CATEGORIA: EM ANDAMENTO CATEGORIA:
ÁREA: CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E SAÚDE ÁREA:
SUBÁREA: Biomedicina SUBÁREA:
INSTITUIÇÃO(ÕES): CENTRO UNIVERSITÁRIO DAS FACULDADES METROPOLITANAS UNIDAS -FMU
INSTITUIÇÃO(ÕES):
AUTOR(ES): IANE CARVALHO SHIEH AUTOR(ES):
ORIENTADOR(ES): ROBERTO DE PASQUALE ORIENTADOR(ES):
Título
Modulação do Receptor 5HT
1Aem um Modelo de Estresse
RESUMO
O estresse está relacionado a gênese de várias doenças neuropsiquiátricas, e vem sendo apontada como fator etiológico de várias doenças como a ansiedade e depressão. Várias alterações ocorrem no sistema nervoso central após a exposição a agentes estressores, como a modulação da liberação de serotonina (5HT) e cortisol, entre outros fatores que compõem a resposta neural ao estresse. Em particular, o receptor de serotonina do tipo 1A está bastante envolvido na modulação da atividade neuronal em áreas que participam da resposta de estresse, como o córtex pré-frontal (PFC) e o núcleo paraventricular do hipotálamo (PVN), permitindo assim que o sistema serotoninérgico receba e envie um fluxo contínuo de informações durante a resposta ao estresse. Esse projeto tem como objetivo avaliar se ocorrem alterações desse receptor em um modelo animal de estresse, bem como o impacto dessas alterações na via de sinalização intracelular acoplada ao receptor, que sinaliza via cAMP/PKA, e se esses efeitos promovem alterações no comportamento.
1. INTRODUÇÃO
Situações que ameaçam a homeostase do organismo provocam alterações fisiológicas que devem resultar em alterações de comportamento, para a adaptação do organismo à alteração do ambiente. Essa resposta envolve múltiplos efetores e moduladores, e é denominada de “resposta ao estresse”, enquanto agentes que promovem distúrbios na homeostase podem ser denominados de “estressores”. O papel do sistema nervoso central na articulação dessa resposta é complexo e envolve várias redes neurais diferentes, bem como múltiplos neurotransmissores que interagem com hormônios e outras informações sensoriais, presentes durante a resposta ao estresse [1].
O estresse tem sido apontado como fator etiológico de várias doenças, como ansiedade, depressão e doenças cardiovasculares [2, 3]. A prevalência de doenças e problemas de saúde relacionados ao estresse vem aumentando nas últimas décadas, tornando o estresse um tópico de estudo cada vez mais interessante e importante para a compreensão da fisiopatologia dessas doenças [4-6]. Algumas áreas cerebrais importantes no processamento da resposta de estresse são o córtex pré-frontal (PFC), a amígdala, o hipocampo, o hipotálamo e os núcleos dorsais da rafe (DRN) [3, 7, 8]. As ações dos mediadores liberados durante uma resposta ao estresse nas redes neurais que envolvem essas áreas tem sido postulada como responsáveis pelas alterações neurais vistas em estudos de estresse, e têm sido ligadas à fisiopatologia das doenças relacionadas ao estresse [5, 6, 9, 10].
Estressores presentes durante a fase perinatal de desenvolvimento (envolvendo estresse materno e estresse nos primeiros períodos da vida) são atribuídos como agentes etiológicos de doenças neuropsiquiátricas pela psicologia há alguns anos, e estudos nas últimas décadas, com humanos e modelos animais, têm apresentado evidências de que a presença de estresse na infância pode ser correlacionada com o desenvolvimento de doenças neuropsiquiátricas no futuro [11-13]. No entanto, há poucos estudos funcionais na literatura científica utilizando animais na fase infante a adolescente.
A relação materna com os filhos desempenha um papel fundamental no neurodesenvolvimento dos filhos, e a presença de agentes estressores durante o período perinatal leva a ativação aguda de
sistemas envolvidos na resposta de estresse, com a liberação de mediadores como as catecolaminas e os corticosteroides, que podem levar a efeitos duradouros, observados na vida adulta [14]. Assim, modelos animais que envolvem perturbar o comportamento materno são considerados para o estudo de doenças neuropsiquiátricas, tais como a depressão e a ansiedade [15]. Além disso, o eixo hipotálamo-hipófise-adrenal (eixo HPA), responsável pelo aumento das concentrações plasmáticas de corticosteroides frente a um estímulo estressor, tem sido reportado como hiperativo em pacientes diagnosticados com depressão, bem como em modelos animais de depressão, sendo uma das principais alterações encontradas [16, 17]. Desse modo, o núcleo paraventricular do hipotálamo (PVN), onde se situam os neurônios produtores de CRH (hormônio liberador de corticotrofinas), é uma área interessante a ser analisada em modelos de estresse.
