Perfil de alterações genômicas em angiofibromas nasofaringeos juvenis

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Sara Martorelli da Silveira

Perfil de Alterações Genômicas em

Angiofibromas Nasofaringeos Juvenis

Botucatu-SP Julho - 2008

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Sara Martorelli da Silveira

Perfil de Alterações Genômicas em

Angiofibromas Nasofaringeos Juvenis

Botucatu-SP 2008

UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA

Instituto de Biociências

Dissertação apresentada ao programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas (Genética) do Instituto de Biociências da Universidade Estadual Paulista, como requisitos para obtenção do título de Mestre.

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“É proibido chorar sem aprender, Levantar-se um dia sem saber o que fazer

Ter medo de suas lembranças. É proibido não rir dos problemas

Não lutar pelo que se quer, Abandonar tudo por medo, Não transformar sonhos em realidade.

É proibido não demonstrar amor

Fazer com que alguém pague por tuas dúvidas e mau-humor. É proibido deixar os amigos

Não tentar compreender o que viveram juntos Chamá-los somente quando necessita deles. É proibido não ser você mesmo diante das pessoas,

Fingir que elas não te importam, Ser gentil só para que se lembrem de você,

Esquecer aqueles que gostam de você. É proibido não fazer as coisas por si mesmo,

Não crer em Deus e fazer seu destino, Ter medo da vida e de seus compromissos, Não viver cada dia como se fosse um último suspiro. É proibido sentir saudades de alguém sem se alegrar,

Esquecer seus olhos, seu sorriso, só porque seus caminhos se desencontraram, Esquecer seu passado e pagá-lo com seu presente.

É proibido não tentar compreender as pessoas, Pensar que as vidas deles valem mais que a sua, Não saber que cada um tem seu caminho e sua sorte.

É proibido não criar sua história, Deixar de dar graças a Deus por sua vida, Não ter um momento para quem necessita de você, Não compreender que o que a vida te dá, também te tira.

É proibido não buscar a felicidade, Não viver sua vida com uma atitude positiva,

Não pensar que podemos ser melhores...”

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A Deus... “Ainda que eu tenha o dom de profetizar e conheça todos os mistérios e toda a ciência: ainda que eu tenha tamanha fé, a ponto de transportar montanhas, se não tiver amor, nada serei.” (Trecho da Carta de São Paulo aos Coríntios)

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Aos meus pais, João César e Vitória, aos meus irmãos César e Karinna, por todo amor e apoio incondicionais.

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A Deus...

... “Eu pensei muitas vezes parar e não dar nem resposta. Eu pensei na fuga

esconder-me, ir longe de Ti, mas Tu és a minha rocha e a minha fortaleza; assim, por amor do teu nome, guia-me e encaminha-me.”

(Salmos 31:3)

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A minha professora...

...Dra. Silvia Regina Rogatto

Comecei com a palavra “câncer”. Ouvi seu nome em uma aula de biologia celular. Conheci a pesquisadora em um Workshop de genética. Então, comecei a admirá-la pelo trabalho idôneo, competência e respeito pela ciência. Hoje posso dizer que a admiro pelo respeito, apoio, amizade, carinho, ensinamentos, cobranças e disposição. Agradeço pela oportunidade e confiança e, principalmente, por acreditar em cada um de nós.

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A minha família... Aos meus pais...

...Vitória e João César que representam o começo da minha vida, de um sonho que estamos construindo juntos, em cada passo dado sempre segurando a minha mão ou olhando de longe, pelas noites mal dormidas e peraltices no portão, cada palavra amável e dura, incentivo e repressão na hora certa e também na hora errada porque, assim, eu aprendi que errar também fortalece. Eu os admiro profundamente pelo caráter, simplicidade, perseverança, garra e doação incondicional! Obrigada por serem minha lição de vida e minha fortaleza! Amo vocês!

Aos meus irmãos...

...César (Totozi) e Karinna (Kaka) pela amizade, respeito, cumplicidade, brigas, abraços, apelidos, palavras de conforto e carinho, apoio e incentivo em cada momento da minha vida e, principalmente por fazer com que nossa convivência seja eternamente lúdica. Eu os amo, admiro e respeito!

Aos meus avos...

... Paschoalina e Jayme (in memoriam), Jacira (in memoriam) e José (in memoriam) que são exemplos de família, união, fraternidade, simplicidade, respeito e superação que estarão presentes eternamente em minha vida.

