UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE FACULDADE DE ODONTOLOGIA
ESTUDO CLÍNICO RANDOMIZADO CONTROLADO DUPLO CEGO
PARA AVALIAÇÃO BIOLÓGICA DE DOIS FOSFATOS DE CÁLCIO
BIFÁSICOS COMO SUBSTITUTOS ÓSSEOS
Niterói 2018
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UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE FACULDADE DE ODONTOLOGIA
ESTUDO CLÍNICO RANDOMIZADO CONTROLADO DUPLO CEGO
PARA AVALIAÇÃO BIOLÓGICA DE DOIS FOSFATOS DE CÁLCIO
BIFÁSICOS COMO SUBSTITUTOS ÓSSEOS
MARCELO JOSÉ PINHEIRO GUEDES DE UZEDA
Tese apresentada à Faculdade de Odontologia da Universidade Federal Fluminense, como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor, pelo
Programa de Pós-Graduação em
Odontologia.
Área de Concentração:
Odontologia/Clínica odontológica
Orientadores: Profa. Dra. Mônica Diuana
Calasans Maia e Prof. Dr. José Mauro Granjeiro
Niterói 2018
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BANCA EXAMINADORA
Prof(a). Dr(a). Mônica Diuana Calasans Maia Instituição: Universidade Federal Fluminense
Decisão: _____APROVADO_________Assinatura: ________________________ Prof. Dr. Rafael Seabra Louro
Instituição: Universidade Federal Fluminense
Decisão: _____APROVADO ________Assinatura: ________________________
Prof. Dr. José Mauro Granjeiro
Instituição: Universidade Federal Fluminense
Decisão: _____APROVADO_________Assinatura: ________________________
Prof. Dr. Carlos Fernando Mourão Instituição: Universidade São José
Decisão: _____ APROVADO________Assinatura: _________________________
Prof. Dr. Rodrigo Figueiredo de Brito Resende Instituição: Universidade Iguaçu
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DEDICATÓRIA
Este trabalho é dedicado à todos aqueles que ao longo da história dedicaram suas energias a desvendar os mistérios da vida.
“No princípio Deus criou o céu e a terra...e as trevas cobriam a face dos abismo...e Deus disse: faça-se a luz. E a luz existiu.”
Genesis 1:1-5
“...pois tudo que não é deduzido dos fenômenos deve ser chamado uma hipótese; e as hipóteses, quer metafísicas ou físicas, quer de qualidades ocultas ou mecânicas, não tem lugar na filosofia experimental.”
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AGRADECIMENTOS
Em primeiro lugar, quero agradecer a todos que de alguma forma contribuíram para a realização deste trabalho e peço desculpas antecipadas por alguma omissão.
Aos meus pais queridos e maiores amigos para toda eternidade, Conrado (in memoriam) e Gilda. Tudo que colho, hoje e sempre, é fruto da semente que foi plantada com muito amor e carinho, e que foi regada com bom senso, bons exemplos e educação. Meu amor e gratidão por vocês, transcendem a existência!
À minha esposa Cristiana por todo seu apoio, incentivo, e compreensão. Fonte de minha inspiração e amiga em todos os momentos. Pérola em minha vida, te amo!
Aos meus amados filhos João e Clara, incentivo diário a me tornar uma pessoa cada vez mais paciente, mais tolerante, mais TUDO! Amo vocês!
Aos meus irmãos, sobrinhos e agregados. A toda família de um modo geral; refúgio de paz, tranquilidade, diversão e apoio em todas as horas.
À minha querida amiga Adriana Cury, que me conduziu ao “caminho das pedras” e que está sempre ao meu lado nessa caminhada.
Aos secretários do PPGO João e Lucí por suas presteza e simpatia, sempre prontos a nos ajudar quando precisamos.
A todos os queridos amigos “COLAOB Forever”. Uma segunda família que NÃO aconteceu ao acaso, e que sintetiza a ‘máxima’ de como podemos nos divertir fazendo com seriedade aquilo que gostamos tanto. Reduto de conhecimentos e mola propulsora de desenvolvimento para cada um de nós. É muito bom fazer parte desse grupo!!
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A amiga Adriana Terezinha por sua boa vontade, e disponibilidade na captura das imagens e na análise histológica. A melhor “fornecedora” do suporte nutricional (Cakolet e café) tão fundamental para a sobrevivência de todos nós!
Ao Rodrigo Resende, amigo e colega de vários anos. Grande parceiro nessa caminhada dividindo comigo as alegrias e angústias do percurso. Tamo juntos!
A amiga Suelen Sartoretto por toda sua ajuda nesse trabalho e em vários outros. Sua dedicação e boa vontade são valores preciosos que todos admiramos.
À galera do “Patota Doutorado”, Mourão, Anderson, Hélder e Igor, pelos ótimos momentos passados juntos sempre com muito bom humor “pero sin perder la seriedad jamás” !!
Ao amigo Rafael Seabra, exemplo de competência profissional que me recebeu nas disciplinas de Anestesiologia e Cirurgia Oral da UFF, contribuindo assim de maneira imensurável para o meu desenvolvimento acadêmico.
Ao Paulo Ribeiro, por sua boa vontade e compreensão durante os meus momentos de ausência. Agradeço também pela oportunidade de trabalhar em sua equipe, e a cada dia aprimorar-me na arte da docência.
Aos “novatos” ex-alunos e agora colegas Jhonathan, Giovanna, e Fernanda, obrigado pela ajuda no desenvolvimento das pesquisas e pelos ótimos momentos passados juntos!
A todos os alunos “ex e atuais”, por existirem. Sem vocês se perde o sentido de todo o esforço. Graças à vocês, aprendi e aprendo, muito mais do que ensino. A cada dia, cada gesto e cada palavra mencionada são pensados no sentido de melhorar o seu entendimento, estimulando-os e encorajando-os em sua jornada. Ensinar é, na verdade, aprender a cada dia e, devo isso à vocês!
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Aos pacientes que participaram desse estudo, meu muito obrigado por confiarem em nós.
Aos professores da Faculdade de Odontologia da UFF que nos últimos anos tornaram-se parte do meu cotidiano, incentivando-me a continuar trilhando o caminho, na certeza de alcançar o sucesso!
A Silvia Albuquerque, Química do CBPF, por seu carinho em todos os momentos, seus ensinamentos na síntese dos materiais e por estar sempre disposta a ajudar e resolver prontamente nossos “problemas de última hora”.
A FGM Produtos Odontológicos Ltda. por ter me proporcionado a oportunidade de participar do desenvolvimento de um material tão importante no campo dos biomateriais osteomiméticos.
Ao professor e amigo José Mauro Granjeiro, por sua enorme capacidade de nos contagiar com seu entusiasmo pelo saber, inundando à todos da mais pura busca pelo desenvolvimento crítico e qualidade na pesquisa científica, colocando-se sempre à disposição na arquitetura, condução e correção dos nossos trabalhos de pesquisa.
Finalmente agradeço a minha querida amiga e “eterna” orientadora, Mônica Calasans por todo o seu carinho, disponibilidade e competência. Seu acolhimento ao me receber como orientando, sua dedicação e capacidade de liderança, são virtudes que me servem como referência e que perpetuam através de todos que desfrutam da sua convivência.
