Universidade Federal de Santa Maria
Centro de Ciências Naturais e Exatas
Programa de Pós-graduação em Bioquímica Toxicológica
A Comissão Examinadora, abaixo assinada, aprova a Tese de Doutorado
ALTERAÇÕES COMPORTAMENTAIS E NEUROQUÍMICAS
CAUSADAS POR COMPOSTOS ORGÂNICOS DE SELÊNIO
elaborada por
Gabriele Cordenonzi Ghisleni
como requisito parcial para obtenção do grau de
Doutor em Bioquímica Toxicológica
COMISSÃO ORGANIZADORA:
____________________________________________________
Profº Dr. Diogo Onofre Gomes de SouzaPresidente/ Orientador
____________________________________________________________ Profº Dr. Carlos Alberto Saraiva Gonçalves (UFRGS)
____________________________________________________________ Profª Dra. Susana Tchernin Wofchuk (UFRGS)
____________________________________________________________ Profº Dr. Félix Antunes Soares (UFSM)
____________________________________________________________ Profº Dr. Marcelo Farina (UFSC)
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA MARIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOQUÍMICA
TOXICOLÓGICA
ALTERAÇÕES COMPORTAMENTAIS E
NEUROQUÍMICAS CAUSADAS POR COMPOSTOS
ORGÂNICOS DE SELÊNIO
TESE DE DOUTORADO
Gabriele Cordenonzi Ghisleni
Santa Maria, RS, Brasil
2006
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA MARIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOQUÍMICA
TOXICOLÓGICA
ALTERAÇÕES COMPORTAMENTAIS E
NEUROQUÍMICAS CAUSADAS POR COMPOSTOS
ORGÂNICOS DE SELÊNIO
Gabriele Cordenonzi Ghisleni
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Bioquímica
Toxicológica, Área de Concentração em Bioquímica Toxicológica, da
Universidade Federal de Santa Maria (UFSM, RS), como requisito parcial à
obtenção do grau de
Doutor em Bioquímica Toxicológica.
Orientador: Prof. Dr Diogo Souza
Santa Maria, RS, Brasil
2006
É muito melhor arriscar coisas grandiosas, alcançar triunfos e glórias, mesmo expondo-se à derrota, do que formar fila com os pobres de espírito, que nem gozam e nem sofrem muito, porque vivem nessa penumbra cinzenta que não conhece vitória nem derrota. (Theodore Roosevelt)
AGRADECIMENTOS
Ao Diogo, primeiramente pela disponibilidade, confiança e pelas portas abertas em seu laboratório para o desenvolvimento desta tese. Por ter permitido gozar da sua adorável companhia, pelas grandes lições de vida e aprendizado ao longo destes anos. Além disso, agradeço ao Diogo pelo seu lado pai, amigo, companheiro de festas e orientador para todas as horas.
A Lisi, exatamente por tudo, desde a minha vinda para Bioquímica. Pelos ensinamentos, confiança, dedicação, ajuda e pela grande amizade, dentro e fora do laboratório. Obrigada por todo apoio e companheirismo.
A minha maravilhosa família, pela dedicação, incentivo e amor. Em especial à minha mãe, que nunca me deixou desistir de seguir em frente.
Ao João Batista, que descobri ao longo do doutorado que não era um bicho de sete cabeças, e sim uma grandiosa contribuição.
Aos meus fiéis amigos desde a época da faculdade, Jean, Dani e Gabi, pela amizade e por grandes momentos da minha vida, inclusive pela minha vinda a Bioquímica.
A Vanessa, pela grande amizade que se construiu durante estes últimos anos, pela cumplicidade e ajuda nos trabalhos de comportamento.
A Ana e Renata, pelos bons momentos, apoio e amizade, sem esquecer é claro dos momentos de desabafo.
Ao Ganzella, pela ajuda, parceria de bancada, amizade e descontração.
A todo o pessoal do laboratório pelo ótimo convívio e clima de trabalho, sem contar dos diversos momentos de descontração.
Ao Roska, Dioguinho e André, pela divertida convivência, apoio e carinho.
Ao pessoal dos demais laboratórios com quem interagi durante o doutorado, e que de certa forma contribuíram para este trabalho.
A duas pessoas fundamentais e insubstituíveis, Cléia e Angélica, pela disposição e ajuda. Ao pessoal do ratário sempre solícito e onde sempre obtive compreensão e animais para a realização dos experimentos.
RESUMO
ALTERAÇÕES COMPORTAMENTAIS E NEUROQUÍMICAS DE COMPOSTOS ORGÂNICOS DE SELÊNIO
Autor: Gabriele Cordenonzi Ghisleni
Os compostos orgânicos de selênio, ebselen e disseleneto de difenila (PhSe)2, são
considerados como miméticos da enzima glutationa peroxidase e apresentam propriedades antioxidantes e antiinflamatórias em diversos modelos de injúria celular. Tendo presente que as ações farmacológicas do (PhSe)2 parecem ser mais proeminentes do que seu análogo
ebselen, o presente estudo foi delineado para avaliar o efeito deste composto na morte celular e na detecção do imunoconteúdo da enzima oxido nítrico sintase induzível em um modelo de deprivação de glicose e oxigênio em fatias de hipocampo de ratos. Observamos que a ação neuroprotetora do composto (PhSe)2 foi correlacionada com a supressão do
imunoconteúdo da enzima oxido nítrico sintase induzível, visto que as concentrações do composto que apresentaram proteção contra a morte celular, também suprimiram o aumento do imunoconteúdo desta enzima. A ação neuroprotetora do (PhSe)2 foi dose
dependente e mais pronunciada do que previamente descrito para o ebselen. Visto que ambos os compostos ebselen e (PhSe)2, são capazes de modular parâmetros da sinapse
glutamatérgica in vivo e in vitro, e que o composto ebselen apresentou efeito neuroprotetor em um modelo de toxicidade provocada pelo glutamato seguido de redução na peroxidação de lipídeos, avaliamos também, neste trabalho, o efeito destes compostos no aumento da atividade de ectonucleotidases pelo glutamato em culturas de neurônios cerebelares de ratos. Foi observado que os compostos de selênio não alteram a atividade de ectonucleotidases, mas previnem a estimulação na hidrólise de ATP e AMP pelo glutamato. Na tentativa de correlacionar o efeito preventivo dos compostos com sua atividade antioxidante, comparou-se o efeito do trolox, um antioxidante clássico descrito na literatura. O trolox de maneira similar aos compostos de selênio também preveniu o aumento na atividade das ectonucleotidases pelo glutamato. Embora o glutamato não tenha desencadeado morte celular 24 horas após a prévia exposição das células a este aminoácido, sugeriu-se que parte da ação do ebselen e (PhSe)2 podem estar relacionadas com suas
propriedades antioxidantes. Inferiu-se ainda que a participação de grupos sulfidrila nos efeitos dos compostos de selênio parece estar envolvida nos seus efeitos neuroprotetores, uma vez que tanto o aumento na hidrólise dos nucleotídeos quando a morte neuronal pelo agente alquilante N-ethylmaleimide (NEM) foram prevenidas tanto pelo ebselen quanto pelo (PhSe)2. A co-incubação de NEM e glutamato não modifica o perfil de morte neuronal
e a estimulação da hidrólise de nucleotídeos, com o ebselen e (PhSe)2 revertendo
parcialmente o aumento da hidrólise para o ATP e a morte celular. Entretanto, ambos compostos foram ineficazes em reverter o aumento na hidrólise do AMP causado pela co-incubação do NEM e glutamato. Portanto, apesar de ambos compostos prevenirem parcialmente a morte celular evidenciada por estes dois agentes citotóxicos co-incubados, a ação do ebselen e (PhSe)2 parece modular diferentemente estas enzimas. Por meio de
estudos comportamentais com a administração intraperitoneal de (PhSe)2, observamos que
este composto não alterou a atividade exploratória dos animais quando avaliados na tarefa do campo aberto. Porém, nesta tarefa, os animais administrados com 50 µmol/kg de (PhSe)2
corresponde a um primeiro índice de ansiedade intrínseca diminuída dos animais quando expostos a um ambiente novo. A partir dessa observação, essa dose mais alta não foi utilizada para os experimentos onde se avalia a consolidação da memória nos animais. Na tarefa de esquiva inibitória houve uma diminuição no desempenho dos animais tratados com 25 µmol/kg de (PhSe)2 apenas para a consolidação da memória de curta duração, pois
esse efeito supostamente amnésico não foi observado na consolidação da memória de longa duração. Apesar dos resultados encontrados na tarefa da esquiva inibitória, os mecanismos envolvidos no efeito amnésico do (PhSe)2 não foram explorados. A partir da diminuição do
número de defecações na arena de campo aberto, os animais foram tratados com 50 µmol/kg de (PhSe)2 e submetidos a tarefa do labirinto em cruz elevado (Plus Maze), para
melhor caracterizar um possível efeito ansiolítico. Foi possível claramente observar que os animais tratados com a dose de 50 µmol/kg, apresentaram um comportamento menos ansioso pela maior permanência nos braços abertos e pelo aumento no número de entradas nestes braços. Esse efeito foi semelhante ao observado com fármacos que classicamente possuem ação ansiolítica como o diazepam. Assim, investigou-se a participação de outros sistemas de neurotransmissores nos efeitos ansiolíticos do (PhSe)2 pela administração de
agonistas e antagonistas do sistema GABAérgico e serotoninérgico. Uma vez que antagonistas para receptores GABAA e 5-HT2A/C reverteram a ação ansiolítica do (PhSe)2,
sugerimos que ambos sistemas de neurotransmissores classicamente envolvidos no comportamento ansiolítico/ansiogênico participam do efeito ansiolítico deste composto.
