GLENDA SAMARA DIAS SANTOS
MORFOLOGIA DOS ESPERMATOZOIDES DOS COLEÓPTERAS STICTOLEPTURA CORDIGERA E TRIBOLIUM CASTANEUM E O PRIMEIRO
REGISTRO DE GREGARINA EM VESÍCULA SEMINAL DE INSETOS
Tese apresentada à Universidade Federal de Viçosa, como parte das exigências do Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Estrutural, para obtenção do título de Doctor Scientiae.
VIÇOSA
MINAS GERAIS – BRASIL 2017
ii Ensinar é um exercício de imortalidade. De alguma forma continuamos a viver naqueles cujos olhos aprenderam a ver o mundo pela magia
da nossa palavra. O professor, assim, não morre jamais... Rubem Alves
iii DEDICATÓRIA
iv AGRADECIMENTOS
Na realização desta tese contei com o apoio de muitas pessoas, instituições e agências financiadoras. Correndo o risco de injustamente não mencionar o nome de alguns, deixo aqui os meus sinceros agradecimentos:
À Universidade Federal de Viçosa pela excelência em ensino e estrutura, e à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelas bolsas concedidas durante o doutorado e doutorado sanduíche.
À coordenação do Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Estrutural da UFV, em especial o coordenador, professor José Eduardo Serrão, e a secretária, Elizabeth Alves Pena, pela ajuda com todas as questões burocráticas, pela competência e profissionalismo.
A todos professores do Programa de Biologia Celular e Estrutural pelos ensinamentos e paciência durante as disciplinas.
Aos funcionários do Departamento de Biologia Geral Adriana, Gustavo, Leandro e Letícia pela gentileza e prontidão em sempre ajudar.
Aquele que me conduziu ao longo dessa caminhada e compartilhou comigo grandes conquistas; Obrigada ao meu eterno orientador e amigo, José Lino-Neto. Agradeço todo incentivo, generosidade e compreensão nos momentos mais difíceis deste percurso.
Ao Prof. Romano Dallai pela receptividade, paciência e valiosos ensinamentos que foram fundamentais para o meu amadurecimento profissional e pessoal durante o doutorado sanduíche em Siena. E a todos da Università Degli Studio di Siena que de alguma forma deixaram suas marcas nesta tese.
Aos professores Izabel, Uyrá, Leandro e à Dra Luanda pelo pronto comprometimento na formação desta banca de doutorado. Ainda à Profa Izabel por toda gentileza e auxílio durante os concursos prestados durante o meu doutoramento. E à Profa Uyrá pela acolhida especial em seu laboratório na UFOP. Pelos momentos de “procafestinação” e risadas diárias.
Ao Prof. Lúcio Antônio de Oliveira Campos por, muitas vezes, iluminar os meus caminhos na pós-graduação, por todo apoio e ensinamentos nesses seis anos de convivência.
À UFOP pela oportunidade de experiência como docente e aos meus alunos que me incentivam a cada dia ser uma profissional melhor.
v Aos funcionários do Núcleo de Microscopia e Microanálise pelo suporte técnico. Aos amigos do Laboratório de Ultraestrutura Celular Ademária, Aline, André, Camila, Debora, Dodora, Jamile, Karen, Lenise, Marcelo, Monteiro, Wagner e Virgínia. E aqueles que mesmo distantes se fazem sempre presentes Claudia, Polly, Paty e Luiza. Obrigada pelo clima tranquilo e descontraído do laboratório e pelas conversas e conselhos nestes últimos seis anos.
Ao alicerce da minha vida, minha família, que me proporcionou o amor, o apoio e o encorajamento necessários para que eu pudesse realizar mais uma conquista.
À minha segunda família, República Aconchego, toda a minha gratidão e amor! Emily, Fernanda, Helen, Mayana e Naysa, obrigada pela presença agradável e constante durante todo o meu doutorado e por tornarem os meus dias em Viçosa mais leves e especiais.
vi SUMÁRIO RESUMO ... vii ABSTRACT ... ix 1. Introdução Geral ... 1 1.1. Ordem Coleoptera ... 1
1.2. Apectos filogenéticos e morfologia dos espermatozoides ... 2
1.3. Gregarina (Apicomplexa) ... 3
2. Objetivos ... 4
Capítulo I ... 5
Capítulo II ... 11
Capítulo III ... 19
3. Conclusão geral e perspectivas ... 29
vii RESUMO
SANTOS, Glenda Samara Dias, D.Sc., Universidade Federal de Viçosa, abril de 2017. Morfologia dos espermatozoides dos coleópteras Stictoleptura cordigera e Tribolium castaneum e o primeiro registro de gregarina em vesícula seminal de insetos. Orientador: José Lino Neto.
