UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO ESCOLA DE ENGENHARIA DE LORENA EEL PRISCILA VAZ DE ARRUDA

U N I V E R S I D A D E D E S Ã O P A U L O E S C O L A D E E N G E N H A R I A D E L O R E N A – E E L

PRISCILA VAZ DE ARRUDA

Efeito do glicerol na bioconversão de xilose em xilitol pela levedura Candida guilliermondii FTI 20037

Lorena – SP 2007

PRISCILA VAZ DE ARRUDA

Efeito do glicerol na bioconversão de xilose em xilitol pela levedura Candida guilliermondii FTI 20037

Lorena – SP 2007

Dissertação apresentada à Escola de Engenharia de Lorena da Universidade de São Paulo para obtenção do título de Mestre em Biotecnologia Industrial.

Área de concentração: Conversão de Biomassa

AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.

Catalogação na Publicação Biblioteca Universitária

Escola de Engenharia de Lorena da Universidade de São Paulo

Arruda, Priscila Vaz de

Efeito do glicerol na bioconversão de xilose em xilitol pela levedura Candida

guilliermondii FTI 20037 / Priscila Vaz de Arruda ; orientadora Maria das Graças

de Almeida Felipe.-- 2007 75 f: fig.

Dissertação (Mestrado – Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia Industrial. Área de Concentração: Conversão de Biomassa) – Escola de Engenharia de Lorena da Universidade de São Paulo.

1. Biotecnologia 2. Xilitol 3. Hidrolisado de bagaço de cana-de-açúcar 4. Glicerol 5. Candida guilliermondii 6. Fermentação. I. Título.

Aos meus queridos pais, Dora e Clóves, a minha

adorada Graça e ao meu amado Fernando.

AGRADECIMENTOS

Agradeço inicialmente a Deus pelo dom da vida e por ter colocado anjos no meu caminho.

A Profª. Dra. Maria das Graças de Almeida Felipe, a qual tenho muito a agradecer pelo apoio, orientação, paciência e dedicação com que me orientou a realizar este trabalho. Sem deixar de mencionar a confiança e amizade, com a qual sempre pude contar nas horas em que me acolheu com muito carinho em sua casa. Obrigada Graça, Humberto, Cláudia e Nê.

A doce e querida Rita de Cássia pela amizade e pelo grande auxílio durante a realização dos experimentos, pois mesmo agora, à distância, ela não deixou de me apoiar.

As experientes Jussara, pelas análises cromatográficas e Lilian Marton, pelas traduções.

As amigas conselheiras e “quebradoras de galhos e árvores” Tais, Débora e Carol, por estarem sempre ao meu lado, me escutando, dando sugestões e ajudando no que fosse preciso.

A todos os amigos que estão ou já passaram pelo DEBIQ: Aline, João Paulo, Rogério, Tânia, Priscila (Volta Redonda), Juliana, Herbert, Ciro, Lilian Pivetta, Fernanda Bernardi, Lili, Fran, Dani Cortez, Dani Borba, Adriana, Arismar, Larissa, Waltinho, Soninha, Giovani, Boutrus, Juan, Ricardo, Talita, Kátia, Martha, Rimenys e Marton, pelo incentivo e agradável convívio dentro e fora dos laboratórios.

Aos amigos Andressa Rabelo e Willian Barbosa que acompanharam de perto os cinco anos de “FAENQUIL” e agora à distância, nesses últimos dois anos, continuaram me incentivando e apoiando.

Ao Departamento de Biotecnologia e à Escola de Engenharia de Lorena. A todos os professores e funcionários do DEBIQ, pela colaboração e amizade. A Coordenadoria de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela bolsa de estudos concedida.

Aos meus pais, familiares, Fernando e Dudu pelo incansável carinho, apoio emocional, incentivo e compreensão em todos os momentos.

A todos aqueles que de forma direta ou indireta estiveram presentes nesses sete anos da minha eterna “FAENQUIL”.

“O valor das coisas não está no tempo em que elas duram, mas na intensidade com que acontecem. Por isso existem momentos inesquecíveis e pessoas incomparáveis.”

RESUMO

ARRUDA, P. V. Efeito do glicerol na bioconversão de xilose em xilitol pela levedura Candida guilliermondii FTI 20037. 2006. 75f. Dissertação (Mestrado em Biotecnologia Industrial) - Escola de Engenharia de Lorena, Universidade de São Paulo, Lorena, São Paulo. O bagaço de cana-de-açúcar, subproduto do setor sucroalcooleiro, vem se destacando em várias pesquisas como matéria-prima em diferentes processos fermentativos por sua fração hemicelulósica ser formada na sua maior parte pelo açúcar D-xilose. As leveduras fermentadoras de D-xilose, como as do gênero Candida, destacam-se por excretarem xilitol no meio, um açúcar-álcool que possui propriedades peculiares como alto poder adoçante, semelhante ao da sacarose; anticariogenicidade e metabolismo independente de insulina. É um aditivo em alimentos, substância “GRAS” (Generally Regraded as Safe) pelo Food and Drug Administration dos Estados Unidos. Pesquisas para a obtenção biotecnológica de xilitol a partir de resíduos lignocelulósicos demonstraram que este processo é influenciado por vários fatores, tais como tipo de hidrolisado hemicelulósico empregado e condições de fermentação como temperatura, pH, disponibilidade de oxigênio, concentração de nutrientes no meio de fermentação, concentração de xilose, presença de compostos tóxicos ao micorganismo. Muitos dos parâmetros importantes para o desenvolvimento deste bioprocesso já estão estabelecidos, mas ainda são necessários estudos para melhor entendimento das vias metabólicas envolvidas nesta bioconversão; principalmente em relação à formação de subprodutos deste metabolismo, como o glicerol. A formação desse subproduto é relatada como uma resposta ao estresse celular provocado pelas condições ambientais impostas ao microrganismo. Desta forma, este trabalho teve como objetivo avaliar a fermentação de meio semi-sintético e do hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar contendo diferentes concentrações de glicerol (0,3; 0,7; 1,0; 3,5 e 6,5 g/L) sobre a bioconversão de xilose em xilitol por Candida guilliermondii. As fermentações foram realizadas em frascos agitados a 200 rpm com 50 mL de meio, pH inicial de 5,5, a 30°C, durante 72h. Foram utilizados também meios sem adição de glicerol (controle) e meio contendo glicerol (53 g/L) em substituição aos açúcares. Nas condições experimentais avaliadas, a presença de 0,7 g/L de glicerol em meio semi-sintético, favoreceu não só a conversão de xilose em xilitol (YP/S=0,79 g/g) pela levedura, bem como a produtividade de xilitol (QP=1,13 g/L.h). Já em

experimento realizado em hidrolisado foram necessárias concentrações de glicerol superiores à adicionda ao meio semi-sintético para se obter o máximo de fator de conversão e de produtividade de xilitol (YP/S=0,78 g/g e QP=0,71 g/L.h), os quais foram obtidos quando as

concentrações de glicerol no meio de fermentação foram 6,5 g/L e 1,0 g/L, respectivamente. Em relação ao crescimento celular não se observou diferenças marcantes nas fermentações dos meios semi-sintético e de hidrolisado, porém a máxima concentração (6,08 g/L) foi obtida em hidrolisado na presença de 0,7 g/L de glicerol, condição esta que também coincidiu com aquela em que se observou maior consumo de ácido acético e menor formação deste álcool. A formação do etanol como subproduto deste metabolismo foi observada para todas as condições de fermentação avaliadas.

Palavras-chave: Xilitol. Glicerol. Xilose. Hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar. Candida guilliermondii. Fermentação.

ABSTRACT

ARRUDA, P. V. Effect of glycerol on the xylose-to-xylitol bioconversion by Candida guilliermondii FTI 20037 yeast. 2006. 75f. Dissertation (Master of Science in Industrial Biotechnology) – Escola de Engenharia de Lorena, Universidade de São Paulo, Lorena, São Paulo.

The sugarcane bagasse, by-product of sugar alcohol sector, has been stood out in several researches as raw material in different fermentative processes because its hemicellulosic fraction is mainly formed by D-xylose sugar. The D-xylose fermenting yeasts, like the

Candida species, stand out by releasing xylitol in the medium, a sugar alcohol with peculiar

properties, power similar to that of sucrose, anticariogenicity and an insulin-independent metabolism. Xylitol is a food additive classified as a GRAS substance (Generally Regarded as Safe) by the USA Food and Drug Administration. Studies on the biotechnological production of xylitol from lignocellulosic residues have demonstrated that this process can be influenced by the type of hemicellulosic hydrolysate as well as by the fermentation conditions employed in the process (temperature, pH, oxygen availability, nutrients concentration in the fermentation medium, xylose concentration and the presence of compounds toxic to the microbial metabolism). Although many of the parameters that are important for accomplishing this process have already been established, further studies are still necessary for a better understanding of the metabolic paths involved in the xylose-to-xylitol bioconversion, mainly those concerning the formation of metabolism by-products such as glycerol. The formation of this by-product has been regarded as a response to the cellular stress provoked by the environmental conditions inflicted on the microorganism. By this way, this work aimed to evaluate the fermentation of semi-synthetic medium and of the sugarcane hemicellulosic hydrolysate containing different glycerol concentrations (0.3; 0.7; 1.0; 3.5 and 6.5 g/L) on the xylose-to-xylitol bioconversion by Candida guilliermondii. The fermentations were performed in shaked flasks at 200 rpm with 50 ml of medium, 5.5 initial pH, at 30ºC for 72 h. Medium without glycerol addition (control) and medium containing glycerol (53 g/L) in substitution to the sugars were also used. Under the evaluated experimental conditions, the presence of 0.7 g/L glycerol in semi-synthetic medium favored not only the xylose-to-xylitol conversion by the yeast (YP/S = 0.79 g/g), but also the xylitol productivity (QP = 1.13 g/L.h).

