3.1 Hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana
O hidrolisado empregado nas fermentações foi obtido por hidrólise ácida e concentração a vácuo durante pesquisas realizadas por Matos, 2004 e Silva, 2004. No presente trabalho os volumes de cada hidrolisado foram misturados para a homogeneização do mesmo e posterior caracterização quanto ao pH, à concentração de açúcares (xilose, glicose e
arabinose) e dos compostos tóxicos (ácido acético, furfural, hidroximetilfurfural, ρ-hidroxibenzóico, ácido vanílico, ácido siríngico, vanilina, seringaldeído e ácido ferúlico).
Após a caracterização, o mesmo foi tratado, visando reduzir o teor de compostos tóxicos, segundo metodologia estabelecida por Marton (2002). O procedimento realizado consistiu na alteração do pH do hidrolisado, combinada com adsorção em carvão vegetal ativado (Carbonato delta-A) produzido pela BRASILAC. A alteração do pH ocorreu por adição ao hidrolisado de óxido de cálcio comercial (CaO) até pH 7,0 seguido da redução para 2,5 com ácido fosfórico (H3PO4). Após esta etapa, o hidrolisado foi misturado ao carvão (1%) sob
agitação em incubadora de movimento rotatório (New Brunswick, Scientific Co.) à 100rpm, à 60oC durante 30 minutos. Ao final de cada etapa de tratamento (alteração de pH e adsorção) o hidrolisado foi filtrado em papel de filtro qualitativo para remoção do precipitado formado.
Após o tratamento do hidrolisado este foi autoclavado a 111 ºC por 15 minutos e novamente caracterizado quanto ao pH, à concentração dos açúcares e compostos tóxicos.
3.2 Microrganismo e preparo do inóculo
Os ensaios foram realizados com a levedura Candida guilliermondii FTI 20037, selecionada por BARBOSA et al. (1988) para produção de xilitol, mantida a 4 ºC em tubos inclinados com ágar extrato de malte.
Para o preparo do inóculo foi empregado o meio semi-sintético, contendo 50 mL do meio, composto de xilose (30 g/L) como fonte de carbono, suplementado com sulfato de amônio (2 g/L), cloreto de cálcio dihidratado (0,1 g/L) e extrato de farelo de arroz (20 g/L). As soluções estoques de sulfato de amônio e cloreto de cálcio dihidratado foram preparadas separadamente nas concentrações de 250 e 50 g/L, respectivamente, e esterilizadas a 121 ºC por 20 minutos. Para a utilização do farelo de arroz como nutriente, foi empregado 200 g de farelo para um volume de
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1 L de água destilada, o qual foi autoclavado por 15 minutos a 111°C. Após o resfriamento dessa suspensão, esta foi centrifugada por 30 minutos em condições assépticas a 2000 X g (Cu-500 – Damon/IEC Division). A fração líquida (extrato de farelo de arroz) foi transferida para um frasco previamente esterilizado e conservada em geladeira até a sua utilização, num prazo máximo de uma semana após o seu preparo, conforme metodologia empregada por Felipe et al. (1997a); Alves et al. (1998) e Rodrigues (1999).
O cultivo da levedura foi feito em frascos Erlenmeyer (125 mL) em incubadora de movimento rotatório (New Brunswick, Scientific Co.) com agitação de 200 rpm, a 30 oC por 24 horas. Após este período as células foram recuperadas por centrifugação a 2000 x g (Cu-500 – Damon/IEC Division), lavadas com água destilada esterilizada, sob nova centrifugação para o descarte do sobrenadante e utilização das células para o preparo de uma suspensão com água esterilizada, a qual foi empregada como inóculo. A concentração inicial de células nas fermentações foi de 1,0 g/L, em função desta ter sido a considerada como favorável à esta bioconversão (FELIPE et al., 1997a).
3.3 Meios e condições de fermentação
Os experimentos para avaliação do efeito do glicerol foram realizados empregando- se como meios de fermentação o meio semi-sintético, composto somente de xilose como única fonte de carbono (concentração determinada em função do seu teor presente no hidrolisado) e o hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar (obtido conforme itens 3.1). Foram utilizados também meios sem adição de glicerol e meio contendo glicerol (53 g/L) em substituição aos açúcares. Estes meios foram suplementados com os mesmos nutrientes utilizados para o preparo do inóculo, exceto a xilose (item 3.2).
Para a avaliação do glicerol nas fermentações, este foi adicionado aos meios (semi- sintético e hidrolisado) nas seguintes concentrações: 0,3; 0,7; 1,0; 3,5 e 6,5 g/L. A solução estoque de glicerol, este da marca Synth, U.S.P. e densidade equivalente a 1,3696 g/L, foi preparada na concentração de 200 g/L e em seguida foi esterilizada a 121 ºC por 20 minutos.
Para todas as condições avaliadas o pH inicial de fermentação foi 5,5 e quando necessário este foi corrigido com solução de NaOH-3N durante o preparo do meio. As fermentações foram realizadas em frascos Erlenmeyer (125 mL) em triplicata, com 50 mL dos meios, a 30°C, sob agitação de 200 rpm em incubadora de movimento rotatório (New Brunswick, Scientific Co.) por 72 horas. Amostras correspondentes ao volume de cada Erlenmeyer foram retiradas no início de cada fermentação e após 10, 24, 34, 48, 58 e 72 horas de
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incubação para serem imediatamente avaliadas quanto à concentração celular, viabilidade e pureza da cultura. Em seguida as amostras foram centrifugadas a 2000 x g (Cu-500 – Damon/IEC Division) por 15 minutos, sendo que o sobrenadante foi separado das células e utilizado para determinação do pH, das concentrações dos açúcares (xilose, arabinose e glicose), ácido acético, glicerol, butanol, 1,3 propanodiol, butirato, etanol e xilitol.
