD6. Esse estudo obteve resultados que, inicialmente não
mostraram relação dos genes BMP2, BMP4, RUNX2 e SMAD6 com a cicatrização de lesões ósseas periapicais, porém isso pode ser devido a algumas limitações que foram encontradas no decorrer da pesquisa, como a quantidade de amostra que pode ainda ser considerada baixa. Além disso, o tempo de acompanhamento dos pacientes pode ser um fator que pode mudar os resultados, pois existem casos em que as lesões podem levar mais de um ano para conseguir cicatrizar e nesse estudo o tempo foi de pelo menos um ano, sendo que possui acompanhamento de 1 a 3 anos, além de pacientes que podem já ter realizado a consulta de controle e recebido alta pela total cicatrização da lesão. Outros parâmetros que podem ser observados em um novo estudo são o uso ou não de medicação intracanal durante a endodontia, a quantidade de sessões em que o tratamento ocorreu e a presença ou não de doença periodontal associada, por exemplo.
Quando feita a análise de redução de dimensionalidade multifatorial encontramos novos resultados. Esse teste estatístico pode diferenciar os resultados pelo fato de serem métodos que analisam especificamente as interações dos polimorfismos de nucleotídeo único entre si. Devido à escolha dos genes, por serem moléculas que muitas vezes dependem uma das outras para exercerem suas funções, esse teste pode mostrar que quando dois desses polimorfismos ocorrem juntos, a chance de o fator genético influenciar na cicatrização óssea
existe, e a relação genética com cicatrização de lesão periapical é real, como é o caso de
BMP2 com RUNX2 e BMP4 com SMAD6.
Devido às limitações do estudo e também ao fato de ser uma doença e um tratamento multifatorial, sugere-se que novos estudos sejam desenhados e executados em cima de amostras com lesão periapical persistente a fim de investigar melhor a correlação entre os genes BMP2, BMP4, RUNX2 e SMAD6 com essas lesões periapicais.
7. CONCLUSÃO
Nesse estudo as combinações dos polimorfismos rs235768 (BMP2) com rs59983488 (RUNX2) e rs17563 (BMP4) com rs2119261 (SMAD6) foram associadas com um alto risco de ocorrer lesão periapical persistente.
REFERÊNCIAS
(2006), Quality guidelines for endodontic treatment: consensus report of the European Society of Endodontology. International Endodontic Journal, 39: 921-930.
Abe E. Function of BMPs and BMP Antagonists in Adult Bone. Ann N Y Acad Sci 2006; 1068(1): 41–53.
Aberg T, Wozney J, Thesleff I. Expression patterns of bone morphogenetic proteins (Bmps) in the developing mouse tooth suggest roles in morphogenesis and cell differentiation. Dev Dyn. 1997;210: 383–96.
Aldecoa EA. Repair vs Regeneration. A New Approach to Bone Regeneration - Plasma Rich in Growth Factors (PRGF). Vitoria - Spain: Puesta Al Dia Publicaciones, S.L.; 2001. p. 35 - 46.
Alves FR, Andrade-Junior CV, Marceliano-Alves MF, Perez AR, Rocas IN, Versiani MA, et
al. Adjunctive Steps for Disinfection of the Mandibular Molar Root Canal System: A
Correlative Bacteriologic, Micro-Computed Tomography, and Cryopulverization Approach. J Endod. 2016; 42(11): 1667-72.
Amaya MP, Criado L, Blanco B, Gómez M, Torres O, Flórez L, et al.. Polymorphisms of pro-inflammatory cytokine genes and the risk for acute suppurative or chronic nonsuppurative apical periodontitis in a Colombian population. Int Endontic J. 2013; 46: 71-78.
Bandyopadhyay A, Tsuji K, Cox K, Harfe BD, Rosen V, Tabin, CJ. Genetic analysis of the roles of BMP2, BMP4, and BMP7 in limb patterning and skeletogenesis. PLoS Genet. 2006; 2(12): e216.
Barnouti ZP, Owtad P, Shen G, Petocz P, Darendeliler MA. The biological mechanisms of PCNA and BMP in TMJ adaptive remodeling. Angle Orthod. 2011 Jan;81(1): 91-9.
Bessa PC, Casal M, Reis RL. Bone morphogenetic proteins in tissue engineering: the road from the laboratory to the clinic, part I (basic concepts). J Tissue Eng Regen Med. 2008 Jan;2(1): 1-13.
