• Nenhum resultado encontrado

Thí nghiệm phân tích thực phẩm - Trần Bích Lam

N/A
N/A
Protected

Academic year: 2021

Share "Thí nghiệm phân tích thực phẩm - Trần Bích Lam"

Copied!
111
0
0

Texto

(1)

TRẦN BÍCH LAM

THƯ VIỆN

ĐẠI HỌC NHA TRANG

Đ

664.07

Tr 121 L

THƯ VIỆN ĐH NHA TRANG

ỉilìill

1000021612

NHÀ XUẤT BẢN

(2)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA T P H ồ CHÍ MINH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

T rầ n Bích Lam

THÍ NGHIỆM

PHÂN TÍCH THựC PHẨM

TRƯffll6ftậl HQCttHÃTM T H Ơ V É N I

1 00 2 16 1 2

NHÀ XUẤT BẢN

ĐẠI

liọ c

Q ư ổ c

GIA

(3)

MỤC LỤC

P H Ầ N I CÁC PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ 7

Chương 1 ỨNG DỤNG QƯANG PHỔ UV-VIS TRONG

PHÂN TÍCH THỰC PHẨM 9

1.1 Cơ sở lý thuyết 9

1.2 Thiết bị 10

Bài 1 Định lượng đường khử bằng phương pháp quang phổ so màu 13

I- Nguyên tắc 13 II- Hóa chất 13 III- Dụng cụ 14 IV- Tiến hành 14 V' Xử lý kết quả ; 15 C hương 2 ÚNG DỤNG QUANG PHỔ NGUYÊN TỬ TRONG PHÂN TÍCH THựC PHẨM 17

Bài 2 Xác định hàm lượng khoáng chất trong thực phẩm, phương pháp

quang phổ hấp thu nguyên tử. 18

I- Nguyên tắc 18 II- Hóa chất dụng cụ 18 III- Tiến hành 18 IV- Xử lý kết quả 20 P H Ầ N I I CÁC PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ 21 C hương 3 SÁC KÝ GIẨY 23

Bài 3 Xác định thành phần acid không bay hcri bằng phương pháp sắc ký giấy 23

I- Hóa chất 24

II- Dụng cụ thiết bị 24

III- Tiến hành 24

Bài 4 Định tính chất màu hữu cơ tổng hợp tan trong nước bằng

phương pháp sắc ký giấy 27

I- Nguyên tắc 27

II- Dụng cụ 27

III- Hóa chất 27

IV- Chuẩn bị mẫu 28

V- Chiết phẩm màu 30

(4)

C hương 4 PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ BẢN MỎNG (TH IN LAYER CHROMATOGRAPHY, TLC) 32 Bài 5 Phân tích lipid bằng phương phốp sắc ký bản mỏng 32 I- Dụng cụ 32 II- Hóa chết 32 III- Tiến hành 32 Bài 6 Định tính saccharine bằng phương pháp sắc ký bản mỏng 35 I- Nguyên tắc 35 II- Dụng cụ 35 III- Hóa chất 35 IV- Tiến hằnh 36 Bài 7 Phân tích aflatoxin bằng phương pháp sắc ký bản mỏng 38 I- Nguyên tắc 38 II- Dụng cụ hóa chất 39 III- Tiến hành 40 IV- Tính kết quả 44 C hương 5 PHÂN TÍCH THựC PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆƯ NÀNG CAO 45

Bài 8 Phân tích vitamin tan trong nước bằng phương pháp sắc ký lỏng

hiệu nồng cao 47

I- Vận hành bơm 47

II- Detector SPD - 6AV 50

III- Chromatopac CR 6A 51

IV- Tiến hành phân tích 53

V- Các biểu hiện xấu và cách khắc phục 59

VI- Bảo dưỡng cột 59

Bài 9 Phân tích acid amin bằng phương pháp HPLC 60

I- Chọn các điều kiện vận hành 62

II- Phân tích thành phần aciđ amin bằng kỹ thuật tạo dẫn xuất PITC 63

C hương 6 SẮC KÝ KHÍ 68

Bài 10 Phân tích thành phần acid béo bằng phương pháp sắc ký khí

(Gas chromatography) 69

I- Dụng cụ, thiết bị 69

II- Hóa chất 69

III- Phương pháp chuẩn bị methyl ester 69

(5)

P h ụ lụ c 1 CỘT SẮC KÝ DÙNG TRONG HPLC 79

I- Phân loại cột 79

II- Hướng dẫn chọn các điều kiện vận hành 83

P h ụ lụ c 2 THƯỜNG QUY KIỂM TRA NHANH CHẤT LƯỢNG VỆ SINH

AN TOÀN THựC PHẨM 89

I- Phương pháp phát hiện nhanh phẩm màu độc và không độc 89

II- Phương pháp phát hiện nhanh chì 91

III- Phương pháp phát hiện nhanh asen 92

IV- Phương pháp phát hiện nhanh nitrit 96

V- Phương pháp phát hiện nhanh axit vô eơ 97

VI- Phương pháp phát hiện nhanh nitrat 98

VII- Phương pháp phát hiện nhanh formaldehyde iformol) 99 VIII- Phương pháp phát hiện nhanh đường hóa học trong thực phẩm lỏng

có đường 101

IX- Phương pháp phát hiện nhanh hàn the (na borat) 103 X- Phương pháp phát hiện nhanh nước đã đun sôi và nước chưa đun sôi 104 XI- Phương pháp phát hiện nhanh thuôc bảo vệ thực vật clo hữu cơ 106 XII- Phương pháp phát hiện nhanh thuốc bảo vệ thực vật lân

hừu cơ (wofatox) 108

XIII- Phương pháp xác định độ chưa 110

XIV- Xác định chât lượng dầu mỡ bằng phản ứng Rreiss 112 XV- Phương pháp phát hiện nhanh độ kín của đồ hộp 114

TÀI LIỆU THAM KHẢO 115

(6)

PHẦN I

(7)

Chương 1

ỨNG DỤNG QUANG PHỔ UV-VIS

TRONG PHÂN TÍCH THựC PHẨM

1.1

cdsở

LÝ THUYẾT

Các phân tử hữu cơ và vô cơ có khả năng hấp thu ánh sáng ở các bước sóng khác nhau phụ thuộc vào cấu tạo hóa học của chúng. Cường độ hấp thu ánh sáng phụ thuộc vào bề dày lớp vật chất và phụ thuộc vào nồng độ. Khi chiếu một bức xạ đơn sắc Xi có cường độ lo vào cuvet có lớp dung dịch X dày l có nồng độ c , thì tại bề mặt cuvet:

- Một phần bức xạ bị phản xạ có cường độ bức xạ ỈỊỊ - Một phần ánh sáng bị dung dịch hấp thu có cường độ ỈA - Phần còn lại truyền qua cuvet có cường độ Ỉ T

l o = Ỉ R + Ỉ A + Ỉ T

Thông thường cuvet có bề mặt nhẵn bóng, Nên: 1r » 0

ỉ o ~ Ỉ A + Ỉ T

Cường độ hấp thu được xác định qua các đại lượng là độ truyền suốt T (transmission) được đo bằng tỷ lệ phần trăm (%) ánh sáng truyền qua cuvet và độ hấp thu A (absorption) hay còn gọi là mật độ quang OD (optical density).

T = ụ hay T{%) = -ộ- X 100

-► I,

Hình 1.1 Cường độ ánh sáng

vào cuvet và bị hấp thụ

A = * ị ; = ' 4 = ìeĩ ẵ - 2- ìsT%

Theo định luật Lambert Beer thì độ hấp thu của đung dịch tỷ lệ thuận với chiều đày l của lđp dung dịch và tỷ lệ thuận với nồng độ c của dung dịch, nên:

A = l g ỉ =

k.l.c

(8)

10 CHƯƠNG 1 Hay:

A

=

\ẽ ị

= z.l.c

E (1 .mol'1 cm'1) còn gọi là hệ số tắt phân tử và phụ thuộc vào: - Bản chất cấu tử

- Bước sóng tia tới - Nhiệt độ.

e được xác định bằng thực nghiệm. Tại mỗi bước sóng, một chất sẽ có hệ số hấp thu phân tử khác nhau.

Quang phổ ƯV-VIS hay quang phổ tử ngoại và so màu được sử dụng phổ biến nhất hiện nay trong kỹ thuật phân tích định lượng các thành phần hóa học của thực phẩm. Việc xác định hàm lượng một chất trong mẫu phân tích được thực hiện bằng phép ngoại suy từ độ hấp thu của chất chuẩn và mẫu tại một bước sóng xác định hoặc suy từ đường chuẩn A = f[C) được xây dựng bằng cách đo độ hấp thu của một dãy dung dịch chuẩn.