In the assay using the hydrolysate, glycerol concentrations higher than those added to the semi-synthetic medium were necessary to obtain the maximum values of conversion factor and xylitol productivity (YP/S = 0.78 g/g and QP = 0.71 g/L.h). These values were obtained

when the glycerol concentrations in the fermentation medium were 6.5 g/L and 1.0 g/L, respectively. In relation to the cellular growth, there was no significant difference in the fermentation for the semi-synthetic and hydrolysate media. In the hydrolysate with 0.7 g/L glycerol, the maximum cellular concentration (6.08 g/L), the highest acetic acid consumption and the lowest formation of glycerol as a by-product of this metabolism were observed for all the evaluated fermentation conditions.

Key-words: Xylitol. Glycerol. Xylose. Sugarcane bagasse hemicellulosic hydrolysate.

SUMÁRIO

2.2Ocorrência e obtenção do xilitol...15

2.2.1 Ocorrência... 15

2.2.2 Obtenção... 16

2.3Bioconversão de xilose em xilitol...17

2.4Recuperação de xilitol...22

2.5Glicerol...23

2.6Matérias-primas para a obtenção microbiológica de xilitol...29

2.6.1 Bagaço de Cana-de-Açúcar... 30

3 MATERIAL E MÉTODOS ... 31

3.1Hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana...31

3.2Microrganismo e preparo do inóculo...32

3.3Meios e condições de fermentação...32

3.4Métodos analíticos...33

3.4.1 Viabilidade e Pureza da Cultura ... 33

3.4.2 Determinação das Concentrações de Açúcares, Ácido acético, Glicerol, Butanol, 1,3 Propanodiol, Butirato, Etanol e Xilitol... 33

3.4.3 Determinação das Concentrações de Furfural e Hidroximetilfurfural... 34

3.4.4 Determinação das Concentrações de Compostos fenólicos... 34

3.4.5 Determinação da Concentração Celular ... 34

3.4.6 Determinação do pH ... 35

3.5Metodologia de análise dos resultados...35

3.5.1 Determinação dos Parâmetros Fermentativos... 35

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 36

4.1 Efeito do glicerol na fermentação em meio semi-sintético por C. guilliermondii...36

4.1.1 Consumo de xilose por C. guilliermondii em função da concentração de glicerol em meio semi-sintético... 37

4.1.2 Formação de glicerol e etanol por C. guilliermondii em função da concentração de glicerol em meio semi-sintético... 39

4.1.3 Formação de xilitol por C. guilliermondii em função da concentração de glicerol em meio semi-sintético... 41

4.1.4 Crescimento celular de C. guilliermondii e variação do pH em função da concentração de glicerol em meio semi-sintético ... 45

4.2 Efeito do glicerol na fermentação em hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana por C. guilliermondii...47

4.2.1 Caracterização do hidrolisado hemicelulósico empregado nas fermentações ... 47

4.2.2 Consumo de açúcares e ácido acético por C. guilliermondii em função da concentração de glicerol no hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana ... 49

4.2.3 Formação de glicerol e etanol por C. guilliermondii em função da concentração de

glicerol no hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana... 53

4.2.4 Formação de xilitol por C. guilliermondii em função da concentração de glicerol no hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana ... 55

4.2.5 Crescimento celular de C. guilliermondii em função da concentração de glicerol no hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana ... 59

5 CONCLUSÕES... 60

6 SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS... 62

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1 INTRODUÇÃO

Cresce a cada dia o número de pessoas que, por motivos diversos, necessitam diminuir ou cessar o consumo diário de açúcares. Devido a este fato, muitos estudos estão sendo realizados a fim de se desenvolver produtos que possam, satisfatoriamente, atuar como seus substitutos. Dentre esses produtos, o xilitol vêm adquirindo importância por apresentar certas vantagens em relação aos demais, principalmente pelas suas características peculiares como poder adoçante semelhante à sacarose, não calórico, adequado à dieta de diabéticos e obesos e indicado na prevenção de osteoporose, otites e fibrose cística. Estudos buscam o desenvolvimento de uma tecnologia alternativa ao processo químico (catálise química de xilose), pelo qual o xilitol é comercialmente produzido a partir de materiais com alto teor de xilana (polímero de xilose). Este processo é de elevado custo pelas extensivas etapas de purificação da solução de xilose requerida para a catálise, bem como para a remoção do catalisador e purificação do xilitol. Neste sentido, o grupo de Microbiologia Aplicada e Bioprocessos (GMBio) da Escola de Engenharia de Lorena (EEL/USP) vem há anos concentrando esforços para o desenvolvimento de uma tecnologia de produção de xilitol por via biotecnológica a partir de resíduos lignocelulósicos. Estas pesquisas são intensificadas principalmente pela abundância renovável destes materiais e aplicação do xilitol em vários segmentos industriais, em particular na área da saúde.

Os trabalhos dos pesquisadores da EEL/USP se iniciaram em 1985 com a seleção de leveduras fermentadoras de xilose, destacando-se a Candida guilliermondii como promissora para essa bioconversão. Até a presente data várias pesquisas já foram realizadas para o estabelecimento da melhor condição de hidrólise de diferentes materiais lignocelulósicos como bagaço de cana, palha de arroz, trigo e de cevada, aparas de eucalipto e mais recentemente casca de aveia. Nestas pesquisas tem sido avaliados os parâmetros como a concentração e a idade do inóculo, concentração de xilose, a temperatura, a disponibilidade de oxigênio, o pH, a suplementação nutricional do meio e a relação glicose:xilose. Também a avaliação da concentração de compostos tóxicos à levedura, os quais são provenientes do processo de hidrólise ácida, como o ácido acético e compostos fenólicos vem sendo feita, principalmente em relação aos efeitos tóxicos destes na formação de xilitol e em alguns casos nas atividades enzimáticas de xilose redutase e xilitol desidrogenase. Estas enzimas são chaves nesta bioconversão por participarem dos passos iniciais do metabolismo de xilose. Alguns estudos também foram realizados para a recuperação do xilitol do meio fermentado e

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das enzimas xilose redutase e xilitol desidrogenase. Estudos recentes têm enfocado a recuperação do xilitol do meio e a avaliação do custo do processo biotecnológico.

Embora até o momento os valores dos parâmetros fermentativos como o fator de conversão de xilose em xilitol e a produtividade do xilitol são ainda baixos se comparados aos obtidos em outros bioprocessos, os resultados são promissores quanto à possibilidade de obtenção biotecnológica de xilitol a partir de resíduos lignocelulósicos. Neste sentido, os pesquisadores são impulsionados a realizarem pesquisas que busquem melhor esclarecer a via metabólica de conversão de xilose em xilitol pela levedura C. guilliermondii, em particular no caso do presente trabalho, quanto ao efeito do glicerol nesta bioconversão. O glicerol tem sido detectado em diferentes ensaios fermentativos nos quais foram utilizados meios semi-sintético e também aqueles formulados à base de hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar com vistas à produção de xilitol.

É conhecido que o glicerol tem um papel fundamental em vários processos fisiológicos vitais em procariontes e eucariontes, sendo também um importante intermediário do metabolismo energético. O glicerol é um soluto compatível, formado tanto como uma estratégia para a regeneração de NAD+ quanto em condições de estresse celular. No caso da bioconversão de xilose em xilitol a regeneração do NAD+ a partir da formação de glicerol, além de desviar a utilização da fonte de carbono (xilose) para a formação deste subproduto proporcionaria também uma menor disponibilidade do NADH2, cofator essencial para a

enzima xilose redutase, a qual participa do primeiro passo deste metabolismo.

Apesar do metabolismo do glicerol estar bem documentado, poucos estudos têm enfocado diretamente o seu papel durante a bioconversão de xilose em xilitol. No que se refere ao efeito do glicerol neste bioprocesso, os relatos da literatura apresentam os resultados de ensaios preliminares realizados nos laboratórios do GMBio, os quais mencionam a formação deste por Candida guilliermondii durante as fermentações de meio semi-sintético e hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana. Considerando a importância do glicerol em múltiplos processos fisiológicos vitais e o fato deste ter sido detectado nas fermentações em que se empregou C. guilliermondii, o presente trabalho avaliou o efeito do glicerol, em função de sua concentração, sobre a bioconversão de xilose em xilitol por esta levedura cultivada tanto em meio semi-sintético, quanto em hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar.

