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GUACIRA DOS REIS RIGON
Matrizes de compósitos de PLDLA com
hidroxiapatita obtidas por rotofiação para
utilização em engenharia tecidual
39/2013
CAMPINAS 2013
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CAMPINAS
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Dedicatória
Dedico este trabalho a todos que acreditaram em meu potencial e, que a sua maneira, sempre estiveram ao meu lado.
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Gostaria de agradecer a todos os que contribuíram para a realização deste trabalho:
A minha orientadora Prof. Dra. Cecilia Amélia de Carvalho Zavaglia, pela oportunidade, apoio e confiança em meu trabalho; pela paciência e amizade.
À pesquisadora Adriana Cristina Motta Monteiro por ceder amostras do copolímero sintetizado em seu laboratório na PUC-SP, campus de Sorocaba, para a realização do presente estudo.
Aos colegas do laboratório de biomateriais pela ajuda e orientação, em especial à Guinea Cardoso.
A todos os professores e funcionários da Faculdade de Engenharia Mecânica, que ajudaram de forma direta e indireta na conclusão deste trabalho, entre eles Claudinete e Marcos.
Ao funcionário do laboratório de Processos da Engenharia Química, Celso Camargo, pelas análises termogravimétricas.
À 3M do Brasil por me apoiar e me incentivar em meu crescimento profissional e acadêmico.
Aos pesquisadores do Laboratório Analìtico Corporatvo da 3M do Brasil, pelas análises realizadas, em especial à Jéssica Tosadori e Giuliana.
Às pesquisadoras e amigas Dra. Simone Redondo e Dra. Manuela Kaneko pelas revisões e apoio a este trabalho.
Aos colegas de trabalho, em especial à Cristiane Ulbrich, Débora Garcia, Elem Ribeiro, Marcos Moraes, Marcos Nery e aos meus amigos e familiares, pelo constante apoio e incentivo.
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Epígrafe
A mente que se abre a uma nova idéia jamais voltará ao seu tamanho original Albert Einstein
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Nos últimos anos, os polímeros biorreabsorvíveis ganharam importância na área médica e odontológica, sendo utilizados em um amplo número de aplicações no corpo humano, entre elas matrizes porosas tridimensionais como suporte no crescimento de células na área da engenharia tecidual. Com o objetivo de aperfeiçoar o processo de formação de matrizes como suporte na engenharia tecidual, estudou-se a utilização do compósito formado pelo copolímero PLDLA e um tipo de nanohidroxiapatita (HA) desenvolvida no laboratório de biomateriais da FEM/UNICAMP, na formação de matrizes através do processo de rotofiação. Os compósitos foram preparados utilizando-se 5% e 10% de HA em relação ao copolímero disperso em solvente clorofórmio na presença do surfactante ácido oléico. O processo de rotofiação é um processo simples, que forma uma matriz utilizando alta velocidade de rotação durante o jateamento da solução polimérica através de um orifício central sendo desnecessária, neste caso, a utilização de campo elétrico de alta voltagem, como ocorre para o processo de eletrofiação. As matrizes foram caracterizadas pelas técnicas de microscopia eletrônica de varredura (MEV), análise termogravimétrica (TGA), calorimetria diferencial de varredura (DSC), e espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (FTIR). Os resultados obtidos pela microscopia eletrônica de varredura (MEV) mostraram que houve formação de uma matriz porosa e, portanto, o compósito pode ter uma aplicação promissora como suporte para cultura de células.
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Abstract
In the last years, bioresorbable polymers have been receiving more importance in the medical and dentistry areas, and they have been used in a large number of applications on the human body, such as tissue engineering scaffolds. This work studies the use of a composite of poly (L-co-DL-lactic acid) (PLDLA) and nanoparticles of hydroxyapatite developed at FEM/ UNICAMP to produce membranes by Rotary Jet Spinning process. Composites were prepared with 5% and 10% of HA in a clorophormium polymer solution. Rotary Jet spinning is a simple process to produce 3D structures that does not require a high-voltage electric field, like electrospinning. The results were characterized by the following methods: scanning electron microscopy (SEM), thermogravimetry analysis (TGA), differential scanning calorimetry (DSC), and Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR). The results from SEM showed that a porous membrane was obtained which could be used as scaffold in tissue engineering.
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Figura 2.1: Estereoisômeros do ácido láctico ...9
Figura 2.2: Estrutura química do diéster cíclico do ácido láctico e seus possíveis estereoisômeros (Tsuji, 2002). 10
Figura 2.3: Esquema de um dos fundamentos da metodologia com biomateriais para engenharia de tecidos (Tabata, 2005). 14
Figura 2.4: Desenho esquematizado do sistema de rotofiação.,...17
Figura 2.5: Foto do Equipamento de Rotofiação e seus principais componentes (a)coletor, (b) reservatório, (c) base. ... ...18
Figura 3.1: Foto em destaque do reservatório do Equipamento de Rotofiação...22
Figura 3.2: Figura com visão ampliada do mecanismo de formação de nanofibras ...23
Figura 4.1: Difratograma de raios X do whiskers de HA...27
Figura 4.2: Padrão JCPDS comparando seus principais picos com a amostra de whiskers de HA ...28
Figura 4.3: Imagem dos whiskers de hidroxiapatita com escala de 200nm...28
Figura 4.4: Curvas resultantes da análise térmica por calorimetria diferencial de varredura (DSC) dos pellets de PLDLA utilizados para a produção das amostras M1, M2, M3 e M4...29
Figura 4.5: Curva termogravimétrica dos pellets de PLDLA utilizados para a produção das amostras M1, M2, M3 e M4...30
Figura 4.6: Espectro de infravermelho com transformada de Fourier para o copolímero PLDLA...30
Figura 4.7: Fotografia das matrizes de PLDLA obtidas pelo processo de rotofiação (a) M1,b) M2, c) M3 e d) M4...31
Figura 4.8: Imagens da microscopia óptica das matrizes obtidas no processo de rotofiação com aumento de 25X...33
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Figura 4.9: Imagens da microscopia eletrônica de varredura das matrizes M1, M2, M3 e M4 com escala de (a)1000µm, (b)200µm e (c) 100µm...34 Figura 4.10: Imagens da microscopia eletrônica de varredura das matrizes A)M1, B)M2, C)M3 e D)M4 com escala de (d) 50µm...35 Figura 4.11: Imagens da microscopia eletrônica de varredura da matriz M4 com escala 100µm (a). Foco em uma estrutura perolizada ou bead e imagens da microscopia eletrônica de varredura com detector de composição para a matriz M3 com escala de 50 µm (b)...36 Figura 4.12: Imagens de microscopia eletrônica de varredura da matriz M4 a) aumento de 6500X com detecção (ETD), b) aumento de 10000X com detecção (ETD), c) aumento de 10000X com detecção de composição por contraste (VCD) e imagens de MEV da matriz M3 d) aumento de 4000X com detecção de elétrons secundários( ETD), e) aumento de 4000X com detecção de conposição por contraste (VCD) e f)aumento de 9000X com detecção de composição por contraste (VCD)...37 Figura 4.13: Boxplot do tamanho das fibras obtidas no processo de rotofiação e analisadas por microscopia eletrônica de varredura...38 Figura 4.14: Espectro de infravermelho com transformada de Fourrier – FTIR obtidos nas análises do polímero PLDLA, das matrizes M1, M2, M 3 e M4 e dos whiskers de hidroxiapatita...40 Figura 4.15: Curvas de DSC do 2°aquecimento das matrizes de PLDLA e seus compósitos com Hidroxiapatita...41 Figura 4.16: Curvas de perda de massa (%) em função da temperatura obtidas através da análise
termogravimétrica (TGA) para as matrizes M1, M2, M3 e
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Tabela 3.1: Dados das formulações utilizadas para a preparação das matrizes e seus respectivos códigos...20
Tabela 3.2: Dados das formulações utilizadas para a preparação das matrizes e seus respectivos códigos...22 Tabela 3.3: Dados das formulações utilizadas para a preparação das matrizes e seus respectivos códigos...31 Tabela 4.1: Análise estatística do tamanho das fibras por amostra...39 Tabela 4.2: Resumo das principais bandas de absorção dos espectros de infravermelho obtidos para o polímero PLDLA e para as suas matrizes M1, M2, M3 e M4 e para a hidroxiapatita...41 Tabela 4.3: Valores de Tg para as matrizes obtidas no processo de rotofiação...42
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Lista de abreviaturas e siglas
Letras Gregas
α - alfa
δ – delta
ν - ni
...