Aos tios e primos...

...que estiveram sempre ao meu lado dando apoio e alegria, tornando nossa família unida, mesmo diante da distância.

A Lílian...

...que entrou na nossa família (“cunhadinha”) à algum tempo e vem nos conquistando como uma pessoa amiga, companheira e muito forte.

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Aos amigos...

“O tempo que ganhamos

com cada amigo que fazemos faz cada dia tão importante. Porque tempo gasto com amigos é tempo ganho, aproveitado, vivido.

São lembranças para cinco minutos depois ou anos até.

Um amigo se torna importante pra nós, e nós para ele, quando somos capazes, mesmo na sua ausência, de rir ou chorar,

de sentir saudade e nesse instante trazer o outro bem pertinho da gente. Podemos ter vários melhores amigos de diferentes maneiras.

O importante é saber aproveitar o máximo cada minuto vivido e ter depois no baú das recordações horas para passar com os amigos,

mesmo quando estes estiverem longe dos nossos olhos.”

... Perecila (Priscila), Ferdinanda (Fernanda), Rê (Renata), Fá (Fabíola), Casseta (Cássia), Li (Eliane), Nádia, Carinha´s(Eloisa) e Miriam Rios (Miriam).

Cada uma com um jeitinho completamente diferente da outra: uma fala e fala, é quase um monólogo. A outra fala com o olhar. Uma faz você rir e a outra ri sem parar. Uma come e come, a outra quer uma pílula de refeição. Uma chora e chora, a outra segura o choro e segura sua mão. Vocês são especiais porque me fizeram ver a vida com um olhar mais leve, alegre. Pessoas íntegras que eu respeito e admiro. Agradeço a Deus por colocá-las na minha vida!

...Satie e Érica (Poia)

Eu jamais esquecerei os bons momentos compartilhados! Obrigada por todo carinho e amizade!

...Aninha e Pitu (Alline)

Agradeço por cada festa, segredo compartilhados, caminhos descobertos, amizade verdadeira resistente à distância e ao tempo. Levarei comigo cada lembrança!

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Aos companheiros de profissão...

... Sandra, Flávia, Lívia, Luciana, Érica, Fábio e Greicy me auxiliarem em todos os momentos, sejam eles profissionais ou pessoais, durante a minha caminhada.

...Fabriiiiiicio (Fabrício) e Roberval (Rodrigo) companheiros de citogenética (periodicamente, no caso do Fabrício e vitalício, no caso do Roberval!) sempre alegres e mal-humorados, amigos, mas acima de qualquer coisa, exemplos de caráter, obstinação e sobrevivência no mundo feminino.

...Camila, Priscila Donato, André (Botucatu) e André (Peruano) que nos dão respaldo para facilitar a efetivação de nossos trabalhos.

...Carlito, Silvana e Jú pelas conversas e pelo laboratório sempre cheiroso e limpinho. Além disso, por demonstrarem que a vida é bela quando a olhamos pelos olhos da simplicidade e da alegria.

A Dra. Maria Mitzi Brentani e ao Dr. Ossamu Butugam por nos cederem as amostras e os dados clínicos dos pacientes, e primordialmente, por acreditar no trabalho desempenhado pela nossa equipe.

A Dra. Maria Aparecida Custódio pela microdissecção de todas as amostras e por me ensinar um pouquinho sobre a etiologia e desenvolvimento destes tumores.

A Profa. Dra. Cláudia Aparecida Rainho que permitiu a realização do meu estágio de docência sob sua orientação. Foi um grande aprendizado.

A Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pelo apoio financeiro.

A Universidade estadual Paulista (UNESP), aos docentes do Departamento de Genética e ao conselho de Pós-graduação do Instituto de Biociências de Botucatu pela estrutura, ensino e formação de excelência.

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Aos Pacientes que cederam um pedacinho da sua história para idealização deste trabalho e, primordialmente, confiaram em cada promessa de esperança. Minha sincera gratidão a esses heróis que munidos pela crença em vencer cada dia, ensinam-nos a lutar pela vida.