Palavras chave: disseleneto de difenila, ebselen, sistemas neurotransmissores, ectonucleotidases, ansiedade.
ABSTRACT
BEHAVIORAL AND NEUROCHEMISTRY ALTERATIONS OF SELENIUM ORGANIC COMPOUNDS
Author: Gabriele Cordenonzi Ghisleni
Selenium organic compounds, ebselen and diphenyl diselenide (PhSe)2, are considered
mimics of glutathione peroxidase enzyme and present antioxidants and anti-inflammatory properties in different models of brain injury. In view of the pharmacological actions of (PhSe)2 seem to be more potent than its analogue ebselen, this study was delineated to
evaluate the effect of this compound on cell death and in immunocontent detection of inducible nitric oxide sinthase, in a model of oxygen and glucose deprivation in rat hippocampal slices. We observed that the neuroprotection action of (PhSe)2 was correlated
with the suppression on immunocontent of inducible nitric oxide sinthase enzyme. The neuroprotection action of (PhSe)2 was dose dependent and more pronunciated than its
equivalent compound previously described ebselen. Since both compounds, ebselen and (PhSe)2, are able to modulate some parameters of glutamatergic system in vivo and in vitro,
and the compound ebselen presented neuroprotective effect in a model of glutamate toxicity following redution on lipid peroxidation, we also evaluated in this work, the effect of these compounds on increase of ectonucleotidases activities induced by glutamate in rat cultived cerebellar cells. It was observed that both selenium compounds did not modify the ectonucleotidases activities, but prevent glutamate stimulation on ATP and AMP hydrolysis. In the attempt of correlate the preventive effect of these compounds with their antioxidant activity, we compared the effect of trolox, a classic antioxidant described in literature. Trolox, similarly to selenium compounds, also prevent the increase on ectonucleotidases atictivities induced by glutamate. Although glutamate did not unchain cell death after 24 hours of previous cells exposure to glutamate, it was suggested that part of ebselen and (PhSe)2 action can be related to their antioxidants properties. It was still
inferred that the participation of sulfhidril groups on selenium compounds effects seems to be involved on their neuroprotective effects, a time that as much the increase on nucleotides hydrolysis as the neuronal death for alkylant agent NEM were prevented by both compounds. Co-incubation of NEM and glutamate did not modify the profile of cell death and nucleotides hydrolysis stimulation, with ebselen and (PhSe)2 partially reverting the
increase on ATP hydrolysis and cell death. However, both compounds were ineffective in revert the increase on AMP hydrolysis caused by co-incubation of NEM and glutamate. Although both compounds partially prevent cell death evidenced by co-incubation of these two citotoxics agents, the action of ebselen and (PhSe)2 seems differently modulate these
enzymes. Through behavioral studies with intraperitoneal administration of (PhSe)2, we
observed that (PhSe)2 did not alter the exploratory activity of animals when evaluated on
open field task. However, in this task, animals administered with 50 µmol/kg of (PhSe)2
presented decreased number of defecations, a behavior that correspond at a first index of diminish intrinsic anxiety in animals displayed for a new environment. From these observations, the higher dose of (PhSe)2 was not used in the experiments where
consolidation memory of animals was evaluated. On the inhibitory avoidance task animals treated with 25 µmol/kg of (PhSe)2 had a diminished performance only for consolidation of
consolidation of long-term memory. Although the results found on inhibitory avoidance task, the mechanisms involved on amnesic effect of (PhSe)2 were not explored. From the
diminished number of defecations on open field task, the animals were treated with 50 µmol/kg of (PhSe)2 and submitted to elevated plus maze task for better characterize a
possible anxiolytic effect. It was possible to observe that animals treated with the dose of 50 µmol/kg, presented less anxious behavior for the higher permanency on open arms and for the increase on number of entries in open arms. This effect was similar with classical pharmacological drugs with anxiolytic action as diazepam. Thus, the participation of other neurotransmitter systems was investigated on anxiolytic effects of (PhSe)2 for
administration of agonists and antagonists of GABAergic and serotoninergic system. A time that antagonists for GABAA and 5-HT2A/C receptors reverted the anxiolytic action of
(PhSe)2, we suggest that both classical neurotransmitter systems involved on
anxiolytic/anxiogenic behavior participate of anxiolytic effect of this compound.
Key words: diphenyl diselenide, ebselen, glutamatergic system, purinergic system, anxiety.
LISTA DE FIGURAS.
Artigo I
Figure 1: Effect of diphenyl diselenide on viability of rat
hippocampal slices submitted to oxygen-glucose deprivation.
20
Figure 2: Effect of diphenyl diselenide on immunocontent of
iNOS protein in rat hippocampal slices submitted to oxygen-glucose deprivation.
21
Artigo II
Figure 1: Effect of glutamate on ecto-nucleotidase activities in
cerebellar granule cells.
45
Figure 2: Effect of selenium compounds on glutamate-induced
increase of ectonucleotidases activities. Denotes co-incubation of ebselen and glutamate on ATP and AMP hydrolysis (2a).
46
Denotes co-incubation of (PhSe)2 and glutamate on ATP and
AMP hydrolysis (2b).
46
Figure 3: Effect of glutamate and/or the antioxidant trolox on
ATP and AMP hydrolysis.
47
Figure 4: Effect of the alkylating agent N-ethylmaleimide (NEM)
and/or ebselen or (PhSe)2 on ATP and AMP hydrolysis.
48
Figure 5: Effect of co-incubation with glutamate and NEM and/or
ebselen or (PhSe)2 on ATP and AMP hydrolysis.
49
Figure 6: Cell viability assessed 24 hours after nucleotides
hydrolysis assay by MTT. Denotes cell viability on exposure to glutamate and/or ebselen or (PhSe)2 (6a).
50
Denotes cell viability on exposure to NEM or NEM plus glutamate, and/or ebselen or (PhSe)2 (6b).
50
Artigo III.
Figure 1: Performance of animals treated with (PhSe)2 in the
open field test. Denotes number of crossings (1a).
73 Denotes number of rearings (1b). 73
Denotes number of fecal boli (1c). 74
Figure 2: Effect of (PhSe)2 administered immediately after
training session in a step-down inhibitory avoidance task. Denotes latency to retention test after 1.5 h of training session (2a).
75
Denotes latency to retention test after 24 h of training session
(2b).
75
Figure 3: Effect of (PhSe)2 after 24 hours of treatment in the
elevated plus-maze test. Denotes time spent in open or closed arms (3a).
76
Denotes number of entries in open or closed arms (3b). 76
Figure 4: Pharmacological manipulation of pentylenetetrazol
(PTZ), diazepam (DZP) and/or (PhSe)2 in the elevated plus-maze
test.
77
Figure 5: Effects of ritanserin and/ or (PhSe)2 in the elevated
plus-maze test.
78
Resultados preliminares
Figura 1: Níveis de lactato no liquor de ratos injetados com uma
única injeção intraperitoneal de ebselen e disseleneto de difenila após 48 horas do tratamento.
91
Figura 2: Níveis da proteína S100B no liquor de ratos injetados
com uma única injeção intraperitoneal de ebselen e disseleneto de difenila após 48 horas do tratamento.
91
Figura 3: Medida da atividade de ectonucleotidases em fatias de
hipocampo de ratos tratados com uma única injeção de ebselen e disseleneto de difenila após 48 horas de tratamento (3a,b)
92
Figura 4: Imunoconteúdo da proteína pré-sináptica SNAP 25 e do
transportador vesicular de glutamato VGLUT1 em fatias hipocampais de ratos tratados com uma única injeção de ebselen e disseleneto de difenila após 48 horas de tratamento (4a,b)
LISTA DE TABELAS.