AbreviaçõesBEADS – estruturas perolizadas
BioglassR -- pó de vidro bioativo da empresa US Biomaterials Co
BMP - proteína morfogenética óssea
Boxplot – gráfico em forma de caixas para mostrar variabilidade entre dados
cm-1 – unidade de comprimento de onda
DLA - estereoisômero D-lactídeo obtido da policondensação do ácido lático DLLA – mistura racêmica DLLA
ETD – detctor de elétrons secundários HA – hidroxiapatita
HP – horse power
LLA – estereoisômero L-lactídeo obtido da policondensação do ácido lático M1 – referência das amostras de matrizes de PLDLA puro
M2 – referência das amostras de matrizes de PLDLA / ácido oléico
M3- referência das amostras de matrizes de PLDLA / ácido oléico/ HÁ(5%) M4 - das amostras de matrizes de PLDLA / ácido oléico/ HÁ(10%)
MEC – matriz extracelular
MLA - estereoisômero meso-lactídeo obtido da policondensação do ácido lático PCL - policaprolactona
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PLGA – copolímero poli(DL ácido lático-co-ácido glicólico) PLLA - poli (L-ácido lático)
PUC-SP- Pontifícia universidade católica de São Paulo RPM – rotação por minuto
TGF – fator de crescimento tissular
UNICAMP – Universidade Estadual de Campinas
VCD – detector de composição por contraste (low voltage high contrast detector) W - Watt °C – grau centígrado nm - nanometro % - porcentagem µm - micrometro
...
SiglasDEMA – departamento de engenharia de materiais
DSC – differential scanning calorimetry - caloria diferencial de varredura FEM- faculdade de engenharia mecânica
FTIR – Fourier transform infrared spectroscopy -infravermelho com transformada de Fourier FDA – Food and Drug Administration
ISO - International Organization for Standardization MEV – microscopia eletrônica de varredura
SEM – scanning electron microscopy
TGA – thermogravimetry analysis - análise termogravimétrica Tg – glass transition - transição vítrea
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SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ...1 2 REVISÃO DA LITERATURA ...3 3 MATERIAIS E MÉTODOS ...19 4 RESULTADOS E DISCUSSÕES ...275 CONCLUSÕES E SUGESTÕES PARA PRÓXIMOS TRABALHOS...44
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1 INTRODUÇÃO
Nos últimos anos, tem-se dispensada muita atenção aos compósitos feitos de polímeros e cerâmicas para aplicações no campo de biomateriais e engenharia tecidual. Scaffolds ou matrizes porosas tridimensionais tem sido preparadas para reconstruir órgãos, interfaces teciduais e estruturas de tecidos como ossos, cartilagens, tendões, ligamentos e músculos. A hidroxiapatita, como o maior componente inorgânico dos ossos e dentes, tem sido utilizada como fase cerâmica, podendo ser combinada com vários polímeros naturais e sintéticos, gerando compósitos que podem atingir boas propriedades mecânicas, em muitos casos, superiores em comparação ao material polimérico (Xiuling Xu et al, 2007).
A partir destes compósitos, podem ser preparadas fibras nano estruturadas que possuem grande potencial de aplicações em diferentes áreas tecnológicas como em sensores, sistemas de filtração e, principalmente, em engenharia tecidual e liberação controlada de fármacos [Dzenis, Y., 2004; Andrady, A.L., 2008].
O crescente interesse na produção destas fibras nanoestruturadas deve-se, principalmente, ao desenvolvimento do processo de eletrofiação (ou electrospinning). Além disso, existem outros processos, que vem se tornando mais evidentes pela facilidade de utilização, como é o caso do processo de rotofiação (ou Rotary Jet spinning).
A fase polimérica dos compósitos pode ser constituída por polímeros biorreabsorvíveis, cuja importância na área médica vem crescendo, sendo utilizados em um amplo número de aplicações no corpo humano, entre elas, matrizes como suporte no crescimento de células na área da engenharia tecidual (Beiser, e Huang et al, 2004).
Dentre eles, os poli (α-hidróxi-ácidos), tais como poli (L-ácido lático) (PLLA), poli (ácido glicólico), (PGA) e seus copolímeros, como, por exemplo, poli (DL ácido lático-co-ácido glicólico) (PLGA), estão entre os poucos polímeros sintéticos aprovados para fins clínicos em seres humanos. O que os torna diferenciados perante os outros polímeros são características tais como biocompatibilidade, biodegradabilidade e facilidade de processamento (Beiser, e Huang et al, 2004).
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A possibilidade de modular as propriedades dos polímeros biorreabsorvíveis por meio do processo de copolimerização é um dos atributos destes materiais. Desta forma, a combinação L-ácido lático com o D, L L-ácido lático resulta em um copolímero, PLDLA, que apresenta boas propriedades mecânicas, além de tempo de degradação mais adequado requerido pelas fraturas ósseas ou mesmo na liberação controlada de fármacos, se comparado ao homopolímero PLLA, portanto preferível em muitas aplicações cirúrgicas (Monteiro, 2007).
Neste estudo, foram preparadas matrizes de compósitos, por rotofiação, compósitos utilizando-se 5% e 10% de hidroxiapatita e estas foram analisadas por análise térmica, por microscopias óptica e eletrônica de varredura e por meio de espectroscopia de infravermelho.
1.1 Objetivo
O objetivo deste trabalho centrou-se no estudo da utilização do compósito formado pelo copolímero PLDLA e nanohidroxiapatita (HA) desenvolvida no laboratório de biomatriais da FEM - UNICAMP, na formação de matrizes porosas tridimensionais através do processo de rotofiação como uma tentativa de se aperfeiçoar o processo de formação de scaffolds para utilização na engenharia tecidual. Com o intuito de se caracterizar as matrizes obtidas, as mesmas foram submetidas às técnicas de análise térmica (TGA e DSC), análise química por Infravermelho com transformada de Fourier e análises microscópicas, utilizando microscopia óptica e microscopia eletrônica de varredura.
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2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 Tecido Ósseo
Para um melhor entendimento das propriedades do tecido que se quer substituir ou promover o crescimento, faz-se necessário um estudo preliminar que irá ajudar a direcionar o trabalho de apresentação de uma nova proposta de biomaterial.
O tecido ósseo é um tecido conjuntivo especializado, assim como o sangue e o tecido cartilaginoso, sendo sua função principal fornecer forma e sustentação ao corpo e aos órgãos, além de conectar e ancorar partes. Como todos os tecidos do corpo, os tecidos conjuntivos de sustentação consistem em células, tanto fixas como células que se movem, e uma matriz extracelular (MEC) composta por fibras de colágeno calcificadas, embebidas em uma substância fundamental amorfa (substância opticamente homogênea e transparente que preenche os espaços entre as células e as fibras do tecido conjuntivo, composta, principalmente, por glicoproteínas, ácido hialurônico e proteoglicanas), criando condições ideais de sustentação e de proteção de importantes partes do organismo (Ovalle et al, 2008).
Este tecido é composto basicamente por três tipos celulares associados a uma grande quantidade de MEC. Essas células são: os osteoblastos, que geram o tecido ósseo; os osteócitos, que mantém esse tecido vivo e os osteoclastos que destroem o tecido ósseo. Estruturalmente, os ossos são constituídos, fundamentalmente, por lamelas que contém osteócitos imersos na MEC, que se dispõe de várias maneiras, de acordo com as condições biomecânicas locais. A existência simultânea de atividades de formação e de destruição do tecido ósseo é uma característica importante, que permite a adaptação deste tecido em caso de crescimento ósseo, prática de atividades esportivas, tratamento fisioterápico etc. (Junqueira, 2005).