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Muitos se perderam pelo brilho das suas qualidades, dos seus triunfos, dos seus milagres; mas nunca ninguém se perdeu pelos sentimentos de uma verdadeira e sólida humildade. "
Louis Bourdaloue 1632-1704
9 SUMÁRIO Folha de Rosto ...1 Banca Examinadora ... 3 Dedicatória ... 4 Agradecimentos ... 5 Resumo ...10 Abstract ... 12 1. Introdução ... 14 2. Objetivos ... 18 2.1. Objetivo Geral 2.2. Objetivos Específicos 3. Considerações Sobre Aspectos Éticos ... 20
4. Material e Método ... 22
4.1. Materiais ... 23
4.2. Caracterização dos Biomateriais ... 23
4.2.1. Microscopia Eletrônica de Varredura 4.2.2. Espectrosopia RAMAN 4.2.3. Difração de Raio X 4.2.3.1. Análise Estimada de HA e β-TCP 4.3. Participantes de Pesquisa ...26
4.4. Grupos Experimentais e Procedimentos ... 27
4.5. Protocolo Cirúrgico ... 28
4.6. Obtenção das Amostras ... 32
4.7. Processamento histológico do Material Biológico e Análise Histomorfométrica... 32 4.8. Análise Estatística ... 34 5. Artigo ... 35 6. Conclusão ... 54 7. Referências ...56 8. Anexos ...63 9. Outras Publicações (2014 à 2017) ... 75
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RESUMO
Uzeda MJPG. Estudo clínico randomizado controlado duplo cego para avaliação biológica de dois fosfatos de cálcio bifásicos como substitutos ósseos [Tese]. Niterói: Universidade Federal Fluminense, Faculdade de Odontologia; 2018.
Por sua bioatividade e biocompatibilidade, as cerâmicas a base de fosfato de cálcio especialmente as hidroxiapatitas (HA) são cada vez mais utilizadas como materiais de escolha na substituição e reparação óssea. No entanto, diversas pesquisas ainda vêm sendo realizadas visando melhorar a resposta biológica desses compostos. Com o objetivo de estabelecer a melhor resposta biológica em humanos, este estudo avaliou histológica e histomorfometricamente dois compostos sintéticos de HA associada ao beta-tricálciofosfato (β-TCP) em proporções distintas, e comparou à outro material sintético (Bone Ceramic®) com características químicas estruturais semelhantes, consagrado no meio científico como biomaterial osteomimético, disponível no mercado e largamente utilizado na odontologia e medicina. Os biomaterias utilizados foram, previamente a sua implantação, caracterizados através de Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV), Difração de Raio X (DRX) e Espectroscopia RAMAN (RAMAN). Foram recrutados 48 voluntários com indicação para exodontia a partir de critérios pré-estabelecidos, divididos cega e aleatoriamente por quatro grupos experimentais contendo doze participantes cada: Biomaterial1 (B1), Biomaterial 2 (B2), controle Bone Ceramic® (BC) e Coágulo (C).
Cada grupo foi dividido em dois períodos experimentais de três e seis meses. Cada participante de pesquisa foi submetido à exodontia de um elemento dentário indicado sob anestesia local tendo imediatamente o alvéolo preenchido e suturado, de acordo com o grupo experimental a que pertencia (biomateriais/coágulo). Decorridos os respectivos períodos experimentais, os participantes de pesquisa foram submetidos a novo procedimento cirúrgico sob anestesia local para a remoção da amostra do tecido neoformado na região operada, com instalação imediata de implante dentário para posterior reabilitação protética. As amostras obtidas de cada grupo por período experimental foram processadas e incluídas em parafina para análise microscópica descritiva e histomorfométrica através das quais analisamos a formação de tecido ósseo, presença de tecido conjuntivo fibroso e presença dos biomateriais. As informações obtidas dos diferentes grupos foram analisadas
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estatisticamente através do teste de normalidade Shapiro-Wilks seguido de análise de variância (ANOVA) e teste de Tukey para comparação entre os grupos (p<0,05%). A caracterização dos biomateriais mostrou B1 composto por HA 60,28% e β-TCP 39,72%; B2 - HA 78,21% e β-TCP 21,79%; BC - HA 61% e β-TCP 39%. As amostras de B1 após 6 meses mostraram uma maior quantidade de osso neoformado (p<0.05%), e menor de tecido conjuntivo e biomaterial remanescente. Todos os materiais foram fáceis de manusear, biocompatíveis e osteocondutores. Ambos permitiram a instalação do implante após 3 e 6 meses preservando a arquitetura alveolar.
Palavras-chave: Ensaio Clínico, Fosfato de Cálcio, Substituo Ósseo, Reparação Óssea, Implantes Dentários.
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ABSTRACT
Uzeda MJPG. Randomized clinical trial for biological evaluation of two nanostructured calcium phosphate as bone substitute [Thesis]. Niterói: Fluminense Federal University, College of Dentistry; 2018.
Because of their bioactivity and biocompatibility, calcium phosphate based ceramics, especially hydroxyapatites (HA), are increasingly being used as materials of choice in bone replacement and bone repair. However, several studies have been carried out to improve the biological response of these compounds. In order to establish the best biological response in humans, this study evaluates clinically, histologically and histomorphometrically biphasic calcium phosphate (B1 and B2) implanted in dental sockets immediately after tooth extraction and compares to a commercially available biomaterial (Bone Ceramic®) with characteristics
chemical structure consecrated in the scientific environment as biomaterial osteomimetic, available in the market and widely used in dentistry and medicine. Both biomaterials were previously submitted to Scanning Electronic Microscopy (SEM), X-Ray Diffraction (XRD) and Raman Spectroscopy (Raman) for physical and chemical characterization. Forty-eight volunteers requiring a tooth extraction were divided randomly and blindly into 4 groups of 12 individuals: Clot (C), Bone Ceramic®
(BC), Biomaterial 1 (B1) and Biomaterial 2 (B2). Forty-eight volunteers requiring a tooth extraction were divided randomly and blindly into 4 groups of 12 individuals: Clot (C), Bone Ceramic® (BC), Biomaterial 1 (B1) and Biomaterial 2 (B2).Three and
six months later, a sample of each grafted area was obtained and implants were inserted immediately. Histological sections were examined focusing on the presence of fibrous connective tissue (CT), and newly formed bone in direct contact with the graft. The HE-stained sections were subjected to histological and histomorphometrical evaluation using Image Pro-Plus software (Release 7.0). Statistical analysis using the Shapiro-Wilks normality test was performed followed by ANOVA and Tukey´s test for comparison between the experimental periods Dunn's post-test (p <0.05%). The characterization showed B1 composed by HA 60,28% and β-TCP 39,72%; B2 – HA 78,21% and β-TCP 21,79 % ; BC – HA 61% and β-TCP 39%. B1 samples showed a greater amount of newly formed bone (p<0.05%), fewer connective tissue and remaining biomaterial after 6 months. Both materials are easy
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to handle, biocompatible and osteoconductive. Both allowed the installation of the implant after 3 and 6 months preserving alveolar architecture.
