Londrina 2016
CENTRO DE PESQUISA EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
MESTRADO EM CIÊNCIAS DA REABILITAÇÃO
LEANDRO VAZ TOFFOLI
EFEITOS DO ESTRESSE E DA PRÁTICA DE EXERCÍCIO
FÍSICO SOBRE O MECANISMO DE METILAÇÃO DO DNA
Londrina 2016
LEANDRO VAZ TOFFOLI
EFEITOS DO ESTRESSE E DA PRÁTICA DE EXERCÍCIO
FÍSICO SOBRE O MECANISMO DE METILAÇÃO DO DNA
EM CÉLULAS DO PULMÃO DE RATOS
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Reabilitação (Programa Associado entre Universidade Estadual de Londrina - UEL e Universidade Norte do Paraná - UNOPAR), como requisito para a obtenção do título de Mestre em Ciências da Reabilitação.
Orientador: Prof. Dr. Marcus Vinícius de Matos Gomes
LEANDRO VAZ TOFFOLI
EFEITOS DO ESTRESSE E DA PRÁTICA DE EXERCÍCIO
FÍSICO SOBRE O MECANISMO DE METILAÇÃO DO DNA
EM CÉLULAS DO PULMÃO DE RATOS
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Reabilitação (Programa Associado entre Universidade Estadual de Londrina [UEL] e Universidade Norte do Paraná [UNOPAR]), como requisito para a obtenção do título de Mestre em Ciências da Reabilitação.
BANCA EXAMINADORA
____________________________________ Prof. Dr. Marcus Vinícius de Matos Gomes
Universidade Norte do Paraná
____________________________________ Prof. Drª Regina Célia Poli Frederico
Universidade Norte do Paraná
____________________________________ Prof. Dr. Henrique César Santejo Silveira
Hospital do Câncer de Barretos
AGRADECIMENTOS
Ao meu pai Valdecir Aparecido Toffoli, e minha mãe Elenice Vaz Toffoli e minha irmã Michelle Vaz Toffoli pelo incentivo, pelo amor e apoio incondicional.
Ao meu parceiro e amigo, Thiago Rennan Gomes que esteve presente durante todo esse percurso, sempre me apoiando e comemorando junto comigo as minhas vitórias.
Ao meu Profº Orientador Dr. Marcus Vinicius de Matos Gomes pelo conhecimento transmitido e todo o suporte durante estes anos.
Aos funcionários e amigos do Laboratório Cetel e Laboratório Cellmais por acompanhar essa trajetória.
Aos colaboradores do Laboratório de Análise de Materiais e Moléculas (LAMM) da Universidade Estadual de Londrina (UEL) pela disponibilidade e prontidão.
Aos colaboradores e colegas do Laboratório de Neurociência e Farmacologia Cardiovascular da Universidade Estadual de Londrina (UEL) pelo suporte e disponibilidade.
À Funadesp, pelo apoio financeiro na execução do projeto.
Pouco conhecimento faz com que as pessoas se sintem orgulhosas. Muito conhecimento, que se sintam humildes. – Leonardo da Vinci
TOFFOLI, Leandro Vaz. Efeitos do estresse e da prática de exercício físico sobre o
mecanismo de metilação do DNA em células do pulmão de ratos. 2016. 61 fls. Dissertação
(Mestrado em Ciências da Reabilitação) – Universidade Norte do Paraná, Londrina, 2016.
RESUMO
Dados recentes da literatura sugerem a participação de mecanismos epigenéticos nas respostas celulares adaptativas ao estresse. Similarmente, dados consistentes revelam o potencial do exercicio fisico em modular os efeitos do estresse comportamental. Neste contexto, objetivamos avaliar no presente estudo o efeito do estresse sobre a metilação global do DNA em células do pulmão de ratos e sua relação com a expressão dos genes Dnmt1, Dnmt3a e Dnmt3b. Adicionalmente avaliamos o potencial da prática de exercício físico (natação) em modular os efeitos moleculares relacionados ao estresse. Ratos Wistar foram distribuidos em 04 grupos contendo 05 animais cada: um grupo foi submetido ao protocolo validado de estresse (grupo ST) do 67º dia pós-natal (DPN) ao 80º DPN. Para o grupo de praticantes de exercício físico (grupo EX) foram considerados ratos submetidos a natação no período que compreende 53º e 79º DPN. O grupo de exercício físico e estresse (grupo EX-ST) foi constituído por animais submetidos à natação no período do 53º ao 79º DPN e ao protocolo de estresse do 67º ao 80º DPN. O grupo controle (CTL) foi constituído por animais que foram mantidos nas mesmas condições ambientais porém não foram submetidos aos protocoos de estresse ou exercício físico. No último dia do protocolo (80º DPN) os animais foram sacrificados por decaptação para obtenção de amostra do pulmão. Para a avaliação quantitativa do perfil de metilação global do DNA foi utilizado o Imprint® Methylated DNA Quantification kit (Sigma-Aldrich). A expressão dos genes Dnmt1, Dnmt3a e Dnmt3b foi avaliada por PCR em tempo real utilizando o sistema de detecção Taqman e o gene Gapdh como controle endógeno. Diminuição estatisticamente significativa da metilação global do DNA foi observada quando comparados os grupos ST e CTL (p=0.0159). Entretanto, um aumento significativo na metilação global do DNA foi observado quando comparados os grupos EX e EX-ST com ST (p=0.0018). No tocante aos genes das DNA metiltranferases, aumento estatisticamente significativo foi observado na expressão do gene Dnmt1 no grupo ST quando comparado com CTL (p=0.0159) e uma diminuição na expressão quando comparados os grupos EX-ST e ST (p=0.0042). Diminuição significativa na expressão dos genes Dnmt3a e Dnmt3b foi observada quando comparados os grupos EX e ST (p=0.0018) além de uma diminuição da expressão do gene Dnmt3b quando comparados EX e CTL (p=0.0357). Em suma, nossos dados demonstram que o estresse comportamental induz uma diminuição no perfil de metilação global do DNA em células do pulmão de ratos associada ao aumento na expressão do gene Dnmt1. Além disso, nossas evidências sugerem que a prática de exercício fisico pode potencialmente modular as respostas induzidas pelo estresse em células do pulmão de ratos no que diz respeito a variações na metilação global do DNA e na expressão dos genes Dnmt1, Dnmt3 e Dnmt3b.