1.2 THIẾT BỊ

Máy quang phổ gồm có hai kiểu là có một chùm sáng hay có hai chùm sáng. Máy quang phổ một chùm sáng (single beam instrument) chỉ đo được một cuvet, khi đó phải đo mẫu trắng, điều chỉnh máy ghi về zero trước rồi mới đo mẫu thật.

Máy quang phố’ hai chùm sáng (double beam instrument) đo mẫu thật song song với mẫu trắng.

1.2.1 M áy qu ang phổ so m àu (spectrocolorimeter) sử dụ n g kín h lọc Máy so màu (CHLB Nga)

y = 220 + -Av 50Hz

Đèn PH 8-35 (đèn W) không dùng liên tục quá 8 giờ Dùng cho bức xạ vừng thấy được. Đo ở bước sóng > 340rcm Đèn DPK-120 (neon Hg) không dùng quá 4 giờ liên tục Dùng cho bức xạ vùng tử ngoại. Đo ồ bước sóng <340rcm. Chọn sử dụng kính lọc:

- Tìm vùng sóng hấp thu cực đại

(9)

B ả n g 1.1 Chọn kinh lọc ưà đèn

ỨNG DỤNG QUANG PHỔ UV-VIS TRONG PHÂN TÍCH THựC PHAM 11

Màu dung dỊch Bước sóng hấp thu

(nm) Kính lọc Đèn Số BƯỚC s ú n g c h iế u , nm Khõng màu < 340 1 315 Hg Vàng nhại 370 2 364 w Vàng lục 400 3 400 w Vàng cam 440 4 440 w Đỏ cam 490 5 490 w Đỏ t(m 540 6 540 w Xanh 582 7 582 w Xanh lục 600 8 600 w Lục 630 9 630 w

- Chọn kính lọc theo màu dung dịch, sau đó đo thử với cả hai kính lọc lân cận để tìm độ hấp thu cực đại.

1.2 .2 Máy sp ectro n ic UV- VIS g en esy s 8

H ìn h 1-2 Mặt ngoài của máy và mặt bên của cuvet T h ô n g s ố k ỹ th u ậ t

Vùng đo được: tử ngoại - khả kiến

Khoảng bước sóng: 190 1100nm

Giới hạn tin cậy của bước sóng: ±0,2«m Khoảng giá trị độ hấp thu: -0,3 “T 3A

Giởi hạn tin cậy của độ hấp thu: ±0,005A ở giá trị 1A

Nhiễu: < 0,000LA

Nguồn điện: tự động 90 -ỉ- 264V

(10)

12 CHƯƠNG 1 Máy thuộc loại một chùm sáng, nhưng có nhiều ổ cuvet có thể luân chuyển tự động.

Ổ cuvet

Mặt bên nuvet

H ìn h 1.3 Phía trong của m áy

- Tim bước sóng: Trước khi đo mẫu, dùng chất chuẩn để tìm bước sóng có độ hấp thu cực đại bằng cách quét chọn kn„. ở vùng tử ngoại thường quét từ 190 -*■ 300nm, ở vùng thấy được quét từ 300 700nm. Nếu biết trước khoảng hấp thu cực đại thì thu hẹp khoảng kiểm tra.

- Khi đo, sử dụng bức xạ đơn sắc để sự hấp thu có tính chọn lọc cao và hệ sô hấp thu phân tử 8 là hằng số.

- Chọn cưvet phù hợp: Vùng tử ngoại sử dụng cuvet thạch anh do cuvet thủy tinh hấp thu tử ngoại, vùng thấy được có thể sử dụng cuvet thạch anh, thủy tinh hay nhựa. Không đo bằng cuvet nhựa nếu sử dụng dung môi hữu cơ. Dùng nắp đậy cuvet nếu dung dịch đó dễ bay hơi. Dung dịch đo chứa trong cuvet phải cao hơn vạch mức.

Độ truyền suốt của một số loại cuvet thông dụng tùy thuộc vào vật liệu: A - cuvet thạch anh (silic): 190 4- 800nm

B - cuvet NIR silic: 220 -ỉ- 800nm c - cuvet nhựa polymethacrylate: 280 + 800nm D - cuvet nhựa polystyrene: 320 + 800ram E - cuvet thủy tinh: 330 -5- 800«m

Chất lượng và kỹ thuật sử dụng cuvet là những yếu tô" ảnh hưởng rất lớn tới kêt quả của phương pháp quang phổ. Các cuvet có chất lượng cao thường rất đắt và phải được giữ cẩn thận.

(11)

- Loại ảnh hưởng của dung môi, thuốc thử bằng cách dùng mẫu trắng có đủ các thành phần giống mẫu đo, nhưng không chứa mẫu để điều chỉnh máy về “zero” A = 0 hoặc T% = 100 trước khi đo mẫu thật.

- Nêu thời gian đo mẫu kéo dài, cần kiểm tra lại điểm “zero” bằng mẫu trắng. ỨNG DỤNG QUANG PHỔ UV-VIS THONG PHÂN TÍCH THựC PHẨM 13

BÀI 1: ĐỊNH LƯỢNG ĐƯỜNG KHỬ

BẰNG PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ so MÀU

I- NGUYỀN TẨC

Phương pháp dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa đường khử với thuốc thử đinitrosalicylic (DNS). Phản ứng xảy ra trong môi trường kiềm và có gia nhiệt. Phương trình phản ứng:

3C6H120,; + V 7— COQH --- Ụ COONa + SCsHnCOONa + 3 H ,0 + 4NaOH

Ol,n'

3,5-dinitrosalicylic axit 3-amino, 5-nitrosalicylate gluconate

(màu vàng) (màu nâu đỏ)

Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ đường khử trong một phạm vi nhất định, được đo bằng máy quang phổ so màu. Dựa theo đồ thị đường chuẩn của glucose tinh khiết với thuốc thử, tính hàm lượng đường khử của mẫu nghiên cứu.

II- HÓA CHẤT

- Thuốc thử axit dinitrosalicylic (DNS): pha hỗn hợp

Nước cất: 1416m/

Axit dinitrosalicylic (C7H4N2O7): 10,6g

NaOH: 19,8g

Sau khi hòa tan thêm vào dung dịch gồm: Muôi seignette (KNaC4H406.4H20): 306g

Phenol (CeHsOH): 7,6ml

Natri metabisulfit (Na2s 20 5): 8,3g - Acetat chi 10 %

(12)

14 CHƯƠNG 1 ra - DỤNG cụ THIẾT B|

Thiết bị: máy quang phổ Genesys 8 (xem mục 1.2.2) Dụng cụ:

I- Ống nghiệm (8 ông); 2- Giá để ống nghiệm 3- Becher 250ml\ 4- Becher lOOtti/ 5- Bình xịt nước cất; 6- ôn g bóp cao su 7- Côi chày sứ; 8- Dĩa nhựa

9- Dao; 10- Pipette 5ml

II- Pipette Iml; 12- Phễu thủy tinh 13- Bình định mức 100; 14- Cuvet nhựa

15- Giấy lọc; 16- Giá để pipette; 17- Đũa khuấy.

IV- TIẾN HÀNH 1- X ử lý m ẫ u

Tùy vào đối tượng nghiên cứu mà cách chuẩn bị dung dịch dùng dể định lượng đường khử có khác nhau:

Nguyên liệu không chứa nhiều tỉnh bột hoặc inulỉn

Cân 1 * 2g mẫu nếu là nguyên liệu khô (cây, lá hoặc quả khô) hoặc 5g nếu là nguyên liệu tươi có hàm ẩm cao (rau, quả tươi). Cho vào cối sứ nghiền thật nhỏ với bột thủy tinh hay cát sạch và 3Om/ nước cất nóng 70 -H 80°c. Trích ly nhiều lần bằng nước nóng. Chuyển lượng dịch vào bình định mức, bỏ phần bã đã trích hết đường.

Kết tủa protein và các tạp chất bằng dung dịch axit tricloacetic 10%, sau đó trung hòa bằng dung dịch NaOH 5% với chỉ thị methyl red (màu đỏ chuyển sang vàng).

Thêm nước cất tới vạch định mức 100mlt lọc qua giấy lọc vào cốc hay bình khô. Nước qua lọc đùng làm dung dịch mẫu phân tích đường khử.

Nguyên liệu chứa nhiều axỉt hữu cơ (cà chua, dứa, chanh, khế,...)