Key Words: Clinical trial, Calcium Phosphate, Bone Substitute, Bone Repair, Dental Implants
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1 – INTRODUÇÃO
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A instalação imediata de implantes após exodontias é um procedimento cada vez mais comum na clínica odontológica. Estudos mostram taxas de sucesso de cerca de 95% quando comparados aos procedimentos realizados em alvéolos já cicatrizados1-4/1. No entanto, durante os primeiro doze meses após as
exodontias, devido a reabsorção óssea fisiológica progressiva, o osso residual sofre uma redução de até 50% em suas dimensões vertical e horizontal sendo que desses, 2/3 acontecem durante os primeiros 3 meses após exodontia3-4/1. Essas
taxas de reabsorção podem ainda aumentar se algum processo patológico ou traumático provocarem destruição de uma ou mais paredes ósseas alveolares. Neste caso, parte do defeito será preenchido por tecido fibroso, impedindo uma remodelação adequada do alvéolo que consequentemente influenciará tanto no planejamento quanto na previsibilidade relacionados a osseointegração4/1. Vale
lembrar que a instalação de implantes em locais com osso insuficiente pode causar a alteração da forma e comprimento das coroas protéticas, das ameias e do perfil emergente, levando a resultados estéticos insatisfatórios e funcionais inadequados 5-7/1.
Com intuito de preservar um volume ósseo mais adequado, que favorecerá a instalação de implantes dentários, considerando as dificuldades relacionadas à obtenção e a imprevisibilidade dos enxertos autógenos, especialistas vêm utilizando biomateriais osteocondutivos reabsorvíveis para o preenchimento de alvéolos pós-extração8-14/1. As barreiras para regeneração óssea guiada também
vem sendo utilizadas. No entanto, a possibilidade de deiscência pode levar a sua precoce exposição aumentando a possibilidade de infecção da membrana e a consequente redução no volume e qualidade óssea pretendida13/1,15-16/1. Vários
materiais têm sido usados imediatamente após as exodontias com a finalidade de preencher ou cobrir o alvéolo, na tentativa de limitar ou prevenir reabsorção óssea alveolar6-7/1,12-14/1,16-24/1. O alvéolo dental após a extração apresenta um padrão de
cicatrização que envolve uma série de eventos incluindo a formação de um coágulo que é substituído por matriz de tecido conjuntivo, osso imaturo, osso lamelar e medula óssea20/1. Geralmente para preservar tanto a altura quanto a
espessura do osso alveolar após a extração dentária, e permitir assim a futura instalação de implantes, procedimentos de regeneração óssea guiada (ROG) são necessários. Além disso, esses procedimentos também são indicados para utilização no momento da instalação dos implantes ou nos tratamentos das periimplantites19/1.
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A hidroxiapatita (HA), por ser o principal constituinte da fase inorgânica do osso e devido às suas características químicas e estruturais, possibilita seu uso em diversas áreas da medicina e da odontologia como material biocompatível a ser usado em implantes e próteses. Existem diversos processos para a síntese de apatitas que resultam em materiais com as mais variadas características físico-químicas e biológicas podendo torná-los mais ou menos bioabsorvíveis 9/1,21-22/1.
As HAs sintéticas compostas ou puras, não causam resposta inflamatória exacerbada ou indesejada, além de não serem antigênicas e nem carcinogênicas podem, ainda, funcionar como reservatórios de minerais, favorecendo a formação óssea, sendo consideradas por vários autores como materiais bioativos, tornando-as potencialmente adequadas como material substituto ao osso humano em implantes e próteses21-24/1,29/1.
A presença dos grânulos residuais de hidroxiapatita no tecido cicatrizado não contraindica a sua utilização em procedimentos que buscam o reparo ósseo para posterior instalação de implantes ou mesmo em enxertos no seio maxilar4/1. No entanto, grãos remanescentes poderão diminuir a interface
osso/implante. Sendo assim, a indicação de sua utilização está relacionada à morfologia e extensão do defeito e o tipo de reparo desejado. Um acompanhamento após 20 anos da implantação de hidroxiapatita demonstrou a íntima ligação entre o biomaterial e o osso circunjacente, resultando na estabilização do rebordo alveolar após longo tempo25/1.
As cerâmicas sintéticas de β-Tricálcio Fosfato (β-TCP), dentre outras cerâmicas a base de fosfato de cálcio, constituem um biomaterial osteocondutor com enorme capacidade de reabsorção apresentando resultados clínicos e histológicos bastante satisfatórios quando comparadas a outras cerâmicas tanto em animais quanto em humanos6-7/1,12-14/1,26-27/1. No entanto, os compostos puros de β-TCP por
não apresentarem uma relação equilibrada entre velocidade de reabsorção e a neoformação óssea, vêm sendo combinados com a HA no intuito de se manter um arcabouço por mais tempo na região implantada, devido a incapacidade biológica de reabsorver a HA enquanto o β-TCP é absorvido mais rapidamente, permitindo assim a criação de espaços que serão preenchidos por células osteoprogenitoras acelerando o processo de regeneração óssea 12/1,14/1.
Atualmente, existem disponíveis no mercado diversas marcas comerciais para hidroxiapatitas naturais e sintéticas, dentre estas podemos
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encontrar, Pro-HA®, Genphos® e Genox® (Genius), Osteogen® (Intra-Lock System),
Osteograft® (Lifenet), Bio-oss® (Geistlich), Alobone® (OsseoconBiomateriais) e
BoneCeramic® (Straumann).
Assim sendo, o objetivo deste estudo foi investigar dois substitutos ósseos cerâmicos bifásicos de HA e β-TCP usados no preenchimento alveolar em humanos, comparando suas respostas biológicas e tendo como controles negativo e positivo, respectivamente, coágulo e BoneCeramic®.
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2.1 - Objetivo Geral
O objetivo deste trabalho foi realizar estudo para investigar comparativamente e de forma quantitativa, a resposta biológica a dois diferentes biomateriais substitutos ósseos de origem sintética utilizados no preenchimento alveolar imediato pós-exodontia em humanos tendo como controles negativo e positivo, respectivamente, coágulo e BoneCeramic®.
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2.2 - Objetivos Específicos
2.2.1. Caracterizar físico-quimicamente os biomateriais antes da sua implantação; 2.2.2. Avaliar quantitativamentea área de osso neoformado e de tecido conjuntivo nos diferentes grupos de acordo com os períodos experimentais;
2.2.3. Avaliar quantitativamente a área de biomaterial remanescente nos diferentes grupos, de acordo com os períodos experimentais;
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Este estudo seguiu as diretrizes e normas regulamentadoras de pesquisas envolvendo seres humanos que constam na Resolução Normativa 466/2012 do Conselho Nacional de Saúde (CNS) e foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisas da Faculdade de Medicina da Universidade Federal Fluminense através do sistema Plataforma Brasil (CEP/HUAP nº 59004) em 6 de julho de 2012. (Anexo 1). A avaliação da qualidade deste estudo foi realizada com base na “Lista de Verificação” das declarações CONSORT. (Anexo 2)
Foi realizado um seguro de Responsabilidade Civil para o investigador principal e sub-investigadores (Processo Susep Nº 15414.004806/2005-03). Os participantes da pesquisa também foram cobertos em casos eventuais de reações locais e/ou sistêmicas. Caso as reações fossem consideradas importantes, o estudo seria suspenso e as reações, comunicadas ao Comitê de Ética.