Palavras-Chave: Estresse; Exercício Físico; Metilação do DNA; Epigenética; DNA
TOFFOLI, Leandro Vaz. Effects of stress and physical activity on the DNA methylation
mechanism of rat lung cells. 2016. 61 fls. Dissertação (Mestrado em Ciências da
Reabilitação) – Universidade Norte do Paraná, Londrina, 2016.
ABSTRACT
Recent data from the literature suggest the involvement of epigenetic mechanisms in adaptive cellular responses to stress. Similarly, consistent data show the potential of physical exercise in modulation the effects of behavioral stress. In this context, we aimed to evaluate in the study the effect of the stress on the global DNA methylation in rat lung cells and its relationship with the expression of Dnmt1, Dnmt3a and Dnmt3b genes. Furthermore, we evaluated the potential of physical activity (swimming) to modulate the molecular effects evoked by stress. Wistar rats were divided into four experimental groups containing 05 animals each: one group was submitted to the chronic stress protocol (ST) from the 67th
postnatal day (PND) to the 80 th PND. For the group of physical activity (EX) we considered rats that were submitted to swimming sessions in the period of 53th to 79th PND. Physical activity and stress group (EX-ST) consisted of animals submitted to swimming in the period of 53 th to 79 th PND and to the stress protocol from 67th to 80th PND. The control group (CTL) consisted of animals that were not submitted to interventions. On the last day of the protocol (80th PND), the animals were sacrificed by decapitation and samples from lung were obtained. For quantitative assessment of the global DNA methylation profile was quantified using the Imprint Methylated DNA Quantification kit (Sigma-Aldrich®). The expression of Dnmt1, Dnmt3a and Dnmt3b genes was evaluated by real-time PCR using the Taqman detection system and the Gapdh as endogenous control. A statistically significant decrease in the global DNA methylation profile was observed in the lung of animals from ST group when compared to the CTL group (p=0.0159). There was no statistically significant difference in the global DNA methylation profile when compared the animals from EX and CTL groups. A statistically significant increase in the global DNA methylation profile was observed when compared the EX and the EX-ST groups with the ST group (p=0.0018). In addition, a statistically significant increase in the expression of the Dnmt1 gene was observed when compared the ST group with CTL (p=0.0159). A statistically significant decrease in the expression on the Dnmt1 gene was observed in the EX-ST group when compared to the ST group (p=0.0042). Statistically significant decrease in the expression of the Dnmt3a and Dnmt3b genes was observed when compared EX and ST group (p=0.0018) and statistically significant decrease in the expression of the Dnmt3b gene was observed in the EX group when compared to CTL group (p=0.0357). In summary, our data show that stress induces a decrease in the global DNA methlyation profile accompanied by an increase in the expression of the gene Dnmt1. In addition, our evidence suggests that physical exercise practice can potentially attenuate the effects of stress on the global DNA methylation and modulate the effects induced by behavioral stress on the expression of Dnmt1, Dnmt3a e Dnmt3b genes.
Key words: Stress; Physical Activity; DNA methylation; Epigenetics; DNA methyltransferase
LISTA DE FIGURAS
Figura 1.A – Representação Ilustrativa dos Mecanismos Epigenéticos de Controle da
Expressão Gênica. ... 15
Figura 1 – Efeitos do Estresse e do Exercicio Fisico Sobre a Metilação Global do DNA em
Células do Pulmão de Ratos ... 28
Figura 2 – Efeitos do Estresse e do Exericio Fisico Sobre a Expressão do Gene Dnmt1 em
Células do Pulmão de Ratos ... 28
Figura 3 – Efeitos do Estresse e do Exericio Fisico Sobre a Expressão do Gene Dnmt3a em
Células do Pulmão de Ratos. ... 29
Figura 4 – Efeitos do Estresse e do Exericio Fisico Sobre a Expresão do Gene Dnmt3b em
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
BDNF Fator Neurotrófico Derivado do Cérebro (Brain Derived Neurotrophic Factor)
CTL Controle
DNA Ácido Desoxirribonucleico (Deoxyribonucleic Acid) DNMT DNA metiltransferase
DPN Dias pós-natal EX-ST Exercício-estresse EX Exercício Físico
Gapdh Gliceraldeído 3-fosfato Desidrogenase PAG Substância cinzenta periaquedutal
PCR Reação em Cadeia da Polimerase (Polymersase Chain Reaction) ST Estresse (Stress)
UEL Universidade Estadual de Londrina UNOPAR Universidade Norte do Paraná
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ... 11
2 REVISÃO DE LITERATURA – CONTEXTUALIZAÇÃO ... 14
3 OBJETIVOS ... 21
4 ARTIGO ... 22
5 CONCLUSÃO GERAL ... 39
6 REFERÊNCIAS ... 40
7 ANEXOS ... 46
ANEXO A – NORMAS DE FORMATAÇÃO DO PERIÓDICO BEHAVIOURAL BRAIN RESEARCH ... 47
1 INTRODUÇÃO
O estresse tem se tornado nos últimos anos um importante fator de desequilíbrio das
relações pessoais e de saúde da humanidade (ARALDI-FAVASSA et al 2005). O estresse
pode ser definido como "uma ameaça, real ou implícita, para a manutenção de uma gama
estreita de parâmetros homeostáticos vitais necessários para a sobrevivência” (MCEWEN,
2000).
O modelo de estresse aceito atualmente foi descrito por Hans Selye em 1965 o qual
definiu como uma ameaça real ou potencial a homeostasia do organismo (SELYE, 1965).
Selye dividiu o estresse em três fases: (a) alarme – consiste a primeira reação do organismo
frente a um estimulo estressor, (b) resistência – adaptação e aumento da resistência do
organismo ao estimulo e (c) exaustão – organismo mesmo adaptado não se mantém
indefinidamente, entrando em exaustão (SELYE, 1959).
Entretanto Lipp (2001) propõe o modelo quadrifásico do estresse, o qual identifica,
tanto clinica, como estatisticamente, a fase de “quase exaustão” o qual é definida pelo
momento o qual as doenças começam a surgir, porém, ainda não tão graves como as da “fase de exaustão” (LIPP, 2001). Teoricamente, nesta fase proposta por Lipp compreende a
vulnerabilidade genética e epigenética causada. pelo estresse
Sabe-se que o mecanismo adaptativo primário de resposta ao estímulo estressor
envolve a ativação de áreas cerebrais, às quais inclui o eixo hipotálamo-pituitária-adrenal
(HPA), culminando com a liberação de fatores e hormônios que desencadeiam a ativação do
córtex da glândula suprarrenal (GUYTON, 2006).