3.4 Métodos analíticos
3.4.1 Viabilidade e Pureza da Cultura
A viabilidade da cultura foi verificada a partir de visualizações microscópicas de lâminas preparadas a fresco, nas quais as células foram coradas pela adição de igual volume de uma solução 0,01% (p/v) de azul de metileno dissolvido em citrato de sódio 2% (p/v) (ODUMERO et al., 1992), enquanto a pureza foi verificada a partir de lâminas fixadas e coradas com fucsina. As observações foram realizadas em microscópio óptico Leitz.
3.4.2 Determinação das Concentrações de Açúcares, Ácido acético, Glicerol, Butanol, 1,3 Propanodiol, Butirato, Etanol e Xilitol.
As concentrações dos açúcares (D-xilose, D-glicose e L-arabinose), bem como de ácido acético, glicerol, butanol, 1,3 propanodiol, butirato, etanol e xilitol foram determinadas por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC), nas seguintes condições: coluna “Bio- Rad Aminex” HPX-87H mantida a 45 ºC; detector de índice de refração RID 6A; eluente ácido sulfúrico 0,01N, fluxo de 0,6 mL/min.; volume da amostra injetada, 20μL. As amostras foram previamente diluídas e filtradas em filtro “Sep Pack” C18 (MILLIPORE).
3.4.3 Determinação das Concentrações de Furfural e Hidroximetilfurfural
As concentrações de furfural e hidroximetilfurfural (HMF) nos hidrolisados foram determinadas por HPLC, nas seguintes condições: coluna Hewlett-Packard RP18 mantida a 25 ºC; detector de ultravioleta SPD-10A UV-VIS; eluente, solução de acetonitrila/água (1:8) com 1% de ácido acético; fluxo de 0,8 mL/min; volume da amostra injetada 20 μL. As amostras foram previamente filtradas em membrana Minisart 0,22 μm (MILLIPORE).
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3.4.4 Determinação das Concentrações de Compostos fenólicos
As concentrações dos fenólicos como os ácidos ρ-hidroxibenzóico, vanílico, siríngico ferúlico e os aldeídos siringaldeído e vanilina, foram determinadas por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (WATERS), segundo metodologia empregada por Morales (2005), nas seguintes condições: coluna Waters Resolve C18 5μm (3,9 x 300 mm); temperatura ambiente, detector de ultravioleta SPD-10A UV-VIS a 276 nm; eluente, solução de acetonitrila/água (1:8) com 1% de ácido acético; fluxo 0,9 mL/min e volume da amostra injetada 20μL. As amostras foram previamente diluídas e filtradas em filtro “Sep Pack” C18 (MILLIPORE).
3.4.5 Determinação da Concentração Celular
A concentração celular foi determinada por espectrofotometria a 600 nm, onde a concentração de células em g/L foi calculada por uma curva padrão que correlaciona a absorbância a 600 nm e o peso seco das células obtidas do cultivo por 24 horas em meio semi- sintético empregado no preparo do inóculo.
3.4.6 Determinação do pH
Os valores de pH das amostras foram determinados por potenciometria, por meio de um aparelho da marca Micronal modelo B 474, com correção de temperatura.
3.5 Metodologia de análise dos resultados
3.5.1 Determinação dos Parâmetros Fermentativos
• Fator de Conversão de D-xilose em Xilitol (YP/S)
O fator de conversão ou fator de rendimento, é aquele que expressa a massa de xilitol produzido por massa de xilose consumida, em gramas, foi calculado pela equação 1:
YP/S = ΔP = Pf – Pi (1)
ΔS Sf - Si
Em que:
Si e Sf correspondem às concentrações inicial e final de xilose (g/L);
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• Produtividade Volumétrica de Xilitol (Qp)
A produtividade volumétrica de xilitol expressa a concentração de xilitol produzido (g/L) por tempo (h), e foi calculada de acordo com a equação 2:
Qp = ΔP = Pf – Pi (2)
ΔT Tf - Ti
Em que:
Pi e Pf correspondem às concentrações inicial e final de xilitol (g/L);
Ti e Tf correspondem aos tempos inicial e final de fermentação (h).
• Eficiência de Conversão (η)
Este parâmetro fermentativo expresso em %, representa a razão entre o fator de rendimento (YP/S) obtido experimentalmente e o fator de rendimento teórico de
0,917gxilitol/gxilose calculado segundo BARBOSA et al. (1988) seguindo a equação 3:
η = (Pf – Pi * 100) (3)
(Sf - Si)* 0,917
Em que:
Pi e Pf correspondem às concentrações inicial e final de xilitol (g/L);
Si e Sf correspondem às concentrações inicial e final de xilose (g/L).
• Velocidade de Consumo
Este parâmetro representa a velocidade de consumo de um composto, calculado pela variação da sua concentração (g/L) dividida pelo tempo (h) de fermentação, representado pela equação 4:
V = Cf – Ci (4)
Tf - Ti
Em que:
Ci e Cf correspondem às concentrações inicial e final do composto analisado (g/L);
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