Chuẩn bị nguyên liệu phân tích sắc ký: Lipid động vật được trích ly bằng chloroform, cô đặc tới nồng độ chất khô khoảngl0%, hay dầu thô được thu nhận bằng phương pháp ép hoặc trích ly từ nguyên liệu hạt đầu. Các sản phẩm là dẫn xuất cua dầu béo đều có thể phân tích thành phần bằng phương pháp sắc ký bản mỏng.
Chât chuẩn: axit béo tự do, cholesterol, monoglycerit, diglycerit, triglycerit, sterit hoặc các dẫn xuất lipid ở dạng tinh khiết.
Chấm mẫu: Trên bản mỏng silicagel kẻ đường xuất phát bằng bút chì cách mép l,5cm, dùng bút chì đánh dấu các điểm chấm trên đường xuất phát, mỗi điểm cách nhau l,5em. Dùng micropipette hoặc ống mao quản thủy tinh chấm mỗi mẫu khoảng 10 microlit. Các vệt chấm cần nhỏ, gọn. Có thể chấm vệt tròn hay vệt thẳng.
Dung môi triển khai sắc ký sử dụng là hexan: ete etylic: axit axetic (73:25:2) (hoặc 80:20:1) . Chiều cao lớp dung môi trong bocan < l,5cm.
Để các tấm bản mỏng đã chấm mẫu vào trong thùng và đậy kín nắp. Thời gian triển khai 1 -H 2 giờ, sao cho tối thiểu dung môi đã đi được quá 2/3 chiều dài của bản mỏng. Lấy bản mỏng ra, đặt .trong tủ hotte để bay ìỉơi hết dung môi. Hiện màu bằng dung dịch axit photphomolypdic ,10% sau đó sấy khô ở 80 V 1 0 0°c cho tứi khi xuất hiện các vệt màu xanh trên nền vàng. Cũng có thể hiện màu bằng hơi iod làm xuất hiện các vệt màu vàng trên nền tím.
Nếu phân tích chất béo trích từ mô cơ của động vật thi thứ tự các vệt kể từ đường xuất phát là photpholipit, một vệt không định danh, cholesterol, monoglycerit, diglycerit, axit béo tự do cao phân tử triglycerit, sterit và chạy cùng với vạch dung môi là cacbuahydro.
a)
T LC plate
U '
Fitter paper
Normat chamber
a) b) c)
PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ BẦN MỎNG 35
BÀI 6: ĐỊNH TÍNH SACCHARINE BẰNG PHƯƠNG PHÁP
SẮC KỸ BẢN MỎNG
I- NGUYÊN TẨCChiết tách saccharine từ thực phẩm hoặc đồ uống bằng ethyl acetate. Làm bay hơi dịch chiết, hòa tan phần cặn còn lại vào hỗn hợp dung môi amoniac - nước - ethanol (1:1:2). Sau đó chấm dung dịch này lên bản sắc ký lớp mỏng, so sánh Rf và cường độ huỳnh quang với dung dịch saccharine chuẩn dưới đèn tử ngoại có bước sóng ngắn 254nm.
n - DỤNG CỤ
1- Micropipette có chia vạch hoặc các ống mao quản 2- Bình định mức 10, 50, 250ml 3- Phễu chiết 250m ỉ 4- Ống nghiệm có nắp 5- Bình cầu 250ml 6- Máy cô quay chần không 7- Bình chạy sác ký 8- Tấm kính để tráng lớp mỏng, kích thưức 20 X 20cm hoặc dùng bản mỏng tráng sẵn Silicagel H 9- Máy sấy tóc 10- Đèn tử ngoại có bước sóng 254nm 11- Bếp cách thủy. n i - HÓA CHẤT 1- H2SO4 dung dịch 1:1 2- NaOH dùng dịch 50% 3- NH3 dung địch 25%
4- Eter dầu hỏa có điểm sôi 40 -ỉ- 70°c 5- Ethyl acetate
6- Ethanol 96% 7- Silicagel H
8- Hỗn hợp amoniac - nưởe - ethanol theo tỷ lệ thể tích 1:1:2 (hỗn hợp B) 9- Hệ dung môi chạy sắc ký: n - buthanol - ethanol - amoniac - nước theo tỷ
36* CHƯƠNG 4
IV - TIẾN HÀNH
C h u ẩ n bị d u n g d ịc h sa cch a rin e c h u ẩ n :
Cân chính xác 10mg natri saccharinate cho vào bình định mức 10ml, định mức bằng hỗn hợp B ở trên, lắc đều (1 mỉ dung dịch chuẩn chứa 1 mg saccharine).
C h u ẩ n bị m ẫ u thử:
■ Đôi với đồ uống có C02: đuổi C02 bằng cách đun mẫu trêji bếp cách thủy
hoặc lắc mạnh nhiều lần.