Dados recentes da literatura sugerem uma relação entre o estresse comportamental e
alterações significativas no mecanismo de metilação do DNA em células encefálicas de ratos,
com implicações pincipalmente ao hipocampo, córtex, hipotálamo e PAG (Periaqueductal
mecanismos epigenéticos na neurobiologia do estresse (TROLLOPE et al, 2012; HUNTER et
al, 2015).
Definem-se como epigenéticos os mecanismos capazes de controlar a atividade e a
expressão gênica das células, sem que a sequência do DNA seja modificada. Entre as
principais modificações epigenéticas conhecidas inclui a metilaçao do DNA e as modificações
pós-traducionais de histonas (JONES et al., 2001; JENUWEIN et al., 2001).
A metilação do DNA é certamente a modificação epigenética mais estudada nos
últimos anos. Basicamente, a inserção do radical metil (CH3) no carbono 5 de citosinas é
catalisada por um grupo de enzimas denominadas DNA metiltransferases (DNMT). As
principais atividades metiltranferases de estabelecimento e manutenção de padrões de
metilação do DNA genômicotêm sido atribuídas às enzimas DNMT1 e DNMT3
(principalmente DNMT3A e DNMT3B). Às enzimas DNMT3A e DNMT3B, expressas
principalmente durante o desenvolvimento embrionário, tem sido atribuída a atividade de
metilação de novo, ou seja, a inserção de CH3 em regiões do DNA não metiladas previamente
(OKANO et al., 1999), enquanto que à enzima DNMT1 tem sido considerado o papel crucial
da manutenção das marcas de metilação do DNA pós replicação celular (LI E et al., 1993).
O exercicio fisico é conceituado como qualquer atividade que se associa à um
movimento corporal produzido por músculos o qual resulta em maior dispêndio de energia,
desde que seja estruturada, repetitiva e aplicada de forma proposital (NEDER e NERY, 2004).
A atividade física tem sido evidenciada como intervenção profilática e terapêutica para
diversas disfunções, onde a sua prática regular parece estar associada com menor estresse
psicológico como demonstrado em estudos transversais, prospectivos e experimentais
(MATTHEW et al., 2014).
Oportunamente, estudos têm demonstrado a vulnerabilidade das marcas epigenéticas
exercicio fisico pode ter impacto na função celular e promover beneficios a saúde (DENHAM
et al, 2013; PAREJA-GALEANO et al, 2014). Neste contexto, os estudos atuais têm abordado
o impacto do exercicio fisico em células cerebrais, do sangue, músculo esquelético e cardiaco,
tecido adiposo e mucosa oral (PAREJA-GALEANO et al, 2014; ZHANG et al, 2013),
entretanto muito pouco se sabe sobre esses efeitos em outros tecidos.
A despeito das evidências dos efeitos do estresse e da prática de exercício físico sobre
a programação epigenética de células encefálicas, muito pouco se sabe a respeito da
vulnerabilidade dos mecanismos epigenéticos, como a metilação do DNA, de células não
encefálicas, como as células pulmonares.
Diante disso, objetivamos no presente estudo identificar o efeito do estresse sobre o
mecanismo de metilação do DNA de células do pulmão de ratos, além de identificar as
variações na expressão dos genes Dnmt1, Dnmt3a e Dnmt3b consequentes a esse efeito. Além
disso, objetivamos avaliar o potencial da prática de exercício físico em modular os efeitos
induzidos pelo estresse sobre a metilação do DNA, bem como sobre variações na expressão
dos genes Dnmt1, Dnmt3a e Dnmt3b em células do pulmão de ratos.
Acreditamos que a identificação de variações dos padrões de metilação do DNA em
células pulmonares possa gerar conhecimentos adicionais sobre o mecanismo molecular
associado aos efeitos somáticos do estresse comportamental. Além disso, considerando a
inacessibilidade da obtenção de amostras de pulmão de humanos higidos, consideramos que o
presente estudo, em modelo experimental, possa gerar dados adicionais sobre a influência do
estresse e do exercício físico sobre o mecanismo de metilação do DNA, dados esse
2 REVISÃO DE LITERATURA – CONTEXTUALIZAÇÃO
O estresse tem se tornado nos últimos anos um importante fator de desequilíbrio das
relações pessoais e de saúde da humanidade (ARALDI-FAVASSA et al., 2005).
Diante de uma sociedade moderna que exige grande capacidade de adaptação física,
mental e social, os indivíduos estão frequentemente expostos a situações de conflitos,
ansiedades, angústias e desestabilizações emocionais. Neste contexto, o estresse emerge como
uma consequência direta aos persistentes esforços adaptativos da pessoa à sua situação
existencial. O estresse pode ser definido como um desequilíbrio substancial entre a
capacidade de demanda (física ou psicológica) e a capacidade de resposta, que repercute em
consequências importantes tais como alterações cognitivas e comportamentais, além de gerar
uma predisposição a estados patológicos. (MCGRATH, 1970).
No Brasil, estima-se uma incidência populacional de estresse em torno de 32%,
estando à intensidade de sua manifestação associada à atividade profissional (LIPP;
TANGANELLI, 2002).
No que se diz respeito a fisiologia do estresse, sabe-se que entre as principais áreas
cerebrais ativadas no mecanismo adaptativo inclui o eixo hipotálamo-hipófise, sendo essa
área responsável pela liberação de fatores e hormônios que desencadeiam a ativação do córtex
da glândula supra-renal (GUYTON, 2006). Entretanto pouco se sabe a respeito da
vulnerabilidade das marcações epigenéticas em células não encefálicas, como do pulmão, ao
estresse.
Denominam-se epigenéticas as modificações que ocorrem na molécula de DNA ou nas
histonas (proteínas onde o DNA se enovela para constituir a cromatina) capazes de afetar a
expressão gênica sem que a sequência original do DNA seja alterada (JABLONKA, LAMB
Os mecanismos epigenéticos podem ser divididos em três tipos: 1) modificações
covalentes na cauda N terminal de histonas, 2) metilação do carbono 5 de citosinas,
geralmente seguidas por guaninas (dinucleotideos CpGs) na molécula de DNA e 3) RNAs não
codificantes (Fig. 1.A) (PORTELA, ESTELLER 2010, KOUZARIDES et al., 2007,
HAGOOD et al., 2014).