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4.1 Materiais
Neste estudo foram utilizados dois biomateriais sintéticos a base de hidroxiapatita (HA) e β-Tricálcio Fosfato (β-TCP), que foram caracterizados físico-quimicamente no Centro Brasileiro de Pesquisas Físicas (CBPF) e no Instituto Nacional de Metrologia, Qualidade e Tecnologia (INMETRO).
4.2 Caracterização dos Biomateriais
4.2.1 Microscopia Eletrônica de Varredura
Com o intuito de obter informações detalhadas a respeito da morfologia e da superfície dos biomateriais estudados foi realizada a análise através de Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV).
Para a obtenção das imagens os biomateriais apresentavam-se sólidos e sem umidade, coladas sobre uma fita de carbono e recobertas por uma fina camada de ouro como material condutor. Foram Utilizados aumentos de 200X e 1600X para a visualização dos biomateriais e de 6000X e 40.000X para a avaliação da superfície. Este método gera uma imagem eletrônica de varredura que é formada pela incidência de um feixe de elétrons no material sob condições de vácuo. Um feixe fino de elétrons de alta energia varre a superfície da amostra ponto a ponto onde, pode ser refletido ou produzir elétrons secundários, que correspondem a elétrons arrancados da amostra pelo feixe incidente. A intensidade dos elétrons refletidos ou dos secundários pode modular, ponto a ponto, a intensidade do sinal em um monitor, gerando uma imagem da superfície varrida. O equipamento usado foi Microscópio Eletrônico de Varredura de emissão de campo (Field Emission Gun) FEI Quanta FEG 250 do laboratório de Microscopia Eletrônica do INMETRO.
4.2.2 Espectroscopia RAMAN
Para avaliarmos a composição dos biomateriais utilizados, foi realizada a Espectroscopia Raman em ambos os materiais no Raman da Renishaw InVia, com linha de 514 nm, potência de 1mW e objetiva de 100X, no Instituto Nacional de Metrologia, Qualidade e Tecnologia (INMETRO).
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4.2.3 Difração de Raio X
Para a caracterização quantitativa de fases minerais e cristalinas de materiais compostos por uma mistura de fases é utilizada a análise por Difração de Raio X (DRX). O objetivo de empregar esta técnica no presente trabalho foi de analisar os difratogramas obtidos dos biomateriais fazendo uma análise comparativa com padrões difratométricos de fases individuais disponíveis no JCPDS – Joint Committe of Powder Diffraction Standards, para os vários fosfatos de cálcio. As análises foram realizadas no Centro Brasileiro de Pesquisas Físicas (CBPF) no Laboratório de Cristalografia e Difração de Raios X, com o difratômetro de pó Zeiss HZG4 usando radiação de CuKa (= 1,5418 Å) e varredura angular de 10 – 100° com passo de 0,05/s e com passo de 0,05/s. Para a análise as amostras foram levadas sobre uma lâmina para posterior leitura no aparelho.
4.2.3.1 Análise Estimada de HA e β-TCP
Uma curva padrão com o percentual conhecido de hidroxiapatita e β-TCP disponível no JCPDS – Joint Committe of Powder Diffraction Standards foi utilizada considerando as áreas dos picos 300 e 210, respectivamente para HA e β-TCP (Figura 1). A partir dos difratogramas gerados para os biomateriais e considerando os mesmos picos em cada Biomaterial 1 e 2 além do BoneCeramic®, foi possível
calcular as áreas desses picos, de HA e β-TCP, comparando-as às da curva padrão (Figuras 2,3 e 4). Em seguida, através de uma “Regra de 3” foram calculados os percentuais das fases em cada amostra.
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Figura 2: Áreas de HA e β-TCP obtidas na amostra do Biomaterial 1
Figura 3: Áreas de HA e β-TCP obtidas na amostra do Biomaterial 2
Figura 4: Áreas de HA e β-TCP obtidas na amostra do BoneCeramic®
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4.3 Participantes de Pesquisa
Quarenta e oito (48) participantes de pesquisa apresentando indicação para extração dentária por razões periodontais e/ou protéticas foram selecionados para o presente estudo. Estes participantes eram de ambos os sexos, 18 homens e 30 mulheres, com idades que variaram entre 18 e 66 anos e portanto, considerados maduros do ponto de vista esquelético e sem interferência de crescimento facial para a posterior instalação do implante.
O diagnóstico para extração foi confirmado por dois diferentes profissionais. Todos os participantes foram informados previamente dos critérios físicos e psicológicos necessários para a participação neste projeto. Os critérios físicos compreenderam: não apresentar qualquer doença no momento, não estar fazendo uso de qualquer medicação que possa alterar ou comprometer a resposta cicatricial óssea (diabete, disfunção auto-imune, terapia prolongada com corticosteróides ou quimioterapia). Tabagista e ex-tabagista com menos de seis (6) meses sem fumar previamente ao estudo foram excluídos (Tabela 1). Os voluntários considerados aptos receberam explicações e informações sobre a natureza do estudo e após expressarem o desejo em participar, assinaram um Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (Anexo 3), e preencheram uma ficha sobre sua história médica e odontológica (Anexo 4).
Critérios de Inclusão Critérios de Exclusão
Não fumantes há pelo menos 6 meses Grávidas ou em período de amamentação Boa saúde em geral Usuários de medicamentos com interferência
na resposta inflamatória e metabolismo ósseo (corticóides, bifosfonatos, quimioterápicos) Presença de pelo menos um dente sem
possibilidade terapêutica e com indicação para extração
Portadores de doenças psiquiátricas
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O recrutamento dos participantes de pesquisa foi realizado pelos sub-investigadores treinados pelo investigador principal, e estavam aptos tanto a executar e desenvolver estratégias que aumentassem o recrutamento de voluntários quanto a manter a adesão do sujeito de pesquisa ao estudo clínico em curso, atingindo não apenas a meta de inclusões, estabelecida previamente, mas também garantindo a qualidade de dados de acordo com as Boas Práticas Clínicas (BPCs). O projeto foi divulgado em todo o Departamento de Odontoclínica da Faculdade de odontologia da Universidade Federal Fluminense, buscando assim que os participantes que estivessem dentro dos critérios já mencionados fossem abordados pelos diversos professores, alunos e funcionários da faculdade quanto ao interesse em participar como participantes da pesquisa.
4.4. Grupos Experimentais e Procedimentos
O protocolo utilizado neste projeto tem sido relatado na literatura15,24,26,28 e sofreu algumas modificações para se adequar aos objetivos da
pesquisa.
Foram criados quatro grupos experimentais com doze participantes cada, sendo cada grupo identificado pelo material usado para o preenchimento alveolar: biomaterial 1 (B1), biomaterial 2 (B2), Boneceramic® (BC) e coágulo (C). Em seguida, cada grupo foi novamente dividido por dois períodos experimentais de 3 e seis meses, com seis voluntários cada (Figura 5).