Chasman D, Adams RM. Predicting the functional consequences of non-synonymous single nucleotide polymorphisms: structure-based assessment of amino acid variation. J Mol Biol. 2001; 307(2): 683-706.
Chugal NM, Clive JM, Spångberg LS. A prognostic model for assessment of the outcome of endodontic treatment: Effect of biologic and diagnostic variables. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod. 2001; 91(3): 342-52.
Cohen S, Hargreaves KM. Caminhos da Polpa. 10 ed. Rio de Janeiro: Elsevier, 2007.
Chung Y, Lee SY, Elston RC, Park T. Odds ratio based multifactor-dimensionality reduction method for detecting gene-gene interactions. Bioinformatics. 2006;23(1):71–76.
De Deus G, Belladonna FG, Silva EJ, Marins JR, Souza EM, Perez R, et al. Micro-CT Evaluation of Non-instrumented Canal Areas with Different Enlargements Performed by NiTi Systems. Braz Dent J. 2015; 26(6): 624-29.
De Sá AR, Moreira PR, Xavier GM, Sampaio I, Kalapothakis E, Dutra WO, Gomez RS. Association of CD14, IL1B, IL6, IL10 and TNFA funtional gene polymorphisms with symptomatic dental abscesses. Int Endontic J. 2007; 40: 563-72.
De Sá AR, Pimenta FJ, Dutra WO, Gomez RS. Immunolocalization of interleukin 4, interleukin 6, and lymphotoxin α in dental granuloma. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod. 2003; 96(3): 356-60.
Decup F, Six N, Palmier B, Buch D, Lasfargues JJ, Salih E, et al. Bone sialoprotein-induced reparative dentinogenesis in the pulp of rat’s molar. Clin Oral Investig. 2000;4: 110–9.
Derynck R, Zhang Y, Feng X. Transcriptional Activators of TGF-β Responses: Smads. Cell. 1998; 95(6), 737–740.
Dill A, Letra A, Souza LC, Yadlapati M, Biguetti CC, Garlet GP, et al.. Analysis of Mutiple Cytokine Polymorphisms in Individuals with Untreated Deep Carious Lesions Reveals IL1B (rs1143643) as a Susceptibility Factor for Periapical Lesion Development. J Endod. 2015; 41(2): 197-200.
Ducy P, Starbuck M, Priemel M, Shen J, Pinero G, Geoffroy V, Amling M, Karsenty G. A Cbfa1-dependent genetic pathway controls bone formation beyond embryonic development. Genes Dev. 1999; 13(8): 1025-36.
Ducy P, Zhang R, Geoffroy V, Ridall AL, Karsenty G. Osf2/Cbfa1: A Transcriptional Activator of Osteoblast Differentiation. Cell. 1997; 89(5): 747–754.
Evrosimovska B, Dimova C, Popovska L, Zabokova-Bilbilova E. Matrix Metalloproteinase-8 Gene Polymorphism in Chronic Periapical Lesions. Pril (Makedon Akad Nauk Umet Odd Med Nauki). 2015; 36(2): 217-24.
Graves DT, Oates T, Garlet GP. Review of osteoimmunology and the host response in endodontic and periodontal lesions. Journal of Oral Microbiology. 2011; 3: 5304.
Goldberg M, Six N, Decup F, Buch D, Soheili Majd E, Lasfargues JJ, et al. Application of bioactive molecules in pulp-capping situations. Adv Dent Res. 2001;15: 91–5.
He J, White RK, White CA, Schweitzer JL, Woodmansey KF. Clinical and Patient-centered Outcomes of Nonsurgical Root Canal Retreatment in First Molars Using Contemporary Techniques. J Endo. 2017; 43(2): 231-37.
Heikinheimo K. Stage-specific expression of decapentaplegic-Vgrelated genes 2, 4, and 6 (bone morphogenetic proteins 2, 4, and 6) during human tooth morphogenesis. J Dent Res. 1994;73: 590–7.
Hernádi K, Gyöngyösi E, Mészáros B, Szakács L, Szalmás A, Csoma E, et al.. Elevated Tumor Necrosis Factor-alpha Expression in Periapical Lesions Infected by Epstein-Barr Virus. JOE. 2013; 39(4): 456-60.
Hughes FJ Collyer J, Stanfield M, Goodman SA. The effects of bone morphogenetic protein-2, -4 and –6 on differentiation of rat osteoblast cells in vitro. Endocrinology. 1995;136: 2671-7.