Trong quá trình trích ly đường, sacaroza có thể bị thủy phân một phần do sự có mặt của axit hữu cơ có sẩn trong nguyên liệu, do đó khi cần xác định riêng đường khử và đường sacaroza, phải trung hòa axit hữu cơ bằng đung dịch NaOH 5% hay NazC03 bão hòa.

Nghiền nhuyễn nguyên liệu trong cối sứ với một ít nước cất. Nhỏ ba giọt chỉ thị đỏ metyl (methyl red) và cho từ từ từng giọt NaOH 5% đến khi xuất hiện màu hồng nhạt. Tiếp tục trích ly và định mức như trên.

(13)

ỨNG DỤNG QUANG PHỔ UV-VIS TRONG PHÃN TÍCH THựC PHẨM 15 Nguyên liệu chứa nhiều tinh bột hay inulin (khoai lang, sắn, khoai tây)

Trích ly đường bằng rượu 70 -ỉ- 80°. Đun cách thủy hỗn hợp trong bình có lắp ống sinh hàn không khí. Trong trường hợp này, không cần kết tủa protein vì lượng protein chuyển vào dung dịch không đáng kể.

2- D ự n g đ ư ờ n g c h u ẩ n g lucose

Dung dịch glucose chuẩn: glucose 0,1%

Chuẩn bị dãy ống nghiệm theo bảng sau (mỉ):

STT ĐC t 2 3 4 5 M lu 1 M ỈU 2

Dd chuẩn 0,2 0,4 0,6 0,8 1

Dd mẫu 1 1

Nước cất 3 2,8 2,6 2,4 2,2 2 2 2

Thuốc thử DNS 1 1 1 1 1 1 1 1

Để các ống nghiệm vào nồi cách thủy đang sôi đúng 5 phút.

Lấy ra, làm lạnh đến nhiệt độ phòng rồi đem đi đo mật độ quang ở bước sóng 540nm với mẫu đối chứng (ĐC) lầ nước cất. Ghi các kết quả vào bảng trên.

Đối với những mẫu có lượng đường khử thấp thêm Q,lmg glucose vào mổi mẫu. Cứ 3m l thuốc thử sẽ phản ứng hết vổi khoảng 10mg glucose. Những dung địch đường đậm đặc phải được pha loãng sao cho mẫu đem phân tích chỉ chứa tối da 4mg đường khử.

L ư u ỷ:

1- Phản ứng được tạo thành trong môi trường kiềm, vì vậy những mẫu axit phải được trung hòa trước khi đem phân tích,

2- Phương pháp này thích hợp cho tất cả các loại đường khử, nhưng xenlobioza cho giá trị thấp hơn glucose 15%. Ngược lại, xylose lại cho kết quả đo cao hơn glucose 15%.

3- Các mẫu đã đun có thể để được một thời gian (20 phút) trước khi đo. Các mảu không đun sẽ bị biến đổi.

V- XỬ LÝ KẾT QUÀ

Từ các kết quả đo dung dịch chuẩn, dựng đường chuẩn glucose y = fix) với trục tung là mật độ quang, trục hoành là hàm lượng glucose (mg).

- Xác định phương trình tuyến tính của đường chuẩn:

Phương trình tuyến tính của đường chuẩn biểu thị sự tương quan của các số đo yi trên máy, tương ứng nồng độ Xi của dung dịch chuẩn.

(14)

16 CHƯƠNG 1 Đường chuẩn tốt là một đường qua gốc tọa độ, phương trình hồi quy: Y = kX. Khi đường chuẩn đi lệch gốc tọa độ thì có phương trình hồi quy dạng: Y - a X + b Các hệ số k, a, b và hệ sô tương quan R của đường chuẩn được tính theo quy tắc bình phương cực tiểu: t X ị Y i Ì K - Y ) 2 k = -i----— ; R 2 = \ A — —

ỉ * ?

i ( y , - y ) 2 1 Ỉ X i Y i - Ỹ l ị X i Ì Y i - a ị X i a

= 1 X

( Xi - X

)2

;

6 = 1=1 V =1

với: y , - độ hấp thu đo được tương ứng với nồng độ chuẩn Xi

y - kết quả tính theo phương trình hồi quy Xì - nồng độ cuả dung dịch chuẩn

n ~ sô lần đo trên các dung dịch chuẩn và trên mẫu trắng.

Chấp nhận đường chuẩn, độ tuyến tính của đường chuẩn được chấp nhận khi: - Hệ số tương quan của đường chuẩn phải lớn hơn 0,95.

- Các kết quả phân tích có độ chính xác cao khi dựa trên một đường chuẩn tốt có hệ số tương quan R > 0,99.

Dựa vào đường chuẩn, tính nồng độ (mg/ml) glucose trong dung dịch mẫu (X). Hàm lượng glucose trong nguyên liệu được tính theo công thức:

___X * V * 100

Gị%) = — j--",

1000 * m

với: X - nồng độ đường khử trong dung dịch mẫu tính theo glucose, mg/ml V - thể tích định mức dung dịch thí nghiệm, ml

(15)

Chương

2

ỨNG DỤNG QUANG PHỔ NGUYÊN TỬ

TRONG PHÂN TÍCH THựC PHAM

/

Phương pháp quang phổ nguyên tử được dùng để định tính và định lượng kim loại trong các mẫu rắn và mẫu lỏng.

Mỗi nguyên tố hóa học ở trạng thái hơi hoặc khí khi nóng sáng dưới áp suất thấp cho một quang phổ vạch đặc trưng cho nguyên tố đó. Ở nhiệt độ cao, các chất khoáng bị hóa hơi và nguyên tử hóa. Đám hơi nguyên tử có khả năng hấp thu chọn lọc bức xạ đặc trưng. Các nguyên tử có khả năng hấp thu những ánh sổng đom sắc nào thì cũng có khả năng phát xạ bước sóng đó. Đây là cơ sở của kỹ thuật phân tích nguyên tố bằng các phương pháp quang phổ nguyên tử.

Phương pháp quang phổ hâ'p thụ nguyên tử (Atom ic Absorption Spectrophotometry, AAS) dựa trên phổ hấp thu tử ngoại hoặc thấy được của các nguyên tố được nguyên tử hóa. Dung dịch mẫu được phun sương, hóa hơi và nguyên tử hóa nhờ hệ thống máy phun và ngọn lửa khí đô't (quang phổ hấp thu nguyên tử ngọn lửa: flame AAS) hoặc bởi lò nung graphite (quang phá hấp thu nguyên tử nhiệt điện: electrothermal AAS). Phương pháp EAAS chỉ cần lượng mẫu nhỏ và có giới hạn phát hiện nhỏ hơn nhiều so với phương pháp PAAS, nhưng đắt và ít th&ng dụng hơn.

Phương pháp quang phổ phát xạ nguyên tử (Atomic Emision spectrophotometry, AES) đựa trên phổ phát xạ trong vùng tử ngoại hoặc thấy được của các nguyên tố được nguyên tử hóa. Mẫu được vô cơ hóa, được hòa tan trong nước hoặc axit loâng và được hóa hơi ồ nhiệt độ cao. Sự nguyên tử hóa và sự kích thích dược thực hiện nhờ ngọn lửa hoặc một nguồn plasma ghép nối cảm ứng (inductively coupled plasma, ICP) làm nung nóng mẫu ở nhiệt độ trên 6000°K trong-khí Ar.

Cả hai loại phương pháp AAS và AES đều có khả năng đo dược chính xác hàm lượng của vết kim loại trong một hỗn hợp phức tạp. Phương pháp ICP-AES có thể đo được tới 80 nguyên tố trong mẫu. Vì vậy hiện nay và AES đả trd thành những công cụ ưu việt thay thế cho các phương pháp cổ điển .'ong việc phân tích hàm lượng khoáng trong thực phẩm và các dối tượng phân tích khác.

(16)

18 CHƯƠNG 2

BÀI 2: XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG KHOÁNG CHẤT TRONG THựC PHẨM

- PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ HẤP THU NGUYÊN TỬ

I- NGUYÊN TẮC

Dùng đèn cathode tạo ra các bức xạ đơn sắc đặc trưng cho mỗi nguyên tố. Việc định tính dựa trên sự hấp thu chọn lọc của đám hơi nguyên tử của mỗi nguyên tố cần xác định. Việc định lượng dựa vào cường độ hấp thu và bằng cách lập đường chuẩn.