Sessenta anos após a sua descoberta, a serotonina (5HT) ainda é objeto de intensas pesquisas destinadas a compreender seu papel na adaptação ao estresse [18-20]. Existem amplas evidências da presença de terminações ou receptores serotoninérgicos em regiões cerebrais e neuroendócrinas envolvidas na resposta ao estresse, tais como o PFC, a amígdala, o hipocampo e o hipotálamo [19, 21]. Os corpos celulares dos neurônios serotoninérgicos se situam nos núcleos da rafe, e recebem aferentes de uma vasta gama de regiões, incluindo as mencionadas acima [22], permitindo assim que o sistema serotoninérgico receba e envie um fluxo contínuo de informações durante a resposta ao estresse. De fato, diferentes estressores psicológicos aumentam os níveis extracelulares de serotonina nessas regiões [20], indicando um aumento da liberação de 5HT, além de aumentar a síntese e o turnover desse neurotransmissor nos núcleos da rafe [19].
Receptores para serotonina são encontrados em praticamente todo o sistema nervoso central, e são subdivididos em 7 famílias, com subtipos totalizando pelo menos 13 receptores com caraterísticas estruturais e operacionais diferentes [23]. Dentre eles, há evidências na literatura científica de que o receptor 5HT1A é importante para a regulação da atividade de áreas cerebrais envolvida na resposta de estresse e na regulação do humor, em humanos e roedores [24, 25], e fármacos antidepressivos como a fluoxetina tem como mecanismo de ação proposto a alteração na expressão de 5HT1A em neurônios [26, 27]. Esses receptores pertencem a família dos receptores acoplados a proteína G, e desempenham suas funções ativando uma Gαi, consequentemente diminuindo os níveis intracelulares de cAMP e, portanto, inibindo a PKA [28, 29]. Nos neurônios, essa via de sinalização reduz a excitabilidade neuronal e a frequência de disparo de potenciais de ação [30, 31], sendo um dos mecanismos propostos a abertura de canais de potássio, levando à hiperpolarização da membrana plasmática [23, 24]. Os receptores 5HT1A também reduzem o influxo de cálcio [32-34], e a ativação desses receptores reduz a corrente mediada pelos receptores glutamatérgicos AMPA e NMDA [35-39], reduzindo os potenciais pós-sinápticos excitatórios em várias regiões do cérebro [33, 40]. A combinação desses efeitos com a abertura de canais de potássio faz com que a 5HT consiga silenciar rapidamente e eficazmente a transmissão neuronal, e, portanto, esses receptores desempenham um papel significativo na modulação da atividade pós-sináptica
excitatória, determinando também efeitos prolongados sobre as mudanças a longo prazo na plasticidade sináptica [41, 42].
Ainda, a expressão do 5HT1A pode ser correlacionada com alterações vistas na rede que conecta o PFC à amigdala, no que se refere à resposta neural ao estresse, posicionando esse receptor em uma posição essencial na regulação da resposta neural ao estresse, a qual está intimamente relacionada ao desenvolvimento de doenças neuropsiquiátricas [43]. Adicionalmente, este receptor, através do núcleo paraventricular do hipotálamo (PVN), também regula a atividade do eixo HPA para modular a resposta neuroendócrina ativa durante o estresse e ansiedade [44-46].