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2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1 Xilitol

2.1.1 Propriedades e Aplicações

O xilitol, um álcool pentahidroxilado (C5H12O5) de massa molar 152,15g/mol, tem

poder adoçante semelhante ao da sacarose e superior ao de polióis comuns, além de valor calórico reduzido (MANZ; VANNINEN; VOIROL, 1973; HYVÖNEN; KOIVISTOINEN; VOIROL, 1982). O modelo molecular deste poliol está representado na Figura 1.

Figura 1. Modelo molecular do xilitol – Software ACD/ChemSketch – vs. 4.55 (MARTON, 2002)

Outra propriedade do xilitol que merece destaque é a sua não cariogenicidade, uma vez que este não é utilizado pelos microrganismos da flora bucal, principalmente pela bactéria

Streptococcus mutans, impedindo assim a formação de ácidos que atacam o esmalte dos

dentes, além deste promover a remineralização dos mesmos, revertendo lesões recém formadas (MÄKINEN, 1976; MÄKINEN, 1992; SHEN et al., 2001). O esquema da Figura 2 proposto por Wen, Browngardt e Burne (2001), representa o mecanismo de ação do xilitol nesta bactéria. Neste esquema, o xilitol entra na célula pelo sistema fosfotransferase, e uma vez no interior da célula este é fosforilado pela frutose fosfotransferase formando então xilitol-5P. A bactéria não consegue metabolizar o xilitol-5P, pois este é tóxico a ela, o que resulta na expulsão do metabólito formado através do gasto de energia e seu acúmulo no citoplasma. Desta forma o acúmulo de xilitol-5P inibe o consumo de outros açúcares e o crescimento bacteriano (WEN; BROWNGARDT; BURNE, 2001; GRILLAUD et al., 2005). Segundo Kandelman (2003) a diminuição do número de S. mutans na saliva e/ou na placa pode ser devido tanto à redução da quantidade de açúcar extracelular como pela perda da capacidade de adesão destas bactérias na cavidade bucal. Pesquisas clínicas com crianças em

Carbono Oxigênio Hidrogênio

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idade escolar, as quais utilizaram doces e gomas de mascar contendo xilitol, evidenciaram a capacidade deste poliol em prevenir a cárie dentária e manter a higiene-oral (ALANEN; ISOKANGAS; GUTMANN, 2000; MÄKINEN et al., 2001).

Expulsão

Fru = Frutose; SFT = Sistema Fosfotransferase

Figura 2. Esquema do efeito do xilitol em Streptococcus mutans (Baseado em WEN;

BROWNGARDT; BURNE, 2001)

O xilitol também não participa de reações do tipo Maillard por não apresentar grupos aldeídicos ou cetônicos em sua molécula, responsáveis por escurecimento e redução do valor nutricional de proteínas, o que possibilita seu uso na indústria alimentícia no processamento de produtos em que estas reações não são desejáveis (MANZ; VANNINEN; VOIROL, 1973).

Uma outra característica importante do xilitol é o seu metabolismo independente de insulina, tornando-o um substituto de outros açúcares na dieta de diabéticos (PEPPER; OLINGER, 1988). Este adoçante também pode ser empregado no tratamento de outras desordens metabólicas como a deficiência da enzima glicose-6-fosfato desidrogenase e na dieta de obesos, uma vez que este exerce pequena contribuição para a formação de tecidos gordurosos quando comparado a outros açúcares (MANZ; VANNINEN; VOIROL, 1973; van EYS et al., 1974). Em estudos realizados com ratos foi constatado que a ingestão de xilitol reduziu o ganho de peso e o consumo de alimento e também diminuiu os níveis plasmáticos de triglicerídeos e colesterol nestes animais (ELLWOOD et at., 1999).

Outras aplicações clínicas do xilitol têm sido descritas como, por exemplo, sua utilização na prevenção de osteoporose, relatada por Mattila, Knuuttila e Svanberg (1998). Segundo esses autores, experimentos com ratos evidenciaram que a administração oral de xilitol impediu a progressão da osteoporose proporcionando aumentos da massa óssea e das

Xilitol-5P Efeitos Tóxicos XILITOL Fru SFT . Inibição do crescimento e perturbação na síntese de proteínas. ATP ADP

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propriedades biomecânicas de ossos enfraquecidos naqueles ratos, apontando ainda que, a utilização de xilitol torna-se uma nova alternativa que amplia os tratamentos clínicos na prevenção desta doença. Recentemente foi demonstrado por Mattila, Kamgasmaa e Knuuttila (2005) que a administração simultânea em ratos de 10% de xilitol aliada a 10% de etanol aumentou o volume ósseo e o conteúdo mineral dos mesmos. Esses efeitos foram maiores do que aqueles induzidos pela única suplementação de 10% de xilitol (MATTILA; KANGASMAA; KNUUTTILA, 2005).

Outra aplicação do xilitol é no tratamento da fibrose cística, uma doença que afeta principalmente os pulmões e o sistema digestivo, pois a sua utilização teve efeito satisfatório no controle desta doença (ZABNER et al., 2000). Esses autores constataram em testes com humanos, que o uso inalatório do xilitol em “spray” resultou na diminuição da concentração salina da camada superficial da membrana respiratória, o que favoreceu a imunidade própria desta superfície e, como conseqüência, reduziu o número de bactérias do gênero

Staphylococcus coagulase-negativa na cavidade nasal de voluntários, diminuindo o risco de

infecções bacterianas pulmonares. Sajjan et al. (2004) relataram que o xilitol inibiu o crescimento da bactéria Burkholderia cepaciae, uma das principais bactérias responsáveis por infecções e morte em pacientes com fibrose cística.

O xilitol tem também a sua eficácia comprovada no tratamento de pacientes com otite e isto é atribuído à inibição do crescimento de Streptococcus pneumoniae em função do impedimento da adesão desta bactéria sobre as células nasofaringeais (UHARI; TAPIAINEN; KONTIOKARI, 2001; TAPIAINEN et al., 2002). Esta propriedade foi observada em experimentos clínicos em crianças, onde o xilitol mostrou-se eficaz na prevenção do desenvolvimento de otite com a utilização de uma dose variando entre 8,4 a 10 g/dia dividida em cinco porções. Estes autores observaram ainda que o uso de xilitol na prevenção desta doença reduziu consideravelmente a utilização de antibióticos empregados no tratamento, contribuindo para a redução de um problema mundial, que é resistência de bactérias a agentes antimicrobianos causada justamente pelo uso descontrolado dos mesmos.

A combinação do xilitol com farnesol, tem sido também testada como forma de controlar o balanço da microbiota da pele, pela inibição da formação de biofilme da bactéria

Staphylococcus aureus além de dissolver aquele já existente (MASAKO et al., 2005a e b)

Segundo os mesmos autores, a formação de biofilme, constituído principalmente de glicocálix e fibras de fibrina, é impedida pela inibição da formação de glicocálix causada pelo xilitol e a dissolução das fibras de fibrina causada pelo farnesol. Entretanto, não se observa a inibição do crescimento da bactéria Staphylococcus epidermidis, a qual é a principal constituinte da

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microflora da epiderme de pessoas saudáveis protegendo-as contra o crescimento de bactérias patogênicas como no caso de S. aureus.

2.1.2 Tolerância e Toxicidade

O xilitol é bem tolerado pelo corpo humano podendo ser consumido até 20g por dose, ou 60g por dia se ingerido em várias refeições, por isso, a ingestão acima dessa porção pode apresentar efeito laxativo devido ao desbalanço osmótico causado no intestino grosso pela baixa taxa de assimilação (EMODI, 1978; CULBERT et al., 1986).

Quanto à segurança do consumo e utilização por humanos, o xilitol já é aceito pela

European Economic Community – EEC desde 1984, enquanto a Food and Drug Administration – FDA dos Estados Unidos o classifica como “geralmente reconhecido como

seguro” (Generally Regarded as Safe – GRAS) desde 1986 e “seguro para os dentes” (Safe

for Teeth) desde 1994. A Joint Expert Comitte on Food Additives (JECFA), uma divisão

prestigiada da World Health Organization, classificou o xilitol como aceitável para consumo diário (Acceptable Daily Intake – ADI).

Todas as características apresentadas pelo xilitol têm garantido seu uso com demanda crescente nas indústrias alimentícia, farmacêutica e odontológica em países como Alemanha, Argentina, Bélgica, Canadá, Estados Unidos, Finlândia, França, Holanda, Inglaterra, Japão, México, Suécia, Suíça e Rússia (CCC – Calorie Control Concil, 2005). No Brasil, a sua utilização está voltada principalmente a produtos como creme dental, gomas de mascar e pastilhas.