Artigo II
Tabela 1- Effect of ebselen and diphenyl diselenide on ATP and
AMP hydrolysis in cultured cerebellar granule neuron.
42
Artigo III
Tabela 1- Effects of diazepam (DZP) or pentylenetetrazol (PTZ) on
the anxiolytic-like effect by 50 µmol/ kg diphenyl diselenide in the elevated plus maze.
69
Tabela 2- Effects of ritanserin on the anxiolytic-like effect by 50
µmol/ kg diphenyl diselenide in the elevated plus maze.
APRESENTAÇÃO
Os resultados que fazem parte desta dissertação estão apresentados sob a forma de artigo, o qual encontra-se no item ARTIGO CIENTÍFICO. As seções Materiais e
Métodos, Resultados, Discussão dos Resultados e Referências Bibliográficas, encontram-se no próprio artigo e representam a íntegra deste estudo.
Os itens DISCUSSÃO E CONCLUSÕES, encontrados no final desta dissertação, apresentam interpretações e comentários gerais sobre os artigos científicos contidos neste trabalho.
As REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS referem-se somente às citações que aparecem nos itens INTRODUÇÃO, REVISÃO BIBLIOGRÁFICA, DISCUSSÃO
SUMÁRIO
AGRADECIMENTOS iv RESUMO v ABSTRACT vii LISTA DE FIGURAS ix LISTA DE TABELAS xi APRESENTAÇÃO xii Capítulo I. Introdução I.1- Introdução 1Capítulo II. Revisão Bibliográfica 4 II.1- Selênio 5
II.1.1- A descoberta do selênio 5
II.1.2- O selênio em sistemas biológicos 6 II.1.3- Compostos orgânicos de selênio 7
II.1.3.1- Ebselen 8
II.1.3.2- Disseleneto de difenila (PhSe)2 9
II.2- Sistemas Neurotransmissores 10 II.2.1- Glutamato e seus receptores 10
II.2.2- GABA 11
II.2.3- Serotonina 12
II.3- Ectonucleotidases 13
II.4- Objetivos gerais 16
Capítulo III. Artigo I 18
Ghisleni, G., Porciúncula, L.O., Cimarosti, H., Rocha, J.B.T., Salbego, C.G., Souza, D.O. Diphenyl diselenide protects rat hippocampal slices submitted to oxygen-glucose deprivation and diminishes inducible nitric oxide synthase immunocontent. Brain Research 986: 196-199 (2003).
Capítulo IV. Artigo II 23 Ghisleni, G., Porciúncula, L.O., Boeck, C.R.,
Rocha, J.B.T., Souza, D.O. Selenium compounds counteract the increase of ectonucleotidases activities in rat cultured cerebellar granule cells: putative correlation with neuroprotective effects. Submetido.
24
Capítulo V. Artigo III 51
Ghisleni, G., Kazlauckas, V., Both, F.L., Pagnussat, N., Rocha, J.B.T., Souza, D.O., Porciúncula, L.O. Anxiolytic-like effect of diphenyl diselenide involves GABAA and
serotonin receptors. Submetido.
52
Capítulo VI. Discussão geral 79
Capítulo VII. Conclusões 86
Capítulo VIII. Resultados preliminares e perspectivas 88
CAPÍTULO I
I. Introdução.
O selênio é um elemento traço nutricionalmente essencial para os mamíferos. Na forma de selenocisteína, este micronutriente se torna constituinte do sítio ativo de muitas enzimas antioxidantes, como a glutationa peroxidase, fosfolipídeo hidroperóxido glutationa peroxidase, tioredoxina redutase e seleneproteína P (Flohe et al., 1973; Rotruck et al., 1973; Chen e Berry, 2003). Estudos epidemiológicos têm demonstrado que a deficiência de selênio na dieta, está diretamente associada à gênese e/ou progressão de patologias como distúrbios cardiovasculares, neurológicos, infecções virais, câncer e de humor (Ge e Yang, 1993; Benton, 2001; Navsariwala et al., 2006; Hill et al., 2004; Beck et al., 2003). A descoberta das propriedades farmacológicas dos compostos orgânicos de selênio bem como sua menor toxicidade em relação as espécies inorgânicas, tem despertado interesse para a síntese de novos compostos orgânicos que apresentem potencial terapêutico. Em especial, os compostos orgânicos de selênio, ebselen e disseleneto de difenila - (PhSe)2, têm sido
investigados pois simulam a ação catalítica da enzima glutationa peroxidase (Müller et al., 1984; Wilson et al., 1989). Estes compostos apresentam propriedades farmacológicas benéficas que incluem ações como antioxidantes e antiinflamatórios, prevenindo o dano celular em diversos modelos de injúrias (Porciúncula et al., 2001; Rossato et al., 2002a; Porciúncula et al., 2003; Nogueira et al., 2003a).
O estresse oxidativo e o aumento na formação de espécies reativas de oxigênio estão fortemente implicados em patologias do sistema nervoso central (SNC) tais como: acidente vascular cerebral, doença de Alzheimer, doença de Parkinson e epilepsia (Facchinetti et al., 1998; Pràtico, 2002; Pràtico & Sung, 2004; Schapira, 2006; Liang & Patel, 2006). Dessa forma um balanço adequado entre a produção de espécies reativas de oxigênio e a ação das defesas antioxidantes endógenas é de extrema importância para a integridade do sistema nervoso central, o qual por possuir menor expressão de enzimas antioxidantes e alto conteúdo lipídico é um dos tecidos mais vulneráveis aos efeitos deletérios do estresse oxidativo (Ullegaddi et al., 2005; Sultana et al., 2006; Arlt et al., 2002)
Embora o selênio possa apresentar efeitos neuroprotetores tanto em humanos quanto em modelos experimentais de patologias associadas ao SNC, como parte do sítio ativo de enzimas antioxidantes, este elemento também é reconhecido pela sua toxicidade quando administrado em altas doses. Dentre os mecanismos propostos para a toxicidade do selênio
alguns estudos sugerem que ele possa exercer uma ação pró-oxidante pois altas concentrações podem oxidar grupamentos sulfidrila endógenos e aumentar a formação de radicais livres (Stewart et al., 1999; Nogueira et al., 2003b).
Neste sentido, considerando que os compostos de selênio, ebselen e (PhSe)2, têm
sido descritos pelos seus efeitos na proteção e toxicidade em sistema nervoso central, estudos da interação destes compostos com diferentes sistemas neurotransmissores bem como possíveis mecanismos de ação, podem ajudar no esclarecimento da farmacologia destes compostos.
CAPÍTULO II
II.Revisão bibliográfica.
II.1 - Selênio
II.1.1 – A descoberta do selênio e sua utilização.
O elemento selênio foi descoberto em 1817 pelo químico sueco Jöns Jacob Berzelius e seu nome foi dado em homenagem à Selena, deusa grega da lua, devido a sua coloração. O selênio é um elemento traço pertencente ao grupo 16 da tabela periódica, apresentando-se em três formas alotrópicas incluindo selênio cinza, vermelho e preto, e ocorre em quatro estados de oxidação: seleneto (Se-2), selênio elementar (Se0), selenito (Se+4) e selenato (Se+6). Na forma elementar o selênio é um semicondutor, e na forma alotrópica cinza é sensível à luz. Por estas características o selênio exibe propriedade de transformar energia luminosa diretamente em energia elétrica, e dessa forma tem sido utilizado extensivamente como células fotoelétricas, fotômeros e células solares. Além destas aplicações, sua utilização se encontra na fabricação de vidros, nos processos de reprodução xerográfica, catalisador e como suplemento alimentar. O selênio compartilha propriedades químicas e físicas com o enxofre. Esta similaridade permite que o selênio substitua o enxofre, promovendo interações selênio-enxofre nos sistemas biológicos. Por outro lado, as diferenças nas propriedades físico-químicas entre selênio e enxofre constituem a base de seus papéis biológicos específicos (Ursini e Bindoli, 1987).
II.1.2- O selênio em sistemas biológicos.