II- HÚA CHẤT DỤNG cụ 1- D ụ n g c ụ th iế t b ị

- Chén sứ, binh định mức SOmỉ, pipette 5mỉ - Bếp điện (bếp cách cát)

- Cân phân tích . - Lò nung

- Hệ thống máy quang phổ hấp thu nguyên tử (AAS) của hãng Shimadzu - Đèn cathode cho mỗi nguyên tố cần xác định, trong bài này sử dụng đèn

cathode cho Ca, Fe

- Khí sử dụng: C2H2 và không khí. 2- H ó a c h ấ t -Nước cất - HNO3 Ĩ N - L&2O3 -CsCl. , U I- TIẾN HÀNH

X ử lý m ẫ tti Mẫu được trộn đềụ để đồng nhất. Lấy mẫu trung bình, sau đó cân vào chén nung từ 2 -ỉ- 5g ỉnẫu. Đặt chén lên bếp điện, gia nhiệt từ từ. Khi mẫu hết bốc khói chuyển vầo lò nurig, nung ở 525°c,- thời gian nung 3 * 5 giờ (không quá 8 giờ). Sau khi nung mẫu trắng, chuyển chén mẫu sang bình hút ẩm, để nguội tới nhiệt độ phòng (tránh làm bay tro của mẫu). Hòa tan tro với 5m l HNOa IN , đun nhẹ cho mẫu tan hoàn 'toàn, chuyển vào bình định mức 50m l, dùng HNO3 ƯV tráng chén hai lần, sau đó định mức 50m l bằng HNO3 IN .

(17)

ỨNG DỤNG QUANG PHỔ NGUYẼN TỬ TRONG PHÂN TÍCH THỰC PHẨM 19

Đối với những mẫu tro còn xám hoặc đen (còn C), ta lấy ra và thấm ướt tro bằng 0,5 -ĩ- 3m l HNO3 liV, sau đó đặt lên bếp điện cho khô và hết khói, chuyển vào lò nung, nung ở 525°c từ 1 -ỉ- 2 giờ (bước này nên hạn chế vi ÍT dễ bị mất).

Mẫu đã vô cơ hóa hoàn toàn được dùng để phân tích nguyên tố. Pha chế các dãy dung dịch chuẩn:

- Cân chất chuẩn, pha dung dịch chuẩn mẹ có nồng độ lOOỌppm - Từ dung dịch mẹ, pha dung địch chuẩn con có nồng độ lOOppm - Dung dịch LaCl31%: 1 1,7g La2Os + 50m l HC1 định mức 1000m/ - Dung dịch CsCl 10%: 12,7g CsCl định mức lOOmỉ.

B ả n g 2.1 Pha dãy chuẩn Ca

Thứ tự bỉnh định mức (50ml) 1 2 3 4

Nóng độ Ca (Cppm) 0 2 4 6

Thể tích dd con (Ca tOOppm) 0 1 2 3

Vml LaCI3 1% 5 5 5 5

Nước cất ĐỊnh mức đến vạch

Dung dịch LaCls trong mẫu là 0,1% (nền mẫu khi đo Ca có LaCỈ3 0,1%). B ả n g 2.2 Pha dãy chuẩn Fe

STT binh đm 100ml 1 2 3 5

Nổng độ (Cppm) 0 1 3 10

Vml Fe lOOppm 0 1 3 10

Nước cất Định mức óến vạch

B ả n g 2.3 Pha dãy chuẩn Na

STT bình dm 100ml 1 2 3 4

Nống độ (Cppm) 0 1 3 5

VmlNalOOppm 0 1 3 5

Vml CsCI 10% 5 5 5 s

Nước cất Định mức đến vạch

Dung dịch CsCl trong mẫu là 0,5% (nền mẫu khi đo Na có CsCl 0,5%)

- Cần ưức tính hàm ỉượng sơ bộ của các nguyên tố có trong mẫu để pha loãng trước khi đo.

(18)

CHƯƠNG 2

Tiến hành phân tích:

Quá trình phân tích gom các bước:

- Nguyên tử hóa mẫu, chuyển mẫu phân tích thành trạng thái hơi của các nguyên tử tự do.

- Dùng đèn cathode chiếu chùm tia sáng phát xạ của nguyên tố cần phân tích qua đám hơi nguyên tử.

- Đám hơi nguyên tử hấp tha chọn lọc bức xạ đặc trưng tạo thành phổ hấp thu nguyên tử.

- Thu nhận, phân ly và chọn vạch phổ cần tìm.

Tiến hành đo độ hấp thu của mỗi dãy dung dịch chuẩn với các đèn tương ứng. Từ các kết quả đo chuẩn, lập đường chuẩn A = fíC) theo phương pháp bình phương cực tiểu như đã tiến hành ở cốc bài thí nghiệm trên La có dường chuẩn của mỗi nguyên tố (Ca, Na, Fe). Đo độ hấp thu của mẫu tại các bức xạ đặc trưng cho mỗi nguyên tố.

IV- XỬ LÝ KẾT QUẢ

Từ độ hấp thu của mẫu dựa vào các đường chuẩn suy ra nồng độ của mỗi nguyên tố. Từ nồng độ dung dịch, tính hàm lượng mỗi nguyên tố Ca, Mg, Fe trong mẫu theo công thức sau.

Công thức tính hàm lượng nguyên tô': V /— JT C p p m * V d m * F Xi (m g/kg) =

---—---M

trong đó: Cppm - nồng độ nguyên tố ỉ có trong dung dịch mẫu đo hiển thị trên máy, ppm Vdm - thể tích dung địch mẫu định mức, ml

F - hệ số pha loãng của dung dịch mẫu trước khi đo so với dung dịch định mức M - lượng mẫu ịg).

(19)

PHẦN II

(20)

Chương

3

SẮC KÝ GIÂY

BẢI 3: XÁC ĐINH THÀNH PHẦN AXIT KHÔNG BAY Htíl

BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ GIẤY

Phương pháp sắc ký giấy dùng để phân tích các thành phần trong một hỗn hợp mẫu dựa trên sự phân bố khác nhau của các chất tan giữa hai tướng động và tướng tĩnh. Khi đặt băng giấy có chấm mẫu phân tích vào bình chứa dung môi thì dưđi tác dụng của lực mao dẫn, dung môi sẽ địch chuyển theo chiều dọc giấy kéo theo các thành phần phân bô' khác nhau đồng thời tách chúng ra từng thành phần.

Trong bài thí nghiệm này dùng phương pháp chạy sắc ký từ dưới lên.

I . HÓA CHấT

1- H ệ d u n g m ô i c h ạ y sắ c ký: n-butanol*axít íòrmic-nước (10:2:5)

Lấy n-butanol-axit formic-nước theo tỷ lệ thể tích (10:2:5) cho vào phễu chiết, lắc kỹ. Để yên 1 đến 3 giờ, tách lớp nước ỗ dưới vào một cốc đặt vào giữa bình sắc ký để làm bão hòa hơi nước ở bình trong khi chạy sắc ký. Tách lớp trên dùng làm hệ pha động chạy sắc ký.

2- T h u ố c h iệ n m à u sắ c k ỷ Dung dịch Bromphenol blue

Cân 40mg Bromphenol blue hòa tan trong 'lOOm/ rượu etylic 95%, dùng dung dịch ỉoãng Na2C03, chỉnh pH bằng 5.

3‘ D u n g d ịc h a x it c h u ẩ n : Các axit chuẩn nồng độ 3% trong nước cất gồm axit lactic, axit citric, axit oxalic, axit pyruvic, axit tactric...

(21)

24 CHƯƠNG 3 II- DỤNG CỤ THIẾT BỊ

1- Micropipette hoặc các ông mao quản; 3- Becher 250; 4- Bình xịt nước cất;

6- Giá để pipette; 7- Bình xịt thuốc hiện màu;

9- Pipette 5ml; 1 0- Ông nghiệm có nắp;

1 2- Giấy chạy sắc ký; 13- Cuvet nhựa; 15- Nồi cách thủy; 16- Bếp điện; 18- Erlen 250ml', 19- Đũa khuấy

2- Becher 100 5' Ống bóp cao su

8- Phễu thủy tinh 11- Bình tiêu bản có nắp 14- Máy sấy tay

17- Giấy lọc

20- Giá để ống nghiệm. Thiết bị:

Máy quang phổ so màu. III- TIẾN HÀNH

1- C h u ẩ n bị m ẫ u t h ử

Cân 20g sản phẩm thực phẩm đã nghiền nhỏ, cho vào cốc đung tích 250ml, thêm 50ml nước cất đã đun nóng, khuấy kỹ, để yên 20 phút để hòa tan hết axit, đem lọc lấy dịch lọc, tráng bã lọc nhiều lần bằng nước cất ấm, thử giấy đo pH để kiểm tra trích ly hết ax.it. Đem cô dung dịch sau lọc trên bếp đun cách thủy, cô cho đến cạn. Hòa tan cặn bằng 2ml nước cất, ta thu được dung dịch mẫu (M) để chấm sắc ký.