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Após a primeira consulta de avaliação e orientação sobre o estudo, os participantes de pesquisa foram cadastrados e agendados para a realização da primeira etapa dos procedimentos cirúrgicos (Anexo 5). Neste mesmo dia foram realizadas radiografias periapicais do dente com indicação para extração e em seguida a randomização dos participantes dentro dos grupos experimentais através do sistema de envelopes para depois iniciar os procedimentos de anestesia e cirurgia (extração). Antes das exodontias, as radiografias periapicais e moldagens foram realizadas pelo mesmo profissional e com o mesmo aparelho (ASTEX – OdontoMax 70/7P) para realização das tomadas radiográficas. Um guia cirúrgico foi confeccionado, referente a cada dente extraído. O guia cirúrgico englobava além do dente a ser extraído, os dois dentes adjacentes, um anterior e outro posterior. Este guia foi confeccionado com resina acrílica auto-polimerizável transparente. Com o intuito de evitar a possibilidade de obtenção de osso nativo no momento da obtenção da amostra, foi realizada uma perfuração de 3 mm de diâmetro no centro do alvéolo - quando se tratava de dente unirradicular, ou no centro da raíz mesial – quando se tratava de dentes multirradiculares, marcando assim a porção central da região preenchida. No momento em que o implante foi instalado, 3 ou 6 meses após a exodontia, o guia cirúrgico foi novamente adaptado no local, e uma broca trefina de 2 mm foi usada para a remoção de uma amostra de osso neoformado. Desta maneira, o osso/biomaterial removidos para análise histopatológica foram centrais a região implantada preservando o osso nativo que não foi removido. É importante enfatizar que o tecido removido, o seria de qualquer forma com a perfuração da primeira broca durante a instalação do implante, tendo esta metodologia sido utilizada em outras publicações prévias3-5,10,15,23,24,26.
4.5 Protocolo Cirúrgico
Todos os participantes foram submetidos a anestesia local através da injeção de lidocaína 2% com epinefrina 1:100.000 (Alphacaíne® 100, Nova DFL, Rio
de Janeiro, Brasil), na quantidade de acordo com o dente a ser extraído respeitando a dose máxima em mg/Kg. Em seguida, após ausência de sinais de dor, incisões intra-sulculares com bisturi nº3 e lâmina nº15 (Solidor®, Lamedid, São Paulo, Brasil)
foram realizadas para permitir a exposição das raízes e da crista alveolar. Os descolamentos muco periosteais foram realizados por vestibular e por lingual com
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instrumento descolador tipo Molt ( S.S. White Duflex, Rio de Janeiro, Brasil) para permitir uma visão adequada do alvéolo e para facilitar o fechamento primário da ferida cirúrgica. Após as exodontias os alvéolos dentários foram suavemente explorados, curetados e irrigados com solução salina fisiológica. Para o grupo coágulo sanguíneo(C) a sutura foi realizada com fio de seda 4-0 (J & J Ethicon®, São
Paulo, Brasil) sem o preenchimento alveolar em doze alvéolos dentários. Após o termino das cirurgia em todos os grupos, foi aplicado gel a base de clorexidina 0,2%(Perioxidin Gel®, Gross/Lacer©, Rio de Janeiro, Brasil) (Figura 6). Doze
alvéolos receberam o biomaterial 1 (B1, Figura 7), doze alvéolos receberam o biomaterial 2 (B2, Figura 8) e doze alvéolos receberam uma hidroxiaptatita com beta-tricálciofosfato já comercializada e disponível no mercado nacional (Bone Ceramic®, Straumann©, Basiléa, Suiça) (BC, Figura 9). O tecido gengival que
recobre os alvéolos foram suturados com fio de seda 4-0(J & J Ethicon®, São Paulo,
Brasil) utilizando pontos interrompidos. Em todos os casos a sutura foi realizada sem tensão.
Os pacientes receberam Azitromicina 500mg(Astro®, Eurofarma©, Rio
de Janeiro, Brasil), no dia da exodontia e durante mais 2 dias além de Dexametasona 4 mg( Decadron®, Aché, São Paulo, Brasil) uma vez ao dia durante 3
dias iniciando no dia da exodontia. Os participantes de pesquisa também foram instruídos a realizar a higiene oral através do uso de gel a base de clorexidina 0,2%( Perioxidin Gel®, Gross/Lacer©, Rio de Janeiro, Brasil), duas vezes ao dia, iniciando
no dia da cirurgia e mantendo por 30 dias, além de analgesia com 500 mg de paracetamol(Tylenol®, Janssen-Cilag, São Paulo, Brasil) só em caso de dor e até de
6/6 horas. Os participantes de pesquisa receberam as instruções pós-operatórias e os kits de medicamentos para o pós-operatório (Anexos 6 e 7).
As avaliações clínicas pós-operatórias foram realizadas em todos os voluntários 7 dias, 1 mês, 3 meses e 6 meses de acordo com os períodos experimentais para avaliação da cicatrização local, presença de necrose superficial e dor.
30
Figura 6: Sequência cirúrgica do grupo coágulo(C). Paciente do sexo feminino, 56 anos: A e B) aspecto intraoral do dente 46 a ser extraído; C) RX periapical confirmando fratura radicular; D) Alvéolo dentário vazio após a exodontia; E) Fratura radicular do 46; F) Alvéolo suturado.
Figura 7: Sequência cirúrgica do grupo B1. Paciente do sexo feminino, 66 anos: A) Aspecto intraoral do dente 23 a ser extraído; B) RX periapical do dente 23 confirmando lesão cariosacervical; C) Alvéolo preenchido com o biomaterial após a exodontia; D) Sutura da mucosa após deslizamento de retalho.
A B
31
Figura 8:Sequência cirúrgica do grupo B2. Paciente do sexo feminino, 52 anos: A) Aspecto intraoral do dente 36 a ser extraído; B) RX periapical confirmando fratura radicular do dente 36; C) Alvéolo preenchido com o biomaterial após a exodontia; D) ) Sutura da mucosa após deslizamento de retalho.
Figura 9: Sequência cirúrgica do grupo BC. Paciente do sexo feminino, 45 anos: A) Aspecto intraoral dos dentes 15 e 16 com fratura radicular a serem extraídos; B)Aspecto do alvéolo preenchido após a exodontia do 15 C) Aspecto dos alvéolos preenchidos após as exodontias dos 15 e 16; D) ) Sutura da mucosa após deslizamento de retalho.
32
4.6 Obtenção das Amostras
Após 3 e 6 meses da exodontia com ou sem o preenchimento alveolar, foi realizada a remoção de uma amostra com Trefina de 2 x 6 mm (SIN©, São Paulo,
Brasil) e a instalação imediata do implante dentário conforme o planejamento prévio (Figura 10).
Figura 10: Voluntário do sexo feminino, 66 anos de idade, que realizou a exodontia e enxerto com o Biomaterial 1. A) Aspecto clínico após 6 meses da extração do dente 23 e preenchimento alveolar; B) Aspecto cirúrgico da área enxertada com o B1 após 6 meses com o biomaterial integrado ao osso; C) Trefinagem da área enxertada para posterior processamento histológico da amostra removida; D) Implante instalado na área enxertada.
4.7 Processamento Histológico do Material Biológico
e Análise Histomorfométrica
As amostras removidas foram armazenadas em solução de formol a 10% tamponado em pH 7,2 e encaminhadas ao laboratório LABA (Laboratório de Biotecnologia Aplicada – Setor Histologia) da Universidade Federal Fluminense para iniciar os procedimentos de inclusão em parafina. Cinco amostras de cada grupo e
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período experimental foram obtidas para processamento e inclusão em parafina, totalizando quarenta amostras.