O selênio ocorre naturalmente no ambiente, distribuído irregularmente pelo solo e encontrado nas rochas sedimentares das regiões mais áridas. No ano de 1930, o selênio foi reconhecido como uma substância tóxica quando animais que se alimentaram de plantas com grande potencial de acumular este elemento, apresentaram sintomas de envenenamento. Foi em 1957 que Schwarz e Foltz identificaram o selênio como um micronutriente essencial para bactérias, mamíferos e pássaros. Além disso, sua identificação como parte do sítio ativo da glutationa peroxidase, uma enzima antioxidante de mamíferos, permitiu que outras selenoproteínas fossem identificadas (Rotruck et al., 1973; Flohé et al., 1973; Flohé et al., 2000). Estes fatos deram início à busca por compostos orgânicos e inorgânicos de selênio, e seus efeitos foram estudados pela administração em animais. No entanto, durante muitos anos os problemas na purificação, o odor desagradável
e a instabilidade de muitos compostos dificultaram sua síntese. Além disso, a síntese de compostos orgânicos de selênio aumentou consideravelmente devido à menor toxicidade dos compostos orgânicos em relação aos inorgânicos, embora muitos deles ainda não tenham sido testados biologicamente (Klayman e Günter, 1973). Nas últimas décadas estudos de síntese têm sido direcionados para o desenvolvimento de compostos orgânicos de selênio mais estáveis que possam ser usados como antioxidantes, inibidores enzimáticos, agentes anti-tumorais e antiinfecciosos, bem como imunomoduladores (Müller et al., 1984; Wendel et al., 1984; Wilson et al., 1989; Sies e Matsumoto, 1997; Mugesh et al, 2001). Dentre estes, o desenvolvimento de novos compostos que possuam atividade catalítica sendo capazes de atuar como enzimas, tem merecido maior destaque.
De fato, alguns compostos orgânicos de selênio já consolidaram o elemento como um antioxidante por mimetizar as ações da glutationa peroxidase, reduzindo peróxido de hidrogênio, hidroperóxidos lipídicos e fosfolipídicos. Além das suas propriedades antioxidantes, os compostos orgânicos de selênio também apresentaram propriedades antiinflamatórias por reduzir hidroperóxidos intermediários formados na via da cicloxigenase e lipoxigenase, diminuindo a produção de prostaglandinas e leucotrienos (Spallholz et al., 1990; Rayman 2000).
O selênio entra na cadeia alimentar através das plantas, que o absorvem do solo. Sua importância como elemento essencial na dieta foi reconhecida após a descoberta da doença de Keshan, uma cardiopatia infantil com alta incidência em algumas regiões da China onde o solo é extremamente pobre em selênio (Ge e Yang, 1993). O consumo diário de selênio varia entre 100 a 200 µg/ dia, podendo ser encontrado nos seguintes alimentos: castanha-do-pará, alho, cebola, brócolis, cogumelos, cereais, pescados, ovos e carnes (Dumont et al., 2006; Reilly, 1996). As espécies de selênio estão distribuídas no organismo em diferentes órgãos, sendo que grandes quantidades deste elemento estão presentes em ordem de concentração: nos rins, fígado, baço,músculo cardíaco, pulmão e cérebro (Dumont et al., 2006). Apesar da concentração de selênio cerebral não se apresentar elevada, este órgão é o único que mantém um suplemento adequado em caso de deficiência do elemento.
A ingestão adequada de selênio também pode prevenir o surgimento de alguns tipos de câncer e infecções graves, pois alguns estudos prospectivos demonstraram que a suplementação de selênio na dieta foi associada à redução na incidência de câncer da
próstata, pulmão e coloretal e na prevenção de infecções virais como o HIV (Patrick, 2004; Clark et al., 1998;Knekt et al., 1998; Kupka et al., 2004; Broome et al., 2004).
O selênio também exerce influência em patologias associadas aos transtornos de humor, uma vez que a carência de selênio parece levar a um estado de humor mais deprimido (Hawkes e Hornbostel, 1996) e o aumento no consumo deste elemento estabiliza o humor e diminui o estado depressivo e outros sintomas negativos do humor como ansiedade, confusão e hostilidade (Benton e Cook, 1991, Finley e Penland, 1998). No que diz respeito às doenças associadas ao envelhecimento, observou-se que níveis séricos baixos de selênio foram associados à aceleração do declínio cognitivo no decorrer da idade (Savarino et al., 2001; Akbaraly et al., 2005). Essas observações corroboram com as alterações metabólicas decorrentes da idade avançada tais como a diminuição na absorção de micronutrientes, incluindo o selênio. Desta forma, as defesas antioxidantes endógenas começam a diminuir e dada a susceptibilidade do cérebro ao estresse oxidativo juntamente com a predisposição genética, surgem as doenças decorrentes do envelhecimento.
II.1.3- Compostos orgânicos de selênio.
Os compostos orgânicos de selênio, ebselen e disseleneto de difenila (PhSe)2, têm
merecido destaque na literatura desde a década de 80 principalmente por serem miméticos da enzima glutationa peroxidase (Müller et al., 1984; Wendel et al., 1984; Wilson et al., 1989). Desde então, outras propriedades farmacológicas benéficas foram descobertas tais como suas ações como antiinflamatórios e antinociceptivos (Parnham et al., 1991; Nogueira et al, 2003a), crescendo enormemente o número de estudos onde estes compostos exercem proteção nos mais diversos tipos celulares para os mais diversos tipos de injúria. Concomitantemente a esses estudos, o risco de contaminação ocupacional por compostos de selênio tem motivado pesquisas voltadas ao entendimento dos seus efeitos tóxicos.
Alguns estudos mostram que a toxicidade do ebselen e (PhSe)2 são bastante
similares, dependendo no entanto, da via de adiministração e do modelo animal utilizado (Meotti et al., 2003; Nogueira et al., 2003b). Entretanto, quando administrados em doses farmacológicas, ambos os compostos apresentam baixa toxicidade tanto para ratos como para camundongos (Nogueira et al., 2004).
II.1.3.1- Ebselen
O ebselen, por suas propriedades antioxidantes e antiinflamatórias, além da baixa toxicidade, tem sido estudado na prevenção e proteção celular contra os mais diversos tipos de injúria, utilizando-se de modelos animais, experimentos in vitro e inclusive estudos em humanos. O ebselen apresentou importantes efeitos como antioxidante na redução da peroxidação de lipídeos e pelas reações com grupos sulfidrílicos (–SH) em diferentes tecidos (Sies e Arteel, 2000; Rossato et al., 2002b; Davis et al., 2004; Nowak et al., 2006). Além disso, a ação antiinflamatória deste composto foi demonstrada pela inibição de algumas enzimas envolvidas no processo inflamatório e pela redução da síntese e liberação de citocinas pró-inflamatórias (Parnham et al., 1991; Haddad et al., 2002; Walther et al., 1999). O ebselen inibe in vivo a formação de leucotrienos sintetizados pela via da lipoxigenase 5, e em granulócitos inibe a atividade da proteína kinase C (PKC) e da NADPH oxidase (Schewe et al., 1994; Cotgreave et al., 1989). O ebselen também inibiu in
vivo e in vitro a enzima óxido nítrico sintase induzível (iNOS), isoforma da óxido nítrico
sintase que torna-se ativa nos processos inflamatórios (Hattori et al., 1994; Porciúncula et al., 2003).
Este composto apresenta efeitos protetores em diversos modelos de isquemia tais como: cerebral, cardíaca, hepática e em um modelo in vitro, pela privação de glicose e oxigênio (Osaki et al., 1997; Takasago et al., 1997; Maulik et al., 1998; Imai et al., 2001; Porciúncula et al., 2003). O ebselen apresentou neuroproteção em pacientes que sofreram acidente vascular cerebral isquêmico em um ensaio clínico de fase III (Yamaguchi et al., 1998), e além disso quando administrado em humanos, diminuiu os déficits neurológicos provocados por hemorragia de aneurisma subaracnóide (Saito et al., 1998).
Recentemente, estudos têm investigado a habilidade deste composto na supressão de enzimas envolvidas no processo apoptótico e vias de sinalização, colaborando para a elucidação de outros mecanismos que possam estar envolvidos nas propriedades farmacológicas do ebselen (Yoshizumi et al., 2002, 2004; Xu et al., 2006). Em estudos in
vitro com tecidos e células do SNC o ebselen apresentou efeito protetor contra a
excitotoxidade provocada pelo glutamato, bem como demonstrou alterar alguns parâmetros do sistema glutamatérgico (Porciúncula et al., 2001; Nogueira et al., 2002; Porciúncula et al., 2004). Além disso, Herin et al. (2001) sugeriu que o efeito neuroprotetor do ebselen em
injúrias provocadas pelo glutamato e seus agonistas, pode ser em parte devido a sua direta interação com o sítio modulatório redox do receptor de glutamato do tipo N-metil-D-aspartato (NMDA). No entanto, este composto quando administrado por infusão direta na região CA1 do hipocampo prejudica a perfomance dos animais na tarefa de esquiva inibitória, sugerindo que o ebselen pode prejudicar os processos de aquisição, consolidação e evocação da memória (Porciúncula et al., 2002).