Kang SH, Kim BS, Kim Y. Cracked Teeth: Distribution, Characteristics, and Survival after Root Canal Treatment. J Endod. 2016; 42(4): 557-62.
Kawashima N, Stashenko P. Expression of bone-resorptive and regulatory cytokines in murine periapical inflammation. Arch Oral Biol. 1999; 44(1): 55-66.
Ko H, Yang W, Park K, Kim M. Cytotoxicity of mineral trioxide aggregate (MTA) and bone morphogenetic protein 2 (BMP-2) and response of rat pulp to MTA and BMP-2. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod. 2010 Jun;109(6): e103-8.
Küchler EC, Tannure PN, Falagan-Lotsch P, Lopes TS, Granjeiro JM, Amorim LMF. Buccal cells DNA extraction to obtain high quality human genomic DNA suitable for polymorphism genotyping by PCR-RFLP and Real-Time PCR. J Appl Oral Sci. 2012; 20(4): 467-71.
Lee Yl, Liu J, Clarkson BH, Lin CP, Godovikova V, Ritchie Hh. Dentin-pulp complex responses to carious lesions. Caries Res. 2006; 40(3): 256-64.
Leoni GB, Versiani MA, Silva-Sousa YT, Bruniera Jf, Pecora Jd, Sousa-Neto MD. Ex vivo evaluation of four final irrigation protocols on the removal of hard-tissue debris from the mesial root canal system of mandibular first molars. Int Endod J. 2017; 50(4): 398-406.
Lian JB, Javed A, Zaidi SK, Lengner C, Montecino M, van Wijnen AJ, Stein JL, Stein GS. Regulatory controls for osteoblast growth and differentiation: role of Runx/Cbfa/AML factors. Crit Rev Eukaryot Gene Expr. 2004;14(1-2):1-41.
Lianjia Y, Yuhao G, White FH. Bovine bone morphogenetic proteininduced dentinogenesis. Clin Orthop Relat Res. 1993;295: 305–12.
Liapatas S, Nakou M, Rontogianni D. Inflammatory infiltrate of chronic periradicular lesions: an immunohistochemical study. Int Endod J. 2003; 36(7): 464-71.
Lin LM, Rosenberg PA, Lin J. Do procedural errors cause endodontic treatment failure?. J Am Dent Assoc. 2005; 136(2): 187-93.
Lopes HP, Siqueira JFJr. Instrumentos endodônticos. in: Lopes HP, Siqueira JF Jr . Endodontia: biologia e técnica. Rio de Janeiro: MEDSI, (2004); 323-417.
Maeda H, Nakano T, Tomokiyo A, Fujii S, Wada N, Monnouchi S, et al.. Mineral Trioxide Aggregate Induces Bone Morphogenetic Protein-2 Expression and Calcification in Human Periodontal Ligament Cells. JOE. 2010; 36(4): 647-52.
Maeda H, Wada N, Nakamuta H, Akamine A. Human periapical granulation tissue contains osteogenic cells. Cell Tissue Res. 2004 Feb;315(2): 203-8.
Maheshwari K, Silva RM, Guajardo-Morales L, Garlet GP, Vieira AR, Letra A. Heat Shock 70 Protein Genes and Genetic Susceptibility to Apical Periodontitis. J Endod. 2016; 42(10): 1467–71.
Matsumoto N, Minakami M, Hatakeyama J, Haruna C, Morotomi T, Izumi T, Anan H. Histologic evaluation of the effects of emdogain gel on injured root apex in rats. JOE. 2014; 40(12): 1989-94.
Mazzi-Chaves JF, Petean IBF, Soares IMV, Salles AG, Antunes LAA, Segato RAB, Silva LAB, Küchler EC, Antunes LS, Sousa-Neto MD. Influence Of Genetic Polymorphisms In Genes Of Bone Remodeling And Angiogenesis Process In The Apical Periodontitis. Braz Dent J. 2018; 29(2): 179-183.
Menezes-Silva R, Khaliq S, Deeley K, Letra A, Vieira AR. Genetic Susceptibility to Periapical Disease: Conditional Contribution of MMP2 and MMP3 Genes to the Development of Periapical Lesions and Healing Response. JOE. 2012; 38(5): 604-607.
Miyaji H, Sugaya T, Ibe K, Ishizuka R, Tokunaga K, Kawanami M. Root surface conditioning with bone morphogenetic protein-2 facilitates cementum-like tissue deposition in beagle dogs. J Periodontal Res. 2010 Oct;45(5): 658-63.