2.2 Ocorrência e obtenção do xilitol

2.2.1 Ocorrência

Na natureza, o xilitol é encontrado, por exemplo, em frutas, legumes, leveduras, liquens, algas e cogumelos (Psalliota campestris) e a sua extração diretamente dessas fontes não é economicamente viável pelas baixas quantidades presentes nestes materiais (900mg/100g), o que torna este processo de obtenção economicamente inviável (HYVÖNEN; KOIVISTOINEN; VOIROL, 1982; PEPPER; OLINGER, 1988).

O xilitol também aparece como um produto intermediário durante o metabolismo de carboidratos em mamíferos, inclusive no homem (MANZ; VANNINEN; VOIROL, 1973; YLIKAHRI, 1979). Um humano adulto produz, por exemplo, entre 5 e 15g de xilitol por dia

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durante o metabolismo normal (PEPPER; OLINGER, 1988) e a sua concentração no sangue encontra-se na faixa de 0,03 a 0,06 mg/100mL (MANZ; VANNINEN; VOIROL, 1973; YLIKAHRI, 1979).

Em organismos superiores o metabolismo do xilitol ocorre principalmente no fígado, onde pode ser transformado em glicose a uma taxa entre 20 e 80%, dependendo da necessidade. Sua absorção é lenta e, por isso, também pode ser metabolizado indiretamente pela biota intestinal (PARAJÓ; DOMÍNGUEZ; DOMÍNGUEZ, 1998a; MAKINEN, 2000).

2.2.2 Obtenção

Em escala comercial o xilitol é obtido por via química, porém, pesquisas têm sido extensivamente conduzidas com o objetivo de desenvolver uma via alternativa de obtenção microbiológica deste adoçante. De acordo com Winkelhausen e Kusmanova (1998) e Parajó, Domínguez e Domínguez (1998a), na via química o rendimento deste processo é baixo (50-60% baseado na xilana convertida), sendo difícil alcançar alto rendimento pela quantidade considerável de subprodutos formada e pelo alto custo dos processos de recuperação e purificação do xilitol, enquanto na produção microbiana, altos rendimentos são alcançados a partir de xilose (65-85%).

A produção de xilitol por processo químico iniciou-se na Finlândia pela Finnish Sugar Co. Ltda., Helsink, com capacidade para produzir acima de 3000 ton/ano, processo patenteado em 1977 (Patente # 4.008.285) (MELAJA; HÄMÄLÄINEN, 1977). Este processo consiste na hidrogenação catalítica da xilose pura obtida através da hidrólise de materiais lignocelulósicos. De modo geral, são necessárias quatro etapas básicas para a realização do processo químico: (1) desintegração de materiais lignocelulósicos ricos em xilana através de uma hidrólise ácida, (2) separação da xilose do hidrolisado, por cromatografia, para a obtenção de uma solução de xilose de elevada pureza, (3) hidrogenação catalítica da xilose pura em xilitol na presença de níquel como catalisador e (4) purificação e cristalização do xilitol (MELAJA; HÄMÄLÄINEN, 1977).

O rendimento do processo químico, bem como a qualidade do xilitol, são dependentes da pureza da solução inicial de xilose, uma vez que a presença de impurezas interfere no processo de catálise. Além disto, a produção de xilitol por via química exige várias etapas de purificação para remoção de resíduos do catalisador, o qual é um metal tóxico e prejudicial à saúde humana, e de subprodutos gerados durante o processo de hidrogenação

17

(MELAJA; HÄMÄLÄINEN, 1977), resultando no aumento de tempo de processamento e encarecimento do produto (PARAJÓ; DOMÍNGUEZ; DOMÍNGUEZ, 1998a).

Apesar da produção química de xilitol ser um processo já bem estabelecido, o uso comercial deste adoçante tem sido limitado devido ao seu custo relativamente alto (cerca de 10 vezes o custo de produção da sacarose e do sorbitol) (PARAJÓ; DOMÍNGUEZ; DOMÍNGUEZ, 1998a). Como alternativa ao processo químico, pesquisas têm sido conduzidas para o desenvolvimento de processos biotecnológicos utilizando microrganismos para a conversão de xilose em xilitol sem a necessidade de uso de solução inicial de xilose pura (ONISHI; SUZUKI, 1966; FELIPE et al., 1997a; PARAJÓ; DOMÍNGUEZ; DOMÍNGUEZ, 1998b; FELIPE, 2004a).

Vários microrganismos já foram identificados como fermentadores de xilose em xilitol, destacando-se as leveduras, especialmente o gênero Candida pela maior eficiência de conversão (SIRISANSANEEYAKUL; STANISZEWSKI; RIZZI, 1995; WINKELHAUSEN; KUSMANOVA, 1998; PARAJÓ; DOMÍNGUEZ; DOMÍNGUEZ, 1998b). Atualmente não se tem encontrado na literatura, pesquisas com fungos filamentosos e bactérias produtoras de xilitol, mas há relatos anteriores de trabalhos com fungos filamentosos como os dos gêneros

Penicillium, Aspergillus, Rhizopus, Gliocladium, Byssochlamys, Myrothecium e Neurospora

spp. (CHIANG; KNIGHT, 1961), Petromyces albertensis (DAHIYA, 1991), Mucor sp. e

Fusarium oxysporum (PARAJÓ; DOMÍNGUEZ; DOMÍNGUEZ, 1998a) e bactérias, como Corynebacterium sp., Enterobacter liquefaciens e Mycobacterium smegmatis

(WINKELHAUSEN; KUSMANOVA, 1998).

Existem ainda microrganismos, nos quais o xilitol é formado a partir de arabinose ou arabitol como é o caso do fungo filamentoso Aspergillus niger (WITTEVEEN et al., 1994), da levedura Pichia stipitis (HALLBORN et al., 1995) e da bactéria Gluconobacter oxydans (SUZUKI et al., 2002). O rendimento de xilitol alcançado com esta bactéria foi 0,98 g xilitol/g arabitol, quando o etanol e a glicose também estavam presentes no meio de cultura (SUZUKI et al., 2002).

2.3 Bioconversão de xilose em xilitol

O metabolismo da xilose inicia-se com o seu transporte através da membrana celular por diferentes mecanismos (WINKELHAUSEN; KUSMANOVA, 1998) e uma vez no interior das células, esta é reduzida em xilitol, por uma reação catalisada pela enzima xilose redutase (E.C. 1.1.1.21) ligada a nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfatada ou não, em sua

18

forma reduzida (NADPH/NADH). Em seguida ocorre a oxidação do xilitol em xilulose pela enzima xilitol desidrogenase (E.C. 1.1.1.9) ligada a nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfatada ou não em sua forma oxidada (NADP+/NAD+). A xilulose é então fosforilada a xilulose-5-fosfato que pode ser convertida em piruvato através da conexão da via das fosfopentoses com a via Embden-Meyerhof (HAHN-HÄGERDAL et al., 1994).

As enzimas xilose redutase (XR) e xilitol desidrogenase (XDH) podem ter especificidades diferentes em relação aos cofatores oxidados e reduzidos dependendo da espécie da levedura. Para Candida utilis a enzima XR requer como cofator NADPH, enquanto a XDH é dependente da NAD+. Em Pichia stipitis e Pachysolen tonnophilus estas enzimas são específicas para ambos os cofatores reduzidos (NADH/NADPH) e oxidados (NAD+/NADP+) (BRUINENBERG et al., 1984). Em C. guilliermondii FTI 20037 a enzima XR é NADPH-dependente e a enzima XDH é NAD+ ou NADP+- dependente (SILVA et al., 1996). Yokoyama et al. (1995) sugerem que microrganismos que apresentam a enzima XR dependente de NADH são melhores produtores de etanol e ao contrário, aqueles que apresentam xilose redutase dependente de NADPH, acumulam xilitol ao invés de produzir etanol. Além disso, a disponibilidade de oxigênio influencia fortemente o requerimento dos cofatores desta enzima. Condições de anaerobiose ou limitadas de oxigênio causam um desbalanço redox o qual interfere com a produção de xilitol e dos subprodutos deste metabolismo, etanol e/ou glicerol (FELIPE, 2004a).

Ko, Rhee e Kim (2006) avaliaram o aumento da produtividade e rendimento de xilitol a partir da deleção do gene da enzima xilitol desidrogenase (XLY2) da levedura

C. tropicalis cultivada em meio constituído por xilose e diferentes concentrações de glicerol

como fontes de carbono. Os valores de fator de rendimento e de produtividade foram 0,97 g/g e 3,2 g/L respectivamente, quando 20 g/L de glicerol foi empregada juntamente com 50 g/L de xilose. Os mesmo autores sugerem que o passo metabólico da transformação de xilitol em D-xilulose em Candida sp. pode ser bloqueado pela deleção do gene da enzima responsável por esse passo e o emprego de glicerol como co-substrato para crescimento celular e regeneração de NADPH foram responsáveis pelo elevado valor de rendimento e produtividade alcançados.