Figura 1A – Representação ilustrativa dos Mecanismos Epigenéticos de Controle da Expressão Gênica
(HAGOOD et al., 2014)
A metilação do DNA é certamente a modificação epigenética mais estudada nas
metilação do DNA desenvolve um importante papel no controle de vários processos
biológicos, tais quais, diferenciação celular embrionária, inativação do cromossomo X em
fêmeas de mamíferos, imprinting genômico, supressão de retrovírus endógenos e estabilidade
cromossômica (REIK, WALTER 2001; LI et al 1992; BESTOR 1998; PANNING,
JAENISCH 1998; THOMPSON et al 2010).
A inserção deste radical no carbono 5 de citosinas é catalisada por enzimas
denominadas DNA metiltransferases (DNMT1, DNMT2, DNMT3A, DNMT3B e DNMT3L).
As DNMT3A e DNMT3B são, predominantemente, expressas durante o desenvolvimento
embrionário e catalisam a chamada metilação de novo. Similarmente, a DNMT3L
(DNMT3-Like) compartilham homologia com as DNMT3s, desempenhando um papel essencial sobre a metilação tecido-especifico. (OKANO et al., 1999). Já a DNMT1 tem papel crucial na
metilação hereditária, pois age reconhecendo os sítios CpG hemi-metilados estabelecidos,
anteriormente, pela DNMT3A e DNMT3B, o qual converte para um estado totalmente
metilado. Assim, a DNMT1 é responsável pela metilação de manutenção célula-célula (LI E
et al., 1993). Finalmente, a DNMT2 parece ter pouca atividade de DNA metiltransferase,
sendo descrita como tendo um papel chave na metilação e estabilizações de tRNA, aumentado
a síntese proteica (TUORTO et al, 2012).
A vulnerabilidade dos padrões epigenéticos frente a exposições ambientais é um tema,
atualmente, muito estudado em virtude de inúmeras implicações à saúde (GOMES; PELOSI,
2013). Durante os últimos anos, vários grupos de pesquisadores têm relatado os efeitos do
estresse, tanto agudo como crônico, no epigenoma (CHAKRAVARTY et al, 2014;
KENWORTHY et al, 2014; SCHOUTEN et al, 2013).
Estudo realizado por Unternaehrer et al (2012) demonstrou a presença de alterações
loci especificas de metilação do DNA em células do sangue periférico humano associadas ao estresse, No entanto, análises envolvendo outros tecidos não foram realizadas neste estudo em
virtude da inacessibilidade para a obtenção de material em indivíduos hígidos
(UNTERNAEHRER et al, 2012).
Roth et al (2011) demonstraram, em modelo experimental, a associação entre o
estresse psicossocial e o aumento dos níveis de metilação do gene BDNF (Brain Derived
Neurotrophic Factor) acompanhado de diminuição da expressão desse gene no hipocampo dorsal de ratos adultos (ROTH et al, 2011)
Dados recentes do nosso grupo de pesquisa revelaram a participação do mecanismo de
metilação do DNA nas respostas celulares adaptativas de células cerebrais de ratos como o
hipocampo, córtex, hipotálamo e PAG (Periaqueductal gray) mediante estresse
comportamental (RODRIGUES et al, 2015; KASHIMOTO et al., 2015).
Muito pouco se sabe ainda a respeito dos efeitos do estresse comportamental em
células não encefálicas, como do pulmão. No entanto, com base na característica
vulnerabilidade da manutenção (transmissão célula-célula) do padrão epigenético frente a
variações ambientais, acredita-se que alterações dos padrões de metilação do DNA possam ser
induzidas por fatores externos e, consequentemente estarem associadas à origem de várias
doenças humanas, como o câncer (FRAGA, 2009).
O câncer é certamente a doença em que a associação com alterações epigenéticas está
mais bem caracterizada (PORTELA; ESTELLER 2010). De uma forma geral, o padrão de
metilação de células tumorais está consideravelmente alterado em relação às células normais
(PORTELA; ESTELLER 2010). Entre as principais alterações relacionadas ao câncer incluem
a perda de metilação global do DNA e hipermetilação de regiões promotoras (ilhas CpGs) de
genes supressores tumorais. Particularmente, enquanto as células tumorais são caracterizadas
por uma perda significativa da metilação do DNA (20 a 60% menos 5-metil-citosinas) é
observado um aumento de metilação em ilhas CpGs específicas (SHEN et al., 2007;
Estudos epidemiológicos prévios indicaram uma relação significativa entre o estresse
crônico e a origem, progressão e mortalidade de câncer (LILIBERG et al., 2003; BUCCHERI
et al., 1998; STOMMEL et al., 2002; CHIDA et al., 2008).
Dados obtidos por metanálise envolvendo 165 estudos longitudinais correlacionaram a
influência de fatores psicossociais com a incidência e diminuição na sobrevida de pacientes
com câncer (CHIDA et al., 2008). Além disso, a análise destes dados pemite a observação de
que o câncer de pulmão é o tipo de câncer no qual a associação com o estresse está
estabelecida de forma mais significativa (CHIDA et al., 2008), o que torna este o modelo
determinado para as análises subsequentes. Por se tratar de um estudo longitudinal, há que se
ponderar que os resultados obtidos por Chida et al (2008) se limitam à observação dos
elementos amostrais sem manipular fatores que possam alterar as variáveis de interesse, como
os hábitos alimentares, estilo de vida, consumo de álcool e tabagismo, fatores hereditários e
histórico de doenças pulmonares em casos de câncer pulmonar (CHIDA et al., 2008).
Além disso, estudos envolvendo modelos experimentais validados demonstraram que
o estresse crônico pode aumentar in vivo a capacidade de crescimento tumoral e de metástase
em modelos xenotransplantados de tumores (FENG et al 2012; HASSAN et al 2013).
A atividade física é definida como um movimento corporal produzido pelos músculos
esqueléticos que requer gasto de energia acima dos níveis de repouso (BAMMAN et al.,
2014; COLPANI et al., 2013), enquanto o exercício físico é conceituado como qualquer
atividade que se associa à um movimento corporal produzido por músculos que resulta em
maior dispêndio de energia que ocorra de forma estruturada, repetitiva e aplicada de forma
proposital (NEDER e NERY, 2004).
De acordo com a Organização Mundial da Saúde estima-se que a inatividade física
cânceres de mama, 10% dos canceres do cólon e 6% das doenças cardíacas coronarianas
(OMS, 2010).