Nếu là mẫu lỏng, lấy 50mỉ sản phẩm lỏng. Cô cạn tới 2ml. Lọc loại kết tủa nếu có, phần còn lại dùng chạy sắc ký. Đôi với mẫu thực phẩm có hàm lượng axit cao như sữa chua, rau quả, tùy hàm lượng, chỉ cần lấy 5 \ữg và tiến hành xử lý như trên.

2- C h u ẩ n b ị g iấ y sắ c k ý

Giấy có kích thước 25 X 25cm. Dùng bút chì kẻ đường xuất phát cách mép giấy theo chiều đài 2,5crụ và trên dó đánh dấu các đĩểm chấm dung địch chuẩn và mẫu, mỗi chấm cách nhau 3cm và cách mép giấy 2cm. Ghi tên mẫu chấm sắc ký gồm các axit chuẩn, hỗn hợp chuẩn và mẫu: L (lactic), c (citric), o (oxalic), p (pyruvic), T (tactric)... và H (hỗn hợp), M i, M2 (mẫu).

3- C h ấ m m ẫ u lê n g iấ y sắ c k ỷ

Trong phương pháp sắc ký giấy kỹ thuật, chấm mẫu ảnh hưởng rất lđn đến kết quả sắc ký. Yêu cầu là vệt chấm phải nhỏ, gọn, phải châm mẫu nhiều lần để đủ lượng mẫu có thể nhận biết nhưng vệt chấm không được loang. Đường kính vệt chấm tôi đa 2mm.

(22)

SẮC KÝ GIẤY 25

Dùng micropipette hoặc ống mao quản chấm lên giấy sắc ký vào các điểm xác định 5 lần, tổng cộng khoảng 0,0Im l đung dịch từng axit chuẩn, hỗn hợp chuẩn và mẫu.

Chú ý, vệt chấm càng gọn thì kết quả phân tích càng tốt. Muốn vậy, sau mỗi lần chấm phải đợi các chấm thật khô mới chấm tiếp lần sau. Sấy khô giấy, cuộn hai mép chiều rộng, dùng kim đính lại thành một ông hình trụ rồi đặt ống giây vào bình sắc ký đã có chứa dung môi, sao cho dung môi nằm dưới vạch xuất phát, không ngập các điểm chấm sắc ký.

H ìn h 3.1 Chuẩn bị giấy sắc ký và triền khai sắc ký giấy

Để dung môi chạy từ dưới lên cho tới mép trên trong vòng 2 ^ 3 giờ. Sau đó lấy giấy ra để khô trong không khí. Tiếp tục sấy đến khô hoàn toàn trong tủ sấy ở

105°c trong 5 phút. Phun dung dịch thuôc hiện bromphenol blue lên giấy.

(23)

26 CHƯƠNG 3

H ìn h 3.3 Cách bơm thuốc hiện, chiêu m ũi tên chỉ hướng bơm thuốc nhuộm Đưa giấy vào tủ sấy ở nhiệt độ 90°c trong 10 phút. Trên giấy sẽ xuất hiện các vệt màu vàng của axit hữu cơ trên nền xanh của thuốc hiện.

Xác định hệ số phân bố Rf của các axit cỏ trong mẫu:

với: / - khoảng cách từ tâm các vệt màu tới đường xuất phát, cm

lo - khoảng cách từ đường đích của dung môi tới đường xuất phát, cm.

Người ta cũng cố thể định lượng bằng cách chấm một dãy dung dịch chuẩn có nồng độ biết trước, sau khi hiện màu thì cắt rời từng vệt màu cho vào ống nghiệm chứa 3ml rượu methylic. Ngâm, thỉnh thoảng lắc cho đến khi chiết hết chất màu và giấy trở nên trắng. Đem dung dịch này đo màu trên máy so màu ở bước sóng 340nm. Ghi trị số mật độ quang. Xây dựng đường chuẩn và tính nồng độ dung dịch mẫu theo đường chuẩn.

(24)

SẮC K Ý GIẤY 27

BÀI 4: DỊNH TÍNH CHẤT MÀU HỮU C0 TổNG Hộp

TAN TRONG Nước BẰNG PHƯÚNG PHÁP SẮC KÝ GIẤY

ĩ- NGUYÊN TẮC

Lấy mẫu và xử lý mẫu theo quy định đối với từng sản phẩm thực phẩm cụ thể. Sử dụng đung môi chiết phẩm màu hữu cơ tổng hợp. Dùng phương pháp sắc ký giấy phân tích các dung dịch phẩm màu chiết xuất được từ mẫu thử và so sánh với các chất màu chuẩn đã biết, từ đó định tính các phẩm màu.

II- DỤNG CỤ

- Cốc thủy tinh, ống đong chia độ, phiu thủy tinh, bếp cách thủy, bông. - Bát sứ, cối chày sứ, cối xay cà phê, cân kỹ thuật, bông. Phễu chiết 250ml, 500ml - Bộ chiết Sohxlet. Cát trắng tinh chế.

- Dụng cụ dùng cho phương pháp sắc ký giấy: micropipet chia đến p/ hoặc ống mao quản.

- Bình chạy sắc ký: bình trụ có nắp kín 20 X 50cm. - Giấy sắc ký: Whatman 1, FN4 hoặc FN6,

III- HÓA CHẤT

- NH3 dung dịch 1%

- Ether đầu hỏa

- Pepsine bột hoặc dung dịch đậm đặc - HC1 0 f05JV

- H2SO4 dung dịch 25% - Iso-buthanol

• Ether ethylic

- Các dung dịch phẩm màu chuẩn để so sánh (đã biết hàm lương màu)

- Các hệ dung môi chạy sắc ký: tuỳ theo từng loại phẩm màu chọn hệ dung môi phù hợp (xem bảng hướng dẫn).

(25)

28 CHƯƠNG 3

B à n g 4.1 Hưởng dẫn chọn hệ dung môi sắc ký giấy phâ n tích p h ẩm m àu thực phẩm

Phẩm màu và hỗn hợp Nổng độ chất màu Hệ dung môi th(ch hợp

Vàng: Tartazine (Cl. 19140) 0,2 1,2.3,6

Vàng axit: Fast yellow AB (CI.13015) 0,3 1,2.3,6

Đỏ; Ponceau 4R (C l.16215) 0,2 1,2,3

Đỏ: Amaranth (Cl. 16185) 0,2 1

Đỏ: Erithrosíne (Cl.45430) 0,1 3,4

Xanh: Indigocarmine (Cl,73015) 0,1 3,5,7,6

Đen: Brilliant black (CI.28440) 0,2 3.6

Vàng: Sunset yellow (Cl. 15985) 0,2 1,2,3,6

Tartazine + Ponceau 4R 0,4 1

Tartazine + Indigocarmine 0,4 5

Tartazine + Ponceau 4R + Brilliant black 0,6 1.2,3,6

Tartazine + Amaranth + Indigocarmine 0,6 3,4,6

Tartazine + Amaranth + Brilliant black 0,6 1,2,6

B ả n g 4.2 T h àn h p h ầ n các hệ dung môi sắc ký giấy p h ă n tich phẩm m àu thực phẩm

Hệ dung m6i Thành phần Tỷ IẬ

1 Trinatri xilrat-amoniac-nước 2-5-93 2 Etanol-amoniac-nước 12,5-2,5-85 3 n-Butanol-etanol-nước 2-1-1 4 Phenol-etanol-nước 8-5-8 5 Phenol-nước-amoniac 8-2-1 6 Piridin-isobutanol-nước 4-6-3

7 Ety) axetat- piridin-nước 50-25-20

TV- CHUẨN BỊ MẪU

Đồ uống và đồ hộp rau quả (đồ uống có C 02, rượu mùi, rượu quả, xíro, nước ép hoa quả, mứt hoa quả...).

Pha loãng 5 -ỉ-10m ỉ mẫu thử với 5 -ỉ- 20m l nước cất (có thể nhiều hơn). Lọc qua bông nếu cần, rửa bông bằng nước cất. Tập trung dịch lọc để chiết phẩm màu.

Lưu ý : trước khi chiết phẩm màu trong các đồ uống có C 02 hoặc có cồn phải đuổi hết CƠ2 và cồn ra khỏi mẫu bằng cách đun cách thủy.

(26)

SẮC KỶ GIẤY 29

Sản p hẩm kẹo:

Chọn từng loại kẹo riêng theo màu

Đôi với kẹo không nhân: hòa tan 5 -ỉ- lQg kẹo bằng nước cất nóng cho đến khi tan hết.