As atividades de xilose redutase e xilitol desidrogenase podem ser também influenciadas por outros carboidratos como a arabinose e glicose, presentes juntamente à xilose nos hidrolisados hemicelulósicos como o de bagaço de cana-de-açúcar (FELIPE, 2004b; SILVA e FELIPE, 2006).

19

Outros fatores devem ser também considerados como parâmetros interferentes na bioconversão de xilose em xilitol como o pH (LAWFORD; ROUSSEAU, 1993; FELIPE et al., 1997b; SENE et al., 2000; RODRIGUES et al., 2003c), a repressão catabólica exercida pela D-glicose (YAHASHI et al., 1996; BICHO et al., 1998; LEE; RYU; SEO, 2000), a idade e concentração do inóculo (PFEIFER et al., 1996; FELIPE et al., 1997a), a concentração inicial de xilose (SILVA; AFSCHAR, 1994; FELIPE et al., 1997a), a temperatura (PARAJÓ; DOMÍNGUEZ; DOMÍNGUEZ, 1998b; SENE et al., 2000) e a relação glicose:xilose no meio de fermentação (SILVA; FELIPE, 2006). Porém, quando da utilização de hidrolisados hemicelulósicos é importante considerar além desses fatores acima mencionados a influência exercida por compostos tóxicos aos microrganismos, como fenóis, ácido acético, furfural e 5-hidroximetilfurfural, presentes nos hidrolisados, os quais são provenientes do processo de hidrólise de biomassa vegetal (FELIPE, 2004a). Estes compostos inibem o metabolismo microbiano em função da concentração em que estes se encontram no meio (FELIPE et al., 1997a; ALVES et al., 1998; RODRIGUES et al., 2001; CONVERT et al., 2000; LARSSON et al., 2000; PALMQVIST, HAHN-HÄGERDAL, 2000; NILVEBRANT; REIMANN; LARSSON, 2001; SILVA et al., 2004a).

Os primeiros passos da formação de xilitol por C. guilliermondii a partir dos açúcares presentes em hidrolisados obtidos de materiais lignocelulósicos, estão esquematizados na Figura 3.

20

Figura 3. Fluxograma simplificado da via biotecnológica de obtenção de xilitol a partir de glicose, xilose e arabinose presente nos hidrolisados obtidos de materiais lignocelulósicos (Baseado em MATOS, 2004)

D

-Xilose

X

X

I

I

L

L

I

I

T

T

O

O

L

L

-Xilulose

Xilulose

5P

V

V

i

i

a

a

P

P

e

e

n

n

t

t

o

o

s

s

e

e

F

F

o

o

s

s

f

f

a

a

t

t

o

o

-Arabinose

L-Arabitol

L- Xilulose

MEMBRANA CELULAR MEMBRANA CELULAR MEMBRANA CELULAR

D

-Glicose

Frutose 1,6diP

Dihidroxicetona P

_{Gliceraldeído 3P}

Piruvato

Acetil Coa Acetaldeído

G

G

L

L

I

I

C

C

E

E

R

R

O

O

L

L

KREBS

E

E

t

t

a

a

n

n

o

o

l

l

D

-Glicose

-Xilose

-Arabinose

Frutose 6 P

Glicerol 3P

21

No processo biotecnológico de obtenção de xilitol a partir de C. guilliermondii cultivada em hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana de açúcar já foram estabelecidos parâmetros como concentração (0,1 a 1,0 g/L) e idade do inóculo (24 h) (PFEIFER et al., 1996; FELIPE et al., 1997a), pH (5,5 a 6,5) (FELIPE et al., 1997b); temperatura (30 ºC) (BARBOSA et al., 1988; FELIPE et al., 1997a; SENE et al., 2000), concentração de xilose (50 a 60 g/L) (FELIPE et al.,1997a), relação glicose:xilose (1:5) (SILVA; FELIPE, 2006), concentração de ácido acético (FELIPE et al., 1995; SILVA, 2001; SILVA et al., 2004c). Também a adaptação e reciclagem do inóculo ao próprio hidrolisado (FELIPE, 2004a; MATOS, 2004; RODRIGUES et al., 2006), bem como o preparo do inóculo na presença de baixa concentração de glicose (SILVA, 2004; SILVA; FELIPE, 2006) ou arabinose (MATOS, 2004) junto à xilose foram condições de fermentação que propiciaram o favorecimento da produção de xilitol nas pesquisas realizadas com C. guilliermondii.

Dentre os vários parâmetros avaliados, encontrou-se ser a velocidade de transferência de oxigênio um dos fatores mais importantes na bioconversão de xilose em xilitol por C. guilliermondii, uma vez que a variação acima ou abaixo de um valor ótimo leva a uma diminuição significativa do fator de conversão e/ou produtividade em xilitol (SILVA; FELIPE; MANCILHA, 1998). Para C. guilliermondi a condição de transferência de oxigênio empregada para a produção de xilitol, em frascos agitados (125 mL contendo 50 mL de meio) tem sido 200 rpm (FELIPE et al., 1997a; SENE et al., 2000; SILVA et al., 2004c; RODRIGUES et al., 2006), enquanto em fermentadores de bancada a utilização de um coeficiente volumétrico de transferência de O2 (KLa) próximo de 20 h-1 têm sido o empregado

(MARTÍNEZ; SILVA; FELIPE, 2000; RODRIGUES et al.,2003c; RODRIGUES, 2005). Como já foi mencionado anteriormente, o hidrolisado hemicelulósico obtido por hidrólise do bagaço de cana contém compostos tóxicos à levedura e nesse sentido várias técnicas de tratamento do hidrolisado vem sendo avaliadas com vistas a reduzir o teor destes compostos e aumentar a fermentabilidade do hidrolisado. Dentre estas técnicas, destacam-se o ajuste do pH com adição de ácidos e bases (ALVES et al., 1998; MARTINEZ et al., 2001), a adsorção em carvão ativo (GINORIS, 2001; MARTON, 2002), a retenção em resinas de troca iônica (CANILHA; ALMEIDA E SILVA; SOLENZAL, 2004; MARTON, 2005) e a utilização de células adaptadas ao próprio hidrolisado (FELIPE et al., 1996; SENE et al., 2001a; MATOS, 2004; RODRIGUES et al., 2006).

A partir do esquema apresentado na Figura 4 podem ser observadas as etapas comparativas da produção de xilitol por ambos processos químico e microbiológico.

22 Cristalização Redução Catalítica (Ni) Purificação Recuperação

XILITOL

Materiais Lignocelulósicos Ricos em Xilana Hidrólise

Hidrolisado Hemicelulósico (açúcares e compostos tóxicos)

Tratamento Concentração

Figura 4. Esquema comparativo entre os processos químico (▪▪▪) e microbiológico ( ) de obtenção de

xilitol (Baseado em SILVA, 2004)

2.4 Recuperação de xilitol

A recuperação do xilitol é o passo mais complexo de todo o processo fermentativo devido à sua baixa concentração e complexa composição do caldo fermentado (polipeptídeos, açúcares, sais inorgânicos, álcoois) (DE FAVERI et al., 2004).

A utilização de técnicas de separação do xilitol por diferentes tipos membranas permitiu cristalizar mais de 87% deste produto proveniente da fermentação, por

Candida tropicalis, de hidrolisado hemicelulósico de palha de milho (AFFLECK, 2000). A

máxima pureza obtida neste trabalho foi de 90,3% utilizando-se membrana polisulfônica HG19.

Santos (2004) realizou pesquisas com diferentes zeólitas, na tentativa de recuperar xilitol da fermentação por C. guilliermondii em hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar. Os resultados dessa pesquisa revelaram a eficácia desta técnica, sendo a maior XILOSE

23

eficiência de recuperação do xilitol (94,5%) encontrada com a utilização de um sistema composto por coluna de leito fixo empacotada com a zeólita BaWE.

Recentemente, Martinez (2005) recuperou o xilitol por cristalização tanto do caldo fermentado obtido a partir de solução sintética quanto deste obtido da fermentação do hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar, obtendo-se cristais com 98-99% e 92-94% de pureza respectivamente. Resultados de recuperação semelhante ao de Martinez (2005) foram obtidos a partir de hidrolisado hemicelulósico de palha de trigo (CANILHA, 2006).

2.5 Glicerol

O glicerol, também denominado glicerina, é um álcool (1,2,3–propanotriol), cujo modelo estrutural está apresentado na Figura 5. No caso da utilização do glicerol em humanos, para fins terapêuticos, como em remédios, por exemplo, a terminologia encontrada em sua especificação deve ser glicerol USP (MORRISON, 1994). Embora o glicerol seja encontrado em diferentes espécies, como protistas unicelulares e mamíferos (BRISSON et al., 2001), é difícil o encontrarmos na sua forma “livre” nesses organismos, já que geralmente este se encontra como um triglicerídeo combinado, por exemplo, com ácidos graxos (oléico, palmítico e esteárico) (MORRISON, 1994). Grandes quantidades de glicerol podem ser encontradas também em óleos ou azeites como o de coco, dendê, soja, algodão e oliva, bem como em gorduras de animais como a banha de porco e sebo (MORRISON, 1994).