Estudos prévios têm buscado a elucidação da relação entre a prática de exercício físico
a promoção da saúde via mecanismos epigenéticos (PAREJA-GALEANO et al., 2014).
Entretanto tal relação é pouco compreendida emergindo dessa forma a necessidade de estudos
tecidos específicos.
Zeng et al (2012) observaram, a partir de um ensaio clinico envolvendo pacientes com
câncer de mama e análise genômica em larga escala (microrray) a associação entre a prática
de atividade física aeróbica moderada por um período de seis meses e mudanças nos perfis de
metilação do DNA de 43 genes. Destes, alterações significativas na expressão de três genes
foram correlacionadas positivamente com a sobrevida dos pacientes, entre eles o gene
L3MBTL1, um gene de conhecida função de supressão tumoral (ZENG et al., 2012).
Similarmente, outro estudo realizado por Bryan et al (2012) demonstrou que o aumento da
atividade física durante 12 meses diminuiu a metilação do DNA em 45 ilhas CpGs de genes
relacionados com o inicio e progressão do mesmo tipo de câncer (BRYAN et al., 2012).
Em idosos, Luttrop et al (2012) demonstraram que a prática de atividade física está
relacionada com um aumento dos níveis de metilação global do DNA, e que esses níveis
permanecem significativos após a correção com fatores de risco cardiovasculares (LUTTROP
et al., 2012).
Similarmente, Roon et al (2013) demonstraram um aumento nos níveis de metilação
global do DNA, bem como alterações em 17.975 ilhas CpGs em 7663 genes em tecido
adiposo de homens adultos saudáveis sugerindo o potencial da intervenção de seis meses de
exercício físico na indução de alterações no mecanismo de metilação do DNA em células
Em virtude da quantidade ainda limitada de informações na literatura, emerge a
necessidade de estudos em modelos experimentais focados na compreensão, ao nível
molecular, do quanto e como o estresse pode influenciar as atividades biológicas normais de
controle da expressão gênica celular. Especulamos que alterações epigenéticas importantes
podem ocorrer em consequência à exposição ambiental, indicando dessa forma uma possível
3 OBJETIVOS
3.1 Objetivo Geral
Diante do expoto acima, o presente trabalho tem como objetivo geral identificar o
efeito do estresse crônico sobre a metilação do DNA e expressão gênica de células do pulmão
de ratos.
3.2 Objetivo Específico
1) Identificar o efeito do estresse crônico sobre o perfil de metilação global do DNA
em células do pulmão de ratos
2) Identificar o efeito do estresse crônico sobre a expressão dos genes Dnmt1, Dnmt3a
e Dnmt3b em células do pulmão de ratos.
3) Avaliar os efeitos da prática de exercício (natação) sobre a metilação global do
DNA e a expressão dos genes Dnmt1, Dnmt3a e Dnmt3b em células do pulmão de ratos.
4) Verificar o possível potencial do exercicio físico em modular os efeitos moleculares
induzidos pelo estresse sobre a metilação do DNA e a expressão dos genes Dnmt1, Dnmt3a e
4 ARTIGO
EFFECTS OF THE BEHAVIORAL STRESS AND THE PRACTICE OF PHYSICAL EXERCISE ON THE MECHANISM OF DNA METHYLATION IN RAT LUNG
CELLS
Toffoli LV1, Volpini VL2, Silva WR1, Magnoni LN1, Pelosi GG2, Gomes MV1.
1 Centro de Pesquisa em Ciências da Saúde, Universidade Norte do Paraná (Unopar),
Londrina, Paraná, Brasil,
2 Centro de Ciências Biológicas, Departamento de Ciências Fisiológicas, Universidade
Estadual de Londrina (UEL), Paraná, Brasil
Telefone: +55 43 3371 9859
Email: lvtoffoli.biomed@gmail.com; mvmgomes@gmail.com
ABSTRACT
Increasing recent evidences has proposed the participation of epigenetics mechanisms in the molecular adaptive cellular responses to stress and physical exercise practicing. In the present study we assessed the effects of the chronic stress and physical exercise (swimming) on the global DNA methylation profile of rat lung cells and addressed the respective relationships with the expression of the DNA methyltransferases (Dnmt) genes Dnmt1, Dnmt3a and Dnmt3b. Furthermore, we evaluated the potential of physical activity to modulate the molecular effects induced by the behavioral stress. Male Wistar rats were divided into four experimental groups: (1) animals that were submitted to the chronic stress protocol (ST) during the period that comprehends the 67th and 80th postnatal day (PND); (2) animals that were submitted to physical exercise (swimming sessions) (EX) in the period of 53th -79th
PND; (3) animals that were submitted to swimming in the period of 53th -79th PND and to
stress during the 67-80 PND (EX-ST); and (4) animals that were not submitted to stress or swimming (CTL). The animals were sacrificed at the end of stress protocol at the 80th PND
and the lung removed. The global DNA methylation profile was quantified using the Imprint Methylated DNA Quantification kit (Sigma-Aldrich®) and the expression of genes was obtained by real time PCR. A statistically significant decrease in the global DNA methylation profile was observed when compared the lung of animals from ST and CTL groups (p=0.0159) which was accompanied by a statistically significant increase in the expression of the Dnmt1 gene in the ST group (p=0.0159). A statistically significant decrease in the expression of the Dnmt3b gene was observed in the EX group in comparison to CTL group (p=0.0357). Furthermore, a statistically significant decrease in the expression of the Dnmt3a and Dnmt3b genes was observed in the EX group when compared with the ST group (p=0.0018). Based on these findings we concluded that chronic stress evokes a global DNA hypomethylation and an increase in expression Dnmt1 in lung cells. Furthermore, our data indicated that physical exercise might potentially attenuate the effects of behavioral stress on the global DNA methylation profile and modulate the impact of stress on the expression of Dnmt1, Dnmt3a e Dnmt3b genes.
INTRODUCTION
Stress has become, in the last years, an important imbalance factor of personal and health relationships of humanity [1,2]. Consistent data associate behavioral stress with modulation epigenetic mechanisms, such as DNA methylation, in brain cells of the hippocampus, cortex, hypothalamus and PAG (Periaquectual gray) [3,4] thus suggesting implications of epigenetic mechanisms in the adaptive cellular responses to stress [5-7].