II.1.3.2- Disseleneto de difenila (PhSe)2
O composto (PhSe)2 é empregado como intermediário em síntese orgânica,
apresentando síntese mais barata e rentável que seu análogo ebselen (Zeni et al., 2003). Embora este composto tenha recebido menor destaque, seus possíveis efeitos como antioxidante e antiinflamatório, tem apresentado maior potência farmacológica do que o ebselen (Wilson et al., 1989; Rossato et al., 2002a; Nogueira et al., 2003a). O (PhSe)2 tem
apresentado pronunciada ação como antioxidante, na redução da peroxidação de lipídeos provocada por diversos agentes e em diferentes tecidos (Nogueira et al., 2004; Rossato et al., 2002a; Santos et al., 2004; Posser et al., 2006; Borges et al., 2006). Além disso, a administração aguda deste composto em ratos e camundongos, apresentou uma atividade antiinflamatória e antinociceptiva mais potente do que seu análogo ebselen (Nogueira et al., 2003a).
Em modelos experimentais de injúria no sistema periférico, o (PhSe)2 foi eficaz na
redução de lesões hepáticas provocadas por 2-nitropropano, preveniu o aumento na atividade de enzimas plasmáticas marcadores de lesão hepática e restaurou a atividade de enzimas antioxidantes como a catalase e superóxido dismutase (Borges et al., 2005, 2006). Recentes estudos demonstraram ainda que este composto previne o dano oxidativo induzido por nitroprusiato de sódio em plaquetas humanas e, diferentemente do composto ebselen, o (PhSe)2 foi capaz de reverter as alterações causadas na indução de diabetes,
demonstrando uma propriedade anti-diabetogênica (Posser et al., 2006; Barbosa et al., 2006).
Alguns estudos, entretanto, relatam que altas doses deste composto, quando administradas de forma crônica e aguda, levam a deposição de selênio no fígado, rim e cérebro, chamando a atenção para o potencial tóxico do composto (Jacques-Silva et al.,
2001; Maciel et al., 2003). Através destes estudos se pode observar que (PhSe)2 é capaz de
desencadear danos cerebrais em camundongos. O composto (PhSe)2 demonstrou ainda
afetar alguns parâmetros do sistema glutamatérgico em cérebro de ratos in vivo e in vitro (Nogueira et al., 2001), e em ensaios in vitro com plaquetas humanas (Borges et al., 2004). O efeito agudo da toxicidade por (PhSe)2 foi investigado pelo potencial de indução de
convulsões em camundongos, nos quais a modulação de sistemas neurotransmissores, em especial moduladores do sistema GABAérgico, preveniram as convulsões (Nogueira et al., 2003b). Recentes estudos mostraram ainda que em altas doses este composto orgânico de selênio acelera o início das convulsões induzidas por pentilenotetrazol (PTZ), um antagonista GABAA, e aumenta a incidência de morte nestes animais (Britto et al., 2006).
Estes resultados indicam evidências da modulação pelo (PhSe)2 de diferentes sistemas de
neurotransmissores em SNC de ratos.
II.2- Sistemas neurotransmissores
II.2.1- Glutamato.O aminoácido glutamato é o principal neurotransmissor do SNC de mamíferos. O glutamato está envolvido em diversas funções cerebrais tais como cognição, aprendizado e memória e na formação de redes neurais durante o desenvolvimento (Izquierdo e Medina, 1997; Ozawa et al., 1998; Castellano et al., 2001). Alguns estudos têm avaliado o envolvimento do sistema glutamatérgico na ansiedade. Neste sentido, estudos com antagonistas de receptores glutamatérgicos têm demonstrado eficácia pela ação ansiolítica em diferentes modelos animais (Jessa et al., 1996; Fraser et al., 1996). No entanto, Olney e colaboradores (1970,1978) observaram que altas doses de glutamato e seus agonistas provocavam dano, e até mesmo morte celular, introduzindo na literatura o termo excitotoxicidade para a morte neuronal provocada pela estimulação excessiva de receptores glutamatérgicos.
Os receptores glutamatérgicos estão categorizados em duas classes distintas: receptores ionotrópicos e metabotrópicos (Osawa et al., 1998). Os receptores ionotrópicos (iGluR) são assim denominados, pois são canais que permitem a passagem de um cátion específico quando ativados por um agonista (Ozawa et al., 1998) e foram subdivididos em N-metil-D-aspartato (NMDA), α-amino-3-hidróxi-5-metil-4-isoxazol-ácido propiônico
(AMPA) e ácido caínico (KA), de acordo com a sensibilidade a estes agonistas. Os receptores metabotrópicos (mGluR) pertencem a uma família de receptores que estão acoplados às proteínas ligantes de nucleotídeos da guanina (proteínas G), promovendo então a modulação de efetores intracelulares que por sua vez ativam e/ou inibem diversos eventos de transdução de sinal (Conn e Pin, 1997; Osawa et al., 1998).
O glutamato, após ser liberado para o espaço extracelular, e realizar sua ação via seus receptores, é removido da fenda sináptica principalmente por sistemas de transporte que são dependentes de sódio, localizados nos neurônios e principalmente nas células gliais (Anderson e Swanson, 2000; Danbolt, 2001; Amara e Fontana, 2002). A atividade de alguns receptores de glutamato, em especial o receptor ionotrópico do tipo NMDA, e alguns mecanismos de captação de neurotransmissores são regulados pelo seu estado redox (Gozlan e Ben-Ari, 1995; Trotti et al., 1997; Tang e Aizenman, 1993). Um aumento nas concentrações de glutamato na fenda sináptica leva à estimulação excessiva dos receptores glutamatérgicos, desencadeando uma cascata de eventos intracelulares que incluem aumento na produção de espécies reativas de oxigênio, diminuição nos níveis de enzimas antioxidantes e maior influxo de cálcio e sódio (Lafon-Cazal et al., 1993; Reynolds e Hastings, 1995; Singh et al., 2003; Lipton e Rosenberg, 1994). Alguns estudos têm demonstrado que o tratamento com compostos de selênio restabelece o nível e a atividade de enzimas antioxidantes, reduz a peroxidação de lipídeos e previne a morte celular em modelos de toxicidade pelo glutamato e seus agonistas (Porciúncula et al., 2001; Savaskan et al., 2003).
II.2.2- GABA
O ácido γ-amino-butírico (GABA), principal neurotransmissor inibitório do SNC adulto é indispensável para o controle de funções do SNC como atividade locomotora, aprendizado e ritmo circadiano (Varju et al., 2001). O GABA é responsável pelo tônus inibitório que contrabalança a excitação neuronal. Episódios convulsivos podem ocorrer pela perturbação nesse balanço inibitório/excitatório (Treiman et al., 2001). O GABA pode ser liberado do terminal pré-sináptico pelas vesículas sinápticas, um processo que é dependente de cálcio e estimulado por altas concentrações de potássio. Esse neurotransmissor pode ainda ser liberado pelo transporte reverso, um processo
independente de cálcio e secundário à despolarização da membrana celular e influxo de sódio (Treiman et al., 2001). A ação do GABA após liberação dos terminais pré-sinápticos ocorre em receptores ionotrópicos e metabotrópicos, e termina pela sua rápida recaptação via transportadores Na+/Cl- dependentes, ligados a membranas pré e pós-sinápticas de neurônios e também de células gliais (Minelli et al., 1995, 1996).
A ação inibitória do GABA é mediada via a ativação de receptores específicos. Dentre eles, os receptores ionotrópicos GABAA são constituídos de um complexo de
estrutura hetero-oligômera, cujas subunidades formam um canal de cloreto, o qual, ao aumentar o influxo, hiperpolariza o neurônio. Estes receptores medeiam a resposta inibitória rápida e apresentam sítios de ligação para GABA, benzodiazepínicos, barbitúricos, neuroesteróides, picrotoxina e etanol (Korpi et al., 2002). Os subtipos de receptores GABAA são formados por diferentes combinações de subunidades, cuja
expressão em diferentes células e regiões de cérebro e propriedades farmacológicas variam (Korpi et al., 2002). Já os receptores GABAB ligados a proteína G, hiperpolarizam o
neurônio aumentando a condutância de potássio e diminuindo o influxo de cálcio, desencadeando assim, um efeito inibitório lento. Este receptor é ativado com baixas concentrações de neurotransmissor, e, portanto agonistas de receptor GABAB, sob certas
circunstâncias, podem ser anticonvulsivantes (Veliskova et al., 1996). A função de cada receptor ainda não está claramente estabelecida, mas muitos estudos têm apontado para a importância de algumas subunidades, por exemplo, na regulação da ansiedade e efeitos colaterais de benzodiazepínicos (Rudolph et al., 1999; Low et al., 2000; Gulinello et al., 2001).