Nesta tese descrevemos a morfologia dos espermatozoides dos coleópteras Stictoleptura
cordigera (Cerambycidae) e Tribolium castaneum (Tenebrionidae) e, pela primeira vez,
a ocorrência de parasitos Gregarina (Ascogregarina sp.) em vesícula seminal de insetos. Ao longo do processo evolutivo, os espermatozoides acumularam inúmeras variações morfológicas, tornando-se as células mais diversas dos metazoários, sendo especialmente observada nos insetos. Por essa razão, o conhecimento sobre a morfologia dessas células tem auxiliado extensivamente à sistemática de diversos grupos de insetos, podendo ser usado para distinguir diferentes níveis taxonômicos e, até mesmo, espécies filogeneticamente próximas. Dentre estes, os Coleoptera constituem a maior e mais significativa ordem em riqueza de espécies. E, como para a maioria dos grandes grupos, as suas relações filogenéticas permanecem controvérsias nos diversos níveis taxonômicos. Neste contexto, procuramos, através de diferentes métodos de microscopia, descrever a morfologia dos espermatozoides dos besouros S.
cordigera e T. castaneum, buscando fornecer dados que possam contribuir na
sistemática das famílias as quais pertencem, bem como dos Coleoptera em geral. Os espermatozoides de S. cordigera apresentaram: na região de cabeça, um acrossomo em duas camadas (vesícula acrossomal e perforatorium) e um núcleo alongado fortemente eletrondenso, e na região flagelar, um axonema com 9 + 9 + 2 microtúbulos, dois derivados mitocondriais assimétricos parcialmente cristalizados, e dois corpos acessórios levemente assimétricos, com duas regiões de densidades diferentes. Nessa espécie, a morfologia dos espermatozoides exibe estreita semelhança àquela descrita para curculionídeos, indicando uma estreita relação filogenética entre Chrysomeloidea e Curculionoidea. Os espermatozoides de T. castaneum, assim como os de S. cordigera, apresentaram, na região da cabeça, um acrossomo e um núcleo, e no flagelo, um axonema com a mesma organização microtubular, dois derivados mitocondriais assimétricos e dois corpos acessórios. Contudo, em T. castaneum, o acrossomo é do tipo três camadas (além da vesícula acrossomal e o perforatorium, apresenta um material extra-acrossomal), e os corpos acessórios exibem apenas a região de maior densidade. A
viii presença de dois feixes de espermatozoides por cisto dispostos antiparalelamente, descrita para outros tenebrionídeos, foi aqui também observada. Ainda, nesses espécimes de T. castaneum, observamos degeneração em massa das células espermáticas em muitos cistos testiculares e, surpreendentemente, nas vesículas seminais, a presença de parasitos Gregarina. Os quais, segundo estudos morfológicos e moleculares, pertencem ao gênero Ascogregarina.
ix ABSTRACT
SANTOS, Glenda Samara Dias, D.Sc., Universidade Federal de Viçosa, April, 2017. Sperm morphology of the Stictoleptura cordigera and Tribolium castaneum coleopteran and the first record of gregarina in seminal vesicle of insects. Adviser: José Lino-Neto.