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Sumário

Índice de Figuras... i

Índice de Tabelas... ii

Lista de Siglas e Abreviaturas... iii

Resumo... v

Abstract... vi

I- Introdução... 01

1. Angiofibroma Nasofaríngeo Juvenil... 01

2. Influência dos Hormônios Sexuais e Seus Receptores... 03

3. Fatores de Crescimento... 06

4. Genes Supressores Tumorais e Oncogenes... 09

5. Análise Citogenética... 13

6. Hibridação Genômica Comparativa Cromossômica (CGH)... 15

II- Objetivos... 20

III- Material e Métodos... 21

1. Caracterização das Amostras... 21

2. Microdissecção das Amostras... 23

3. Extração do DNA... 23

4. Hibridação Genômica Comparativa de Alta Resolução (HR-CGH)... 24

4.1. Marcação e Hibridação... 24

4.1.1. NICK TRANSLATION... 24

4.1.2. SCOMP... 24

4.2. Preparações Cromossômicas... 27

4.3. Condições de Hibridação e Tratamento Pós-Hibridação... 28

4.4. Seleção e Captura de Imagens... 29

5. RT-PCR Quantitativa em Tempo Real... 30

5.1. Extração de RNA total... 30

5.2. Digestão do DNA e transcrição reversa... 31

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5.4. Análise Estastística... 34

IV- Resultados... 35

1. Análise das alterações genômicas... 35

2. Análise de expressão dos genes B-catenina e AR... 51

3. Análise de alterações genômicas e de expressão dos genes AR e B-catenina... 57

V- Discussão... 59

VI- Conclusões... 83

VII- Referências Bibliográficas... 84

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i

Índice de Figuras

Figura 1. Padrão de marcação da HR-CGH para a amostrA 12 marcada pela metodologia de NICK TRANSLATION... 36 Figura 2. Padrão de marcação da HR-CGH para a amostra 12 microdissecada no componente estromal e marcada pela metodologia de SCOMP... 37 Figura 3. Padrão de marcação da HR-CGH para a amostra 12 microdissecada no componente endotelial e marcada pela metodologia de SCOMP. ... 38 Figura 4. Caracterização das regiões mínimas das alterações no número de cópias do DNA identificadas por HR-CGH nas 18 amostras de JNA não microdissecadas (NICK TRANSLATION)... 45 Figura 5. Ideograma demonstrando as regiões de ganhos e perdas genômicas nos nove casos microdissecados nos componentes endotelial e estromal... 48 Figura 6. Curvas-padrão dos genes alvo AR, B-catenina e endógeno GAPDH... 52 Figura 7. Curvas de amplificação dos genes alvo AR, B-catenina e endógeno GAPDH ... 53 Figura 8. Curvas de dissociação dos genes alvo AR, B-catenina e endógeno GAPDH... 54 Figura 9. Análise dos níveis de expressão dos genes B-catenina (3p21) e AR (Xq11.2-q12) em 18 amostras de ANJ... 55

(15)

ii

Índice de Tabelas

Tabela 1. Síntese das análises dos receptores hormônios sexuais em ANJ... 06

Tabela 2. Principais fatores de crescimento associados com patogênese dos ANJ... 07 Tabela 3. Alterações cromossômicas freqüentemente observadas em ANJs..

.

14

Tabela 4. Informações clínicas e histopatológicas das 18 amostras de ANJ.... 22 Tabela 5. Caracterização das regiões mínimas das alterações no número de cópias do DNA identificadas por HR-CGH (p<0,05) em cada uma das 18 amostras de JNA não microdissecadas (NICK TRANSLATION)... 40

Tabela 6. Regiões mínimas comuns de perdas e ganhos genômicas em nove angiofibromas nasofaríngeos juvenis, considerando a análise dos componentes endoteliais e estromais... 49

Tabela 7. Regiões consistentes de perdas e ganhos comuns entre as mesmas amostras microdissecadas (presente nos dois componentes isolados) e não microdissecadas... 50

Tabela 8. Determinação da eficiência da qRT-PCR para os pares de iniciadores dos genes alvo e endógeno... 52

Tabela 9. Resultados da análise de expressão avaliados pela RT-PCR quantitativa dos genes AR, B-catenina e endógeno GAPDH em amostras de angiofibroma nasofaríngeo juvenil e cornetos nasais... 56

Tabela 10. Correlação entre as alterações no número de cópias em 3p21 e Xq12 e padrão de expressão dos genes -catenina e AR em 18 amostras de angiofibromas nasofaríngeos juvenis... 58

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iii

Lista de Siglas e Abreviaturas Genes

AR Androgen receptor (Receptor de andrógenos)