II.2.3- Serotonina.
O sistema serotoninérgico está envolvido em uma ampla variedade de funções fisiológicas e comportamentais como o humor, memória, aprendizado, agressão, resposta ao estresse, sono e termoregulação (Buhot et al., 2000; Ressler e Nemeroff, 2000; Struder e Weicker, 2001a; 2001b). A disfunção na neurotransmissão serotoninérgica em várias regiões cerebrais, tem sido relacionada ao desenvolvimento da depressão e ansiedade (Wrase et al., 2006).
As múltiplas ações da serotonina (5-HT) são explicadas pela sua interação com mais de um subtipo de receptor. Atualmente, os receptores para a serotonina foram classificados em sete famílias (5-HT1-7), sendo que algumas classes são ainda dispostas em subclasses estruturalmente e farmacologicamente distintas (Barnes e Sharp, 1999). A grande maioria dos receptores de serotonina são metabotrópicos, atuando em proteínas G e estimulando atividade de fosfolipase e adenilato ciclase, dependendo do subtipo de receptor. Entre os receptores de serotonina, em especial os 5-HT1A, 2A e 2C, têm sido extensivamente estudados pelo envolvimento destas subunidades na regulação do humor e ansiedade (Toth, 2003; Van Oekelen et al., 2003). A ativação dos receptores 5-HT1A, via proteína G sensível à toxina pertussis, decorre na inibição da adenilato ciclase ou pela abertura de canais de potássio que dessa forma inibem o disparo neuronal (Hensler, 2003). Por outro lado, a ativação dos receptores 5-HT2A e 5-HT2C acoplados à proteína G para fosfolipase C e A2, aumentam o acúmulo de fostato inositol e Ca2+ intracelular, levando a excitação celular (Van Oekelen et al., 2003).
Estudos farmacológicos têm esclarecido o papel destes receptores em diversos distúrbios psiquiátricos. Neste contexto, agonistas do receptor 5-HT1A e antagonistas dos receptores 5-HT2A e 5-HT2C, demonstraram propriedades como antidepressivos (Blier et al., 1997; Palvimaki et al., 1996). Fármacos que atuam em receptores HT1A, HT2A, 5-HT2C têm sido revelados em modelos comportamentais condicionados (Bourin e Hascoet, 2001) por suas propriedades como ansiolíticos. No entanto, dados na literatura sobre a função destes receptores no tratamento da ansiedade, ainda são contraditórios.
II.3- Ectonucleotidases.
A concentração de nucleotídeos presente em um determinado meio biológico é o resultado do equilíbrio existente entre a liberação destes nucleotídeos e seu metabolismo através de nucleotidases apropriadas.
Uma vez liberado, o ATP pode interagir com receptores P2 (Burnstock e Williams,
2000), ser degradado até adenosina ou servir como substrato para ecto-quinases, durante o fenômeno de plasticidade sináptica (Vizi e Sperlagh, 1999). Os receptores P2 estão
envolvidos na modulação da maioria das ações induzidas pelo ATP, incluindo os efeitos sobre a transmissão sináptica (Inoue et al., 1992; Inoue, 1998), podendo ser classificados
em duas famílias: receptores P2X e P2Y. Os receptores P2X atuam comocanais ionotrópicos
ativados por ATP e estãodivididos emsete subtipos (P2X1-7). Os receptores metabotrópicos
P2Y são acoplados a proteínas G e estão divididos nos subtipos P2Y1,2,4,6,11 (Ralevic e
Burnstock, 1998).
O nucleosídeo adenosina é de importância para a manutenção de uma série de processos fisiológicos em diferentes tecidos. Devido ao importante papel na modulação da atividade sináptica, adenosina é descrita como uma substância neuroprotetora e neuromoduladora em diferentes regiões do SNC de mamíferos (Cunha, 2001).
A adenosina exerce seus efeitos modulatórios através da interação com purinoreceptores P1. Tais receptores foram identificados e clonados, sendo então divididos
em quatro subtipos: A1, A2A (receptores de alta afinidade), A2B e A3 (receptores de baixa
afinidade). Todos estes receptores são acoplados a proteína G, sendo que os receptores A1 e
A3, interagem com proteínas G da família Gi e Go, enquanto que os receptores A2A e A2B
estimulam a adenilato ciclase através da proteína Gs (Klinger et al., 2002). Adicionalmente,
os receptores A2B também podem ativar a fosfolipase C através da interação com a proteína
Gq (Klinger et al., 2002). Os efeitos modulatórios de adenosina estão associados com o
subtipo de receptor ativado. Sabe-se que o efeito de inibição da liberação de neurotransmissores, é mediado pelos receptores A1 (Dragunow, 1988; Brundege e
Dunwidie, 1997). O papel neuroprotetor de adenosina em situações patológicas, pode ser atribuído aos mecanismos de manutenção da homeostase intracelular do cálcio, diminuição da liberação de aminoácidos excitatórios e manutenção do potencial de membrana (Rudolphi et al., 1992). Outro aspecto que exemplifica o papel neuroprotetor de adenosina, é o seu efeito na ativação das enzimas do sistema antioxidante como a catalase, superóxido dismutase e glutationa peroxidase (Maggirwar et al., 1994).
Portanto, após a liberação e posterior interação com seus receptores específicos localizados na membrana celular, os nucleotídeos da adenina devem ser posteriormente metabolizados através da ação de ecto-enzimas, para sua conversão em adenosina. A degradação seqüencial de ATP extracelular pela “via das ectonucleotidases”,pode resultar na inativação da sinalização mediada pelo ATP via receptores P2, e contribuir para a
sinalização mediada por adenosina através dos receptores P1 (Richardson et al., 1987;
mecanismo de controle dos níveis de nucleotídeos e nucleosídeos no espaço extracelular (Zimmermann, 1996; Zimmermann, 2001; Robson et al., 2006). Este processo envolve uma variedade de enzimas, dentre as quais podemos citar: (a) os membros da família das E-NTPDases (ecto-nucleosídeo trifosfato difosfoidrolase), para a hidrólise de nucleotídeos di- e trifosfatados, e (b) a 5’-nucleotidase, principal enzima responsável pela hidrólise de nucleotídeos monofosfatados (Zimmermann, 2001).
A família das E-NTPDases, inclui as ATPases do tipo-E que se caracterizam principalmente por possuírem atividade dependente de cátions divalentes, serem insensíveis a inibidores específicos de ATPases do tipo-P (Na+K+ ATPase), tipo-F (ATPase mitocondrial) e tipo-V (bomba de prótons vacuolar), além de hidrolisarem todos nucleotídeos di- e trifosfatados, mas não nucleotídeos monofosfatados (Plesner, 1995). Nas últimas décadas, apirases ou ATP difosfohidrolases (EC 3.6.1.5) têm sido descritas em diversos tecidos, entre eles tecidos de mamíferos como preparações de SNC e periférico (Battastini et al., 1991; Bruno et al., 2002; Sarkis & Salto, 1991). Estudos sobre as NTPDases e seus efeitos na regulação dos níveis de nucleotídeos e seus produtos, indicam os diferentes papéis fisiológicos desempenhados por estas enzimas, dependendo do tecido em que se encontram. Em sistema nervoso, as NTPDases possuem um importante papel na inativação da ação do neurotransmissor ATP através de sua hidrólise seqüencial até o neuromodulador adenosina (Battastini et al., 1991; Sarkis & Salto, 1991; Zimmermann, 1996). Estas enzimas também tem sido descritas em situações patológicas. Alterações significativas na atividade da ATP difosfohidrolase foram descritas em hipocampo de ratos submetidos a episódios isquêmicos (Braun et al., 1998; Schetinger et al., 1998), e em SNC de ratos após a indução de epilepsia através da administração de diferentes agentes pró-convulsivantes (Bonan et al., 2000; Bruno et al., 2003).
A ecto-5’-nucleotidase (EC 3.1.3.5) é a principal enzima responsável pela formação de nucleosídeos extracelulares a partir de nucleotídeos monofosfatados. Apesar da 5’-nucleotidase possuir habilidade para hidrolisar nucleotídeos como GMP e UMP, o AMP geralmente é o nucleotídeo hidrolisado com maior eficiênica (Zimmermann, 1996). A presença desta enzima foi demonstrada em particular, em diferentes regiões de cérebro de ratos (Cammer et al., 1980; Heymann et al., 1984), estando presente tanto em neurônios,
como em células gliais, incluindo astrócitos, oligodendrócitos e microglia (Maienschein & Zimmermann, 1996; Zimmermann, 1996).