Đối với kẹo có nhân: hòa tan như trên, nếu hòa tan không hết thì lọc qua bông và rửa phần còn lại bằng NH3 1% (nước rửa hứng vào bình riêng), sau đó đuổi NH3 bằng cách đun cách thủy. Tập trung tất cả dịch lọc để chiết phẩm màu.

Sản phẩm chứa tinh bột: Các sản phẩm kẹo bột có chứa ít chất béo, bánh ngọt, bột puđing, mì sợi khô.

Cân 5 -ỉ- 10ể mẫu đã được sấy khô tự nhiên vào bát sứ, nghiền với ĨOml ether đầu hỏa, sau đỏ chắt bỏ lớp ether. Phần còn lại tiếp tục đuổi hết ether dầu hỏa trên bếp cách thủy.

Nghiền nhỏ mẫu thu được trong côi xay cà phê.

Cân 5 * 10# mẫu đã nghiền, dùng 30 + 50ml dung dịch NH3 1% hòa dần từng ít một vào mẫu, sau đó lọc qua bông và đun cách thủy dể loại amoniac.

Dung dịch thu được dùng để tiến hành chiết phẩm màu. Sản phẩm chứa đường và nhiều cếiất béo:

Nghiền khoảng 10ể mẫu với cát trắng sạch, sau đó sấy khô ở 60°c. Dùng ether dầu hỏa để tách châ't béo bằng bộ Sohxlet.

Chuyển phần mẫu đã chiết chất béo ra cốc, tiếp tục đuổi hết ether trên bếp cách thủy.

Cho vào cốc 20 4- 30mỉ dung dịch NHa 1%, đun nhẹ trên bếp cách thủy để chiết phẩm màu, rồi lọc qua bông.

Đun cách thủy để loại hết NH3 hoặc axit hóa địch lọc, dung địch này sẽ được dùng để chiết phẩm màu.

Sản phẩm chứa protein: thịt và các sản phẩm chế biến từ thịt như giò, lạp xưởng... Phương pháp dùng dung môi.

Trước khi tách phẩm màu khỏi sản phẩm thịt, cần phải loại chất béo bằng cách sau: mẫu được nghiền nhỏ đều, loại chất béo bằng ether dầu hỏa trong bộ Sohxlet. Cũng có thể tách béo bằng cách đun mẫu với nước cho đến khi chất béo nóng chảy hết, sau làm lạnh đột ngột dung địch, tách lớp chất béo đóng băng khỏi lớp nước.

Axit hóa dung dịch đã tách béo bằng HC1, protein kết tủa kéo theo cả phẩm màu. Cho \g pepsine đã hòa sẵn trong 10 -ỉ- 20ml HC1 0,05N vào chất kết tủa cổ màu và để ở nhiệt độ 45 -ỉ- 50°c trong 2 giờ, sau đó lọc và rửa bằng nước cất nóng.

(27)

30 CHƯƠNG 3 Nếu chất còn lại trên phễu lọc vẫn còn màu thì phải cho pepsine lần thứ hai và tiến hành như trên. Tập trung tất cả dịch lọc có màu lại để chiết phẩm màu.

V- CHIẾT PHẨM MÀU

Nguyên lý: Sử dụng dung môi chiết phẩm màu hữu cơ tổng hợp có tính axit bằng isobutanol ở môi trường axit, sau đó chiết lại phẩm màu đó bằng dung dịch kiềm nhẹ.

Riêng phẩm màu erythrosine, dùng dung môi là ether ethylic. Chiết bằng isobutanol:

Axit hóa mẫu thử bằng dung dịch H2SO4 25% theo tỷ lệ 1/10.

Chiết xuất phẩm màu bằng isobutanol 2 -ỉ- 3 lần, mỗi lần 15ml. Lắc kỹ đến khi isobutanol không còn màu, tập trung dịch chiết isobutanol.

Dùng dung dịch NH3 1% chiết phẩm màu, mỗi lần 5ml, lắc kỹ đến khi dung địch amoniac không còn màu. Tập trung dung dịch màu amoniac lại, đuổi hết amonỉac bằng cách đun cách thủy. Cô đặc đến thể tích cần thiết, dung dịch thu được sẽ được dùng để định tính phẩm màu.

Chiết erythrosine bàng ether-ethylỉc:

Từ dung dịch mẫu thử đã được axit hóa bằng H2SO4 như trên, chiết xuất erythrosine bằng ether-ethylic hai lần, mỗi lần 10ml.

Tập trung dịch chiết, lắc với nước máy. Phẩm màu sẽ tạo thành muối với các ion kiềm và kiềm thổ trong nước máy và tan được trong nước.

Lắc ba lần với nước cất, tập trung các dung dịch chiết, Cô cách thủy đến thể tích cần thiết (khoảng \m l), đung dịch này được dùng để định tính phẩm màu.

VI- ĐINH TÍNH PHẨM MÀU BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KỸ GIẤY

Chuẩn bị bình sắc ký: Là một bình thủy tinh hình trụ, có nắp đậy kín, tránh sự bay hơi của dung môi. Kích thước bình sắc ký giấy tữ 16 X 30 đến 20 X 50cm phụ thuộc khả năng tách của hệ dung môi và hệ số phân bố của các thành phần trong hỗn hợp phân tích. Đổ dung môi (pha dộng) vào bình tới chiều cao 15mm. Đậy nắp để dung môi ổn định và tạo trạng thái bão hòa hơi dung môi trong bình.

Chuẩn bị giấy sắc ký: c á t tờ giâíy sắc ký thành hình chữ nhật có chiểu dài nhỏ hơn chu vi đáy bình sắc ký 2cm và chiều rộng nhỏ hơn chiều cao bình sắc ký 3cm. Trên chiều dài dùng bút chì kẻ song song cách mép 2cm dùng làm đứởng xuất phát để chấm mẫư và đánh dấu các vị trí chấm mẫu cách nhau 3cm.

(28)

SẮC KÝ GIẤY 31

Chấm mẫu và triển khai sắc kỷ: Trên đường xuất phát, đùng ống mao quản chấm 10 -ỉ- 2 0ụl dung dịch mẫu thử và các chất màu chuẩn lên giấy sắc ký vào các điểm xác định. Làm khô bằng máy sấy sau mỗi lần chấm, vệt chấm phải nhỏ, gọn. Sấy khô các vệt chấm, cuộn hai mép chiều rộng, dùng kim đính lại thành một ống hình trụ rồi đặt ống giấy vào bình sắc ký đã có chứa dung môi, sao cho dung môi nằm dưới vạch xuất phát, không ngập các điểm chấm sắc ký. Triển khai sắc ký cho tởi khi vệt dung môi lên tới gần mép trên của ống giấy. Lấy giấy ra, đánh dấu đường đích của dung môi. Treo giấy trong tủ hotte cho dung môi bay hơi hết, và để cho giấy khô hoàn toàn.

Đánh giá kết quả phân tích: Sự phân bố của các vết màu trên giấy sắc ký có thể nhìn thấy được hoặc soi dưới đền tử ngoại. Dùng bút chì đánh dấu vị trí các vết màu và đo khoảng cách tới đường xuất phát của mỗi vết. Tính hệ số phân bố:

Nhận dạng các chất màu dựa vào sự trùng hợp về hệ số phân bố và màu sắc của các vết mẫu và chuẩn.

Có thể kiểm tra lại kết quả phân tích bằng cách thực hiện chạy sắc ký với một hệ dung môi khác.

(29)

c

hương

4

PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ BẢN MỎNG

(THIN LAYER CHROMATOGRAPHY, TLC)

sắc ký bản mỏng là một loại sắc ký phẳng. Pha tĩnh ở trạng thái rắn được trải thành một lớp mỏng trên bề mặt của bản kính, bản nhôm hay nhựa tổng hợp. Pha động là một hệ dung môi. Khi cho pha động di chuyển qua pha tĩnh từ dưới lên, bằng lực hút mao quản, nó sẽ kéo theo các cấu tử trong mẫu với vận tốc khác nhau làm cho chúng tách rời. Trong sắc ký phảng, sự khuếch tán vừa theo chiều dọc vừa theo chiều ngang nên đại lượng đặc trưng cho quá trình di chuyển của các cấu tử là hệ số phân bố vùng.

Pha tĩnh trong sắc ký bản mỏng: có thể dùng tất cả các loại pha tĩnh dùng trong sắc ký cột. Thông thường là silicagel, oxyt nhôm, kieselguhr, cellulose, tinh bột, nhựa trao đổi ion. Ngoài ra, còn dùng các chất trên kết hợp vđi các chất lỏng hữu cơ như các amin cao phân tử hay tributylphosphate.