In this thesis we describe the sperm morphology of the coleopterans Stictoleptura
cordigera (Cerambycidae) and Tribolium castaneum (Tenebrionidae) and, for the first
time, the occurrence of Gregarina parasites in seminal vesicle of insects. Troughout the evolutionary process, the sperm cell accumulated numerous morphological variations, becoming the most diverse cells of the metazoan, being especially observed in the insects. For this reason, the knowledge about the morphology of these cells has extensively assisted the systematics of different insect groups, being used to distinguish different taxonomic levels and, even, close phylogenetically species. The Coleoptera comprise the largest and most significant order in species richness. And, as for most large groups, their phylogenetic relationships remain controversial at the various taxonomic levels. In this context, we describe the sperm morphology of the S. cordigera and T. castaneum beetles using different microscopy methods, searching to provide data that may contribute to the systematics of the families that belong to them, as well as to Coleoptera in general. The spermatozoa of S. cordigera exhibited: in the head region, an acrosome in two layers (acrosomal vesicle and perforatorium) and an elongate nucleus strongly electron-dense; in the flagellar region, an axoneme with 9 + 9 + 2 microtubules, two partially crystallized asymmetric mitochondrial derivatives, and two slightly asymmetric accessory bodies with two regions of different densities. In this species, the sperm morphology exhibits close similarity to that described for Curculionidae, indicating a close relationship between Chrysomeloidea and Curculionoidea. The spermatozoa of T. castaneum, as those of S. cordigera, showed an acrosome and a nucleus in the head region, and in the flagellum, an axoneme with the same microtubular organization, two asymmetric mitochondrial derivatives and two accessory bodies. However, in T. castaneum, the acrosome is of the three-layer type (besides the acrosomal vesicle and the perforatorium, an extra-acrosomal material), and the accessory bodies exhibit only the greater density region. The presence of two bundles of spermatozoa per cyst arranged antiparallelly, described for other tenebrionids, was also observed in this beetle. Furthermore, in these T. castaneum
x specimens, we observed a mass degeneration of spermatic cells in many testicular cysts, and, surprisingly, in the seminal vesicles, the presence of Gregarina parasites. Molecular and morphological studies indicated that these parasites belong to the genus
1 1. Introdução Geral
1.1. Ordem Coleoptera
Com mais de 400 mil espécies descritas, Coleoptera constitui a ordem mais rica e diversa da classe Insecta, representando quase 25% de todas as formas viventes conhecidas (Hunt et al. 2007; Jäch & Balke 2008). Cerca de 170 famílias são encontradas em diferentes regiões do mundo, sendo 104 registradas no Brasil o que corresponde a aproximadamente 30.000 espécies (Costa 2000).
O sucesso desse grupo possivelmente está relacionado à ocorrência de metamorfose completa (holometabolia), evitando desta forma competição intra-específica, bem como a um conjunto de caracteres que o permite a ocupar locais bastante diversificados sem perder a habilidade de voo (Grimaldi & Engel 2005). Por exemplo, são os únicos insetos que possuem as asas anteriores rígidas e altamente esclerotizadas (élitros), protegendo-os da dessecação e de choques mecânicos. Ainda, os élitros protegem as asas membranosas e o corpo frágil, permitindo que os besouros explorem ambientes inacessíveis a outros insetos (Grimaldi & Engel 2005; Triplehorn & Johnson 2011). Os coleópteras apresentam grande diversidade em forma, cor e tamanho. Eles podem variar de menos que 1 mm, como os Ptiliidae, até 200 mm, como o cerambycídio Titanus giganteus, considerado o maior inseto do mundo, encontrado na Amazônia (Gullan & Cranston 2012).
Os besouros são considerados um grupo monofilético, cuja principal sinapomorfia é a presença dos elétritos. Os besouros, provavelmente, divergiram a partir de um ancestral comum com Neuropterida e a grande diversificação do grupo ocorreu a partir do Jurássico, há 160 milhões de anos, período em que já existiam os grupos de Coleoptera mais derivados, como Curculionidae, Chrysomelidae e Cerambycidae (Grimaldi & Engel 2005).
A ordem Coleoptera é dividida em quatro subordens: Archostemata, Myxophaga, Adephaga e o grande grupo Polyphaga (Triplehorn & Johnson 2011). Esta última, com cerca de 300 mil espécies descritas, contém mais de 90% dos besouros (Grimaldi & Engel 2005; Vanin & Ide 2002). A classificação interna de Polyphaga compreende as superfamílias: Hidrophiloidea, Staphylinoidea, Scarabaeoidea, Buprestoidea, Byrrhoidea, Elateroidea, Bostrichoidea, Tenebrionoidea, Lymexyloidea, Chrysomeloidea, Curculionoidea, Cleroidea e Cucujoidea, com as seis últimas
2 constituindo o agrupamento Cucujiformia, que representa mais da metade de todos os besouros (Hunt et al. 2007; Gullan & Cranston 2012)
1.2 Aspectos filogenéticos e morfologia dos espermatozoides
Traçar a história evolutiva e compreender o sucesso adaptativo dos insetos em um período de existência de cerca de 400 milhões de anos tem sido um grande desafio (Grimaldi & Engel 2005). Muitos trabalhos vêm sendo feitos envolvendo a sistemática dos insetos, organismos de indiscutível importância para os ecossistemas em especial por constituírem o grupo mais diverso da fauna atual (Dallai et al. 2016). A morfologia dos espermatozoides tem oferecido um conjunto de dados, o qual tem auxiliado na sistemática de diferentes grupos animais, incluindo os insetos. Por ser um tipo celular muito diverso nos diferentes grupos de insetos, mas bastante conservada na espécie, faz com que ele seja uma importante ferramenta para fins filogenéticos e taxonômicos. As variações estruturais e ultraestruturais dos espermatozoides têm sido comumente utilizadas para resolver dúvidas sobre a filogenia de vários grupos de insetos, incluindo os besouros (Burrini et al. 1987; Baccetti & Daccordi 1988; Jamieson et al. 1999; Dias et al. 2013a, b; 2015a, b). Apesar do número limitado de componentes subcelulares, os espermatozoides são caracterizados por um surpreendente conjunto de caracteres (Dallai et al. 2016). Ake Franzén (1955) foi o primeiro a realizar estudos utilizando a morfologia e ultraestrutura destas células no estabelecimento de relações filogenéticas (ver Birkhead et al. 2009). Em seguida, vários autores deram continuidade a esta linha de pesquisa (Baccetti et al. 1973; Lino-Neto et al. 1999; Zama et al. 2005; Dolder et al. 2008, 2009; Dias et al. 2013a, b; Dallai et al. 2016). Em Coleoptera, um dos primeiros trabalhos comparativos sobre a morfologia dos espermatozoides foi descrito por Dlugosz & Harrold (1952) em Pitnus tectus (Ptnidae).