Estudos têm demonstrado a expressão da ecto-5’-nucleotidase na superfície de células neuronais e em sinapses durante o desenvolvimento neuronal (Schoen & Kreutzberg, 1994). Outros trabalhos ainda mostram que esta enzima desempenha um papel essencial para a diferenciação e sobrevivência das células neuronais durante seu desenvolvimento (Heilbronn et al., 1995). O principal papel fisiológico atribuído a ecto-5’-nucleotidase, é a formação de adenosina a partir do AMP extracelular e a subsequente ativação dos receptores P1, que em sistema nervoso, resulta principalmente na inibição da
liberação de neurotransmissores excitatórios (Brundege & Dunwidie, 1997). Dessa forma, alterações na atividade da 5’-nucleotidase tem sido demonstrada em resposta a uma série de situações patológicas como epilepsia (Bonan et al., 2000; Bruno et al., 2003), isquemia (Schetinger et al., 1998) e toxicidade pelo glutamato (Boeck et al., 2000; Bruno et al., 2002).
II.4- Objetivos gerais.
O objetivo do primeiro trabalho desta tese, que constitui o capítulo III, foi verificar a eficácia do disseleneto de difenila em prevenir a morte celular e o aumento do imunoconteúdo da oxido nítrico sintase induzível em um modelo experimental de isquemia
in vitro pela deprivação de glicose e oxigênio em fatias de hipocampo de ratos. Além disso,
este trabalho tem a intenção de estabelecer uma comparação da eficácia do disseleneto de difenila neste modelo com o ebselen a partir de dados já previamente publicados.
No segundo trabalho desta tese, que constitui o capítulo IV, verificou-se a ação do ebselen e disseleneto de difenila sobre as enzimas responsáveis pela hidrólise extracelular de nucleotídeos - as ectonucleotidases – em cultura de neurônios cerebelares. Ainda buscou-se estabelecer uma relação entre os compostos e a ação estimulatória do glutamato sobre a atividade das ectonucleotidases com a viabilidade neuronal e a participação de grupos sulfidrilas.
Dada a pequena parcela de estudos abordando parâmetros comportamentais com disseleneto de difenila, no capítulo V que compreende o terceiro estudo desta tese, investigou-se o efeito da administração intraperitoneal do disseleneto de difenila sobre
vários parâmetros comportamentais que incluíram: a) testes de aprendizado e memória; b) avaliações da performance motora e exploratória dos animais; c) avaliação do comportamento ansiolítico/ansiogênico dos animais. Com este estudo, a partir dos resultados obtidos, pretendeu-se estabelecer alguma relação por meio de manipulações farmacológicas com alguns sistemas de neurotransmissão particularmente envolvidos nas alterações comportamentais observadas pelo disseleneto de difenila.
CAPÍTULO III
Diphenyl diselenide protects rat hippocampal slices submitted to
oxygen-glucose deprivation and diminishes inducible nitric oxide
synthase immunocontent.
Brain Research 986: 196-199 (2003).
CAPÍTULO IV
Selenium compounds counteract the increase
of
ectonucleotidases activities in rat cultured cerebellar granule
cells: putative correlation with neuroprotective effects.
Submetido a Neurochemistry International
Selenium compounds counteract the stimulation ofectonucleotidases activities in rat cultured cerebellar granule cells: putative correlation with neuroprotective effects.
Gabriele Ghisleni, Lisiane O. Porciúncula #, Carina R. Boeck #, João B. T. Rocha,
Diogo O. Souza # *.
Departamento de Química, Centro de Ciências Naturais e Exatas, Universidade Federal de Santa Maria, Santa Maria, RS, CEP 97105-900, Brazil.
# Departamento de Bioquímica, Instituto de Ciências Básicas da Saúde, Universidade
Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS, CEP 90035-003, Brazil.
Corresponding author: Diogo Onofre Souza
Address: Departamento de Bioquímica, Instituto de Ciências Básicas da Saúde, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS, CEP 90035-003, Brazil. Fone: +5551 33165557 Fax: +5551 33165540
Abstract
The organoselenium compounds, ebselen and diphenyl diselenide (PhSe)2, have been
studied by their antioxidant and anti-inflammatory properties. Ebselen was described to prevent glutamate-induced lipid peroxidation and cell death in cerebellar granule cells and both compounds were demonstrated to modify glutamatergic synapse parameters in vitro and in vivo. Glutamate, an excitatory neurotransmitter involved in pathophisiology of various brain injuries, was demonstrated to stimulate ectonucleotidases activities in cerebellar granule cells, producing adenosine, molecule showed to counteract the glutamate toxicity. In this study, we investigated the effects of ebselen and (PhSe)2 on the increase of
ATP and AMP hydrolysis in rat cultured cerebellar granule cells, induced by glutamate and NEM (a thiol groups alkylant agent). Both organoselenium counteracted these effects. However, only NEM caused cell death (which was also counteracted by the selenium compounds), an effect not observed with glutamate (up to 24 h after the treatment). Our results suggest that selenium compounds can be preventing the increase of ectonucleotidases activities probably by their antioxidant properties.
Key words: Ebselen, diphenyl diselenide, glutamate, ectonucleotidase, cerebellar granule cells.
1. Introduction
Organoselenium compounds have been known by their antioxidant properties, being effective in preventing oxidative stress by detoxifying reactive oxygen species (ROS). In this context, ebselen is one of the most recognized organoselenium compounds with antioxidant properties, able to mimic the glutathione peroxidase activity (Müller et al., 1984; Wilson et al., 1989). As the selenium core in ebselen molecule is not totally available, this compound has been safely administered in animal models of brain injuries with pronounced neuroprotective effects (Namura et al., 2001; Takasago et al., 1997). Part of the neuroprotection conferred by ebselen also involves its anti-inflammatory actions, as observed in clinical conditions such as acute ischemic stroke, subarachnoid hemorrhage, acute middle cerebral occlusion, animal models of Parkinson´s disease and brain ischemia (Yamaguchi et al., 1998; Mouassoui et al., 2000; Imai et al., 2001; Porciúncula et al., 2003).
Although glutamate is an essential brain excitatory neurotransmitter, it is well established the role of glutamate in the pathophysiology of brain injuries by over stimulation of its receptors (Lipton and Rosemberg, 1994; Osawa et al., 1998; Maragakis and Rothstein, 2004). In fact, high concentration of extracellular glutamate are extremely toxic to neurons by triggering via overstimulation of its receptors a sequence of cellular events including oxidative stress, which ultimately leads to neuronal death (Atlante et al., 2000; Atlante et al., 2001; Sanganahalli et al., 2006; Reynolds and Hastings, 1995). Moreover, over stimulation of glutamate receptors also promotes an increase in extracellular ATP levels and subsequently an increase in adenosine levels via sequential hydrolysis of adenine nucleotides by the ectonucleotidases (E-NTPDases) (Zimmermann, 2006). The most relevant ecto-enzymes involved in this chain are the ecto-nucleoside
triphosphate diphosphohydrolases family (E-NTPDases, including ATP-diphosphohydrolase), which hydrolyzes nucleoside tri- and di- phosphates, and ecto-5’-nucleotidase, which hydrolyzes nucleoside monophosphates (Fredholm et al, 2005; Zimmermann, 2006; Robson et al., 2006). Physiological levels of extracellular nucleotides and nucleosides are maintained by releasing through particular transporters or via sequential action of the ectonucleotidases. Importantly, alterations in the activity of these enzymes have been found in some models of acute brain injury involving over stimulation of glutamate receptors (Bonan et al., 2000, Bruno et al., 2003, Nedeljkovic et al., 2006). Likewise, exogenous glutamate modifies the activity of ectonucleotidases in cerebellar granule neurons and hippocampal slices (Boeck et al., 2000, Bruno et al., 2002).
Ebselen seems to interfere with some parameters of the glutamatergic system depending on its concentration. Administration of high doses of ebselen inhibited glutamate release and uptake by rat brain synaptosomes and impaired glutamate uptake into synaptic vesicle by inhibiting the vesicular H+-ATPase, (Nogueira et al., 2002; Porciúncula et al., 2004). Conversely, ebselen at low concentrations prevented glutamate-mediated neuronal death (Porciúncula et al., 2001), and these neuroprotective effects are associated with its antioxidant and/or anti-inflammatory properties. Recently, some reports have also evidenced its ability to inhibit alterations in apoptotic pathways, contributing for elucidating other mechanisms involved in the pharmacological properties of ebselen (Xu et al., 2006;Yoshizumi et al., 2002; 2004).