Apesar de o osso ter alta resistência à pressão e elevada dureza, o tecido ósseo é muito plástico, sendo capaz de remodelar sua estrutura interna em resposta a modificações nas forças a que estão submetidos normalmente. Essas propriedades são possíveis porque o osso é um material compósito, constituído de hidroxiapatita e colágeno. A hidroxiapatita óssea é resistente à
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compressão, com baixa resistência à tração e possui módulo de elasticidade elevado. O colágeno, por outro lado, tem limite de resistência à tração elevada, mas baixo módulo de elasticidade. A combinação resulta em um material compósito com alta resistência à tração e alto módulo de elasticidade, leve e bastante flexível. As trincas nos cristais de HA não se propagam nas fibras adjacentes de colágeno, pois estas podem ser deformadas, sem necessariamente serem rompidas (Walsh, et al, 1994).
Para fim de correção das falhas originadas de diferentes fatores, como as seqüelas resultantes de acidentes de trânsito, ferimento por arma de fogo e traumatismos em esportes de risco, além de situações em que há necessidade da reposição de perdas ósseas ou estímulo para a formação óssea, como nas enxertias realizadas nas artrodeses da coluna vertebral, principalmente nas cirurgias para escoliose, ressecção de tumores músculo-esqueléticos, revisões de artroplastias e o tratamento das pseudoartroses, assim como na área da cirurgia craniofacial e implantodontia, freqüentemente há necessidade de reconstituir estruturas ósseas perdidas.
A enxertia óssea é utilizada desde a antiguidade, inicialmente para corrigir defeitos da calota craniana. Com a evolução das técnicas de cirurgia, assepsia e anestesia, o enxerto ósseo passou a fazer parte do arsenal cirúrgico (Zabeu et al, 2008).
Os enxertos, quanto à sua origem, podem ser autógenos quando obtidos do mesmo indivíduo, sendo este receptor e doador; isógenos quando obtidos de outro indivíduo com mesma carga genética; homógenos quando obtidos de indivíduos diferentes com carga genética diferente, porém da mesma espécie e os heterógenos que são obtidos de outras espécies (Del Valle et al, 2006).
O osso autólogo é considerado, até o momento, o melhor material a ser utilizado na busca da consolidação óssea. Isso se deve às suas propriedades osteogênicas, osteoindutoras e osteocondutoras, além do fato de não causar reação imunológica ou transmissão de doenças infecciosas. Seu uso, no entanto, é limitado por ter fonte esgotável, causar seqüelas no sítio doador do enxerto (dor, alteração de sensibilidade e cicatrizes), além de ter sua qualidade dependente da idade e das condições gerais do indivíduo. Sendo assim, há necessidade do desenvolvimento de materiais e técnicas que proporcionem resultados ao menos equivalentes àqueles obtidos quando do uso de enxertia autóloga.
Chamados pelos autores de “substitutos ósseos” foram citados os diversos elementos que podem ser utilizados com essa finalidade. No estudo dos substitutos ósseos, devem ser
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considerados os agentes osteogênicos, basicamente células mesenquimais pluripotenciais (células-tronco), com capacidade para se diferenciarem em células produtoras de tecido ósseo ou vascular, agentes osteoindutores, que são moléculas capazes de induzir proliferação e diferenciação de células mesenquimais em diferentes tecidos (como exemplo, a proteína morfogenética óssea – BMP, o fator de crescimento tissular – TGF, entre outras), produzidas no interior de diferentes células e estocadas em elementos como plaquetas, e os agentes osteocondutores, que agem como um arcabouço para o crescimento ósseo, sendo em alguns casos progressivamente substituídos pelo osso. São exemplos de materiais osteocondutores de enxertos ósseos homólogo e heterólogo, biocerâmicas, biovidros, polímeros sintéticos e metal poroso ( Zabeu et al, 2008)
2.2 Biomateriais
Há mais de um século muitos pesquisadores vêm dedicando esforços para encontrar materiais com características adequadas para restauração e substituição dos tecidos ósseos no corpo humano. Em uma fase inicial, a procura de tais compostos se deu através da utilização de materiais de origem biológica, como no caso dos enxertos e dos transplantes, os quais são classificados como autógenos (onde o doador é o próprio receptor), alógenos (onde o doador e o receptor são da mesma espécie) e xenógenos (onde o doador é de origem animal). Devido às desvantagens desses materiais e também do grande desenvolvimento científico e tecnológico, muitos trabalhos foram realizados com o objetivo de dispor de materiais de origem sintética com características adequadas que permita diminuir e, em alguns casos, eliminar o uso de materiais de origem biológica (Guastaldi, 2003).
Biomaterial é definido como qualquer substância ou combinação destas que não sejam fármacos, de origem natural ou sintética, que pode ser usada por qualquer que seja o período de tempo, aumentando ou substituindo parcial ou totalmente qualquer tecido, órgão ou função do corpo, com a finalidade de manter e ou alterar a qualidade de vida do paciente (Willians, 1987).
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A base para a escolha de biomateriais é feita, principalmente, de acordo com a aplicação a que se destinam. Por exemplo, para dispositivos que fiquem em contato com o sangue, esses materiais podem ser:
• componentes de dispositivos extracorpóreos que removem e retornam sangue do corpo; • dispositivos que são inseridos em um vaso sanguíneo;
• dispositivos que ficam permanentemente implantados.
Para dispositivos de aplicações em tecidos moles, a proposta dos materiais é aumentar ou redefinir o tecido (ex.: implantes de seios e implantes faciais). Em aplicações ortopédicas e odontológicas, os materiais são componentes de implantes estruturais (ex.: próteses de juntas e implantes de raiz de dentes) ou são usados para reparar defeitos ósseos - exempl.: parafusos e pinos inseridos em osso (Silva, 1999).
A vantagem que mais se sobressai do uso de biomateriais como implantes, próteses ou dispositivos implantáveis é a sua disponibilidade, reprodutibilidade e adaptação biomecânica. Seu desenvolvimento, produção e aplicação têm regulamentação internacional mediante regras bem restritas que emanam, predominantemente, as normas estabelecidas pelo FDA nos Estados Unidos e pelas normas ISO na Europa (Sastre et al, 2004).
A utilização de materiais sintéticos para a substituição ou aumento dos tecidos biológicos sempre foi uma grande preocupação nas áreas médica e odontológica. Com o intuito de fornecer soluções para estes problemas, a ciência dos biomateriais tem se desenvolvido em um ritmo constante, principalmente devido à disponibilidade de materiais metálicos, cerâmicos, poliméricos e, mais recentemente, compósitos (Sastre et al, 2004).
Estes materiais permitem a preparação de dispositivos com aplicações avançadas em uma nova geração de implantes, tanto para tecidos duros como para cartilagens, bioestáveis ou biodegradáveis, com ampla relação de dispositivos médicos com funções específicas, tais como marcapassos, biosensores, sistemas de suporte para regeneração de tecidos, incluindo sistemas biodegradáveis utilizados como suturas temporais com reabsorção espontânea em um intervalo de tempo apropriado, os sistemas de liberação controlada de drogas e medicamentos e compostos bioativos que oferecem enormes possibilidades de desenvolvimento futuro (Sastre et al, 2004).
É importante ressaltar que, apesar de tudo, muitos implantes que se utilizam hoje em dia apresentam problemas de estabilidade na superfície devido às suas interações com os tecidos humanos e fluidos fisiológicos. Algumas vezes não há congruência biomecânica entre o implante
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e o tecido em que ele se aplica ou a produção de micropartículas por fricção, assim como o desgaste de componentes de próteses de articulações, como de joelho, por exemplo. Como conseqüência disso, todo implante tem uma vida limitada, mas que pretende ser a maior possível para os implantes bioestáveis e, para isso, se recorre a sistemas que ofereçam garantia de estabilidade, segurança e ancoragem permanente o máximo possível. É o caso do desenvolvimento de desenhos de próteses para cirurgia ortopédica com fixação morfológica ou biológica mediante crescimento de tecido na superfície porosa da prótese ou mediante a incorporação de elementos bioativos na superfície das próteses que permite e estimula a formação de ligações entre o componente bioativo e as fibras de colágeno o componente ósseo circundante (Satre et al, 2004).