- Đối với đồ uống có cồn: lấy 50mỉ đồ uống vào một cốc thủy tinh, đun cách thủy trên bếp để đuổi hết cồn. Sau đó làm nguội phần còn lại rồi đổ vào bình định mức 50mỉ. Tráng cốc bằng nước cất, tập trung nước tráng vào bình định mức rồi định mức tới vạch bằng nước cất, lắc đều.
- Đối với thực phẩm dạng rắn: nghiền nhỏ mẫu, lấy 5g mẫu đã nghiền nhỏ vào cốc thủy tinh. Thêm 200ml nước sôi vào cốc, trộn đều và giữ trong 2 giờ, thỉnh thoảng khuây đều. Sau đó lọc hỗn hợp qua giấy lọc vào bình định mức 250ml. Tráng giấy lọc nhiều lần bằng nước cất, sau đó định mức tới vạch bằng nước cất và lắc đều.
C h iết tá c h sa cch a rin e:
Axit hóa 50m ỉ phần mẫu thử đã được chuẩn bị ở trên bằng 10ml dung dịch H2SO4 45%, sau đó cho vào phễu chiết, chiết bằng 50m l ether dầu hỏa. Lắc mạnh, sau đó để yên cho phân lớp. Thu lại lớp dưới có chứa saccharine sang bình cầu.
Chiết phần còn lại trong bình chiết thứ nhất bằng 50m l dung dịch ether dầu hỏa như trên và cũng thu phần lớp dưới vào bình chiết thứ hai. Thêm vào bình chiết thứ hai 5mỉ NaOH 50%, chiết hai lần bằng ethyl acetate, mỗi lần 50ml. Lọc dung dịch chiết ethyl acetate qua bông thủy tinh (đã được rửa trước bằng ethyl acetate) vào bình cầu của máy cô quay chân không.
Tiến hành cô quay cho đến khi còn 2 -T 3ml thì chuyển sang ống nghiệm dung tích 10mZ. Tráng rửa bình cầu bằng ethyl acetate, thu nước tráng vào ống nghiệm. Làm bay hơi dung môi trong ống nghiệm trên bếp cách thủy, tốt nhất là dưới luồng khí nitơ nhẹ. Sau đó hòa tan lượng cặn thu được bằng 2,5m l hỗn hợp B. Đậy kín ống nghiệm để chạy sắc ký bản mỏng.
T iê n h à n h c h ấ m sắ c kỷ:
Trước khi chấm sắc ký phải cọ sạch lớp silicagen ở cạnh đáy và hai cạnh bên của bản sắc ký để tránh hiện tượng mao dẫn. Dùng bút chì và thước kẻ đánh dấu vạch xuất phát cách mép dưới của bản mỏng 2,5em. Dùng micropipet chấm 5 điểm
PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ BẢN MỎNG 37
đung địch mẫu thử và dung dịch chuẩn, các điểm cách mép của bản sắc ký và cách nhau 2,5cm. Mỗi lần chỉ chấm khoảng 1)4ỉ để đường kính của mỗi vết chấm không quá 0,5cm. Chấm xong một chấm phải làm khô bằng máy sấy tóc rồi mới chấm tiếp cho đến khi chấm hết lượng dung dịch cần phải chấm.
Chấm các vết theo thứ tự từ trái sang phải như sau: - 2,5\d dung địch saccharine chuẩn
- 5|Jỉ dung dịch saccharine chuẩn - 5jj1 dung dịch chiết của mẫu thử
- 5ụl dung dịch chiết của mẫu thử đã được pha loãng gấp đôi bằng hỗn hợp dung dịch B
- 1 0|ii đung dịch saccharine chuẩn
- Chấm xong đê bản mỏng khô trong không khí. T iê n h à n h ch ạ y sắ c hý:
Dùng một tờ giấy lọc đã được tẩm ướt bằng dung môi chạy sắc ký (dung môi A) phủ xung quanh thành bình phía trong, sau đó đổ dung môi A vào bình tới độ cao 1 cm. Đậy kín nắp bình và để yên trong 30 phút để có được trạng thái bão hồa dung môi trong bình.
Đặt bản mỏng sắc ký đã chấm mẫu và được làm khô vào bình, đậy nắp lại để
khí quyển trong bình luôn được bão hòa dung môi.
Khi mức đung môi trên bản mỏng đạt độ cao 10cm (sau khoảng 1 giờ), nhấc
bản mỏng ra, đánh dấu chính xác mức dung môi và làm bay hơi dung môi cho tới
khi không nhìn thấy vạch (khoảng 10 phút).
Quan sát bản sắc ký dưới ánh đèn tử ngoại có bước sóng 254nm và khoanh vùng vết saccharine phát huỳnh quang (Rf s 0,5).
Đ á n h g iả sắ c k ỷ đồ:
Đo khoảng cách di chuyển của vệt dung môi và của vết saccharine, tính toán Rf. Đối chiếu so sánh sắc ký đồ của mẫu thử với mẫu saccharine chuẩn về giá trị Rf và cường độ huỳnh quang. Nếu giống nhau thì kết luận: sắc ký đồ đó là của hai chất giống nhau.