In the last years, our group has investigated possible pharmacological properties of diphenyl diselenide (PhSe)2, another organoselenium compound that hitherto seems to
share most of antioxidant and anti-inflammatory effects with ebselen (Rossato et al., 2002; Nogueira et al., 2003). Although both compounds displayed beneficial pharmacological
properties when administered at low doses, cellular and molecular mechanisms involved on the actions of these compounds are still lacking in the literature.
In this study, we evaluated, in cerebellar granule neurons, the effect of ebselen and (PhSe)2 on the basal activity of ectonucleotidases as well as their effects on the stimulation
of ectonucleotidases activities by glutamate and/or N-ethylmaleimide (NEM), since this type of neurons has a remarkable sensitivity to glutamate toxicity due to a predominant expression of N-methyl-D-aspartate (NMDA) glutamate subtype receptor (Llansola et al, 2005). Moreover, these neurons also express ectonucleotidases (Van der Valk et al., 1991; Resink et al., 1994; Maienschein and Zimmermann, 1996; Wang and Guidotti, 1998; Wink et al, 2006).
2. Experimental procedures
2.1. Chemicals
Glutamate, nucleotides, ebselen (2-phenyl-1,2-benzisoselenazol-3(2H)-one), trypan blue, [3-(4,5-dimethylthiazolyl-2)-2,5-diphenyltetrazolium bromide] (MTT), malachite green base, coomassie brilliant blue G were obtained from Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, U.S.A). Trolox was purchased by Aldrich (Milwaukee, WI, U.S.A) and N-ethylmaleimide (NEM) was from FLUKA (New York, NY, U.S.A). Diphenyl diselenide was synthesized by the method described previously (Paulmier, 1986). All other chemicals were of analytical grade.
2.2. Cell Culture
Primary cultures of cerebellar granule cells were prepared from 8-day-old Wistar rats (Boeck et al, 2000; Porciúncula et al, 2001). Briefly, freshly dissected cerebella were
incubated with 0.025% trypsin solution for 15 min at 37ºC and disrupted mechanically in the presence of 0.08 mg/ml DNase and 0.05% trypsin inhibitor. The cells were then seeded at a density of 2.5 × 105 cell/cm2 in a 96-well multiwell dish (TPP) coated with 10 µg/ml
poly-D-lysine in minimum essential medium (MEM) containing Earle’s salts (GIBCO) supplemented with 10% fetal bovine serum, 50 µg/ml gentamicin and 25 mM KCl. The growth of non-neuronal cells was inhibited by addition of 20 µM cytosine arabinofuranoside 18-24 h after seeding and the medium was maintained without change during the culture period.
2.3. Determination of ectonucleotidase activities
After 8 days in vitro (DIV), culture medium was carefully discarded, and the cell monolayer was gently washed twice with the reaction medium used to measure ATP hydrolysis, which consisted of (mM): 20 HEPES/Na+ (pH 7.4), 120 NaCl, 5 KCl, 2 CaCl2,
10 glucose (Boeck et al, 2000). For AMP hydrolysis assay, the reaction medium used was the same above except that 2 mM CaCl2 was replaced by 2 mM MgCl2. The reaction started
by adding ATP or AMP (1mM final concentration) and incubated for 20 min or 10 min, respectively, at 37ºC, in a final volume of 150 µl/well. The reaction was stopped by removal of 115 µl aliquot of the assay that was then immediately mixed with 115 µl 10 % TCA. After centrifugation for 5 min at 12000 × g at 4ºC, the amount of released inorganic phosphate (Pi) in the medium was measured as described by Chan et al., 1986. Nucleotide hydrolysis was expressed as percentage of control.
2.4. Experimental design for enzyme assays
In a set of experiments, cells were pre-incubated for 30 min in the presence of 10 µM or 100 µM glutamate. In other set of experiments, 100 µM glutamate was co-incubated
with ebselen (1-10 µM), (PhSe)2 (0.3-3 µM) or Trolox (50 µM) for 30 minutes. In another
set of experiments, 10 µM NEM was pre-incubated for 10 min prior to addition of 100 µM glutamate, in the presence or absence of 3 µM ebselen or 1 µM (PhSe)2. As control,
selenium compounds, trolox and NEM were also pre-incubated alone. Selenium compounds were diluted in 50% ethanol (v/v). Maximal concentration of ethanol in the medium was 0.25%, which did not interfere in the nucleotide hydrolysis.
2.5. Neuronal viability
Neuronal viability was assessed by exclusion assay with 0.4% trypan blue for 4 min just at the end of incubation. The number of non-viable (blue stained cells) and viable (bright cells) cerebellar neurons was counted in at least five randomly fields in duplicate in phase contrast microscopy. Moreover, neuronal viability was also assessed by MTT method after 24 hours of incubation period. Briefly, immediately after the assay, the cultures were replaced with the previously saved culture-conditioned medium in the absence of any drug. After 24 hours, cultures were incubated for 30 minutes at 37 ºC with 0.5 mg/ml of MTT. Only metabolically active cells are able to reduce MTT into formazan product soluble in dimethyl sulfoxide (DMSO). Measurements of formed formazan amounts were performed at 490 and 630 nm.
2.6. Protein determination
Protein was determined colorimetrically using bovine serum albumin as standard (Bradford, 1976).
2.7. Statistics
All the assays were carried out in triplicate or quadruplicate and each value is
differences among groups was evaluated by a One-Way analysis of variance (ANOVA) followed by Duncan’s post-hoc test. Differences were significant for p ≤ 0.05.
3. Results
The effects of organoselenium compounds, ebselen (1-10 µM) and (PhSe)2 (0.3-3
µM), on the ectonucleotidase activities are shown in Table 1. Pre-incubation of both compounds in all concentrations tested had no effect on basal ATP and AMP hydrolysis. We further investigated whether pre-incubation of both organoselenium compounds could modulate the glutamate-mediated stimulation of ATP and AMP hydrolysis. Glutamate stimulated ATP hydrolysis at 10 µM (36% ± 7) and 100 µM (43% ± 9) and AMP hydrolysis at 10 µM (44% ± 8) and 100 µM (47% ± 9) (Fig. 1). To evaluate if inorganic phosphate (Pi) release was not related to cell membrane disruption, cells were incubated with glutamate in the absence of substrates. Neurons incubated with glutamate did not release Pi (data not shown), suggesting that the effect of glutamate involved the enzyme activities.
To evaluate if ebselen (1-10 µM) or (PhSe)2 (0.3-3 µM) could affect the stimulatory
effect promoted by glutamate, the compounds were co-incubated for 30 minutes in the presence of 100 µM glutamate. Both selenium compounds abolished the stimulatory effect (Fig. 2A and B).
Searching for some correlation with the antioxidant properties of these compounds with the modulation of the ectonucleotidases, we investigated the effect of the well-known antioxidant trolox. As observed with the selenium compounds, pre-incubation
for 30 min with 50 µM trolox had no effect on basal nucleotides hydrolysis, but prevented the glutamate-mediated increase of ATP and AMP hydrolysis (Fig. 3).
In order to elucidate the modulation of redox sites by ebselen and (PhSe)2, we
evaluated if the alkylating agent NEM, which irreversibly alkylates thiol groups, could inhibit the action of selenium compounds on the glutamate effect. Cells were previously incubated with 10 µM NEM and after 10 minutes selenium compounds were added (Fig. 4). Treatment with NEM alone increased ATP (55.5 % ± 8) and AMP (61 % ± 20) hydrolysis, and similarly to observed with glutamate, this effect was abolished by ebselen (3 µM) or (PhSe)2 (1 µM). Moreover (Fig. 5), ATP and AMP hydrolysis remained increased
46 % ± 12 and 79 % ± 16, respectively when 100 µM glutamate and 10 µM NEM were co-incubated. Furthermore, ebselen and (PhSe)2 were less effective in preventing the AMP
hydrolysis stimulation by glutamate/NEM.
Finally, we examined cell viability with trypan blue exclusion assay at the end of incubation period and with MTT 24 h after the incubation. The percentage of cells stained with trypan blue (non-viable cells) was similar for all groups analysed, ranging from 15% to 19% (data not shown). Conversely, cell viability assessed 24 hours with MTT (Fig.6) showed no effect of glutamate during incubation period (Fig. 6A); however, treatment with NEM or NEM plus glutamate increased the number of non-viable neurons. Interestingly, 3 µM ebselen and 1 µM (PhSe)2, partially protected cultured neurons from NEM and
NEM-glutamate toxicity (Fig. 6B).