DNA methylation is certainly the most studied epigenetic modification in the latest decades. Dynamic and potentially modifiable throughout the development, the methylation process consists in the introduction of a methyl radical on the carbon 5 of cytosine, usually followed by guanines (dinucleotide CpG) in DNA molecule, by the action of enzymes called DNA methyltransferase (DNMT1, DNMT3a and Dnmt3b) [8-10].
Cancer is certainly the disease in which the association with epigenetic changes is most well characterized. Among these changes related to cancer include loss of global methylation and hypermethylation of promoter regions (CpG islands) [10].
It is currently accepted that the regular practice of physical exercise adaptively benefits several body systems, including the cardiopulmonary system, which can be evidenced in lung capacity by the increase of alveolar openings, significant increase in the partial pressure of oxygen in arterial blood and the reduction in the partial pressure of carbon dioxide (CO2) [11].
Previous studies have sought to elucidate the vulnerability of epigenetic mechanisms to physical exercise [12]. For example, in healthy adult males initially with physical inactivity, Roon et al (2013) demonstrated that a six months program of physical exercise results in adipose tissue in significant changes in global methylation and loci-specific levels [13]. However this relationship (physical exercise versus epigenetic mechanisms) is poorly understood in several other tissues such as lung.
Despite the enormous progress obtained on the field of neurobiology of stress and the benefits of the practice of physical exercise in the promotion of health, little is still known about the molecular molecular mechanisms associated to the behavioral stress and the practice of the physical exercise in non-brain cells [3,4].
In this context, the present study aimed to identify the effects of chronic stress and the practice of physical exercise on the global DNA methylation profile in rat lung cells, as well as the correlation with the expression of Dnmt1, Dnmt3a and Dnmt3b genes. Furthermore, the present study aimed to evaluate the potential of the practice of physical
exercise in modulating the effects of the behavioral stress effects on the global DNA methylation profile and the expression of Dnmt1, Dnmt3a and Dnmt3b genes in rat lung cells.
MATERIALS AND METHODS
Animals and experimental groups:
Experimental procedures were carried out following protocols approved by the ethical review committee of the University of Lon-drina, Londrina, Parana, Brazil (CEUA no. 14441.2013.18) and all efforts were made to minimize suffering.
Non-related male Wistar rats were kept under standard condi-tions (temperature 25 ± 1◦C, photoperiod 12 h light/12 h dark) andwith water and food ad libitum in the Central Animal House of theUniversity of Londrina.
The animals were distributed into four groups containing 5 animals each: 1) stress group (ST): animals submitted to the restriction stress protocol from the 67 postnatal day (PND) to 80 PND; 2) physical exercise group (EX): animals submitted to physical exercise (swimming for 60 minutes / day) from 53 PND to 79 PND; 3) physical exercise and stress group (EX-ST): animals submitted to physical exercise (swimming for 60 minutes / day) 53 PND to 79 PND and also to chronic stress by restriction of 67 PND to 80 PND, respectively; and 4) control group (CTL): animals that were maintained in the same conditions as other animals but were not submitted to stress or exercise protocols.
The animals from groups one and three (EX e EX-ST) were assisted in all swimming sessions, to avoid the passive rat floating and minimize bias related to different exercise intensities of each animal. All the experiment protocol was performed in the morning between 07:00 and 12:00.
Chronic stress by restriction of movement:
For the analyzes of the effects of behavioral stress on epigenetic patterns was used the validated test of chronic stress by restriction as previously described [14].
In the morning (7:00 to 09:00) the animals were transported to the experimental room in their cages and allowed to adapt to this environment for at least 30 minutes. After this period, the animals were submitted to the stress protocol, being placed in a metal cylinder with 6.5 cm in diameter and 15 cm long with holes, that allow ventilation, which remained closed for 60 min.
Physical exercise:
The animals from EX and EX-ST group were submitted to physical training (swimming), according to Martins-Pinge et al. Swim sessions were realized in the morning (8:00 to 12:00) in a glass tank filled with warm water (31 ± 1 ° C) of 4000 cm2 surface area and 60 cm in depth. The training consisted of 4 weeks (20 sessions) of swimming being held 5 days a week and 60 min/day.
During the first week, the training was graded, begin-ning with 15 min on the first day, 30 min on the second day, and45 min on the third day, for adaptation to the training process. Fromthe fourth day on, each session consisted of 60 min of swimminguntil the 74th PND. After each swimming session, the animals weredried with a towel and returned to their cages.
Samples:
Samples were collected in the morning (between 08:00 and 12:00) in order to maintain the same circadian rhythm for all groups. The animals were killed by decapitation and the right lower lobe of the lung was removed. All samples were washed immediately in saline solution after obtaining and frozen at -80 ° C for further molecular analysis.
Global DNA Methylation Profile:
Genomic DNA was obtained by phenol chloroform after soaking the tissue in a grail and pistillate in the presence of liquid nitrogen [16]. Evaluation of the purity and concentration of DNA was performed by analysis of absorbance in a spectrophotometer (NanoDrop ND-2000 - Thermo Scientific) at 260nm and 280nm.
The global DNA methylation profile was evaluated by dosage of methyl groups (CH3) by Imprint® Methylated DNA Quantification Kit Kit (Sigma-Aldrich®) using
the concentration of 200ng / ul DNA according to the manufacturer's recommendations and as described previously [17]. Briefly, the percentage of each sample methylation was calculated by the amount of cytosines methylated in the sample (5mC) relative to overall cytidine (5mC + AD) in a positive control previously methylated (100% methylated) and a negative control (0 % methylated). The absorbance readings were performed at 450 nm in a microplate reader and the percentage of DNA methylation was obtained following the formula: A450sample-A450NTC / (A450met-A450sample-A450NTC) x100. All samples were analyzed in duplicate.
Gene Expression Levels:
RNA samples were obtained using Trizol (Invitrogen®) and the reverse transcription was performed using the High Capacity Kit (Applied Biosystems®).
The gene expression levels were quantitatively assessed by RT-PCR, Step One Plus (Applied Biosystems) and used the detection system specifies Company Taqman Applied Biosystems with the probes (on demand) to the Dnmt1 gene (ID: Rn00709664_M1) Dnmt3a (ID: Rn01027162_G1) and Dnmt3b (ID: Rn01536418_G1). For the normalization of the difference in the amount of cDNA used in each experiment we used GAPDH (ID: Rn01775763_G1) as endogenous control. It used the comparative CT method (2-ΔΔCt) for assessment of gene expression levels. The experiments were performed in triplicate.