Estes materiais, utilizados como biomateriais, devem apresentar certos requisitos essenciais como: biocompatibilidade, biofuncionalidade, bioadesão, propriedades mecânicas semelhantes às do osso, tais como: módulo de elasticidade, resistência à tração e à fadiga, processabilidade, resistência à corrosão e preços condizentes com a realidade brasileira (Silva, 1999).
Um material, que usado em aplicações específicas, desenvolve respostas teciduais adequadas no sistema hospedeiro, caracteriza-se como biocompatível, ele não necessariamente tem de ser absolutamente inerte ou inócuo como se acreditava anteriormente, já a biofuncionabilidade caracteriza-se por desempenhar funções desejadas, dadas as suas propriedades mecânicas, químicas, ópticas, elétricas, etc (Silva, 1999).
Ainda, em relação às características dos biomateriais, possivelmente, um dos fatores mais importantes que moldam a resposta do organismo humano é a sua natureza, composição, morfologia e geometria da superfície. Assim, a resposta que provoca uma superfície muito hidrofóbica pode ser muito diferente da originada por uma superfície hidrofílica ou a influência da rugosidade superficial pode ser grande em prótese de articulação onde a fricção dos componentes rotacionais é de vital importância para estabelecer a vida média da prótese (Sastre et al, 2004).
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O uso de polímeros biorreabsorvíveis, como suporte para a cultura de células, vem tendo destaque na engenharia de tecidos como um dos componentes desta etapa (Kellomaki et al, 2004).
Os termos utilizados para os conceitos de biodegradação, bioabsorção e bioreabsorção são distintos e freqüentemente usados na engenharia de tecidos. Devido à falta de padronização para os termos, utilizamos, neste trabalho a definição fornecida por Michel Vert, químico e diretor do Centro de Pesquisas em Biopolímeros Artificiais, da Universidade de Montpellier 1, França, um dos pioneiros e líderes mundiais no estudo de materiais poliméricos bioreabsorvíveis.
Segundo Vert (Vert et al, 1992), biodegradável é um termo utilizado para polímeros e dispositivos sólidos que devido à degradação macromolecular sofrem dispersão in vivo, mas sem a eliminação dos produtos e subprodutos pelo organismo. Polímeros biodegradáveis podem ser atacados por elementos biológicos de forma que a integridade do sistema seja afetada, formando-se fragmentos ou outros subprodutos de degradação, que podem formando-ser removidos do formando-seu local de ação, mas não necessariamente do organismo. Biorreabsorvíveis são materiais poliméricos e dispositivos sólidos que mostram degradação através da diminuição de tamanho e que são reabsorvidos in vivo; i.e. materiais que são eliminados por rotas metabólicas do organismo. Biorreabsorção é um conceito que reflete a eliminação total do material e dos subprodutos de degradação (compostos de baixa massa molar) sem efeitos colaterais residuais. O uso da palavra “biorreabsorção” é utilizado quando a eliminação é total. Bioabsorvível são materiais poliméricos e dispositivos que podem se dissolver em fluidos corpóreos sem qualquer clivagem da cadeia macromolecular ou diminuição de massa molecular. Por exemplo, este é o caso da lenta dissolução de implantes solúveis em fluidos orgânicos. Um polímero bioabsorvível pode ser biorreabsorvível se suas macromoléculas são excretadas (Vert et al, 1992).
Muitos fatores determinam a taxa de degradação dos polímeros biorreabsorvíveis, entre eles: local de implante, solicitação mecânica, massa molar, distribuição da massa molar, composição, composição química, cristalinidade, morfologia, porosidade, rugosidade da superfície, energia livre, carga superficial, pH, presença de aditivos etc (Middleton et al, 2000).
Dentre os polímeros sintéticos biodegradáveis e biorreabsorvíveis encontram-se os poli(α-hidróxi ácidos), representantes de uma classe de poliésteres alifáticos sintéticos, dos quais fazem parte o poli(ácido glicólico) (PGA), poli(ácido láctico) (PLA), poli(ácido láctico-co-ácido glicólico) (PLGA), poli(ε-caprolactona) (PCL), seus copolímeros e outros.
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Originalmente usados como fios de sutura (Dexon®, Vicryl®, Maxon®, PDS®, etc), atualmente os poli(α- hidróxi ácidos) podem ser encontrados em diversos produtos comerciais de fixação óssea, também aprovados pelo Food and Drug Administration (FDA), (Biofix®, FixSorb®, Neofix®, ResorPin®, etc)(Barbanti et al, 2005).
2.2.1.1. Poli-ácido láctico
Dentre os poli (α- hidroxi ácidos), representantes de uma classe de poliésteres alifáticos sintéticos, estão o PLA e seus copolímeros.
O poli ácido láctico (PLA) pode existir como dois estereoisômeros, designados como D e L, quando é obtido através do processo de fermentação. Na Figura 2.1, estão representadas as formas D e L, que são opticamente ativas. (Chahal, 1997)
Figura 2.1: Estereoisômeros do ácido láctico (L e D)
O ácido láctico também origina um diéster cíclico, que é formado a partir do processo de policondensação do ácido lático que dá origem a 4 estereoisômeros: LLA, DLA, MLA e a mistura racêmica DLLA, como pode ser observado na figura 2.2 (Tsuji, 2002).
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Figura 2.2: Estrutura química do diéster cíclico do ácido láctico e seus possíveis estereoisômeros (Tsuji, 2002).
Através do processo de polimerização por abertura do anel do dímero cíclico do ácido lático pode-se obter polímeros com alta massa molar e as formas mais comuns são o PLLA e o PDLA.
O PLA tem uma temperatura de transição vítrea (Tg) de cerca de 60 ºC e temperatura de fusão (Tm) no intervalo de 130-180º C. (Liu et al, 2004) Tg e Tm dependem da composição óptica, a história térmica e peso molecular (Ma et al, 2001).
O PLLA é um polímero altamente cristalino, com boa resistência à tração e força de retenção, além da excelente biocompatibilidade. Porém, pesquisas têm demonstrado um longo tempo de degradação (maior do que 5 anos) o que pode levar a incidência de reações adversas nos tecidos próximos ao implante (Monteiro, 2007).
O PDLA é um polímero completamente amorfo com propriedades mecânicas inferiores as do PLLA, como tensão e módulo de elasticidade, mas com um tempo de degradação bem menor, cerca de 12 a 16 meses (Monteiro, 2007).
Com o objetivo de unir as melhores características de cada polímero e minimizar os efeitos negativos, foi desenvolvido o copolímero poli(L-co-DL ácido láctico), o PLDLA, que na
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proporção 70/30 é utilizado comercialmente com nome de Macropore Biosurgery da empresa Macropore (www.macropore.com).
Nesta proporção, o PLDLA se mostra completamente amorfo com taxa de degradação menor do que a do homopolímero PLLA em função de sua cristalinidade ( de 18 a 36 meses). Além disso, é mais biocompativel do que o PLLA e possui melhor processabilidade (Monteiro, 2007).
De acordo com Ignatius (Ignatius et al, 1996), discos sólidos de PLDLA foram investigados em testes por difusão de Agar com células L929 de fibroblastos de ratos, por 24, 48 e 72h e não foi detectada qualquer reação de citoxicidade, concluindo que o PLDLA mostra uma satisfatória biocompatibilidade em relação ao teste usado (Ignatius et al, 1996).
Sendo assim, devido às propriedades de biocompatibilidade, processabilidade adequada e menor taxa de degradação em relação a outros polímeros como o PCL e o PLLA, mencionadas anteriormente, o copolímero PLDLA foi escolhido para o desenvolvimento deste trabalho na obtenção de matrizes porosas para possível aplicação na engenharia tecidual.
2.2.2 Biocerâmicas
Biocerâmicas são usadas para reparar, reconstruir e substituir partes do corpo humano, pois se integram bem com o tecido ósseo vivo, estimulando seu crescimento. Estas, entre outras propriedades, fazem desses novos materiais produtos estratégicos no mercado atual. Entre as biocerâmicas, a hidroxiapatita, mais conhecida pela sigla HA, ocupa posição de destaque por sua larga aplicação no campo da medicina e da odontologia, como um substituto ósseo e dentário em implantes (Rossi et al, 2012).