ESR1 Estrogen recepor 1 (Receptor estrógeno 1) ESR2 Estrogen recepor 2 (Receptor estrógeno 2)

PGR Progesterone receptor (Receptor de progesterona)

VEGF Vascular endothelial growth factor A (Fator de crescimento endotelial vascular A) VEGFR2 Vascular endothelial growth factor receptor 2 (Receptor do fator de crescimento

endotelial vascular 2)

TGFB1 Transforming growth factor beta 1 (Fator de crescimento transformante-beta 1) TGFB2 Transforming growth factor beta 2 (Fator de crescimento transformante-beta 2) TGFB3 Transforming growth factor beta 3 (Fator de crescimento transformante-beta 3) FGFb Fibroblast growth factor basic (Fator de crescimento de fibroblastos básico)

PDGFA Platelet-derived growth factor alfa (Fator de crescimento derivado de plaquetas A) PDGFB Platelet-derived growth factor beta polypeptide (Fator de crescimento derivado de

plaquetas B

IGF2 Insulin-like growth factor 2 (Fator de crescimento semelhante à insulina-2 NGF Nerve growth factor (Fator de crescimento dos neurônios)

BMP4 Bone morphogenetic protein 4 (proteína morfogênica óssea-4) Bcl2 B-cell lymphoma 2 (linfoma de células B 2)

Kit v-kit Hardy-Zuckerman 4 feline sarcoma viral oncogene homolog

H19 H19, imprinted maternally expressed transcript (non-protein coding (H19, Transcrito expresso em imprinting materno-não codifica proteína)

APC Adenomatous polyposis coli (adenomatose polipose coli)

GSK3B Glycogen synthase kinase 3 beta (Glicogênio Sintase Quinase 3 beta) B-catenina Catenin (cadherin-associated protein) beta 1 (Catenina beta 1)

TP53 Tumor protein p53 (Proteína tumoral p53)

Kras v-Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog (oncogene) Hras v-Ha-ras Harvey rat sarcoma viral oncogene homolog (oncogene) cMYC v-myc myelocytomatosis viral oncogene homolog (oncogene)

ERBB2 v-erb-b2 erythroblastic leukemia viral oncogene homolog 2 (Receptor do fator de crescimento epidermal 2)

AURKA Aurora kinase A (quinase aurora A)

MDM2 Mdm2 p53 binding protein homolog (protein moduladora do p53)

Auxin Auxina

Tcf T-cell factor (Fator células T- transcrição)

LEF Lymphoid enhancer factor (Fator estimulante linfóide- fator transcrição) Cyclin D1 Ciclina D1

GAPDH Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase

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iv Metodologias

LOH Loss of heterozigos(perda de heterozigose)

FISH Fluorescence in situ hybridization (hibridação fluorescente in situ)

CGH Comparative genomic hybridization (Hibridação Genômica Comparativa)

HR-CGH High Resolution Comparative genomic hybridization (Hibridação Genômica Comparativa de Alta Resolução)

CGHarray Array-based Comparative genomic hybridization (Hibridação Genômica

Comparativa baseada em microarrays)

PCR Reação em cadeia da polimerase

qRT-PCR PCR quantitativa em tempo real IHQ Imunohistquímica

Geral

ANJ Angiofibroma nasofaíngeo juvenil

FAP Pólipose Adenomatosa Familial

MCR Região de agrupamento de mutações

Mutações frameshift

Mutações que alteram a matriz de leitura do DNA (inserção ou deleção de um ou mais nucleotídeos)