A ultraestrutura dos espermatozoides de Coleoptera segue um padrão do espermatozoide típico de Pterygota. Eles são filiformes, na região da cabeça contem um acrossomo de duas ou três camadas, e um núcleo com cromatina bastante compacta, e na região flagelar, um axonema de 9 + 9 + 2 microtúbulos com material intertubular, dois derivados mitocondriais e dois corpos acessórios ao longo de praticamente todo flagelo. Na região de transição núcleo-flagelo observa-se um adjunto de centríolo, geralmente pouco desenvolvido (Jamieson et al. 1999, Dallai 2014; Dias et al. 2015a, b). Variações deste tipo ocorrem, predominantemente, no tamanho, número e arranjo
3 dessas estruturas. Por exemplo, uma estrutura adicional associada a cada corpo acessório é observada no flagelo de Chrysomelidae e Curculionidae, a qual foi denominada “puff-like” por ter uma aparência amorfa e difusa (Burrini et al. 1987; Baccetti & Daccordi 1988).
Os curculionídeos, crisomelídeos e tenebrionídeos estão entre os maiores grupos que compõem a secção Cucujiformia. Há quase 30 anos foi descrita a morfologia dos espermatozoides de várias espécies de Curculionoidea (Burrini et al. 1987) e Chrysomelidae (Baccetti & Daccordi 1988). Quanto aos tenebrionídeos, a primeira descrição dos espermatozoides foi realizada em Tenebrio molitor por Baccetti et al. em 1973.
Entretanto, considerando o grande número de espécies em Coleoptera apenas uma pequena fração delas tem sido examinada com respeito à ultraestrutura dos espermatozoides. Portanto, estudar a morfologia dessas células em um número maior de espécies dessa ordem possibilitará a identificação de caracteres que poderão ser usados na sistemática do grupo.
1.3 Gregarina (Apicomplexa)
As gregarinas são um dos mais antigos parasitos conhecidos, formando um grupo heterogêneo dentro de Apicomplexa. Aproximadamente 1.650 espécies distribuídas em 250 gêneros têm sido registradas (Clopton 2000). Eles são caracterizados por indivíduos grandes e extracelulares, infectando uma variedade de invertebrados, principalmente artrópodes (Valigurová & Koudela 2005; Lantova & Volf 2014). Entre os insetos hospedeiros, Orthoptera, Odonata, Blattodea, Diptera e Coleoptera são os mais infectados (Desportes & Schrével 2013). Nestes grupos, as gregarinas são principalmente observadas em corpos gordurosos, túbulos de Malpighi e trato digestivo de larvas e adultos (Lantova & Volf 2014). Já no sistema reprodutor esses parasitos têm sido descritos apenas em glândulas acessórias e espermateca de fêmeas (Warburg & Ostrovska 1989; Lantova et al. 2010; Lantova & Volf 2014 ). Portanto, este é o primeiro relato de uma espécie de gregarina em vesícula seminal de insetos. Os ciclos de vida da gregarina incluem os seguintes estádios: esporozoítos (forma celular que infecta novos hospedeiros); Trofozoítos ou gamontes (grandes estádios vegetativos extracelulares); Gametocistos (pares de gamontes nos quais gametas são produzidos); E oocistos (esporo resistente, com parede espessa, que contém
4 os estádios infectantes). Em geral, a contaminação por gregarina ocorre através da transmissão oro-fecal, quando os parasitos entram no corpo por ingestão de oocistos contendo vários esporozoítos. Em seguida, os esporozoítos atingem a cavidade intestinal, ligam-se às células hospedeiras, e desenvolvem extracelularmente em estágios vegetativos maiores (Desportes & Schrével 2013. Estes diferentes estádios de desenvolvimento, foram descritos, nesta tese, usando as microscopias de luz e eletrônica de transmissão. Análises de uma sequência de rDNA indicaram que este protozoário pertence ao gênero Ascogregarina.