A hidroxiapatita é o constituinte mineral natural encontrado no osso representando de 30 a 70% da massa dos ossos e dentes. A hidroxiapatita sintética possui propriedades de biocompatibilidade e osteointegração, o que a torna substituta do osso humano em implantes e próteses, daí o grande interesse em sua produção. Estas propriedades somadas à sua alta capacidade de adsorver e/ou absorver moléculas fazem da hidroxiapatita um excelente suporte para ação prolongada de drogas anticancerígenas no tratamento de tumores ósseos, e também
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eficiente no tratamento de remoção de metais pesados em águas e solos poluídos (Costa et al, 2009).
A HA é um fosfato cerâmico – ou biocerâmica – que tem composição e estrutura similares à fase mineral de ossos e dentes. Dependendo de sua pureza, ela pode suportar aquecimentos superiores a 1.200 graus celsius, sem se decompor. Além disso, pode ser modelada como a maioria dos materiais cerâmicos. Nas aplicações tecnológicas, a HA é usada no preenchimento de cavidades, na forma de grãos densos ou porosos, bem como no revestimento de implantes metálicos, estes geralmente feitos com o metal titânio. Neste último caso, procura-se melhorar as características dos implantes, combinando-se a resistência mecânica do metal à biocompatibilidade e à atividade biológica do material cerâmico As propriedades químicas da HA podem ser modificadas através do método de sua preparação. Para implantes ósseos ou dentários, duráveis por muitos anos, utiliza-se um material pouco solúvel, constituído por hidroxiapatita pura. Quando se deseja que o implante seja reabsorvido pelo corpo, cedendo lugar ao tecido ósseo novo, usa-se uma cerâmica mais solúvel, geralmente constituída por uma mistura de hidroxiapatita com outros fosfatos. Outra característica da HA é sua capacidade de adsorção, isto é, de fixar em sua superfície moléculas de outra substância (Rossi et al, 2012).
Essa propriedade faz com que ela possa ser usada em implantes, como suporte para antibióticos e drogas anticancerígenas, além de poder ser empregada também em tratamentos prolongados de infecções e doenças ósseas – neste último caso, liberando aos poucos, na região afetada, a medicação necessária. A hidroxiapatita é formada por átomos dos elementos químicos cálcio, fósforo, oxigênio e hidrogênio, arranjados conforme mostra sua fórmula: Ca10(PO4)6(OH)2 (Rossi et al, 2012).
2.3 Fundamentos da Engenharia Tecidual
A engenharia tecidual apresenta um método alternativo para reparar e regenerar o tecido humano danificado. O princípio envolvido é a regeneração do tecido vivo onde ocorreu a perda ou o dano como resultado de um ferimento ou doença. (Langer R &Vacanti J.P., 1993).
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A essência da engenharia tecidual é que as células que são capazes de iniciar e sustentar o processo de regeneração estão ligadas, possivelmente, através de fatores de crescimento ou genes, de modo que elas geram tecido funcional novo com a variedade desejada. O novo tecido pode ser gerado com a ajuda de um suporte ou matriz celular (scaffolds) para guiar a geometria ou a forma deste novo tecido e pode realizar-se de uma forma personalizada, no local da lesão de um doente individual ou em uma escala mais industrial num biorreator, onde o tecido construído é re- implantado no paciente (Williams, 1999).
Atualmente estratégias empregadas na engenharia tecidual podem ser categorizadas em três classes maiores: condutoras, indutoras e transplante celular. Essas estratégias utilizam tipicamente os mesmo materiais, entretanto com diferentes finalidades. A condução utiliza os biomateriais de uma maneira passiva, para facilitar o crescimento ou a capacidade regenerativa dos tecidos existentes. A indução é a segunda maior estratégia da engenharia tecidual, e envolve a ativação das células nas proximidades do local a ser recomposto com específicos sinais biológicos. A origem desse mecanismo tem suas raízes na descoberta das proteínas morfogenéticas ósseas (BMPs). Urist (Urist et al, 1965) primeiro demonstrou que um novo osso poderia ser formado por um campo não mineralizado, após implantação de osso “tratado” (osso desmineralizado em pequenos pedaços). No osso tratado havia proteínas (BMPs), as quais se tornariam o elemento chave para a indução da formação óssea. Essas proteínas agora são disponíveis em fórmulas diversas e produzidas em larga escala pelas empresas de biotecnologia (Cardoso et al, 2009).
O esquema da figura 2.3 exemplifica a aplicação de uma matriz tridimensional preparada a partir de biomateriais biodegradáveis utilizada para promover a proliferação e diferenciação de células. O esquema ilustra a matriz com ou sem células, com e sem moléculas sinalizadoras, como, por exemplo, fator de crescimento celular, e é aplicado a um defeito do corpo para induzir a regeneração in vivo de tecidos e de órgãos (Tabata, 2005).
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Figura 2.3: Esquema de um dos fundamentos da metodologia com biomateriais para engenharia de tecidos (Tabata, 2005).
Portanto, para induzir a regeneração do tecido no local de defeito, pode-se construir um ambiente artificial para as células como um scaffold que, inicialmente, auxilia a fixação das células com a subsequente proliferação e diferenciação (Tabata, 2005).
.
2.4 Suporte ou matriz tridimensional (scaffolds)
Um suporte ou matriz tridimensional, também chamada de scaffold pode ser desenhada para guiar células anexadas, proliferação e diferenciação para regeneração tecidual. As condições biológicas e os requisitos de material a ser utilizado podem ser considerados para cada tipo de aplicação em engenharia tecidual e diferem de acordo com o órgão a ser reparado. Em relação ao material, há vários requisitos para a aplicação em matrizes artificiais, como por exemplo, biocompatibilidade, apresentar taxa de degradação desejada, processabilidade, porosidade e propriedades mecânicas. Quanto aos requisitos biológicos, é desejável que não cause reações alérgicas ou rejeição (Byung-Soo et al, 2011).
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Uma matriz artificial polimérica pode ser classificada em dois tipos: matriz artificial baseada em polímeros naturais e matriz artificial baseada em polímeros sintéticos. As matrizes artificiais baseadas em polímeros naturais são formadas de proteínas funcionais e estruturais, proteoglicanas, glicoproteínas e glicosaminoglicanas encontradas no tecido natural e são implantadas por remodelamento construtivo de muitos tecidos em testes clínicos em humanos. Polímeros naturais têm vantagens sobre os sintéticos porque possuem excelentes propriedades biológicas, incluindo adesão celular e propriedades mecânicas similares aos tecidos naturais, biodegradabilidade e biocompatibilidade (Rosso et al, 2004). Alguns exemplos destes polímeros naturais são: colágeno, ácido hialurônico, quitosana, gelatina entre outros (Badylak et al, 2009).
Os suportes celulares ou matrizes tridimensionais obtidas através de polímeros artificiais são fabricados utilizando-se polímeros biocompatíveis para evitar reações crônicas ou rejeição por parte do corpo humano. Polímeros artificiais podem ser obtidos por reprodução em larga escala e podem ser processados a uma matriz tridimensional em que as propriedades mecânicas e o tempo de degradação podem ser controlados, de acordo com o polímero escolhido. Os polímeros artificiais mais comumente utilizados em engenharia tecidual são: PLA (Poli ácido láctico), PGA (Poli ácido glicólico), PLA- co-PGA, PCL (Policaprolactona) entre outros (Byung-Soo et al, 2011).
Em engenharia de tecido ósseo, o entendimento do comportamento das células de formação do osso deve ser combinado com o avanço nas ciências dos materiais para atender a regeneração óssea guiada. Muitos cientistas se referem ao uso de fosfato de cálcio, como a hidroxiapatita, para estimular uma resposta bioquímica dos tecidos vivos e obter uma forte ligação entre a matriz polimérica e o tecido adjacente com resultados positivos (Ciapetti et al, 2003).
Outro fator importante na construção de matrizes tridimensionais para utilização em engenharia tecidual é a área superficial do dispositivo de forma que permita a ligação das células. Isto é feito, geralmente, criando uma superfície polimérica porosa, onde o tamanho do poro deve ser grande o suficiente para as células penetrarem nos poros e os poros devem estar conectados para facilitar a troca de nutrientes e permitir o crescimento celular. Estas características, porosidade e tamanho do poro, dependem, frequentemente do método de fabricação da matriz (Mikos et al, 2000).