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Resumo Silveira, SM

v

O Angiofibroma Nasofaríngeo Juvenil (ANJ) é um tumor vascular e localmente invasivo e, por ocorrer predominantemente em adolescentes do sexo masculino, sugere-se que é uma neoplasia hormônio dependente. Embora seja um tumor bastante raro e de crescimento lento, o ANJ pode progredir para lesões avançadas, tendo sérias seqüelas para seu portador. Por estas razões, este tumor pouco relatado em literatura é um modelo interessante para análise de alterações genômicas e moleculares. Neste estudo foi utilizada a metodologia de hibridação genômica comparativa de alta resolução (HR-CGH) para a triagem de perdas e ganhos cromossômicos em 18 amostras de ANJs. Em nove destes casos, as células endoteliais e os fibroblastos foram isolados por microdissecção a laser e analisados separadamente por HR-CGH. As regiões genômicas consistentemente alteradas foram investigadas em bancos de dados com o objetivo de identificar genes candidatos que pudessem estar relacionados com a etiologia destes tumores. Baseando-se na função e localização, dois genes foram selecionados e validados pela análise de expressão quantitativa em tempo real (qRT-PCR) em 18 amostras de ANJs. Entre os 18 ANJs, foram detectadas 281 regiões genômicas preferencialmente alteradas. A análise dos componentes celulares isolados revelou aproximadamente 90 regiões cromossômicas significativamente alteradas. Os ganhos genômicos foram mais prevalentes nas células endoteliais do que nas células estromais. Regiões consistentes de perdas e ganhos comuns entre as mesmas amostras microdissecadas (dois componentes isolados) e não microdissecadas revelaram concordância de 58%. A análise individualizada dos dois componentes celulares presentes no tumor mostrou diversas regiões significativamente alteradas incluindo 3p, 4q, 8q, 16q e X. Ganhos em 8q21-q22, 4q25 e Xq11.2-q12 foram detectados nos dois componentes celulares. Perdas em 16q22 foram freqüentemente observadas nas células estromais (8/9 casos) e ganhos em 3p21 nas células endoteliais (4/9 casos). Há evidências que o AR é ativado a transcrever pela B-catenina e alterações nestes genes tem sido correlacionadas com ANJ. Baseado nos resultados da HR-CGH e em dados da literatura, os níveis de expressão dos genes B-catenina e AR foram avaliados pela qRT-PCR em 18 ANJ. Em onze casos, foi detectado um alto nível do transcrito B-catenina, confirmando os resultados de HR-CGH. A expressão aumentada do gene AR foi detectada em seis casos. Foi observada uma correlação positiva entre os níveis de expressão dos genes B-catenina e AR (P<0,0001, r=0,8204) sugerindo o envolvimento destes genes em ANJ. A expressão aumentada dos transcritos AR e B-catenina sugere que alterações na via Wnt/B-catenina podem estar associadas com o desenvolvimento destes tumores. Além disso, a presença de alterações genômicas consistentes nos dois componentes celulares dos ANJs indica que o estroma tem papel importante na origem ou progressão destes tumores.

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Abstract Silveira, SM

vi

Juvenile Nasopharyngeal Angiofibroma (JNA) is a locally invasive vascular tumor that occurs predominantly in male adolescents, suggesting that the tumor may be hormone-dependent. Although this tumor is rare and presents a slow growth, JNA may evolve to advanced lesions, resulting in severe consequences for the patient. For these reasons, this tumor, which is scarcely reported on literature, is an interesting subject to research for genomic and molecular alterations. In this study, the high-resolution comparative genomic hybridization (HR-CGH) methodology was performed to screening of genomic gains and losses in 18 JNA samples. In nine out of 18 cases, the endothelial and stromal components were isolated by laser microdissection and they were analyzed by HR-CGH separately. The consensus abnormal genomic regions were investigated using databases to identify potential candidate genes which could be associated to JNA etiology. According to the function data, two potential genes were selected and validated in a second group of 18 JNA samples by quantitative real-time reverse transcriptase-polymerase chain reaction (qRT-PCR) method. In 18 JNA cases, were observed 281 significant altered genomic regions. The differential analysis of the endothelial and stromal components identified about ninety significant altered chromosomal regions. The genomic gains were more prevalent in endothelial than fibroblasts cells. The comparison between non-microdissected and microdissected sample HR-CGH data showed concordance in 58% genomic regions. The individual analysis of each cellular component identified many chromosome regions significantly altered, including 3p, 4q, 8q, 16q e X. Gains in 8q21-q22, 4q25 and Xq11.2-q12, were detected in both endothelial and fibroblastic components. Genomic losses on 16q22.1 were frequently observed in stromal cells (8/9 cases) and 3p21 gain in endothelial cells (4/9 cases). There are some evidences that AR transcription is activated by B-catenin and beside alterations on AR status has been associated with JNA. Therefore, qRT-PCR method was performed to measure the B-catenin and AR gene expressions in the second group. High level of B-catenin mRNA was observed in 11 cases, confirmed the results of HR-CGH. The gene AR expression was increased in six cases. A significant positive correlation between B-catenin and AR expression genes was observed (p<0,0001, r=0,8204), suggesting the involvement of these genes in JNA. The expression augmented of B-catenin and AR transcripts suggest which alterations in

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Abstract Silveira, SM

vii

Wnt/B-catenin pathways may be associated with tumorigenesis of these tumors. Furthermore, the presence of consistent genomic alterations in both tumor cellular components, suggesting the importance of stromal role in origin and tumorigenesis of JNA.