As amostras ósseas descalcificadas e incluídas em parafina foram utilizadas para a análise microscópica descritiva e histomorfométrica através dos quais analisamos a ocorrência dos seguintes eventos: tecido ósseo neoformado, presença de tecido conjuntivo fibroso e presença dos biomateriais remanescentes.
Figura 11: Padrão histomorfométrico realizado nas amostras incluídas em parafina e analizadas através do software ImageProPlus®.
A histomorfometria foi realizada através de análise digital das fotomicrografias capturadas das lâminas em parafina através de um microscópio de luz de campo claro (Nikon Eclipse E400, Tóquio, Japão) em aumento de 20x. Essas imagens foram capturadas pelo sistema CellSens® 1.9 Digital Imaging Software for
Research Applications.
Antes da colocação da lâmina na platina do microscópio, sua limpeza foi feita com lenço de papel para remoção de impurezas. A iluminação do microscópio foi mantida constante durante todas as sessões de captura de imagem, mantendo o potenciômetro da lâmpada de tungstênio na posição de 12h. A objetiva escolhida para a captura foi a de 20x por propiciar um bom campo de observação e ainda permitir o detalhamento morfológico do tecido. Em cada corte foram
34
capturados 5 campos corridos por varredura e sem sobreposição, correspondentes a amostra trefinada. Foram coletadas fotomicrografias de todos os grupos experimentais. A interface de captura foi disponibilizada pelo software Image J® v.
1.45. Primeiramente, a área total de interesse foi delimitada com o auxílio da ferramenta “freehand selections” e, logo após, essa mesma área, dentro da demarcação foi mensurada através da função “analize/mesure” e os valores gerados em pixels foram transferidos para a planilha do software Microsoft Excel®. As regiões
onde havia a presença de biomaterial foram delimitadas conforme descrito acima, assim como tecido conjuntivo e osso neoformado (Figura 11). Após a mensuração de cada área, todos os valores foram transferidos para o software Microsoft Excel® e
as áreas totais de cada região foram calculadas.
Os registros das informações quantitativas da análise histomorfométrica foram armazenadas em um banco de dados elaborado em planilha do software Microsoft Excel®. As imagens foram capturadas utilizando uma
câmera fotográfica digital acoplada ao microscópio de luz de campo claro com objetiva de 20X e analisadas utilizando o programa Image J ® v.1.45 (Microsoft©,
Washington, EUA).
4.8 Análise Estatística
A análise estatística entre os grupos foi realizada através da comparação entre a porcentagem de osso neoformado, biomaterial e tecido conjuntivo presentes em cada grupo. A descrição quantitativa das áreas foi representada através de descrição paramétrica com médias e desvio padrão. Na análise histomorfométrica o software GraphPad Prism 7 v 1.45 (GraphPad Software, Inc. La Jolla, CA, USA) foi utilizado para a realização dos valores médios e desvio padrão. Foi realizado o teste paramétrico de Shapiro-Wilks seguido de Análise de Variância (ANOVA) e teste de Tukey para a comparação entre os diversos grupos (p<0,05%).
35
37
Randomized clinical trial for the biological evaluation of two nanostructured biphasic calcium phosphate biomaterials as a bone substitute
Running Title: Clinical trial to evaluate two biphasic calcium phosphate
ABSTRACT
Background: The presence of non-resorbable residual granules of HA may
decrease the bone/implant interface. To balance resorption and bone formation, β-TCP compounds applied at different rates have been studied.
Purpose: The aim of this trial was to compare the clinical, histological, and
histomorphometric responses of two new β-TCP biomaterials in fresh dental sockets after three and six months.
Materials and Methods: Forty-eight volunteers were divided into 4 groups of 12
individuals in a random and double-blind manner: Clot (C), BoneCeramic® (BC),
Biomaterial 1 (B1), and Biomaterial 2 (B2) groups. Three and six months later, samples were obtained, and histological and histomorphometric sections were evaluated, focusing on the presence of fibrous connective tissue (CT) and newly formed bone. Statistical analysis was performed (p<0.05%).
Results: The quantification of crystalline phases showed that B1 was composed of
HA (60.28%) and β-TCP (39.72%); B2 was composed of HA (78.21%) and β-TCP (21.79%); and BC was composed of HA (61%) and β-TCP (39%). The B1 group showed the most newly formed bone (69.3%6.03%), followed by the BC (51.612.34%), B2 (46.67.66%), and C groups (45.47.98%), and less connective tissue and biomaterial remained in the B1 group after 6 months.
Conclusion: The B1 group samples showed the greatest amount of newly formed
38
INTRODUCTION
Ridge preservation measures, which include the filling of extraction sockets with bone substitutes, have been shown to reduce ridge resorption1. Human
re-entry studies recorded horizontal bone loss of 29 to 63% and vertical bone loss of 11 to 22% during the first 6 months after tooth removal2. A previous systematic
review showed that the alveolar ridge undergoes a mean horizontal reduction in width of 3.8 mm and a mean vertical reduction in height of 1.24 mm within 6 months after tooth extraction3. Moreover, the resorption rate can increase if any pathological
or traumatic process causes destruction of one or more of the alveolar bone walls. In this case, part of the defect will be filled by connective tissue, which consequently influences both the planning and predictability of osseointegration4. Furthermore,
dental implant placement at locations with insufficient bone can cause changes in the shape and length of the prosthetic crowns, battlements, and emergence profile, leading to unsatisfactory aesthetic and functional results5-7.
Considering the difficulties related to obtaining autogenous grafts, as well as their unpredictability, experts have been using different resorbable osteoconductive biomaterials to fill post-extraction sockets to maintain a more adequate bone volume and preserve an alveolar architecture that will favor dental implant installation1, 6-13. HA, the main constituent of the inorganic phase of bone, is
employed in various areas of medicine and dentistry due to its chemical and structural characteristics. Compound and pure synthetic forms of HA do not cause an exacerbated or undesired inflammatory response and are neither antigenic nor carcinogenic. Additionally, they may serve as mineral a tank promoting bone formation and are considered by some authors to be bioactive materials, making them potentially suitable as a substitute material for human bone implants and prostheses11, 14, 15. However, the presence of non-resorbable residual granules of HA
in the socket may decrease the bone/implant interface4. Thus, the indication for its
use is related to the morphology of the socket, the extent of the defect and the desired type of repair16.
There are many processes involved in the synthesis of apatites, resulting in materials with various physicochemical and biological characteristics, which may make them more or less bioabsorbable14. Among the available calcium
phosphate-based ceramics, synthetic β-tricalcium phosphate ceramics (β-TCP) are osteoconductive biomaterials with an enormous capacity for reabsorption, presenting
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very satisfactory clinical and histological results compared with other ceramics, both in animals and in humans7, 6, 12, 13, 17-19. However, pure compounds of β-TCP do not
present a balance between the resorption rate and bone formation. Thus, β-TCP has been combined with HA with the aim of maintaining a framework in the implanted area for a longer time due to the inability of HA to be reabsorbed. β-TCP is absorbed more rapidly, allowing the creation of spaces to be filled by osteoprogenitor cells and speeding up the process of bone regeneration13, 19-21. Advances in nanotechnology
open up new possibilities for producing biomimetic materials that resemble the in vivo cell growth environment at a nanoscale level22. Nanotechnology involves the creation
of functional materials, devices, and systems through the control of matter at a nanometer length scale (1–100 nm). The application of nanotechnology to biomedical materials is explained by the ability of cells to interact with nanometric features23.