Figura 5. Modelo estrutural do glicerol (UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA, 2005)

Dentre as características físico-químicas do glicerol (Tabela 1) destacam-se as propriedades de ser um líquido oleoso, incolor, viscoso e de sabor doce, solúvel em água e

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álcool em todas as proporções e pouco solúvel em éter, acetato de etila e dioxano, enquanto em hidrocarbonetos este é insolúvel (LÓPES; REVILLA; MUNILLA, 1999).

Tabela 1 - Propriedades físico-químicas do glicerol (JACKOBSON; KATHAGEN; KLATT, 1989;

MORRISON, 1994; LÓPES; REVILLA; MUNILLA, 1999):

Peso Molecular 92,09

Densidade (glicerol 100%) 25 ºC 1,262 Kg/m3

Viscosidade 20 ºC 939 cps

Ponto de ebulição (101.3 KPa) 290 ºC

Ponto de fusão 18 ºC

Ponto de inflamação 177 ºC

Tensão superficial 20 ºC 63,4 mN/m

Calor específico (glicerol 99.94%) 26 ºC 2,435 J/g

Calor de evaporação 55 ºC 88,12 J/mol

Calor de formação 667,8 KJ/mol

Condutividade térmica 0,28 W/(m.K)

Devido à combinação de propriedades físico-químicas como não toxicidade, ausência de cor e odor, o glicerol é uma substância com grande variedade de aplicações, conforme ilustrado na Figura 6 (REHM, 1988; MORRISON, 1994; BRISSON et al., 2001).

25

Figura 6. Diferentes aplicações do glicerol (ARRUDA; RODRIGUES; FELIPE, 2006)

Dentre as diferentes aplicações do glicerol, destaca-se seu papel como agente crioprotetor em microrganismos, uma vez que ele não permite a formação de cristais de gelo na célula e mantêm a estabilidade da parede celular permitindo a vitalidade da mesma durante o processo de congelamento para a conservação celular (NEVOIGT; STAHL, 1997; BRISSON et al., 2002).

Outra característica do glicerol é seu papel como osmorregulador, importante mecanismo que ocorre nas células como reação a fatores ambientais, como por exemplo, o aumento da pressão osmótica. Assim, em resposta a estas alterações e como forma de manutenção da estabilidade celular, a mesma responde através de mecanismos de osmorregulação como no caso a produção de glicerol pela célula, o que acarreta em diminuição da permeabilidade da membrana e restabelecimento da atividade celular (SAN JOSÉ et al., 1996; NEVOIGT; STAHL, 1997; REP et al., 1999).

Na indústria de alimentos o glicerol é utilizado como aditivo alimentar em função de suas propriedades estabilizantes, antioxidantes, sequestrantes, emulsificantes e umectantes. Como produto farmacêutico sua aplicação se deve à sua alta viscosidade, o que permite sua utilização em xaropes (MORRISON, 1994; RESOLUÇÃO Nº 386).

GLICEROL Aplicações terapeuticas Aplicações em diagnósticos Aplicações industriais

Controla a osmolaridade sanguínea Xaropes Agente purgativo Agente hidratante Agente Crioprotetor Doenças Renais Desordem do metabolismo de carboidratos Aditivo Tinta Explosivos Indústria Alimentícia Indústria Textil Indústria Química Papel Detergente Emulsificante Adesivo Antioxidante Estabilizante Sequestrante Indústria Farmacêutica Remédio

Doenças gastrointestinais e constipações Edemas cerebral e intraocular

Tabaco Maquiagem

Pasta de Dente Cosmético Umectante

Sua ingestão aumenta a resistência a atividades

físicas em atletas Agente

Osmorregulador

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Além das aplicações na indústria de alimentos e farmacêutica, o glicerol é ainda empregado para produção de resinas e poliésteres devido à sua reatividade polifuncional e também como lubrificante na indústria têxtil (MORRISON, 1994). Tem também um importante papel no processamento do tabaco, pois este ajuda a manter a umidade prevenindo o ressecamento deste produto, além deste poder ser utilizado como solvente de muitos compostos (MORRISON, 1994; BRISSON et al., 2001; WANG et al., 2001).

Recentemente novas aplicações do glicerol vem sendo descobertas, como seu emprego como substrato para fermentações bacterianas com a finalidade de se obter produtos de alto valor agregado como polímeros biodegradáveis, raminolipídeos, biosurfactantes, dentre outros (97th AOCS ANNUAL MEETING & EXPO, 2006).

Tradicionalmente o glicerol é produzido por saponificação dos óleos, gorduras ou sebos utilizando lixívias alcalinas, sendo obtido como subproduto na fabricação de sabão. No entanto, esse processo não tem sido mais utilizado a nível industrial devido à substituição do sabão por detergentes (REHM, 1988; AGARWAL, 1990; LÓPES; REVILLA; MUNILLA, 1999; WANG et al., 2001). A sua obtenção pode ser a partir de derivados do petróleo por cloração a altas temperaturas, mas devido à formação de subprodutos prejudiciais ao meio ambiente essa rota entrou em declínio (REHM, 1988; HESTER, 2000).

Devido às diferentes possibilidades de aplicações do glicerol na indústria e a sua ocorrência em vários processos fisiológicos vitais tanto em procarióticos quanto em eucarióticos, vem aumentando o número de pesquisas para a sua produção por via fermentativa a partir de fontes renováveis de energia, cujos resultados destas pesquisas tem sido patenteados (MORRISON, 1994; WANG et al., 2001). No processo fermentativo a matéria-prima empregada incide apreciavelmente nos custos de fabricação do glicerol (JACKOBSON; KATHAGEN; KLATT, 1989; MORRISON, 1994). É importante considerar também que os processos com leveduras freqüentemente resultam em altos rendimentos de glicerol, além do que é muito difícil a sua recuperação do caldo fermentado, especialmente quando esses caldos contêm matérias-primas sem valor e não refinadas. Essas dificuldades são o maior problema durante o processo de obtenção microbiológica de glicerol (REHM, 1988; AGARWAL, 1990; MORRISON, 1994).

Diferentes matérias-primas são empregadas para produção fermentativa do glicerol como melaço de cana e de beterraba, caldo de cana, cereais, bagaço de cana, palha de trigo e arroz (MORRISON, 1994; LÓPES; REVILLA; MUNILLA, 1999). Vários microrganismos como bactérias, leveduras, fungos e também algas e alguns protozoários (Tabela 2), são

27

mencionados na literatura como produtores desse álcool (WANG et al., 2001; TAHERZADEH et al., 2002).

Tabela 2 - Alguns organismos produtores de glicerol (WANG et al., 2001; TAHERZADEH; ADLER;

LIDÉN, 2002)

Bactérias Leveduras Fungos Algas Protozoários

B.1 subtilis S.3 cerevisiae Aspergillus niger D.6 tertiolecta Trypanosoma cruzi B.1 coli S.3 ellipsoideus R.5 nigricans D.6 bioculata Leishmania mexic B.2 orleanense S.3 mellis R.5 javanicus D.6 salina

B.2 pasteurianum C.4 stellata Botrytis cinerea D.6 viridis Lactobacillus lycopersici C. 4 boidinii C.4 kefyr Hanseniaspora guilliermondii

1_Bacillus; 2_Bacterium; 3_{Saccharomyces;} 4_Candida; 5_Rhizopus; 6_Dunaliella.

A biosíntese de glicerol em S. cerevisiae, ocorre pela redução de didroxicetona fosfato a glicerol 3-fosfato, catalisado por adenina dinucleotídeo na sua forma oxidada (NAD+), seguida pela desfosforilação do glicerol 3-fosfato a glicerol (GANCEDO; GANCEDO e SOLS, 1968 apud NEVOIGT; STAHL, 1997). Segundo Nevoigt e Stahl (1997), a formação de glicerol é um mecanismo no qual o microrganismo evita a perda de água para o meio extracelular, enquanto que, no meio intracelular, a sua formação permite a manutenção do equilíbrio redox, principalmente na ausência de oxigênio. A formação deste subproduto a partir do metabolismo de xilose em meio sintético foi observada durante o cultivo das leveduras C. boidinii, C. shehatae, Pichia stipitis, Pachysolen tannophilus (VANDESKA et al., 1995), Candida tropicalis (YAHASHI et al., 1996), e S. cerevisiae (ANDERLUND; RÅDSTRÖN; HAHN-HÄGERDAL, 2001), bem como nos diferentes hidrolisados cultivados com Candida guilliermondii como hidrolisados de bagaço de cana-de-açúcar (RODRIGUES et al., 2003c, MATOS; FELIPE; SIVA, 2003) e de casca de aveia (FELIPE et al.,2003). Rodrigues et al. (2003c) encontraram que a formação de glicerol por C.

guilliermondii cultivada em bagaço de cana, está associada ao pH, sendo favorecida em pH

7,5, diferente ao observado para o xilitol já que este foi favorecido em pH 5,5.