Statistical Analysis:
Graph Prism 6.0 software for statistical analysis was used. The data were submitted to a descriptive analysis, and the normality and homogeneity of variance of the data evaluated by the Shapiro-Wilk test. To analyze the effects of stress and physical exercise on DNA methylation and expression of Dnmt1 genes, Dnmt3a and Dnmt3b the values observed in the groups ST and EX were analyzed by non-parametric Mann-Whitney in the values presented CTL group.
For evaluating the potential exercise-physical to modulate cellular responses triggered by stress profile of global DNA methylation and the values for the relative expression of DNMT1 genes, Dnmt3a and Dnmt3b of ST groups, EX and EX-ST were analyzed from the Kruskal-Wallis statistical test (post-test: Dunn). Confidence interval of 95% and a significance level of 5% (p <0.05) in all the tests used was adopted.
RESULTS
Effects of stress on global DNA methylation:
A statistically significant decrease was observed in the global DNA methylation in lung cells (p = 0.0159) of animals ST group when compared with animals CTL group.
There was no statistically significant difference in the percentage of global DNA methylation when compared the EX and CTL groups (p = 0.3095).
methylation was observed when comparing the EX and EX-ST groups with the ST group (p = 0.018). (Fig. 1).
Figure 1 – The effects of stress and physical exercise on the global DNA methylation in rats lung cells. A) CTL
group versus ST; B) CTL group versus EX; C) ST group versus EX-ST versus EX. CTL: control group; ST: stress group; EX: physical exercise group and EX-ST: physical exercice and stress group. *p<0.05. Mann-Whitney and Kruskal-Wallis test. The error bar represents the standard error of average.
Effects of stress on expression of Dnmt1 gene:
A statistically significant increase was observed in the expression of the Dnmt1 gene in ST group when compared to CTL group (p = 0.0159).
There was no statistically significant difference when compared the EX group with CTL group (p = 0.3095).
A statistically significant decreae in Dnmt1 gene expression was observed when comparing the values of the EX-ST and ST groups (p = 0.0042). There was no statistically significant difference when compared the ST and EX values (Fig. 2).
Figure 2 – Effects of stress and physical exercise on the expression of Dnmt1 gene in rat lung cells. A) CTL group versus ST; B) CTL group versus EX; C)ST group versus EX-ST versus EX. CTL: control group; ST: stress group; EX: physical exercise group and EX-ST: physical exercice and stress group; RQ: relative quantification according to expression of the Gapdh gene..*p<0.05. Mann-Whitney e Kruskal-Wallis test. The error bar represents the standard error of average.
Effects of stress on expression of Dnmt3a gene:
No statistically significant difference in the expression of the Dnmt3a gene was observed when compared ST and CTL groups (p = 0.6667), as well as when compared the EX and CTL groups (p = 0.0556).
Statistically significant decrease in expression of the Dnmt3a gene was observed between the EX and ST groups (p = 0.0018). (Fig. 3)
Figure 3 – Effects of stress and physical exercise on the expression of Dnmt3a gene in rat lung cells. A) CTL
group versus ST; B) CTL group versus EX; C) ST group versus EX-ST versus EX. CTL: control group; ST: stress group; EX: physical exercise group and EX-ST: physical exercice and stress group; RQ: relative quantification according to expression of the Gapdh gene. *p<0.05. Mann-Whitney e Kruskal-Wallis test. The error bar represents the standard error of average.
Effects of stress on expression of Dnmt3b gene:
No statistically significant difference in the expression of the Dnmt3b gene was observed when compared ST and CTL groups (p = 0.8016). However, a statistically significant decrease was observed when compared the Dnmt3b gene expression values in EX and CTL groups (p = 0.0357). In addition, statistically significant decrease in expression of Dnmt3b gene was also observed when compared the EX and ST groups (p = 0.0018). (Fig. 4)
Figure 4 – Effects of stress and physical exercise on the expression of Dnmt3b gene in rat lung cells. A) CTL
group versus ST; B) CTL group versus EX; C) ST group versus EX-ST versus EX. CTL: control group; ST: stress group; EX: physical exercise group and EX-ST: physical exercice and stress group; QR: RQ: relative quantification according to expression of the Gapdh gene. *p<0.05. Mann-Whitney e Kruskal-Wallis test. The error bar represents the standard error of average.
DISCUSSION
In the present study we evidenced the association between chronic stress and the decrease in the global DNA methylation levels in rat lung cells. Furthermore, our evidences shown that although the physical exercise by itself does not alter the global DNA methylation in lung cells it can potentially modulate the effects caused by stress.
An increasing number of studies have aimed to demonstrate the role of epigenetic mechanisms, in particular DNA methylation in the physiological and pathological function of lung cells, such as in chronic obstructive pulmonary disease (COPD) and pulmonary function [18], pulmonary vascular dysfunction [19], lung cancer [20] and infection by Mycobacterium tuberculosis [21].
The present study evidenced, as far as we known at the first time in the literature, an association between behavioral stress and epigenetic effects in lung cells and also indicated the potential of physical exercise in modulating these effects.
Recent data from our group demonstrated that the decrease of global DNA methylation is normally associated with the adaptive responses of brain cells that are evoked by behavioral stress and physical exercise [3, 4].
Results obtained by Rodrigues et al (2015) demonstrated that behavioral stress induces global DNA hypomethylation in the hippocampus, cortex and PAG and suggest that this epigenetic change might be associated with decreased expression of Dnmt1 gene in cortex and PAG, and with increased of the Bdnf expression in the PAG. Furthermore, data obtained in this study revealed the potential of physical activity to modulate the changes in
global DNA methylation that are evoked by stress in the hippocampus, cortex and PAG as well as modulate the effects on the expression of Dnmt1 and Bdnf gene in the brain rats [3].
Similarly, in another study from our research group, Kashimoto et al (2015) identified significant changes in global DNA methylation in brain cells, mainly in the hypothalamus, associated with physical exercise practice. In addition the data obtained by Kashimoto et al (2015) demonstrated the potential of physical exercise to modulate the adaptative responses to repeated stress in regards to DNA methylation in the hippocampus, cortex, hypothalamus and PAG and in the expression of Dnmt1 gene in the hippocampus and hypothalamus [4].
Contextualizing with the previously results obtained in brain cells [3, 4] the data from the present study corroborate the vulnerability of epigenetic markings to stress and to physical exercise and show that stress might also induce a global DNA hypomethylation in lung cells.