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A utilização de materiais cerâmicos, como a hidroxiapatita, na engenharia tecidual devido a sua afinidade com o tecido ósseo, sendo que, quando combinada com polímeros naturais ou sintéticos, formando matrizes tridimensionais de compósitos, a eficiência é melhorada.
Os scaffolds obtidos com compósitos de polímeros biodegradáveis ou biorreabsorvíveis e hidroxiapatita possuem maior resistência mecânica do que os scaffolds feitos somente com HA, além de permitir um melhor controle do processo, obtendo melhores características de porosidade e biodegradabilidade. A presença de HA na matriz polimérica produzida com material sintético reduz os efeitos adversos de polímeros sintéticos no organismo que recebe o implante (Smith et al, 2009).
2.5 Sistema e processo de rotofiação
O sistema de rotofiação consiste em um dispositivo de baixo custo composto, basicamente, por uma base circular acoplada a um motor elétrico, um coletor, onde são depositadas as fibras produzidas e um reservatório que aloca a solução. O reservatório possui orifícios de vazão por onde escoa a solução empregada e o seu diâmetro definirá o diâmetro das fibras produzidas e pode variar de 0,1mm a 2,0mm. A rotação do dispositivo pode chegar até 12000 rpm (Badrossamay et al, 2010).
Os fios são formados pela expulsão da solução polimérica através dos orifícios de vazão, quando o conjunto gira em seu próprio eixo e sofre uma aceleração centrípeta e um processo de centrifugação, onde o efeito causado é o lançamento da solução para fora, formando os fios. A solução é continuamente injetada no reservatório para manter o fluxo constante por tempo indeterminado, originando a quantidade de fibra desejada. A figura 2.4 mostra um desenho do dispositivo de rotofiação (Zavaglia et al, 2012).
17 Figura 2.4: Desenho esquematizado do sistema de rotofiação
É a combinação da pressão hidrostática e da pressão centrífuga que excede as forças de capilaridade que propele a solução polimérica através do orifício do reservatório como um jato. A figura 2.5 representa o mecanismo da formação das fibras obtidas no processo de rotofiação.
Figura 2.5: Figura com visão ampliada do mecanismo de formação de nanofibras (Badrossamay et al, 2010).
A ação centrífuga estica o jato polimérico contra a parede do coletor, mas o jato faz uma trajetória curvilínea devido a inércia de rotação. O solvente evapora, solidificando e contraindo o jato (Badrossamay et al, 2010).
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A taxa de evaporação do solvente depende de sua volatilidade. Se o solvente é altamente volátil, os jatos formam fibras mais finas, pois com a rápida evaporação, a solidificação é potencializada, resultando na extensão do jato (Badrossamay et al, 2010).
De um modo geral, o diâmetro das fibras é determinado pela escolha do solvente, pela concentração da solução, pela tensão superficial da solução, pelo diâmetro do orifício e pela velocidade de rotação do equipamento (Badrossamay et al, 2010).
Sendo assim, a técnica de rotofiação possui várias vantagens em comparação com outros métodos de fabricação de micro e nanofibras: não requer campo elétrico de alta voltagem; o aparato é simples de se implementar; as fibras podem ser fabricadas em uma estrutura tridimensional ou outra forma qualquer, variando-se a geometria do coletor. Além disso, a morfologia, o diâmetro e a porosidade das fibras podem ser modificados, alterando-se as variáveis de processos e a produção das fibras ocorre independentemente da condutividade da solução.
Outra vantagem apresentada pelo processo de rotofiação é que a técnica é facilmente aplicada à soluções e suspensões, oferecendo uma elevada taxa de produção quando comparada ao processo de eletrofiação (Badrossamay et al, 2010).
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3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Materiais utilizados
Para a obtenção do compósito foram utilizados os materiais PLDLA, o qual foi produzido em colaboração com o laboratório da Professora Eliana Duek (PUC-SP, campus de Sorocaba) e “whiskers” de hidroxiapatita, produzido no laboratório Labiomec pela aluna Guinea Cardoso, como detalhado anteriormente (Cardoso, 2010). O solvente escolhido foi o clorofórmio (Aldrich), já utilizados em trabalhos anteriores (Ramos, 2011). O ácido oleico (Synth), usado como surfactante, foi adicionado com o objetivo de melhorar a interação entre o polímero e a hidroxiapatita, já que possui características de um surfactante anfifílico (Hae-Won, 2007).
Outros materiais: - Erlenmeyers de 50mL - agitadores magnéticos - bastão de vidro - equipamento de Rotofiação - placa de Petri - -ultrassom
- Hidroxiapatida em forma de wiskers cedida pelo laboratório Labiomec da Unicamp e obtida como resultado do trabalho da aluna de Doutorado Guinea Cardoso (Cardoso, 2010).
- Polímero PLDLA em pellets com massa molar média de 170.000 g/Mol, cedido pelo laboratório de materiais da PUC SP, campus de Sorocaba e obtido como resultado do trabalho da pesquisadora Adriana Motta Monteiro (Monteiro, 2007).
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O compósito foi preparado utilizando-se o PLDLA como matriz polimérica e hidroxiapatia como carga. Foram preparadas quatro diferentes formulações como segue na tabela 3.1:
Tabela 3.1: Dados das formulações utilizadas para a preparação das matrizes e seus respectivos códigos.
Descrição
Código da
matriz
Formulação (1): solução de clorofórmio com PLDLA (20% emmassa)
M1
Formulação (2): solução de clorofórmio com PLDLA (20% em massa) e ácido oléico (1,4%)
M2
Formulação (3): solução de clorofórmio com PLDLA (20% em massa), ácido oléico (1,4%) e hidroxiapatita (5%)
M3
Formulação (4): solução de clorofórmio com PLDLA (20% em massa), ácido oléico (1,4%) e hidroxiapatita (10%)
M4
A formulação “1” foi preparada dissolvendo-se o PLDLA numa porcentagem de 20% em massa no solvente clorofórmio em um Erlenmeyer de 50mL, utilizando-se agitação magnética por 60 minutos para se obter uma solução homogêna. Após a agitação, a formulação foi colocada em um banho com ultrassom (Ultrassom Thorton T7) durante 10 minutos para remoção de possíveis bolhas. Em seguida, a solução foi levada ao processo de rotofiação.
A solução “2” foi preparada, misturando-se o solvente clorofórmio e o ácido oléico em um Erlenmeyer de 50mL e, após 15 minutos de agitação magnética, foi adicionado o PLDLA numa porcentagem de 20% em massa, seguindo-se os mesmos procedimentos adicionais realizados para a formulação “1”. Esta formulação foi feita para ser utilizada como um comparativo entre as formulações 3 e 4 com a incorporação da hidroxiapatita.
As soluções “3” e “4” foram preparadas, misturando-se o solvente com o ácido oléico em um Erlenmeyer de 50mL, agitando-as durante 15 minutos e, posteriormente, foi adicionada a hidroxiapatita: 5% para a formulação “3”e 10% para a formulação ‘4”. A solução foi agitada durante 30 minutos para depois ser adicionado o PLDLA, mantendo-se em agitação por mais 60
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minutos, até completa solubilização, seguindo-se os mesmos procedimentos adicionais realizados para a formulação “1”.
Estudos indicaram que concentrações a partir de 10% são capazes de aumentar a viscosidade da solução, dificultando a evaporação do solvente, fazendo com que ele evapore a uma velocidade que favorece a formação de fibras mais finas, enquanto soluções com concentrações inferiores a 10% propiciam o aparecimento das estruturas perolizadas (beads), devido à rápida evaporação do solvente, que se apresentam como pontos de fragilidade mecânica, não sendo desejáveis nas matrizes. Sendo assim, optou-se em se iniciar o estudo com soluções de PLDLA na concentração de 20% em massa
.