To establish the best biological response in humans, this study aimed to histologically and histomorphometrically assess two nanostructured synthetic biphasic calcium phosphate biomaterials and to compare them with another synthetic commercially available biomaterial that is widely used in dentistry (BoneCeramic®).
MATERIALS AND METHODS
Biomaterial physicochemical characterization
Prior to implantation in sockets, both biomaterials were characterized in the Biomaterials Laboratory (LABIOMAT) of the Brazilian Center for Physics Research (CBPF) and at the National Institute of Metrology, Quality and Technology (INMETRO). Scanning electron microscopy (SEM - FEI Quanta FEG 250) allowed the biomaterial surface morphology to be examined. Raman spectroscopy (RAMAN - Renishaw InVia, with a 514 nm line, 1 mW power and 100X objective) was employed to determine the chemical groups present in the biomaterials. X-ray diffraction (XRD – CuKa Radiation, ZeissHZG4) identified the crystalline mineral phases present in the samples. To determine the percentage of the phases of each biomaterial, a curve with known percentages of HA and ß-TCP was generated, and the areas of the peaks in the respective phases were then calculated. The same procedure was performed in samples of biomaterial 1 (B1), biomaterial 2 (B2) and BoneCeramic® (BC).
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Subject volunteers
This study was performed in compliance with the principles outlined in the Declaration of Helsinki regarding experimentation involving human subjects. Quality assessment was carried out based on the RCT checklist of the CONSORT statements24. All procedures and materials applied in the present study were
approved by the Committee on the Ethics of Human Research at Fluminense Federal University (CEP/HUAP no. 59004), and the volunteer subjects were informed about the study protocol and required to sign a consent form.
Forty-eight individuals (18 men and 30 women) in good general health with ages ranging from 18 to 66 years were eligible for participation in this study according to specific exclusion and inclusion criteria (Table 1). After thorough clinical and radiographic examination and immediately before surgical procedures, subject volunteers were divided randomly and blindly into 4 groups of 12 individuals using numbered and sealed envelopes: Clot group (C), BoneCeramic® group (BC), Biomaterial 1 group (B1), and Biomaterial 2 group (B2). Each group was then divided into two experimental periods of 3 or 6 months. The assignment was hidden from the clinical operators until the envelopes were opened. The outcome examiners remained blinded to the group assignments.
41
Surgical Protocol
All volunteers underwent surgery for tooth extraction as indicated, under local anesthesia using 2% lidocaine with 1:100,000 norepinephrine (ALPHACAINE® 100, New DFL, Rio de Janeiro, Brazil), respecting the maximum dose in mg/kg. After extraction, the sockets were gently explored and irrigated with a 0.9% saline solution. Each group of 12 sockets received biomaterial 1 (B1), biomaterial 2 (B2) or BoneCeramic® (BC). The gum tissue overlying the biomaterial was primarily sutured with 4-0 silk ((J&J ETHICON®, Sao Paulo, Brazil). For the Clot group (C), suturing was performed without socket filling. In all cases, a simple and interrupted suture was realized without tension. The patients received Azithromycin 500 mg/day (ASTRO®, Eurofarma, Rio de Janeiro, Brazil) and dexamethasone 4 mg/day (DECADRON®, Aché, São Paulo, Brazil) for 3 days, starting 1 hour before surgery. For analgesia, paracetamol 750 mg 6/6 hours (Tylenol®, Janssen-Cilag, São Paulo, Brazil) was used as needed. The volunteers were instructed to apply Chlorhexidine 0.2% gel over the wounds twice a day for 30 days. All patients received postoperative instructions and medical kits. Postoperative evaluation was performed on all volunteers at seven days, one month, three months, and 6 months.
Sample Processing
After 3 and 6 months, one sample was removed from each socket with a trephine bur (2x6 mm) in the most central region of the grafted socket. Immediately after obtaining the samples, dental implants were installed (SIN®, São Paulo, Brazil) for subsequent oral rehabilitation. Six samples from each group/experimental time were fixed in formaldehyde solution, embedded in paraffin, cut to a thickness of 5 μm and then stained with hematoxylin and eosin (HE) for descriptive and histomorphometric analysis, where the presence of newly formed bone tissue, fibrous connective tissue, and remaining biomaterials was recorded in a total of forty samples. Histomorphometrical evaluation was performed through digital image analysis of photomicrographs of the decalcified samples taken using a bright-field light microscope (Nikon Eclipse E400, Tokyo, Japan) under 20x objective magnification.
42
These images were captured with CellSens® system 1.9 Digital Imaging Software for Research Applications. The capture interface was provided by the software ImageJ® v. 1.45 (http://imagej.nih.gov/ij). Regions containing the biomaterials were defined, as were those containing connective tissue and newly formed bone. After the measurement of each area, all values were calculated and transferred to a Microsoft Excel® spreadsheet.
Statistical Analyses
All data passed the Shapiro-Wilk normality test (alpha=0.05). The means and standard deviations of each analyzed parameter were subjected to analysis of variance (ANOVA) and Tukey’s multiple comparisons test (alpha=0.05) using the software GraphPad Prism 7® (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA).
RESULTS
The analysis of biomaterial surfaces via SEM before implantation showed B1 and B2 to be less compact, with a roughness greater than that of BC (Figure 1).
The RAMAN analysis of the two samples showed quite similar and compatible spectrograms with calcium phosphate. The low-intensity band located at 1076 cm-1 may be indicative of the presence of carbonate, while the other bands all
represent phosphate groups (PO4-3) (Figure 2).
The purpose of XRD analysis was to compare the diffraction patterns obtained from the biomaterials with the standard diffractometric individual phases
43
available from the Joint Committee of Powder Diffraction Standards (JCPDS) for the various calcium phosphates. The diffraction patterns showed that there was partial decomposition of hydroxyapatite to tricalcium phosphate, characterized by the presence of a biphasic material with HA and ß-TCP peaks (Figure 3). The results regarding the percentages of the HA and ß-TCP phases in each biomaterial are described below (Table 2).
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Figure 1: Scanning electronmicroscopy (SEM) micrographs of B1, B2 and BC at 800X and 40,000 X magnification (scale bar=100 μm and 2 μm). Morphology surface before implantation showed B1 and B2 to be less compact with more roughness when compared to BC.
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Figure 2: Raman spectrograms of B1, B2 and BC.The RAMAN analysis for both samples showed quite similar and compatible spectrograms with the calcium phosphate.
46
Figure 3: X ray diffraction pattern (XRD) of B1, B2 and BC samples. Diffraction patterns showed that there was a partial decomposition of hydroxyapatite to tricalcium phosphate that is characterized by the presence of a biphasic material with HA and ß-TCP peaks.