Os receptores 5HT1A são particularmente influentes nos comportamentos relacionados à ansiedade [47]. A administração sistêmica de agonistas para 5HT1A diminui a ansiedade em roedores, como observado nos testes de interação social e labirinto em cruz elevado [48]. Animais nocautes para 5HT1A apresentam aumento de comportamento ansioso, observável no labirinto em cruz elevado e no teste do campo aberto [49-51], e restaurando a função do receptor na parte frontal do cérebro de animais nocautes se pode inibir esses efeitos [52]. Essa recuperação da função, i.e., alteração do comportamento ansioso nos animais nocautes para comportamento comparável ao dos controles, não ocorre se os receptores 5HT1A são restaurados após o dia pós-natal 20; ao passo que a diminuição da expressão de 5HT1A após o dia pós-natal 80, no mesmo modelo, não tem nenhum efeito sobre a ansiedade [52], sugerindo que esse efeito depende da idade e que a sinalização do receptor 5HT1A no início da vida desempenha um papel crucial no desenvolvimento dos circuitos cerebrais de resposta ao estresse [53]. Os receptores 5HT1A regulam também comportamentos relacionados ao humor, particularmente aqueles relacionados à depressão: a administração de agonistas reduz o comportamento depressivo no teste de natação forçada [54, 55]e no teste de suspensão pela cauda [56].Em um modelo animal de depressão, que envolve a memorização de uma situação que apresenta ausência de resolução (learned helplessness), a injeção sistêmica de agonistas para 5HT1A aumenta as tentativas de fuga frente a um estresse inevitável [57], e esse efeito pode ser observado também através da injeção direta de um agonista para 5HT1A após as fibras serotoninérgicas ascendentes serem destruídas [58, 59], indicando que o receptor 5HT1A desempenha um papel na resiliência ao estresse, e/ou modula as redes neurais envolvidas com a memória, emoções e comportamento.
Considerando os fatos expostos nesta introdução, fica evidente a importância do 5HT1A na regulação de diversos processos relacionados a resposta ao estresse, a regulação do humor e a fisiopatologia de doenças neuropsiquiátricas. Portanto, esse projeto pretende fornecer uma visão mais clara sobre o papel do receptor 5HT1A no desenvolvimento emocional, nas doenças neuropsiquiátricas e na resposta neural ao estresse.
Os números de casos de doenças neuropsiquiátricas vêm aumentando na população mundial e causando incapacitação para o trabalho, e estas doenças têm sido associadas ao estresse, e, portanto, a compreensão dos mecanismos pelos quais o estresse pode levar a doenças neuropsiquiátricas faz-se necessária [60-63]. Além disso, existem poucos estudos na literatura com animais infantes, e sabe-se que fatores ambientais atuam nesse período, produzindo alterações que podem persistir até a idade adulta [64]. Portanto, entender o papel fisiológico do sistema serotoninérgico na modulação da rede neural de estresse e de regulação do humor oferece a possibilidade de esclarecimento da ligação entre estresse e doenças neuropsiquiátricas, tornando possível o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para o tratamento dessas doenças.
3. OBJETIVOS
O objetivo geral desse projeto é analisar alterações na expressão e/ou sinalização do receptor 5HT1A no modelo de Separação Materna (MS). A hipótese é que o estresse crônico pós-natal, promovido nesse modelo animal, irá causar alterações na expressão de 5HT1A no PFC e no PVN, e estas alterações irão modificar os padrões comportamentais relacionados ao humor neste modelo. O PFC e o PVN serão as áreas de interesse relevantes, pois a primeira está envolvida na adaptação cognitiva ao estresse [65, 66], enquanto a segunda é importante para desencadear as respostas endócrinas que modificam as funções fisiológicas para adaptá-las a situações estressantes [67, 68].
Os objetivos específicos são:
Analisar alterações na expressão de 5HT1A no PFC e PVN em animais infantes, provocadas pela MS;
Analisar alterações na expressão da PKA (subunidade catalítica) no PFC e PVN, em animais infantes, provocadas pela MS;
Verificar as alterações comportamentais causadas pela MS nos testes de campo aberto e labirinto em cruz elevado, para avaliação de ansiedade;
Verificar as alterações comportamentais causadas pela MS no teste de hipofagia induzida pela novidade, para avaliação de depressão.
4. METODOLOGIA
Neste trabalho, será utilizado o modelo animal de Separação Materna. Este modelo foi selecionado para este estudo por apresentar validade de construto, além de simular situações humanas onde ocorre separação materna, promovendo alterações neurofisiológicas que persistem na idade adulta, as quais estão implicadas na etiologia de doenças neuropsiquiátricas tais como a depressão e ansiedade. Animais submetidos a este protocolo apresentam déficits comportamentais, alterações nos níveis de BDNF e resposta alterada ao estresse agudo [69]. Além disso, o tratamento com antidepressivos como a
amitriptilina pode reverter os efeitos provocados pela MS [70], conferindo a este modelo validade preditiva, além da de construto, como um modelo de vulnerabilidade psiquiátrica. Serão utilizados ratos, considerando que camundongos são mais resistentes ao estresse e ratos apresentam respostas menos divergentes nesse modelo [15, 71].