Morsani JM, Aminosbariae A, Han YW, Montagnese TA, Mickel A. Genetic Predisposition to Persistent Apical Periodontitis. JOE. 2011; 37(4): 455-9
Nair PN. Pathogenesis of apical periodontitis and the causes of endodontic failures. Crit Rev Oral Biol Med. 2004; 15(6): 348-81.
Nakashima M. Induction of dentin formation on canine amputated pulp by recombinant human bone morphogenetic protein (BMP)-2 and -4. J Dent Res 1994;73:1515–22.
Nakashima M. Induction of dentine in amputated pulp of dogs by recombinant human bone morphogenetic proteins-2 and -4 with collagen matrix. Arch Oral Biol. 1994;39: 1085–9
Nakashima M. The induction of reparative dentine in the amputated dental pulp of the dog by bone morphogenetic protein. Arch Oral Biol 1990;35:493–7.
Nakashima M, Toyono T, Akamine A, Joyner A. Expression of growth/differentiation factor 11, a new member of the BMP/TGFb superfamily during mouse embryogenesis. Mech Dev. 1999;80: 185–9
Ou M, Zhao Y, Zhang F, Huang X. Bmp2 and Bmp4 accelerate alveolar bone development. Connect Tissue Res. 2014; 56(3): 204-11.
Özan U, Ocak Z, Özan F, Oktay E, Toptas O, Sahman H, et al.. Association of Toll-like receptors 2, 3, and 4 genes polymorphisms with periapical pathosis risk. Med Oral Patol Oral Cir Bucal. 2016; 21(4): e408-12.
Park OJ, Kim J, Kim HY, Kwon Y, Yun C-H, Han SH. Streptococcus gordonii induces bone resorption by increasing osteoclast differentiation and reducing osteoblast differentiation. Microb Pathog 2019; 126: 218-23.
Pasqualini D, Bergandi L, Palumbo L, Borraccino A, Dambra V, Alovisi M, et al.. Association among Oral Health, Apical Periodontitis, CD14 Polymorphisms, and Coronary Heart Disease in Middle-aged Adults. JOE. 2012; 38(12): 1570-7.
Pedro FM, Marques A, Pereira TM, Bandeca MC, Lima S, Kuga MC, et al.. Status of Endodontic Treatment and the Correlations to the Quality of Root Canal Filling and Coronal Restoration. J Contemp Dent Pract. 2016; 17(10): 830-6.
Petean IBF, Kuchler EC, Soares IMV, Segato RAB, Silva LAB, Antunes LAA, Salles AG, Antunes LS, Sousa-Neto MD. Genetic Polymorphisms in RANK and RANKL are Associated with Persistent Apical Periodontitis. J Endod. 2019; 45(5):526-531.
Pregizer, SK, Mortlock, DP. Dynamics and cellular localization of Bmp2, Bmp4, and Noggin transcription in the postnatal mouse skeleton. JBMR - ASBMR. 2014;30(1): 64–70.
Popovska L, Dimova C, Evrosimoska B, Stojanovska V, Muratovska I, Cetenović B, Marković D. Relationship between IL-1β production and endodontic status of human periapical lesions. Vojnosanit Pregl. 2017; 74(12): 1134–1139.
Quack I, Vonderstrass B, Stock M, Aylsworth AS, Becker A, Brueton L, Lee PJ, Majewski F, Mulliken JB, Suri M, Zenker M, Mundlos S, Otto F. Mutation analysis of core binding factor A1 in patients with cleidocranial dysplasia. Am J Hum Genet. 1999; 65: 1268–1278.
Ritchie MD, Hahn LW, Roodi N, Bailey LR, Dupont WD, Parl FF, Moore JH. Multifactor-dimensionality reduction reveals high-order interactions among estrogen-metabolism genes in sporadic breast cancer. Am J Hum Genet. 2001 Jul;69(1):138-47.
Rôças IN, Siqueira Jr JF, Del Aguila CA, Provenzano JC, Guilherme BPS, Gonçalves LS. Polymorphism of the CD14 and TLR4 Genes and Post-treatment Apical Periodontitis. JOE. 2014; 40(2): 168-72.
Rutherford RB, Spangberg L, Tucker M, Rueger D, Charette M. The time-course of the induction of reparative dentin formation in monkeys by recombinant human osteogenic protein-1. Arch Oral Biol. 1994;39: 833–8.