BÀI 5: PHÂN TÍCH LIPID BẰNG PHƯŨNG PHÁP SẮC KÝ BẢN MỐNG

I- DỤNG CỤ

Hệ thống phân tích sắc ký bản mỏng gồm có: bocan sắc ký có nắp đậy kín tránh dung môi bay hơi, dụng cụ tráng bản mỏng, giá để bản mỏng sau khi tráng, tủ sấy 105+ 110°c, đèn hiện u v và đèn huỳnh quang, ống mao quản hoặc micropipette để chấm sắc ký,

n - HÓA CHẤT

Bột silicagel H, iod tinh thể, metanol, axit axetic, hexan, ete etylic, axit phosphomolypdic 10% trong rượu 96%, axit sulfuric đặc.

III- TIẾN HÀNH

Chuẩn bị bản mỏng sỉlicagel: Tính lượng silicagel cần dùng khoảng 12 +15mg', hồ < h bột 1 + 1,2m# nước 0,03 -ỉ- 0,04ml/cm2 bề mặt bản mỏng. Cân 30g bột silicagel H, trộn với 75m l nước cất, lắc đều trong 30 giây, tạo một dung dịch huyền phù đồng nhất. Dùn^ đụng cụ tráng bản mỏng, tráng một lớp silicagel dày 0,25mm

(30)

PHƯƠNG PHÁP SẮC KỶ BẢN MỎNG 33

lên 5 bản kính diện tích 20 X 20cm. Để khô tự nhiên trong không khí trong vòng 36 giờ. Không được làm khô trong tủ sấy, không được bảo quản trong bình hút ẩm.

Chuẩn bị nguyên liệu phân tích sắc ký: Lipid động vật được trích ly bằng chloroform, cô đặc tới nồng độ chất khô khoảngl0%, hay dầu thô được thu nhận bằng phương pháp ép hoặc trích ly từ nguyên liệu hạt đầu. Các sản phẩm là dẫn xuất cua dầu béo đều có thể phân tích thành phần bằng phương pháp sắc ký bản mỏng.

Chât chuẩn: axit béo tự do, cholesterol, monoglycerit, diglycerit, triglycerit, sterit hoặc các dẫn xuất lipid ở dạng tinh khiết.

Chấm mẫu: Trên bản mỏng silicagel kẻ đường xuất phát bằng bút chì cách mép l,5cm, dùng bút chì đánh dấu các điểm chấm trên đường xuất phát, mỗi điểm cách nhau l,5em. Dùng micropipette hoặc ống mao quản thủy tinh chấm mỗi mẫu khoảng 10 microlit. Các vệt chấm cần nhỏ, gọn. Có thể chấm vệt tròn hay vệt thẳng.

Dung môi triển khai sắc ký sử dụng là hexan: ete etylic: axit axetic (73:25:2) (hoặc 80:20:1) . Chiều cao lớp dung môi trong bocan < l,5cm.

Để các tấm bản mỏng đã chấm mẫu vào trong thùng và đậy kín nắp. Thời gian triển khai 1 -H 2 giờ, sao cho tối thiểu dung môi đã đi được quá 2/3 chiều dài của bản mỏng. Lấy bản mỏng ra, đặt .trong tủ hotte để bay ìỉơi hết dung môi. Hiện màu bằng dung dịch axit photphomolypdic ,10% sau đó sấy khô ở 80 V 1 0 0°c cho tứi khi xuất hiện các vệt màu xanh trên nền vàng. Cũng có thể hiện màu bằng hơi iod làm xuất hiện các vệt màu vàng trên nền tím.

Nếu phân tích chất béo trích từ mô cơ của động vật thi thứ tự các vệt kể từ đường xuất phát là photpholipit, một vệt không định danh, cholesterol, monoglycerit, diglycerit, axit béo tự do cao phân tử triglycerit, sterit và chạy cùng với vạch dung môi là cacbuahydro.

a)

T LC plate

U '

(31)

Fitter paper

Normat chamber

a) b) c)

(32)

PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ BẦN MỎNG 35

BÀI 6: ĐỊNH TÍNH SACCHARINE BẰNG PHƯƠNG PHÁP

SẮC KỸ BẢN MỎNG

I- NGUYÊN TẨC

Chiết tách saccharine từ thực phẩm hoặc đồ uống bằng ethyl acetate. Làm bay hơi dịch chiết, hòa tan phần cặn còn lại vào hỗn hợp dung môi amoniac - nước - ethanol (1:1:2). Sau đó chấm dung dịch này lên bản sắc ký lớp mỏng, so sánh Rf và cường độ huỳnh quang với dung dịch saccharine chuẩn dưới đèn tử ngoại có bước sóng ngắn 254nm.

n - DỤNG CỤ

1- Micropipette có chia vạch hoặc các ống mao quản 2- Bình định mức 10, 50, 250ml 3- Phễu chiết 250m ỉ 4- Ống nghiệm có nắp 5- Bình cầu 250ml 6- Máy cô quay chần không 7- Bình chạy sác ký 8- Tấm kính để tráng lớp mỏng, kích thưức 20 X 20cm hoặc dùng bản mỏng tráng sẵn Silicagel H 9- Máy sấy tóc 10- Đèn tử ngoại có bước sóng 254nm 11- Bếp cách thủy. n i - HÓA CHẤT 1- H2SO4 dung dịch 1:1 2- NaOH dùng dịch 50% 3- NH3 dung địch 25%

4- Eter dầu hỏa có điểm sôi 40 -ỉ- 70°c 5- Ethyl acetate

6- Ethanol 96% 7- Silicagel H

8- Hỗn hợp amoniac - nưởe - ethanol theo tỷ lệ thể tích 1:1:2 (hỗn hợp B) 9- Hệ dung môi chạy sắc ký: n - buthanol - ethanol - amoniac - nước theo tỷ

(33)

36* CHƯƠNG 4

IV - TIẾN HÀNH

C h u ẩ n bị d u n g d ịc h sa cch a rin e c h u ẩ n :

Cân chính xác 10mg natri saccharinate cho vào bình định mức 10ml, định mức bằng hỗn hợp B ở trên, lắc đều (1 mỉ dung dịch chuẩn chứa 1 mg saccharine).

C h u ẩ n bị m ẫ u thử:

■ Đôi với đồ uống có C02: đuổi C02 bằng cách đun mẫu trêji bếp cách thủy

hoặc lắc mạnh nhiều lần.

- Đối với đồ uống có cồn: lấy 50mỉ đồ uống vào một cốc thủy tinh, đun cách thủy trên bếp để đuổi hết cồn. Sau đó làm nguội phần còn lại rồi đổ vào bình định mức 50mỉ. Tráng cốc bằng nước cất, tập trung nước tráng vào bình định mức rồi định mức tới vạch bằng nước cất, lắc đều.

- Đối với thực phẩm dạng rắn: nghiền nhỏ mẫu, lấy 5g mẫu đã nghiền nhỏ vào cốc thủy tinh. Thêm 200ml nước sôi vào cốc, trộn đều và giữ trong 2 giờ, thỉnh thoảng khuây đều. Sau đó lọc hỗn hợp qua giấy lọc vào bình định mức 250ml. Tráng giấy lọc nhiều lần bằng nước cất, sau đó định mức tới vạch bằng nước cất và lắc đều.

C h iết tá c h sa cch a rin e:

Axit hóa 50m ỉ phần mẫu thử đã được chuẩn bị ở trên bằng 10ml dung dịch H2SO4 45%, sau đó cho vào phễu chiết, chiết bằng 50m l ether dầu hỏa. Lắc mạnh, sau đó để yên cho phân lớp. Thu lại lớp dưới có chứa saccharine sang bình cầu.

Chiết phần còn lại trong bình chiết thứ nhất bằng 50m l dung dịch ether dầu hỏa như trên và cũng thu phần lớp dưới vào bình chiết thứ hai. Thêm vào bình chiết thứ hai 5mỉ NaOH 50%, chiết hai lần bằng ethyl acetate, mỗi lần 50ml. Lọc dung dịch chiết ethyl acetate qua bông thủy tinh (đã được rửa trước bằng ethyl acetate) vào bình cầu của máy cô quay chân không.

Tiến hành cô quay cho đến khi còn 2 -T 3ml thì chuyển sang ống nghiệm dung tích 10mZ. Tráng rửa bình cầu bằng ethyl acetate, thu nước tráng vào ống nghiệm. Làm bay hơi dung môi trong ống nghiệm trên bếp cách thủy, tốt nhất là dưới luồng khí nitơ nhẹ. Sau đó hòa tan lượng cặn thu được bằng 2,5m l hỗn hợp B. Đậy kín ống nghiệm để chạy sắc ký bản mỏng.