2. Objetivos
Esta tese tem como objetivo geral fornecer informações sobre a morfologia dos espermatozoides de Coleoptera, buscando descrever elementos que contribuam para o entendimento da sistemática do grupo. Como objetivo específico, descrever a estrutura e ultraestrutura dos espermatozoides de Stictoleptura cordigera (Cerambycidade) e
Tribolium castaneum (Tenebrionidae). Durante a investigação dos espermatozoides de T. castaneum observamos a presença de gregarinas nas vesículas seminais e, a partir
dessa descoberta, realizamos a descrição morfológica e molecular desse parasito.
Durante a realização desta tese foram produzidos três trabalhos, os quais encontram-se publicados. São eles:
1) The sperm ultrastructure of Stictoleptura cordigera (Füssli, 1775) (Insecta, Coleoptera, Cerambycidae);
2) The sperm ultrastructure and spermiogenesis of Tribolium castaneum (Coleoptera: Tenebrionidae) with evidence of cyst degeneration;
5 Capítulo I
Dias, G., Lino-Neto, J. & Dallai, R. (2015a). The sperm ultrastructure of Stictoleptura cordigera (Füssli, 1775) (Insecta, Coleoptera, Cerambycidae). Tissue and Cell, 47, 73-77.
11 Capítulo II
Dias, G., Lino-Neto, J., Mercati, D. & Dallai, R. (2015b). The sperm ultrastructure and spermiogenesis of Tribolium castaneum (Coleoptera: Tenebrionidae) with evidence of cyst degeneration. Micron, 73, 21-27.
15
n
n f
19 Capítulo III
Dias, G,. Dallai, R., Carapelli, A., Almeida, J.P.P,. Faroni, L.R.A., Campos, L.A.O. & Lino-Neto, J. (2017). First record of gregarines (Apicomplexa) in seminal vesicle of insect. Scientific Reports, 7 (1), 175.
29 3. Conclusão geral e perspectivas
Os resultados desta tese indicam que ultraestrutura do espermatozoide de S.
cordigera apresenta uma organização similar a de outros cerambycídeos, principalmente
considerando a morfologia dos corpos acessórios, que parecem ser a característica mais marcante de Cerambycidae. Além disso, os caracteres espermatológicos descritos para essa família suportam a estreita relação filogenética entre as duas superfamílias, Chrysomeloidea e Curculionoidea. A ultraestrutura dos espermatozoides de T.
castaneum apresenta caracteres comuns aos demais tenebrionídeos. Como, por
exemplo, corpos acessórios ovais, pequenos, com apenas a região eletrondensa; acrossomo em três camadas e base nuclear chanfrada, onde se associa a extremidade anterior do derivado mitocondrial maior; Além dessas, a disposição antiparalela dos espermatozoides por cisto, aqui descrita, foi também observada em outras famílias de Tenebrionoidea (Meloidae e Rhipiphoridae), sugerindo que esta é uma característica sinapomórfica para Tenebrionoidea. Essas informações reforçam a ideia de que caracteres espermáticos quando adequadamente descritos podem contribuir para resolver dúvidas sobre as relações filogenéticas entre grupos de insetos em diferentes níveis taxonômicos
Em adição, durante a análise morfológica dos espermatozoides de T. castaneum, observamos degeneração em massa das células espermáticas em vários cistos testiculares. É interessante observar que, nesses mesmos espécimes que observamos a degeneração, apresentaram as vesículas seminais parasitadas por gregarinas. As quais, a partir de análises moleculares e morfológicas, pertencem ao gênero Ascogregarina. Contudo trabalhos futuros deverão ser feitos para analisar se existe uma relação direta entre essas duas observações. Além de buscar entender o ciclo de vida desse parasito e como, de fato, a contaminação ocorre.
30 4. Referências bibliográficas
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