Changes in DNA methylation profiles have been associated with the etiology of various diseases, including cancer [22]. Global DNA hypomethylation accompanied loci-specific hypermethylation are normally epigenetic characteristics described in various tumor types, indicating that the DNA methylation mechanism participates significantly in the tumor development process [23, 24].
Concurrently, recent data demonstrate the potential of considering the global hypomethylation in peripheral blood leukocytes as a biomarker for the risk of various cancers such as kidney cancer, breast cancer and bladder cancer [25-28].
Epidemiological studies have suggested a relation between chronic stress and the origin, progression and mortality of cancer [29-32], and lung cancer being the type of cancer in which the association with stress is established more significantly [32].
In this way, considering the results of this study that link stress to global DNA hypomethylation in lung cells to the literature data that correlate epigenetic change to the molecular mechanism of tumor development, we hypothesized that somehow the change of DNA methylation can justify a possible relationship between stress and lung cancer, as previously reported in epidemiological studies [32]. However, further studies in this area are certainly needed to confirm this hypothesis.
DNA methylation, which consists in introducing methyl group to the cytosine (CpG dimers) is usually catalyzed by DNA methyltransferase enzymes, DNMT1, DNTMT3A and DNMT3B. It is believed that DNMT1 is involved in the maintenance of DNA methylation after cell division, acting on the recognition of CpG hemi-methylated sites
and converting the newly synthesized fragments to a fully methylated state [9], while DNMT3S are predominantly expressed during embryonic development and therefore catalyze the called de novo methylation with involvement in DNA methylation establishment in regions without previous markings [8].
With regard to the effects of stress and physical exercise on the expression of DNA methyltransferase genes (Dnmt1, Dnmt3a and Dnmt3b) in rat lung cells our data show that: 1) the stress induces increased expression of the Dnmt1 gene (p = 0.0159), which is abolished when combined with physical exercise to stress; 2) physical exercise induces antagonistic effect on the expression of the gene Dnmt3a compared to the effect caused by stress and; 3) the physical activity by itself, induces a decrease in expression of the gene Dnmt3b, which is antagonistic to the stress-induced effect on the expression of this gene.
Dados prévios da literatura associaram o aumento na expressão do gene Dnmt1 à hipermetilação loci-especifica de genes supressores tumorais, indicando dessa forma uma contribuição no processo tumoral [30, 31].
Previous data from literature associated the increased in the expression of the Dnmt1 gene to the hypermethylation loci-specific tumor suppressor genes, thus indicating a possible contribution in the tumoral process [33, 34]. However, it should be highlight that in this study, although stress has been associated with an increased expression of Dnmt1 gene was also demonstrated a direct relationship between the stress and the reduction in profile overall DNA methylation in lung cells. Further studies are necessary to evaluate the effect of stress on the methylation-specific loci in order to clarify its relationship with tumorigenesis.
We hypothesized that the apparently active demethylation induced by stress in the lung cells must involve a process of demethylation independent of Dnmt1. Thus, we suggest that the removal of the methyl group of lung cells might occur similarly to the active demethylation recently identified in brain cells, which is dependent on the enzyme activity Ten-Eleven-Translocations family (TET) [35-37]. Future studies are needed in this area to confirm our hypothesis.
With regard to physical exercise, a growing number of studies have reported association with the vulnerability of epigenetic marks not brain somatic cells such as leukocytes, skeletal muscle and heart and adipose tissue and suggested this as a molecular pathway by which the exercise physical impact on cell function and health promotion [11, 38, 39]. However, the data from literature is still limited about the impact of physical exercise on lung tissue [11].
Using the large scale genomic analysis, Kanzleiter et al (2015) recently demonstrated that 2.762 CpG island became differently methylated in skeletal muscle of rats practitioners of physical exercise when compared with animals not practitioners. Moreover, these authors associated a negative correlation with the expressions of approximately 200 genes [40]. In the same segment, another recent study reviewed the role of DNA methylation in myogenesis, addressing physiological and pathological conditions [41].
Although physical exercise practice is known to be beneficial to the cardiopulmonary system, somewhat enlightening are still evidence of the molecular mechanisms associated with such benefits. Addressing recent research related the role of physical activity in the prevention of pathophysiological changes in cells and cardiovascular tissues, Zimmer et al (2015) suggested the involvement of epigenetic mechanisms in the biological pathways that culminate with the benefits induced by exercise practice [42].
In relation to the expression of DNMTs genes, our results demonstrated no statistically significant difference in global DNA methylation and gene expression of Dnmt1 and Dnmt3a compared animals who practiced physical exercise and the control group (p> 0.05). However, our data show a significant decrease in expression of the gene Dnmt3b (p = 0.0357) compared physical exercise and control groups.
Still considering the evidence of this study, we note that in practicing animal physical exercise effects induced by stress on the expression of Dnmt1 genes, Dnmt3a and Dnmt3b are somewhat modified. This modulating effect can be plain observed when comparing animals subjected to stress (ST) and animals subjected to stress and exercise (EX-ST). In such cases we may infer the existence of an important biological effect of modulating the effects of stress caused by physical exercise, although statistically significant difference was observed only with respect to the expression of the gene Dnmt1.
In summary, our data show the vulnerability of methylation cell lung DNA to behavioral stress and suggest the existence of an active demethylation mechanism of the lung induced by stress, which is independent of the expression of Dnmt3a and Dnmt3b genes, although a Dnmt1 increase in gene expression is observed. In addition, our evidence shows the potential of physical exercise in attenuate the effects induced by stress in the lung cells with implications thus in global DNA methylation as the expression of Dnmt1 genes, Dnmt3a and Dnmt3b.
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5 CONCLUSÃO GERAL
Com base em nossos dados podemos concluir que:
1) O estresse comportamental crônico induz hipometilação global do DNA
no pulmão de ratos além de induzir um aumento na expressão do gene Dnmt1, embora não
afete de forma significativa a expressão dos genes Dnmt3a e Dnmt3b;
2) A prática de exercício física não modifica o perfil de metilação global do DNA, assim como não afeta a expressão dos genes Dnmt1 e Dnmt3a no pulmão de ratos,
embora induza uma diminuição na expressão do gene Dnmt3b;
3) A prática de exercício física modula os efeitos do estresse crônico sobre
a metilação global do DNA, assim como sobre a expressão dos genes Dnmt1, Dnmt3a e
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