(Badrossamay et al, 2010)Para cada matriz gerada, foram feitas duplicatas de solução e de rotofiação, em dias alternados, para aprimoramento da técnica de rotofiar. As avaliações foram feitas com as matrizes obtidas com melhores resultados no processo de rotofiação. Estas matrizes foram produzidas com o copolímero PLDLA sintetizado em um mesmo lote para eliminar o efeito de diferenças de resultados por lotes diferentes.
O PLDLA foi dissolvido em clorofórmio, que é um solvente altamente volátil, possuindo alta taxa de evaporação, a qual, aliada à concentração da solução pode produzir fibras finas e porosas, de acordo com estudos realizados por Badrossamay (Badrossamay et al, 2010). O uso do clorofórmio como solvente também é uma referência em trabalhos anteriores com outros polímeros biorreabsorvíveis para obtenção de suportes tridimensionais em processos de eletrofiação (Ramos, 2011). Estudos de obtenção de scaffolds de compósitos de PLDLA e BioglassR realizados por Maquet indicaram a utilização do solvente dimetilcarbonato (DMC), mas neste trabalho, optou-se em utilizar o clorofórmio (Maquet et al, 2004).
No caso do surfactante, foram testados outros dois tipos: SPAM 80 da Zibo Haijie Chemical Industry Co Ltda e o Aerosol 75 OT da Cytec, indicados como bons agentes de interação entre partículas sólidas muito pequenas e polímeros, mas com o ácido oléico, foram obtidas matrizes mais uniformes e volumosas e, por isso, seguiram-se os estudos apenas com este surfactante (Li et al, 2008).
A concentração do surfactante foi determinada tendo como referência estudos anteriores, onde para cada 10mL de clorofórmio foi utilizado 0,1ml de ácido oléico (HaeWon, 2007).
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3.3 Sistema de Rotofiação
Os componentes do sistema de rotofiação utilizado foram devidamente conectados
segundo as instruções do equipamento e suas especificações, conforme segue na tabela 3.2:
Tabela 3.2: Dados das formulações utilizadas para a preparação das matrizes e seus respectivos códigos.
Descrição
Especificação
Voltagem Bivolt Potëncia 1550W Frequëncia 60/50Hz Força do motor 1/4HP Rotação do motor 3450RPMAs fotos das figuras 3.1 e 3.2 ilustram o dispositivo de rotofiação e seus principais componentes estão identificados.
Figura 3.1: Foto do Equipamento de Rotofiação e seus principais componentes (a)coletor, (b) reservatório, (c) base
a
b
c
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Figura 3.2: Foto em destaque do reservatório do Equipamento de Rotofiação
3.4 Obtenção das amostras
Após cada formulação ter sido preparada, iniciou-se a produção das amostras através do processo de rotofiação.
O coletor foi forrado com papel alumínio para receber cada amostra e com o auxilio de um bastão de vidro, a solução foi derramada lentamente no orifício central do reservatório que, em rotação, expulsou o líquido através dos orifícios laterais, formando a matriz.
O processo de rotofiação de cada amostra durou, em média, 5 minutos e as matrizes resultantes foram recolhidas e deixadas na capela por cerca de 10 minutos para que, caso restasse algum resíduo de solvente nas matrizes ele fosse evaporado. Em seguida, as matrizes foram armazenadas em sacos plásticos e ficaram protegidas da luz e do calor para evitar degradação. Em seguida, as matrizes foram submetidas às avaliações e caracterizações morfológicas através de microscopia eletrônica de varredura (MEV), microscopia óptica e análise visual, análise térmica por termogravimetria (TGA) e calorimetria diferencial de varredura (DSC) e análise química por infravermelho com transformada de Fourier com a finalidade de verificar a viabilidade de suas aplicações como, por exemplo, seu uso como suporte para crescimento ósseo. Também foram realizadas algumas análises com o polímero utilizado, já que se trata de um polímero sintetizado em laboratório e não um polímero comercial. As análises realizadas foram: análises térmicas (TGA e DSC) e química (IR) e os resultados foram também relatados.
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Para a hidroxiapatita, foi cedido o resultado da análise de fluorescência de raios X realizada na caracterização da amostra após a síntese, assim como uma micrografia obtida por microscopia eletrônica de varredura no trabalho da aluna Guinea Cardoso (Cardoso, 2010).
3.5 Caracterizações
3.5.1. Microscopia óptica
Através da microscopia óptica podem-se observar as estruturas encontradas na natureza
como uma extensão natural da observação a olho nu, sendo ainda uma técnica muito importante utilizada nas inúmeras áreas das ciências complementada pela microscopia eletrônica.
Neste trabalho, foi realizada análise por microscopia óptica utilizando-se o Microscópio Óptico Leica M400, onde as amostras das matrizes foram colocadas em placas de vidro para visualização e análise de sua estrutura e morfologia das fibras produzidas no processo de rotofiação.
3.5.2. Microscopia eletrônica de varredura (MEV)
A avaliação da morfologia das fibras foi realizada em um microscópio eletrônico de
varredura (MEV) INSPECT S50/ FEI com 10kV de tensão. As amostras foram previamente metalizadas em um metalizador Quorum Q150R ES do Laboratório Analítico corporativo da 3M do Brasil. Para a realização de análise de fratura da fibra, preparada em nitrogênio líquido, foi utilizado um detector de composição (VCD).
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3.5.3. Análise termogravimétrica
Para a análise termogravimétrica (TGA) foi utilizado o equipamento STA409C da NETZSCH
.
As medidas determinaram a temperatura de degradação térmica do PLDLA puro e também identificaram a presença de HA em algumas matrizes. A taxa de aquecimento utilizada foi de 10º C/min e fluxo de 60 ml/min numa atmosfera de nitrogênio e as massas utilizadas estiveram entre 5 e 10mg de amostra para as matrizes e de aproximadamente 17mg para o polímero puro.3.5.4. Calorimetria diferencial de varredura (DSC)
As propriedades térmicas das amostras de PLDLA puro em “pellets”, PLDLA/ ácido oléico Rotofiado e PLDLA/ácido oléico/HA rotofiado foram determinadas utilizando o equipamento DSC Q100 da TA Instruments. As amostras foram pesadas em um porta- amostra de alumínio de formato cilíndrico e fechadas hermeticamente. A massa de cada amostra foi de aproximadamente 6mg. Cada análise foi realizada em atmosfera inerte (Nitrogênio) nas seguintes condições:
Primeira varredura de 10 0C a 150 0C com taxa de 10 0C/min;
Segunda varredura de 100C a 300 0C, intercaladas por um resfriamento com taxa de 200C/min.
3.5.5. Espectroscopia na região do infravermelho por transformada de Fourier (FTIR)
A caracterização quanto às alterações estruturais do compósito PLDLA/ácido oleico/HA foram analisadas por espectroscopia na região do infravermelho médio (4000 a 500 cm-1) no equipamento Nexus 470 FT-IR da Thermo Analyses. Através desta análise podem-se averiguar quais grupos químicos estão presentes nas matrizes comparativamente com o polímero puro e a
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hidroxiapatita, evidenciando se houve mudança na estrutura química durante o processo de rotofiação, assim como se houve a incorporação da hidroxiapatita na matriz.
3.5.6 Fluorescência de raios X
A espectroscopia por fluorescência de raios X (X-ray fluorescence – XRF) é uma técnica de análise qualitativa e quantitativa da composição química de amostras. Consiste na exposição de amostras sólidas ou liquidas a um feixe de radiação para a excitação e detecção da radiação fluorescente resultante da interação da radiação com o material da amostra [Belmonte, E.P., 2005].
A hidroxiapatita utilizada neste trabalho foi analisada pelo espectrômetro de fluorescência de raios X do DEMA-FEM-UNICAMP da marca Rigaku RIX 3100, onde se realizou a quantificação dos elementos químicos presentes na amostra, apresentando resultados da análise semi quantitativa. O resultado da análise foi cedido como referência (Cardoso, 2010).