Não só o pH foi encontrado como um parâmetro que interferiu na formação de glicerol por C. guilliermondii, mas a proporção de glicose:xilose no meio também interferiu

28

neste metabolismo, já que o aumento desta relação no hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana favoreceu a formação deste composto pela levedura (SILVA, 2004).

A concentração de açúcares no hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana também interferiu na produção de glicerol por C. guilliermondii, pois se verificou tendência de aumento na formação do glicerol com o aumento do teor de açúcares no hidrolisado sem tratamento prévio para a sua destoxificação (MATOS, 2004). Entretanto, esse mesmo autor constatou que a adaptação das células ao hidrolisado durante o preparo do inóculo resultou em menor formação de glicerol em relação à utilização do inóculo obtido do cultivo da levedura em meio semi-sintético e sugeriu que a técnica de adaptação poderia promover uma diminuição do efeito dos compostos tóxicos presentes nos hidrolisados sobre a levedura, levando ao consumo do glicerol. Silva et al. (2004b), também constataram a formação e posterior consumo do glicerol por C. guilliermondii durante o cultivo desta em hidrolisado de bagaço de cana, principalmente com o esgotamento da xilose.

As Figuras 7 e 8 apresentam esquemas da assimilação microbiana de glicerol como fonte de carbono e energia (AHRENS et al., 1998; WALKER, 1998; FLORES et al., 2000; BIEBL, 2001). Em leveduras o metabolismo de glicerol na presença de oxigênio (vias oxidativas) é proposto em dois principais passos: (1) em S. cerevisiae ou C. utilis o glicerol é fosforilado por uma glicerol quinase e o L-glicerol-3-fosfato formado é oxidado por uma glicerol fosfato ubiquinona oxirredutase mitocondrial; (2) em Schizosaccharomyces pombe a desidrogenação do glicerol por uma glicerol desidrogenase dependente de NAD+ forma dihidroxiacetona, a qual é então fosforilada por uma dihidroxicetona quinase (GANCEDO; GANCEDO e SOLS, 1968 apud FLORES et al., 2000). Ahrens et al., 1998, sugere além dessas vias oxidativas, uma terceira via, via redutiva, que ocorre em condições limitadas de oxigênio, relatada para Klebsiella pneumoniae, que consiste na desidratação do glicerol por uma glicerol desidratase formando 3-hidroxi-propionaldeído, seguido da conversão deste a 1-3 propanodiol pela enzima 1-3 propanodiol oxirredutase dependente de NADH2.

No caso da bactéria Clostridium pasteurianum (Figura 8) o metabolismo de glicerol resultou na formação de produtos como 1,3 propanodiol, butirato, butanol e etanol (BIEBL, 2001).

29

Figura 8. Esquema do metabolismo de glicerol por Clostridium pasteurianum (Baseado em BIEBL,

2001)

Figura 7. Esquema do metabolismo de glicerol pelas vias oxidativas e redutiva de alguns

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2.6 Matérias-primas para a obtenção microbiológica de xilitol

A biomassa vegetal constitui uma fonte em potencial de carbono e energia que pode ser empregada em bioprocessos para a produção de diversos produtos de valor agregado, uma vez que é abundante, renovável e de baixo custo (TSAO, 1986; LEE, 1997; CHANDRAKAT; BISARIA, 1998). Para se ter uma idéia da produção mundial de biomassa, cita-se o trabalho de Hon e Shiraishi (2001), que estimaram uma produção em torno de 172 bilhões de toneladas por ano, destes 82% são materiais lignocelulósicos florestais, como madeira, resíduos agrícolas, plantas aquáticas, gramíneas e outros.

Vários materiais lignocelulósicos (Tabela 3) são utilizados para obtenção de hidrolisados hemicelulósicos com o objetivo de produzir xilitol. Dentre eles podemos destacar: o bagaço de cana-de-açúcar (FELIPE et al., 1996, 1997a e b; ALVES et al., 1998; SENE et al., 2001a; VIÑALS, 2001; MARTON, 2002; RODRIGUES et al., 2003a e b; MARTON et al., 2006), o eucalipto (PARAJÓ; DOMÍNGUES; DOMÍNGUEZ, 1996a e b, 1997 e 1998a; CANETTIERI; ALMEIDA E SLVA; CARVALHO JR, 2003), a palha de arroz (ROBERTO et al.,1994 e 1995, MUSSATO; ROBERTO, 2005), a de trigo (CANILHA, 2006), a de cevada (CÂNDIDO et al., 2004) e a casca de aveia (TAMANINI et al., 2004).

A composição química dos materiais lignocelulósicos é complexa, sendo constituída principalmente por celulose, hemicelulose, lignina e compostos de baixa massa molar como extrativos (FENGEL, WEGENER, 1989).

Tabela 3 - Composição de alguns materiais lignocelulósicos

Material Celulose (%) Hemicelulose (%) Lignina (%) Referência

Palha de sorgo 34,00 44,00 20,00 Herrera et al. (2003)

Bagaço de cana 40,00 35,00 15,00 Rodrigues (2005)

Palha de cevada 23,00 32,70 24,40 Cândido et al. (2004)

Palha de trigo 33,81 31,83 20,12 Canilha (2006)

Casca de aveia 30,51 28,63 23,09 Felipe et al. (2003)

Palha de arroz 43,50 22,00 17,20 Mussato e Roberto

(2002)

Eucaliptus

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2.6.1 Bagaço de Cana-de-Açúcar

O Brasil é o maior produtor mundial de cana-de-açúcar, destacando-se o estado de São Paulo como o maior contribuidor nessa produção (59,9% da produção nacional). O aumento do consumo de álcool combustível e o crescimento da produção de carros com motor bicombustível deve refletir no campo este ano, pois segundo a CONAB, a safra de 2005/2006 no país produziu 431,4 milhões de toneladas e a previsão para a safra 2006/2007 é de 471,2 milhões de toneladas, um aumento de 9,2% na produção (CONAB, 2006). Tendo em vista que cada tonelada de cana-de-açúcar processada gera de 180 a 280 Kg de bagaço de cana (SANTANA; SOUZA, 1984), pode-se estimar que somente na safra 2006/2007 serão gerados entre 84 e 132 milhões de toneladas de bagaço. Embora o bagaço gerado durante a produção de açúcar e álcool seja utilizado em grande parte pela própria indústria sucroalcooleira como fonte energética, produção de vapor, existe ainda um excedente deste material, em torno de 10%, que gera problemas de estocagem e poluição ambiental (PROCKNOR, 2000).

As fibras do bagaço da cana contêm, como principais componentes, cerca de 40% de celulose, 35% de hemicelulose e 15% de lignina (RODRIGUES, 2005). A celulose é um polímero linear constituído por unidades de D-glicose unidas por ligações glicosídicas β-1→4, enquanto a hemicelulose é um heteropolímero composto predominantemente por hexoses e pentoses com curtas ramificações tais como D-xilose, D-glicose, L-arabinose e D-galactose e

a lignina, uma macromolécula polifenólica, é constituída por unidades básicas de 3-5-dimetoxi-fenilpropano, 3 metoxi-fenilpropano e

4-hidroxi-fenilpropano (FENGEL; WEGENER, 1989). A elevada concentração de xilose na fração hemicelulósica do bagaço, o que corresponde em até 80% do total de açúcar nesta fração (RODRIGUES et al., 2001) e a capacidade de assimilação desta pentose por várias leveduras são os principais fatores que impulsionam o aproveitamento deste resíduo em diferentes processos de bioconversão como para a produção de xilitol (BARBOSA et al., 1988; PARAJÓ; DOMÍNGUEZ; DOMÍNGUES, 1998a) .

Para a utilização do bagaço de cana como matéria-prima na produção biotecnológica de xilitol faz-se necessário sua hidrólise para a liberação de monossacarídeos fermentescíveis da fração hemicelulósica. A hidrólise ácida é o processo pelo qual tem-se obtido o hidrolisado hemicelulósico de bagaço utilizando-se a temperatura de 121 oC, por 10 minutos, empregando-se 100 mg de H2SO4 por grama de matéria seca para uma relação sólido-líquido

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3 MATERIAL E MÉTODOS

3.1 Hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana

O hidrolisado empregado nas fermentações foi obtido por hidrólise ácida e concentração a vácuo durante pesquisas realizadas por Matos, 2004 e Silva, 2004. No presente trabalho os volumes de cada hidrolisado foram misturados para a homogeneização do mesmo e posterior caracterização quanto ao pH, à concentração de açúcares (xilose, glicose e

arabinose) e dos compostos tóxicos (ácido acético, furfural, hidroximetilfurfural, ρ-hidroxibenzóico, ácido vanílico, ácido siríngico, vanilina, seringaldeído e ácido ferúlico).