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Introdução Silveira, SM

1 1. Angiofibroma Nasofaringeal Juvenil (ANJ)

As lesões na nasofaringe podem ser classificadas em benignas e malignas. As lesões benignas são relativamente raras e incluem o cisto de Tornwaldt, angiofibroma juvenil, teratoma e pólipos nasossinusais.

O angiofibroma nasofaringeal juvenil (ANJ) é uma neoplasia de origem mesenquimal benigna, com crescimento lento e localmente destrutivo, que apesar de baixa freqüência na população, pode progredir para lesões avançadas tendo sérias seqüelas para seu portador. Por estas razões, este tumor raramente relatado em literatura é um modelo interessante para análise de alterações genômicas e moleculares.

O Angiofibroma Nasofaríngeo Juvenil é a neoplasia benigna mais comum da nasofaringe, entretanto, ocorre em baixa freqüência na população: representa <1% de todos os tumores de cabeça e pescoço (Tewfik et al., 1999; Saylam et al., 2005). Acomete quase que exclusivamente adolescentes e adultos jovens do sexo masculino, com maior prevalência na segunda década de vida (Radkowski et al., 1996). Foram relatados raros casos em homens acima dos 25 anos ou adolescentes do sexo feminino (Finerman et al., 1951; Osborn et al., 1965; Ewing et al., 1981; Patrocinio et al., 2005; Nomura et al., 2006).

Jafek et al. (1979) sugeriram que o ANJ é uma lesão mais vascular e agressiva em pacientes mais jovens. Contudo, Sennes et al. (2004) investigaram a correlação entre a idade do paciente, classificação histológica e extensão do tumor em 43 pacientes. O estudo demonstrou que quanto maior o tumor, menor o número de vasos e células, maior a quantidade de componentes fibrosos, assim como o grau de

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2 diferenciação do tumor. A idade do paciente não apresentou relação com o tamanho, estadiamento ou com a classificação histológica do tumor.

Os ANJs acometem a parede posterior da cavidade nasal, expandindo-se pela erosão do tecido ósseo e pelo deslocamento de estruturas adjacentes. Eventualmente as lesões podem envolver a nasofaringe, seios paranasais, órbita e base do crânio com extensão intracraniana (Tewfik et al., 1999; Abraham et al., 2001).

Sob o ponto de vista histológico, o tumor apresenta-se envolvido por um estroma fibroso composto predominantemente por fibroblastos em uma densa matriz de colágeno. Essa matriz de colágeno é ricamente irrigada por canais vasculares de tamanhos irregulares (Radkowski et al., 1996; Beham et al., 1997). Há uma impressionante variação na espessura da parede dos vasos abrangendo desde a lâmina simples do endotélio até a musculatura de revestimento (extensão e profundidade). Esta variabilidade comumente está relacionada à significativa tendência a hemorragias (espontânea ou intraoperatória) decorrentes do tumor (Fletcher et al., 2002).

O prognóstico é satisfatório quando a doença é diagnosticada precocemente. Entretanto, devido aos sintomas inócuos (obstrução nasal e epistaxis), o diagnóstico ocorre freqüentemente em estágios tardios da doença (Coutinho-Camillo et al., 2008). O tratamento padrão para os ANJs é a cirurgia (com ou sem embolização); no entanto, dependendo da margem de excisão, existe um risco significativo de recorrência local (particularmente para lesões com extensão intracraniana em até 20% dos casos), variando de 0-57% dos casos, principalmente nos tumores em estágios mais avançados (Bremer et al., 1986; Fletcher et al., 2002; Schuon et al., 2006).

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3 Complicações associadas com a excisão de tumores maiores incluem alteração no desenvolvimento do esqueleto craniofacial pediátrico e exacerbada hemorragia. A radioterapia e a quimioterapia são utilizadas como terapia adjuvante, contudo tem demonstrado sucesso limitado (Montag et al., 2006). Além disso, este tumor foi associado com o desenvolvimento de sarcomas (Tewfik et al., 1999).