Rutherford RB, Wahle J, Tucker M, Rueger D, Charette M. Induction of reparative dentin formation in monkeys by recombinant human osteogenic protein-1. Arch Oral Bio.l 1993;38: 571–6.
Salazar-Pelaéz LM, Grisales ROF, Yepes OEZ, Vargas KO, Calle DT. Il-1 gene polymorphisms and the risk of chronic periapical periodontitis in a population from Antioquia, Colombia. Arch Oral Res. 2012; 8(1): 19-30.
Salles AG, Antunes LAA, Küchler EC, Antunes LS. Association between Apical Periodontitis and Interleukin Gene Polymorphisms: A Systematic Review and Meta-analysis. JOE. 2018; 1-8.
Sawada Y, Hokugo A, Nishiura A, Hokugo R, Matsumoto N, Morita S, et al. A trial of alveolar cleft bone regeneration by controlled release of bone morphogenetic protein: an experimental study in rabbits. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod. 2009;108(6): 812-20.
Shi Y e Massagué J. Mechanisms of TGF-β Signaling from Cell Membrane to the Nucleus. Cell. 2003; 113(6): 685–700.
Sieber C, Kopf J, Hiepen C, Knaus P. Recent advances in BMP receptor signaling. Cytokine Growth Factor Rev. 2009;20(5-6): 343-55.
Siqueira Jr JF, Rôças IN, Provenzano JC, Daibert FK, Silva MG, Lima KC. Relationship Between Fcγ Receptor and Interleukin-1 Gene Polymorphisms and Post-treatment Apical Periodontitis. JOE. 2009; 35(9): 1186-92.
Siqueira Jr JF, Rôças IN, Provenzano JC, Guilherme BPS. Polymorphism of the FcγRIIIa Gene and Post-treatment Apical Periodontitis. JOE. 2011; 37(10): 1345-8.
Six N, Lasfargues JJ, Goldberg M. Differential repair responses in the coronal and radicular areas of the exposed rat molar pulp induced by recombinant human bone morphogenetic protein 7 (osteogenic protein 1). Arch Oral Biol. 2002;47: 177–87.
Sjögren U, Figdor D, Persson S, Sundqvist G. Influence of infection at the time of root filling on the outcome of endodontic treatment of teeth with apical periodontitis. Int Endod J. 1997; 30(5): 297-306.
Sousa JP, Efeito das BMPs na regeneração óssea: mecanismo de acção e aplicação em Medicina Dentária, Faculdade de Medicina Dentária da Universidade do Porto, Dissertação de Mestrado, Porto, 2011
Stashenko P, Yu SM. T helper and T suppressor cell reversal during the development of induced rat periapical lesions. J Dent Res. 1989; 68(5): 830-4.
Swarup N, Nayak M, Chowdhary Z, Mehendiratta M, Khatana S, Choi SJ, Sagolsem C. Evaluation and Immunolocalization of BMP4 and FGF8 in Odontogenic Cyst and Tumors. Anal Cell Pathol. 2018: 1-9.
Tada H, Nemoto E, Kanaya S, Hamaji N, Sato H, Shimauchi H. Elevated extracellular calcium increases expression of bone morphogenetic protein-2 gene via a calcium channel and ERK pathway in human dental pulp cells. Biochem Biophys Res Commun. 2010;394(4): 1093-7.
Trombone APF, Cavalla F, Silveira EMV, Andreo CB, Francisconi CF, Fonseca AC, et al.. MMP1-1607 polymorphism increases the risk for periapical lesion development through the upregulation MMP-1 expression in association with pro-inflammatory milieu elements. J Appl Oral Sci. 2016; 24(4): 366-75.
Takashiba S, Naruishi, K. Gene polymorphisms in periodontal health and disease. Periodontol 2000. 2006; 40: 94-106.
Versiani MA, Leoni GB, Steier L, De-Deus G, Tassani S, Pecora, Jd, et al. Micro-computed tomography study of oval-shaped canals prepared with the self-adjusting file, Reciproc, WaveOne, and ProTaper universal systems. J Endod. 2013; 39(8): 1060-6.
Virtej A, Papadakou P, Sasaki H, Bletsa A, Berggreen E. VEGFR-2 reduces while combined VEGFR-2 and -3 signaling increases inflammation in apical periodontitis. J Oral Microbiol. 2016; 8(1): 1–11.
Xia X, Man Z, Jin H, Du R, Sun W, Wang X. Vitapex can promote the expression of BMP-2 during the bone regeneration of periapical lesions in rats. J Indian Soc Pedod Prev Dent. 2013;31: 249-53.