Após a caracterização, o mesmo foi tratado, visando reduzir o teor de compostos tóxicos, segundo metodologia estabelecida por Marton (2002). O procedimento realizado consistiu na alteração do pH do hidrolisado, combinada com adsorção em carvão vegetal ativado (Carbonato delta-A) produzido pela BRASILAC. A alteração do pH ocorreu por adição ao hidrolisado de óxido de cálcio comercial (CaO) até pH 7,0 seguido da redução para 2,5 com ácido fosfórico (H3PO4). Após esta etapa, o hidrolisado foi misturado ao carvão (1%) sob

agitação em incubadora de movimento rotatório (New Brunswick, Scientific Co.) à 100rpm, à 60oC durante 30 minutos. Ao final de cada etapa de tratamento (alteração de pH e adsorção) o hidrolisado foi filtrado em papel de filtro qualitativo para remoção do precipitado formado.

Após o tratamento do hidrolisado este foi autoclavado a 111 ºC por 15 minutos e novamente caracterizado quanto ao pH, à concentração dos açúcares e compostos tóxicos.

3.2 Microrganismo e preparo do inóculo

Os ensaios foram realizados com a levedura Candida guilliermondii FTI 20037, selecionada por BARBOSA et al. (1988) para produção de xilitol, mantida a 4 ºC em tubos inclinados com ágar extrato de malte.

Para o preparo do inóculo foi empregado o meio semi-sintético, contendo 50 mL do meio, composto de xilose (30 g/L) como fonte de carbono, suplementado com sulfato de amônio (2 g/L), cloreto de cálcio dihidratado (0,1 g/L) e extrato de farelo de arroz (20 g/L). As soluções estoques de sulfato de amônio e cloreto de cálcio dihidratado foram preparadas separadamente nas concentrações de 250 e 50 g/L, respectivamente, e esterilizadas a 121 ºC por 20 minutos. Para a utilização do farelo de arroz como nutriente, foi empregado 200 g de farelo para um volume de

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1 L de água destilada, o qual foi autoclavado por 15 minutos a 111°C. Após o resfriamento dessa suspensão, esta foi centrifugada por 30 minutos em condições assépticas a 2000 X g (Cu-500 – Damon/IEC Division). A fração líquida (extrato de farelo de arroz) foi transferida para um frasco previamente esterilizado e conservada em geladeira até a sua utilização, num prazo máximo de uma semana após o seu preparo, conforme metodologia empregada por Felipe et al. (1997a); Alves et al. (1998) e Rodrigues (1999).

O cultivo da levedura foi feito em frascos Erlenmeyer (125 mL) em incubadora de movimento rotatório (New Brunswick, Scientific Co.) com agitação de 200 rpm, a 30 oC por 24 horas. Após este período as células foram recuperadas por centrifugação a 2000 x g (Cu-500 – Damon/IEC Division), lavadas com água destilada esterilizada, sob nova centrifugação para o descarte do sobrenadante e utilização das células para o preparo de uma suspensão com água esterilizada, a qual foi empregada como inóculo. A concentração inicial de células nas fermentações foi de 1,0 g/L, em função desta ter sido a considerada como favorável à esta bioconversão (FELIPE et al., 1997a).

3.3 Meios e condições de fermentação

Os experimentos para avaliação do efeito do glicerol foram realizados empregando-se como meios de fermentação o meio empregando-semi-sintético, composto somente de xiloempregando-se como única fonte de carbono (concentração determinada em função do seu teor presente no hidrolisado) e o hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar (obtido conforme itens 3.1). Foram utilizados também meios sem adição de glicerol e meio contendo glicerol (53 g/L) em substituição aos açúcares. Estes meios foram suplementados com os mesmos nutrientes utilizados para o preparo do inóculo, exceto a xilose (item 3.2).

Para a avaliação do glicerol nas fermentações, este foi adicionado aos meios (semi-sintético e hidrolisado) nas seguintes concentrações: 0,3; 0,7; 1,0; 3,5 e 6,5 g/L. A solução estoque de glicerol, este da marca Synth, U.S.P. e densidade equivalente a 1,3696 g/L, foi preparada na concentração de 200 g/L e em seguida foi esterilizada a 121 ºC por 20 minutos.

Para todas as condições avaliadas o pH inicial de fermentação foi 5,5 e quando necessário este foi corrigido com solução de NaOH-3N durante o preparo do meio. As fermentações foram realizadas em frascos Erlenmeyer (125 mL) em triplicata, com 50 mL dos meios, a 30°C, sob agitação de 200 rpm em incubadora de movimento rotatório (New Brunswick, Scientific Co.) por 72 horas. Amostras correspondentes ao volume de cada Erlenmeyer foram retiradas no início de cada fermentação e após 10, 24, 34, 48, 58 e 72 horas de

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incubação para serem imediatamente avaliadas quanto à concentração celular, viabilidade e pureza da cultura. Em seguida as amostras foram centrifugadas a 2000 x g (Cu-500 – Damon/IEC Division) por 15 minutos, sendo que o sobrenadante foi separado das células e utilizado para determinação do pH, das concentrações dos açúcares (xilose, arabinose e glicose), ácido acético, glicerol, butanol, 1,3 propanodiol, butirato, etanol e xilitol.

3.4 Métodos analíticos

3.4.1 Viabilidade e Pureza da Cultura

A viabilidade da cultura foi verificada a partir de visualizações microscópicas de lâminas preparadas a fresco, nas quais as células foram coradas pela adição de igual volume de uma solução 0,01% (p/v) de azul de metileno dissolvido em citrato de sódio 2% (p/v) (ODUMERO et al., 1992), enquanto a pureza foi verificada a partir de lâminas fixadas e coradas com fucsina. As observações foram realizadas em microscópio óptico Leitz.

3.4.2 Determinação das Concentrações de Açúcares, Ácido acético, Glicerol, Butanol, 1,3 Propanodiol, Butirato, Etanol e Xilitol.

As concentrações dos açúcares (D-xilose, D-glicose e L-arabinose), bem como de ácido acético, glicerol, butanol, 1,3 propanodiol, butirato, etanol e xilitol foram determinadas por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC), nas seguintes condições: coluna “Bio-Rad Aminex” HPX-87H mantida a 45 ºC; detector de índice de refração RID 6A; eluente ácido sulfúrico 0,01N, fluxo de 0,6 mL/min.; volume da amostra injetada, 20μL. As amostras foram previamente diluídas e filtradas em filtro “Sep Pack” C18 (MILLIPORE).

3.4.3 Determinação das Concentrações de Furfural e Hidroximetilfurfural

As concentrações de furfural e hidroximetilfurfural (HMF) nos hidrolisados foram determinadas por HPLC, nas seguintes condições: coluna Hewlett-Packard RP18 mantida a 25 ºC; detector de ultravioleta SPD-10A UV-VIS; eluente, solução de acetonitrila/água (1:8) com 1% de ácido acético; fluxo de 0,8 mL/min; volume da amostra injetada 20 μL. As amostras foram previamente filtradas em membrana Minisart 0,22 μm (MILLIPORE).

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3.4.4 Determinação das Concentrações de Compostos fenólicos

As concentrações dos fenólicos como os ácidos ρ-hidroxibenzóico, vanílico, siríngico ferúlico e os aldeídos siringaldeído e vanilina, foram determinadas por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (WATERS), segundo metodologia empregada por Morales (2005), nas seguintes condições: coluna Waters Resolve C18 5μm (3,9 x 300 mm); temperatura ambiente, detector de ultravioleta SPD-10A UV-VIS a 276 nm; eluente, solução de acetonitrila/água (1:8) com 1% de ácido acético; fluxo 0,9 mL/min e volume da amostra injetada 20μL. As amostras foram previamente diluídas e filtradas em filtro “Sep Pack” C18 (MILLIPORE).

3.4.5 Determinação da Concentração Celular

A concentração celular foi determinada por espectrofotometria a 600 nm, onde a concentração de células em g/L foi calculada por uma curva padrão que correlaciona a absorbância a 600 nm e o peso seco das células obtidas do cultivo por 24 horas em meio semi-sintético empregado no preparo do inóculo.

3.4.6 Determinação do pH

Os valores de pH das amostras foram determinados por potenciometria, por meio de um aparelho da marca Micronal modelo B 474, com correção de temperatura.

3.5 Metodologia de análise dos resultados

3.5.1 Determinação dos Parâmetros Fermentativos

• Fator de Conversão de D-xilose em Xilitol (YP/S)

O fator de conversão ou fator de rendimento, é aquele que expressa a massa de xilitol produzido por massa de xilose consumida, em gramas, foi calculado pela equação 1:

YP/S = ΔP = Pf – Pi (1)

ΔS Sf - Si

Em que:

Si e Sf correspondem às concentrações inicial e final de xilose (g/L);