T iê n h à n h c h ấ m sắ c kỷ:

Trước khi chấm sắc ký phải cọ sạch lớp silicagen ở cạnh đáy và hai cạnh bên của bản sắc ký để tránh hiện tượng mao dẫn. Dùng bút chì và thước kẻ đánh dấu vạch xuất phát cách mép dưới của bản mỏng 2,5em. Dùng micropipet chấm 5 điểm

(34)

PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ BẢN MỎNG 37

đung địch mẫu thử và dung dịch chuẩn, các điểm cách mép của bản sắc ký và cách nhau 2,5cm. Mỗi lần chỉ chấm khoảng 1)4ỉ để đường kính của mỗi vết chấm không quá 0,5cm. Chấm xong một chấm phải làm khô bằng máy sấy tóc rồi mới chấm tiếp cho đến khi chấm hết lượng dung dịch cần phải chấm.

Chấm các vết theo thứ tự từ trái sang phải như sau: - 2,5\d dung địch saccharine chuẩn

- 5|Jỉ dung dịch saccharine chuẩn - 5jj1 dung dịch chiết của mẫu thử

- 5ụl dung dịch chiết của mẫu thử đã được pha loãng gấp đôi bằng hỗn hợp dung dịch B

- 1 0|ii đung dịch saccharine chuẩn

- Chấm xong đê bản mỏng khô trong không khí. T iê n h à n h ch ạ y sắ c hý:

Dùng một tờ giấy lọc đã được tẩm ướt bằng dung môi chạy sắc ký (dung môi A) phủ xung quanh thành bình phía trong, sau đó đổ dung môi A vào bình tới độ cao 1 cm. Đậy kín nắp bình và để yên trong 30 phút để có được trạng thái bão hồa dung môi trong bình.

Đặt bản mỏng sắc ký đã chấm mẫu và được làm khô vào bình, đậy nắp lại để

khí quyển trong bình luôn được bão hòa dung môi.

Khi mức đung môi trên bản mỏng đạt độ cao 10cm (sau khoảng 1 giờ), nhấc

bản mỏng ra, đánh dấu chính xác mức dung môi và làm bay hơi dung môi cho tới

khi không nhìn thấy vạch (khoảng 10 phút).

Quan sát bản sắc ký dưới ánh đèn tử ngoại có bước sóng 254nm và khoanh vùng vết saccharine phát huỳnh quang (Rf s 0,5).

Đ á n h g iả sắ c k ỷ đồ:

Đo khoảng cách di chuyển của vệt dung môi và của vết saccharine, tính toán Rf. Đối chiếu so sánh sắc ký đồ của mẫu thử với mẫu saccharine chuẩn về giá trị Rf và cường độ huỳnh quang. Nếu giống nhau thì kết luận: sắc ký đồ đó là của hai chất giống nhau.

(35)

BÀI 7: PHÂN TÍCH AFLATOXIN

BẰNG PHƯƠNG PHẤP SẮC KÝ BẢN MỎNG

I- NGUYÊN TẮC

Aflatoxin là nhóm mycotoxin có độc tánh cao do gây ung thư gan, được sinh bởi một số loài nấm mốc mà thường gặp nhất là Aspergillus flavus.

Đây là một nhóm chất gồm khoảng 20 loại có nguồn gốc flavacumarin. Phân tử aflatoxin gồm một gốc cumarin, hai nhân furan và một vòng lacton.

C ông th ứ c c h u n g 38 CHƯƠNG 4 0 0 0 0 R (1) I ^

f Y S

J ồ ỏ

L0JL0X

(2) 0 ° ^ o c h 3 b) (2) 0

10ẳ 0j O O ^

0 OCH3

a) Aflatoxin B1 R = H và cổ nối đôi giữa (1) và (2) Aflatoxin B2 R » H và không có nối đỏi giữa (1) và (2) Aflatoxin M1 R = OH và có nổi đồi giữa (1) và (2) Aflatoxin M2 R ã OH và không có nối đôi giữa (1) và (2)

b) Aftatoxin G1 có nối đối giũa (V) và (2')

Aflatoxln G2 khống có nối đôi giữa (1') và (2')

Các aílatoxin trong tự nhiên gồm bốn loại là B l, B2, G l, G2. Aflatoxin nhóm B và nhóm G được gọi tên do tính phát huỳnh quang dưới tia UV: B: blue; G: green. Về cấu tạo hóa học, chúng khác nhau ở chỗ nhóm B chỉ có một nhóm chức lacton trong khi nhóm G có hai chức lacton. Thứ tự 1, 2 trong mổi nhóm là do sự di chuyển nhanh hay chậm trên sắc ký đồ. Các loại aflatoxin khác được hình thành là do sự biến đổi hóa sinh của 4 aflatoxin ban đầu B l, B2, G l, G2 bên trong các sinh vật bị nhiễm gồm nấm và động vật.

Để phát hiện và định lượng aflatoxin có hai nhóm phương pháp là phương pháp sinh học và phương pháp hóa học, nhưng phương pháp hóa học có tính chọn lọc hơn và có độ tin cậy cao hơn.

Phương pháp hóa học bao gồm các bước cơ bản sau: - Lấy mẫu

(36)

PHƯƠNG PHÁP SẮC KỶ BẢN MỎNG 39 - Loại tạp chất - Cô đặc - Phân tách các thành phần bằng sắc ký - Định tính và định lượng aflatoxin. Để phân tích aflatoxin bằng phương pháp sắc ký bản mỏng sử dụng dung môi đế’ hòa tan và trích ly aflatoxin từ nguyên liệu đã được nghiền nhỏ. Dùng cột sắc ký hấp thụ aflatoxin từ dịch trích. Dùng methanol giải hấp aflatoxin. Định tính và định lượng aflatoxin trong dịch trích bằng phương pháp sắc ký bản mỏng. Đây là phương pháp được sử dụng nhiều nhất trong các phòng thí nghiệm để định lượng aflatoxin trong lương thực thực phẩm, thức ăn gia súc... Phương pháp này rẻ hơn so với HPLC và có độ nhạy khá cao, có thể phát hiện tới nồng độ 1ppb.

II- DỤNG CỤ HÚA CHẤT Dụng cụ thiết bị: - Máy soi huỳnh quang - Máy lắc

- Máy gia nhiệt và thổi khí nitrogen - Bình triển khai sắc ký bản mỏng - Micropipette 20ụl - Syringe nhựa 20ml - Pipette loại 1 mỉ, 5m ỉt 20mỉ - Cột sắc ký ái lực miễn dịch - Các minicolumn florisil dùng để bán định lượng - Bản mỏng silcagel có sẵn hoặc tự chế tạo - Giấy lọc. Hóa chất: - Methanol loại HPLC - Chloroform - Acetone - NaCl

- Aflatoxin chuẩn 0,5|Jg/niỉ trong benzen-acetonitrile (98:2) - Dung môi trích ly aflatoxin là hỗn hợp methanol-nước (55:45) - Hệ dung môi triển khai sắc ký chloroíorm-acetone (9:1)

Referências

Documentos relacionados

Dù là loại, hay thứ hạng thực phẩm nào cũng cần phải được bảo quản đúng phương pháp để duy trì chất lượng sản phẩm đã đạt được trong quy trình chế biến trước

Thông thường, bằng con đưòng thực nghiệm và trả i qua thực tiễn, thường dùng phương pháp quang phổ để định lượng dược chất trong một dạng thuôc chứa

- Các chất oxi hóa ñược ñịnh lượng bằng cách cho tác dụng với KI dư trong môi trường axit và sau ñó chuẩn ñộ lượng iốt giải phóng ra bằng dung dịch natri thiosunfat Na

một phương trình trong hệ từ đó thu được một phương trình hệ quả Giải phương trình hệ quả bằng những phương pháp:.. ■ Tổng,

- Cách đọc kết quả: Đối với dung dịch không màu đọc ở phần đáy của phần cong, dung dịch có màu đọc phần phía trên của mặt

– Trong bài thực hành này, enzyme được cố định bằng phương pháp hấp phụ và bắt giữ.. Nguyên tắc là cho enzyme lẫn vào mạng lưới gel Ca–alginate, enzyme có thể bám

Hàm lượng của Pb trong pha hữu cơ được xác định  bằng phương pháp hấp thụ nguyên tử, mặt khác người ta dùng đèn catot rỗng với đường hấp

Phương pháp tôhg hợp axit closunfonic trong môi truởng axit closunfonic. Theo phương pháp này, dung môi chính là axit