Yamasaki M, Kumazawa M, Kohsaka T, Nakamura H. Effect of methotrexate-induced neutropenia on rat periapical lesion. Oral Surg Oral Med Oral Pathol. 1994; 77(6): 655-61.
Yu SM, Stashenko P. Identification of inflammatory cells in developing rat periapical lesions. J Endod. 1987; 13(11): 535–40.
ANEXO 2
CARTA DE INFORMAÇÃO AO PARTICIPANTE DA PESQUISA E TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Título do Projeto de Pesquisa: “ASPECTOS MOLECULARES ENVOLVIDOS NA RESPOSTA AO TRATAMENTO ENDODÔNTICO”.
Responsáveis pela pesquisa: Mestranda Natascha Douat Hannegraf; Profa. Dra. Erika Calvano Kuchler; Prof. Dr. Flares Baratto Filho.
Objetivos da Pesquisa: A presente pesquisa tem como objetivo avaliar os aspectos clínicos e moleculares envolvidos na resposta do hospedeiro frente às diferentes abordagens terapêuticas pulpares.
Justificativa: No contexto da Bioengenharia e da Genética, o conhecimento dos fatores moleculares terão impacto na terapia endodôntica do futuro.
Procedimentos que serão realizados durante a pesquisa:
Procedimentos Preliminares - Durante a anamnese serão coletados dados sócio-demográficos, ambientais e culturais do participante da pesquisa. Informações referentes aos hábitos de higiene bucal (escovação dentária, uso de fio dental), uso/exposição a fluoretos (uso de dentifrício fluoretado e uso de enxaguatório bucal com flúor) e dieta também serão coletados. Além disso, também serão coletadas informações referentes ao tratamento e/ou retratamento endodôntico realizado e o prognóstico do mesmo, além de informações referentes à exodontia de dentes. Protocolo Clínico: Será realizado exame clínico sob luz artificial, utilizando-se espelho bucal plano nº 5 e sonda exploradora. As amostras de saliva serão coletadas como fonte de DNA. Os participantes realizarão um bochecho com 5 mL de solução salina durante 1 minuto. Todo o volume do bochecho será acondicionado em tubos para centrífuga de 15 mL e mantido a -20°C. O material coletado será processado, armazenado e analisado no Laboratório de Biologia Molecular do Departamento de Odontologia da Universidade Positivo.
Benefícios, riscos e benefícios esperados: O presente projeto não apresenta riscos por não apresentar procedimentos invasivos. Apenas um questionário e bochecho com solução
fisiológica serão utilizados com os participantes. Por outro lado, a investigação proposta contribuirá para o conhecimento da associação de mecanismos moleculares frente à terapia endodôntica.
Acompanhamento e assistência: Todos os procedimentos serão acompanhados pelos pesquisadores. Além disso, os mesmos oferecerão a assistência necessária caso o participante tiver algum problema relacionado aos tratamentos, durante a pesquisa.
Garantia de esclarecimentos: Os participantes têm a garantia de que receberão respostas a qualquer pergunta e esclarecimentos de qualquer dúvida antes, durante e após a realização da pesquisa. Ao convidado a participar da pesquisa, será preservado o direito de informação sobre a pesquisa e aos procedimentos aos quais será submetido, no limite de sua capacidade de compreensão. Qualquer problema relacionado à pesquisa deverá ser comunicado o mais breve possível aos pesquisadores.
Retirada do consentimento: Os participantes da pesquisa têm a liberdade de retirar seu consentimento a qualquer momento, não sendo permitida a continuação da pesquisa sem que isso acarrete qualquer penalidade nem represálias de qualquer natureza.
Ressarcimento ou indenização: Há garantia de indenizações caso ocorram danos diretos ou indiretos, imediatos ou tardios sofridos no decorrer da participação do participante. Os pesquisadores se comprometem a prestar assistência, sendo os participantes da pesquisa acompanhados e tratados pelo pesquisador mesmo que não seja estabelecida, imediatamente, sua relação direta com a pesquisa, apesar desse estudo oferecer risco mínimo a saúde geral do participante.
Garantia de Sigilo: Será mantido sigilo quanto à identidade de todos os participantes da pesquisa na divulgação e publicação dos dados da pesquisa.
Todas as informações contidas neste documento serão explicadas verbalmente, numa linguagem acessível ao participante da pesquisa e aos responsáveis.