O protocolo a ser empregado será adaptado de Lippmann, 2007 [69]. Ratos neonatos, no dia pós-natal (PND) 2, terão suas ninhadas reduzidas a 8 filhotes por ninhada, mantendo números iguais de machos e fêmeas quando possível, mantidos em biotério em condições padrão (21ºC±2ºC, água e alimento ad
libitum, ciclo claro-escuro de 12h). A partir do PND2, diariamente as ratas mães serão separadas dos
filhotes por 3h, até o PND14. Durante a separação, os filhotes serão mantidos em suas caixas de origem. Ao final do período de 3h, as mães serão retornadas para as caixas de origem onde os filhotes foram mantidos. Do PND15 ao PND21 (dia do desmame), os animais não serão perturbados. No PND21, as mães serão mortas e os animais divididos por sexo em gaiolas com no máximo 5 animais. Serão utilizados ratos Wistar, machos e fêmeas, infantes (PND 25), divididos em dois grupos principais: o grupo controle (CON), no qual os filhotes não serão separados das mães em nenhum momento, e o grupo submetido ao protocolo de MS.
Após o término do protocolo, os animais serão perfundidos com solução fisiológica (0,9% de NaCl) tamponada (tampão fosfato 0,1M) e em seguida, com o fixador paraformaldeído (PFA) a 2%. Os cérebros serão coletados e pós-fixados por 4h, e depois armazenados em solução de sacarose 30% para posterior processamento por Imuno-histoquímica. Brevemente, os cérebros serão cortados em micrótomo e os cortes serão incubados com os anticorpos primários e secundários para as proteínas de interesse, utilizando diaminobenzidina para a revelação. Os cortes serão montados em lâminas para microscópio, onde poderão ser observadas as áreas de interesse (PVN e PFC), comparando os grupos CON e MS. Serão avaliados os níveis de expressão do receptor 5HT1A, e da subunidade catalítica da PKA, a qual é regulada diretamente pelos níveis de cAMP intracelulares, que sofrem influência pela sinalização do 5HT1A.
Para a avaliação comportamental, os animais serão submetidos a três testes: o teste de hipofagia induzida pela novidade (HIN), o teste do campo aberto (OF) e o teste do labirinto em cruz elevado (EPM), todos utilizados para a avaliação de comportamentos similares à ansiedade e depressão, além de outros comportamentos como impulsividade e tomada de decisão, no caso do HIN. O protocolo que será utilizado no teste de HIN consiste em uma adaptação do protocolo de Bodnoff et.al. (1989) [72], onde os animais são colocados em jejum por 24h, e após esse período, são testados em um campo aberto no qual uma porção de alimento (ração) é colocada no centro do campo. O tempo que o animal leva para se alimentar é mensurado e utilizado como parâmetro de avaliação, e interpretado como comportamento depressivo-símile quando o animal apresenta uma latência maior para se alimentar. Para o OF, os animais serão colocados na arena sob luminosidade média, e o tempo que o animal passa na área central e na área periférica da arena é computado sendo o parâmetro de avaliação, e interpretado como comportamento ansiedade-símile quando o animal permanece mais tempo na área central do campo aberto. A duração do teste será de 15min. E para o EPM, o animal será colocado inicialmente no centro do labirinto, e o tempo
que o animal permanecer explorando os braços abertos do labirinto será computado e constituirá o parâmetro a ser avaliado, e interpretado como comportamento ansiedade-símile se o animal permanecer mais tempo nos braços abertos.
Os resultados serão submetidos a uma análise estatística descritiva, na qual será avaliada a normalidade e homogeneidade de variância dos dados. Se os dados originais ou transformados apresentarem distribuição normal e homogeneidade de variâncias, análises estatísticas paramétricas (teste
t de Student ou ANOVA) serão empregadas. Caso contrário, os dados serão analisados através de
estatísticas não paramétricas (Mann-Whitney ou Kruskal-Wallis). Adotar-se-á um nível de significância de 95%. 5. CRONOGRAMA DE EXECUÇÃO 2017 2018 1º Trimestre (Mai/Jun/Jul) 2º Trimestre (Ago/Set/Out) 3º Trimestre (Nov/Dez/Jan) 4º Trimestre (Fev/Mar/Abr) Revisão Bibliográfica
X
X
Padronização dos Protocolos de Imuno-histoquímica
X
Execução de Experimentos – Parte I (Imuno-histoquímica)
X
X
Execução de Experimentos – Parte II (Comportamento)
X
X
Análise Estatística
X
X
Discussão dos dados
X
X
X
Escrita de Artigo para publicação
X
X
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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