2. Influência dos Hormônios Sexuais e Seus Receptores

Por ser uma neoplasia que afeta adolescentes do sexo masculino em associação com o desenvolvimento exacerbado das características sexuais e físicas, apresentar similaridade histológica com tecido erétil e expressar múltiplos receptores esteróides, vários estudos sugerem que os hormônios sexuais ou seus receptores estão diretamente relacionados com a etiologia do tumor (Revisão Coutinho-Camillo et al., 2008).

Nas décadas de 60 e 70 a terapia anti-androgênica pré-operatória foi utilizada como adjuvante no tratamento de pacientes com ANJ para suprimir crescimento tumoral, assim como, aumentar a capacidade de ressecção do tumor e minimizar o sangramento durante a cirurgia (Coutinho-Camillo et al., 2008). Diversos estudos demonstraram a redução do tumor após tratamento com estrógenos ou anti-andrógenos (Schiff et al., 1959; Johnsen et al., 1966; Johns et al., 1980; Hagen et al., 1994; Labra et al., 2004). Contudo, nas últimas décadas a terapia hormonal, particularmente estrógenos, foi abolida do tratamento devido aos efeitos variáveis no tumor, assim como no paciente (aquisição de caracteres femininos e risco de complicações cardiovasculares) (Coutinho-Camillo et al., 2008). Dessa forma, ainda

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4 não está claramente estabelecida a influência hormonal no desenvolvimento destes tumores e as informações são controversas.

Em 1954, Dane sugeriu que os ANJs poderiam estar associados a alterações envolvendo os hormônios sexuais, particularmente ao excesso de andrógenos. Estudo realizado no começo da década de 80 demonstrou que administração exógena do estrógeno reduzia o tamanho do tumor, contudo, não apresentava um efeito direto no ANJ (Johns et al., 1980). Lee et al. (1980) avaliaram os receptores hormonais em oito ANJs e detectaram positividade apenas para o receptor andrógeno (AR) (três casos), embora não tivessem observado alteração nos níveis séricos para testosterona e estradiol. Em concordância, Farag et al. (1987) demonstraram níveis séricos normais para a testosterona, diidrotestosterona e 17β-estradiol, e demonstraram positividade do AR em todos os casos analisados. Antonelli et al. (1987) reportaram que os receptores de estrógeno e progesterona foram negativos nestes tumores, no entanto, foi observada marcação intensa do AR em 5/5 casos. Em estudo realizado com coorte de pacientes brasileiros, Brentani et al. (1989) analisaram os receptores de estrógeno, andrógeno, progesterona e glucocorticóides no citosol de 12 ANJ por imunohisotquímica. Os autores demonstraram que os receptores de progesterona e glucocorticóides eram positivos em 58% e 84% dos casos, respectivamente, e os receptores de estrógeno e andrógeno em 25% dos casos. Kumagami et al.(1991) relataram a positividade para o estrógeno em cinco ANJs.

Em 1998, dois relatos foram paradoxais. Hwang et al. (1998) analisaram ESR1, PGR e AR por imunohistoquímica (IHQ) em 24 casos ANJs e relataram 75% dos casos como AR-positivos e apenas 8% PGR positivos; não foi observada positividade para o

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5 ESR1. A marcação estava presente tanto nas células endoteliais quanto nas células estromais. Em contraste, Gatalica et al. (1998) não observaram positividade para o PGR ou ESR1 em oito amostras deANJ analisadas, embora uma fraca marcação para o AR tenha sido observada em uma minoria de células endoteliais e estromais.

Em outra análise de imunohistoquímica em 27 ANJs, Saylam et al. (2005) demonstraram uma fraca positividade do ESR1 e PGR em apenas dois e nove casos, respectivamente. Estes dados foram concordantes com os de Liang et al. (2000) que não observaram presença dos receptores de estrógeno e progesterona entre os 25 casos analisados.

Montag et al. (2006) avaliando uma série de 13 angiofibromas nasofaríngeos demonstraram positividade para ESR2 (receptor de estrógeno beta) em todos os casos tanto nas células estromais como nas endoteliais. Cinco casos apresentaram imunoreatividade para o AR nas células do estroma. Não foi observada positividade para o PGR e ESR1, sugerindo que moduladores da atividade do ESR2 podem ser uma alternativa para o tratamento de angiofibromas nasofaringeos juvenis. Recentemente, Ponti et al. (2008) observaram marcação positiva do AR em todos os quatro casos de ANJs avaliados, tanto nas células estromais como endoteliais dos espaços vasculares.