Table 2: The percentage of HA and β-TCP phases in each biomaterial
Clinical Observations
The distribution of the subject volunteers according to age, gender and tooth site is summarized in Table 3. All volunteers exhibited clinical healing that was free of infection, pain, or swelling. Complete soft tissue closure was observed at one month after extraction and biomaterial implantation in both experimental groups. After
47
3 and 6 months of healing, when the bone specimen samples were obtained, and the dental implants were installed, the B1 and BC groups appeared to show the same resistance upon the application of the trephine.
Table 3: Volunteer subjects allocation after randomization.
Descriptive Histological Analysis and Histomorphometric Evaluation
After 3 months, the B1 and B2 samples showed areas of newly formed bone in close contact with the biomaterial and loose connective tissue areas. In the BC samples, we noted a large amount of organized connective tissue interspersed between the biomaterial and small areas of newly formed bone. The analysis of the Clot group (C) showed the presence of some bone trabeculae interspersed with large areas of connective tissue (Figure 4).
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Figure 4: Photomicrographs of (B1), (B2), (BC) and (C) samples after 3 months. CT – Conective Tissue; Bio – Biomaterial; NFB – New Formed Bone. Stain HE, 4X and 20X augmentation
After 6 months, in samples from the B1 and B2 groups, considerable areas of newly formed bone had appeared, many of which were in close contact with B1 or B2 granules, and interspersed biomaterials and small areas of loose connective tissue were still present. The BC group showed an increased amount of bone trabeculae with many osteocytes and fibrous connective tissue. Finally, the C group exhibited the presence of newly formed bone with small areas of connective tissue almost exclusively (Figure 5).
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Figure 5: Photomicrographs of (B1), (B2), (BC) and (C) samples after 6 months. CT – Conective Tissue; Bio – Biomaterial; NFB – New Formed Bone. Stain HE, 4X and 20X augmentation.
The analysis of the mean and standard deviation of the amounts of newly formed bone areas, biomaterial, and connective tissue in each group/experimental period is summarized as follows. The newly formed bone area in the B1 group after 6 months was greater than that in the B2 and BC groups (p<0.05). After the period of 3 months, there were no significant differences between the experimental groups with respect to the newly formed bone area (p>0.05). No group showed significant differences between 3 and 6 months, with all groups except the B1 group exhibiting similar results to the Clot group after 6 months. In fact, the B1
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group showed an increase in bone density of 156% (p<0.05) after 6 months. We also found a statistically significant difference (p>0.05) in the presence of residual biomaterial between the B1 and BC groups after 3 months and between the two experimental periods in the B1 group. There were no statistically significant differences between the biomaterial groups with respect to connective tissue after 3 or 6 months (Figure 6).
Figure 6: Relative area of newly formed bone for the B1, B2 and BC groups at 3 and 6 monthspost-implantation. Observe the statistically significant difference (p>0.05) between B1 and BC groups after
51
DISCUSSION
Physicochemical, histological, histomorphometric, and clinical results are presented herein. During the clinical follow-up, we did not note any complications that could influence the results of this study. According to one study on the use of BoneCeramic® in the maxillary sinus floor after 6 months and another on the use of β-TCP to repair mandible defects after 3 months, we observed an adequate bone height and horizontal dimension in the grafted area at the time of sample collection and during the subsequent installation of the implants in both experimental periods and experimental groups in which the biomaterials were used19, 25.
Because ß-TCP-based compounds exhibit a better organic response either alone or in combination with osteogenic substances, along with their biocompatibility and osteoconductive potential, several studies have compared their biological behavior as a bone substitute based on scientific evidence from commercially available materials18, 26-31. It was shown previously that the bioactivity of
these biomaterials is related to the respective amounts of HA and ß-TCP in each compound33. Some clinical studies have shown the advantages of alveolar filling
immediately after tooth extraction for the preservation of bone architecture for subsequent implant placement6, 12, 34-37. Systematic reviews have summarized the
advantages of post-extraction alveolar filling for maintaining the dimensions of the alveolar bone ridge3, 38.
Here, we compared two biomaterials with distinct HA:ß-TCP ratios (60:40 and 78:28%) with a commercially available biomaterial (BC, 61:39% ratio), which were evaluated using physicochemical methods (SEM, XRD and Raman spectra). We employed a curve with a known percentage of hydroxyapatite and ß-TCP to calculate the percentages of the phases. A randomized and blinded controlled clinical trial was subsequently conducted, which showed that the use of B1 resulted in significantly more new bone and less biomaterial and connective tissue than that observed in the clot and B2 groups, whereas B1 presented similar results to the BC group 6 months after surgery,without any complications. The clinical data support the notion that the biological response was derived from the higher ß-TCP content in these biomaterials.
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We also noted a statistically significant decrease in the amount of connective tissue in the groups implanted with ß-TCP in both the 3- and 6-month periods compared with the Clot group. In a previous study, inhibition of fibroblastic proliferation by metabolites of β-TCP degradation and a local decrease in pH were observed during the process of chemical dissolution of β-TCP particles, which can slow or even block fibrous tissue formation, favoring bone regeneration12.
Histological analyses also showed areas of osteoid tissue among connective tissues located around and in intimate contact with the remaining biomaterial in both experimental groups, suggesting osteoconductive properties, as demonstrated by previous studies involving ß-TCP19, 29. It is noteworthy that the
largest amount of new bone formation was associated with the lowest amount of remaining biomaterial in the B1 group after 6 months compared with the other tested materials and the C group. We believe that such a specific difference cannot simply be justified by the fact that the chemical composition of B1 presents a lower ratio of HA:ß-TCP, which may have led to greater absorption of ß-TCP, resulting in the formation of numerous spaces to be filled by osteoprogenitor cells and thereby increasing bone regeneration13, 19-21, 33; however, these results could also be
attributed to the route of synthesis and structural characteristics of B1.
Taken together, these results indicate that biphasic calcium phosphate (ß-TCP and HA) is a useful biomaterial for treating bone defects and preserving the alveolar ridge for implant placement.
CONCLUSION
Upon completion of this clinical trial, we concluded that from a clinical point of view, both experimental materials are easy to handle and are excellent materials for use in alveolar filling. Radiographically, these materials are sufficiently radiopaque to be monitored through imaging examinations. Both materials are biocompatible and osteoconductive, and both allowed the installation of implants after 3 and 6 months without complications or loss of the implants and preserved the
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alveolar architecture. The Biomaterial 1 group showed the greatest amount of newly formed bone, less connective tissue and less remaining biomaterials after 6 months compared with the other groups. Both materials proved to be safe and effective for use in humans.
54
55
Os resultados obtidos neste trabalho nos permitem concluir que, sob o ponto de vista clínico, os biomateriais B1 e B2 são fáceis de manusear e excelentes para uso no preenchimento alveolar. Radiograficamente, são suficientemente radiopacos para serem monitorados após a implantação. B1 e B2 são biocompatíveis e apresentam capacidade osteocondutora, preservando a arquitetura alveolar e permitindo a instalação de implantes após 3 e 6 meses sem complicações ou perda dos mesmos. O grupo B1 mostrou maior quantidade de osso neoformado e menor quantidade de tecido conjuntivo e biomaterial remanescente após 6 meses quando comparado aos demais grupos experimentais. Tanto B1 quanto B2 provaram ser seguros e eficazes para uso em humanos.
56
57
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