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4 RESULTADOS E DISCUSSÕES
4.1 Caracterização dos principais materiais
4.1.1 Caracterização da Hidroxiapatita
A hidroxiapatita obtida no trabalho de Guinea Cardoso (Cardoso, 2010) foi caracterizada como whiskers de hidroxiapatita pelos métodos de difratometria de raios X, microscopia de varredura e espectroscopia de infravermelho por transformada de Fourier. Essa cerâmica apresentou seu difratograma compatível com o padrão JCPDS de hidroxiapatita deficiente em cálcio (46-0905), já que foi produzido utilizando como reagente o [Alfa]-TCP, o qual apresentou uma relação Ca/P de 1,50 (Figura 4.1 e figura 4.2). Essa relação permite uma maior solubilidade da cerâmica no fluído corpóreo, ao se comparar com hidroxiapatita estequiométrica, já que é apresentado na literatura que a taxa de reabsorção é de aproximadamente 1-2% por ano (Constantino, et al., 1994). 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 50 100 150 200 250 300 350 In te n si d a d e (cp s) 2(0 )
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Figura 4.2: Padrão JCPDS comparando seus principais picos com a amostra de whiskers de HA (Cardoso, 2010).
Foi verificada a morfologia dos whiskers de hidroxiapatita e caracterizada pela semelhança de agulhas. Esta morfologia semelhante com agulhas pode ser visualizada na figura 4.3.
Figura 4.3: Imagem dos whiskers de hidroxiapatita com escala de 200 nm, cedida pelo laboratório Biotech da Universidade de Trento na Italia (Cardoso, 2011).
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4.2 Caracterizações do Copolímero PLDLA
O copolímero PLDLA utilizado foi caracterizado por DSC, TGA e Infravermelho com transformada de Fourier.
A curva obtida no segundo aquecimento revela apenas uma transição vítrea (Tg), não mostrando nenhuma evidência de fusão, indicando que o polímero é amorfo. O valor da Tg é de 57°C. O fato de o polímero ser amorfo diminui o tempo de degradação no o organismo o que reforça suas características de biocompatibilidade.
2° Aquecimento 1° Aquecimento -1.0000 -0.9375 -0.8750 -0.8125 -0.7500 -0.6875 -0.6250 -0.5625 -0.5000 -0.4375 -0.3750 -0.3125 -0.2500 -0.1875 -0.1250 -0.0625 0.0000 H e a t F lo w ( W /g ) 0 50 100 150 200 250 Temperature (°C) PLDLA ––––––– PLDLA –––––––
Exo Up Universal V4.5A TA Instruments
Figura 4.4: Curvas resultantes da análise térmica por calorimetria diferencial de varredura (DSC) dos pellets de PLDLA utilizados para a produção das amostras M1, M2, M3 e M4.
Pelo termograma obtido na análise termogravimétrica (TGA) da figura 4.5, pode-se verificar três eventos de perda de massa. Os dois primeiros estão relacionados à perda de voláteis, onde se visualiza uma perda inicial de 5,7% até 180°C, relacionada principalmente a água que pode ter sido absorvida durante o manuseio da amostra. O último evento é o resultado da degradação térmica que se inicia em 272°C, com o máximo da velocidade de decomposição a 361°C, não sendo observados resíduos no final do processo.
30 105.44°C 137.01°C 5.709% 272.83°C 358.92°C -1 0 1 2 3 D er iv . W ei gh t C ha ng e (% /° C ) -20 0 20 40 60 80 100 W e ig h t (% ) 0 200 400 600 800 1000 Temperature (°C) Sample: PLDLA Size: 17.3270 mg
Method: Ramp TGA
File: C:\TA\Analises TGA\Guacira\PLDLA.001 Operator: Manuela
Run Date: 07-Oct-2011 09:10 Instrument: TGA Q500 V6.7 Build 203
Universal V4.5A TA Instruments
Figura 4.5: Curva termogravimétrica dos pellets de PLDLA utilizados para a produção das amostras M1, M2, M3 e M4.
O espectro de infravermelho na figura 4.6 indica as absorções referentes ao estiramento OH na região de 3300 a 2500 cm-1, que também pode estar relacionada a um grupo OH da água, indicando que copolímero pode ter absorvido umidade durante os testes.As absorções na região 2950 cm-1são referentes ao estiramento C-H assim como a absorção em 1760 cm-1 devido ao estiramento da ligação C=O.
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Tabela 3.3: Dados das formulações utilizadas para a preparação das matrizes e seus respectivos códigos.
Banda de absorção (cm-1)
Grupo de atribuição da banda
3000 cm-1 ѵ O-H 2950 cm-1 ѵ C-H 1760 cm-1 ѵ C=O 1453 cm-1 ѵ CH3 1381 cm-1 ѵ CH e CH3 1260 cm-1 ѵ CO e COO do éster 1123 cm-1 ѵ CO E OCH do éster
4.3 Caracterização das Matrizes
4.3.1 Aspecto Macroscópico das Matrizes
As matrizes obtidas no processo de rotofiação apresentaram um aspecto macroscópico continuo e denso similar ao de um tecido convencional, como pode ser observado na figura 4.7.
a) b)
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c) d)
Figura 4.7: Fotografia das matrizes de PLDLA obtidas pelo processo de rotofiação {a) M1, b) M2, c) M3 e d) M4}.
Sua flexibilidade e capacidade de manipulação fazem com que o material seja facilmente cortado, potencializando seu uso para aplicações na engenharia tecidual como, por exemplo, em enxertos dentários ou ósseos.
4.3.2 Microscopia óptica
Todas as amostras foram analisadas por microscopia óptica. Na figura 4.8, estão apresentadas as imagens com aumento de 25X. Através dos resultados obtidos, pode-se observar o alinhamento das fibras formadas nas matrizes M1, M2 e M4, assim como a forte presença de estruturas perolizadas ou beads na matriz M1 e M3 e alguns beads na matriz M4. Estas estruturas perolizadas apresentam-se como defeitos e podem ser pontos de fragilidade, afetando a resistência mecânica das fibras (Badrossamay et al, 2010).
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Figura 4.8: Imagens da microscopia óptica das matrizes M1, M2, M3 e M4 obtidas no processo de Rotofiação com aumento de 25X.
Estas variações observadas na morfologia das amostras devem estar relacionadas com variações no processo de rotofiação e a automação e controle do mesmo poderão levar a obtenção de materiais mais uniformes.
Em estudos do processo de rotofiação, foi discutido que o mecanismo de formação das fibras está relacionado à otimização da ação centrífuga e à tensão superficial do jato que pode causar instabilidade e, conseqüentemente a formação dos beads (Badrossamay et al, 2010).
4.3.3 Microscopia eletrônica de varredura – MEV
M1 M2 M4 M3 Bead Bead Bead
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As matrizes obtidas no processo de rotofiação foram avaliadas através da técnica de microscopia eletrônica de varredura. As imagens das análises para as diferentes matrizes podem ser observadas na figura 4.9.
Através dos resultados apresentados, também se pode observar a formação dos beads ou estruturas perolizadas, conectados por segmentos fibrosos em todas as matrizes, com maior concentração nas matrizes M3 e M4 (imagens M3a e M4a).
Embora, através da microscopia óptica não tenha sido observada a presença das estruturas perolizadas na matriz M2, através de um aumento maior, estas estruturas foram reveladas nesta matriz, como pode se verificar nas imagens M2a e M2b. Na imagem M2c, também podemos observar a formação de fibras com diâmetros bastante uniformes nesta matriz.
M1b M1c M3a M3b M3c M4a M4b M4c M2a M2b M2c M1a
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Figura 4.9: Imagens da microscopia eletrônica de varredura das matrizes M1, M2, M3 e M4 com escala de (a)1000µm, (b)200µm e (c) 100µm.
A figura4.10 mostra detalhe das fibras obtidas para as matrizes M1, M2, M3 e M4 (PLDLA em clorofórmio). Através das imagens, pode-se observar certa rugosidade na superfície das fibras. Essa rugosidade está relacionada com a porosidade das mesmas, como pode ser melhor observado nas imagens com aumento de 2000X. Resultados mais precisos poderiam ser obtidos por microscopia de força atômica, porém, se pode concluir que uma superfície porosa apresenta certa rugosidade.
Uma fibra porosa traz benefícios para a aderência no processo de crescimento celular. É ideal que uma matriz a ser utilizada em engenharia tecidual seja porosa para que o novo tecido possa se desenvolver e os nutrientes e fluidos se transfiram livremente (Qinggang Tan et al, 2011)
A) B)