Considerando os dados em literatura, 144 amostras ANJs foram analisadas por ensaios de ligação e/ou imunohistoquímica para diversos receptores hormônios sexuais, incluindo o AR (86 amostras), PGR (122), ESR1 (127) e ESR2 (13) (Tabela 1). Os estudos demonstram 14,8% e 16,4% de positividade para PGR e ESR1/2, respectivamente, e 61% para o AR. Vários autores confirmaram o envolvimento do

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6 receptor de andrógeno (AR) e estrógenos em ANJs, embora nenhuma alteração significativa no nível sérico tenha sido observada e a influência hormonal permaneça controversa.

Tabela 1. Síntese das análises dos receptores hormônios sexuais em ANJ.

Referências AR* ESR1* PGR* ESR2*

Johns et al. (1980) - 0/6 - - Lee et al. (1980) 3/8 0/8 0/8 - Farag et a. (1987) 7/7 0/7 - - Antonelli et al. (1987) 5/5 0/5 0/5 - Brentani et al. (1989) 3/12 3/12 7/12 - Kumagami et al. (1991) 0/5 5/5 - - Hwang et al. (1998) 18/24 0/24 2/24 -

Gatalica et al. (1998) 8/8 (fraca) 0/8 0/8 -

Liang et al. (2000) - 0/25 0/25 -

Saylan et al. (2005) - 2/27 9/27 -

Montag et al. (2006) 5/13 0/13 13/13

Ponti et al. (2008) 4/4 - - -

*Número de tumores em que foi detectada positividade por IHQ ou ensaios de ligação pelo total de casos avaliados. Abreviações: AR - receptor de andrógeno; ESR1 - receptor de estrógeno alfa; ESR2 - receptor de estrógeno beta; PGR – receptor de progesterona. (Modificado Coutinho-Camillo et al.,2008).

3. Fatores de Crescimento

Acredita-se que o processo de transformação celular dependa, fundamentalmente, da ocorrência de alterações moleculares que desregulam a ação de oncogenes e genes supressores de tumor, incluindo a produção de fatores de crescimento pelo estroma circundante ao tumor (Folkman et al., 2002). Tais fatores de crescimento, produzidos pela própria célula tumoral (autócrinos) ou pelo estroma (parácrinos), estimulariam positivamente o processo de proliferação celular.

(27)

7 Existem evidências em literatura que apontam para a existência de uma associação entre diversos fatores de crescimento e a tumorigênese dos ANJs (revisado em Coutinho-Camillo et al., 2008) (Tabela 2 ).

Tabela 2. Principais fatores de crescimento associados com patogênese dos ANJ. Fator de

crescimento

Função biológica Tipo celular (dados de IHQ)

VEGF Angiogênese, proliferação

celular

Estroma e endotélio

TGFB1 Regulação ciclo celular,

produção matriz extracelular, angiogênese Estroma e endotélio FGFb Angiogênese, desenvolvimento tecidual, diferenciação, modulação neural Estroma e endotélio PDGFB Crescimento e progressão tumoral, angiogênese Estroma e endotélio

IGF2 Crescimento e divisão celular,

apoptose Estroma e endotélio NGF Diferenciação celular e angiogênese Estroma e endotélio BMP4 Crescimento e diferenciação celular Estroma e endotélio

Abreviações: VEGF – fator de crescimento endotelial vascular; TGFB1 - fator de crescimento transformante-beta 1; FGFb - fator de crescimentono dos fibroblastos básico; PDGFB - fator de crescimento derivado de plaquetas B; IGF2 - fator de crescimento semelhante à insulina-2; NGF – fator de crescimento do neural; BMP4 - proteínas morfogênicas ósseas-4. (Modificado de Coutinho-Camillo et al., 2008).

Em 1992, Schiff et al. encontraram evidência de expressão do FGFb no endotélio de amostras ANJ de três pacientes por Westhen blot. Nagai et al. (1996) relataram a expressão dos transcritos e das proteínas (por Northen Blot e imunohistoquímica, respectivamente) TGFB1, VEGF, PDGFA e PDGFB, FGFb, e IGF2 em ANJ. Os transcritos dos fatores de crescimento derivado de plaquetas (tipo B, principalmente) estavam aumentados em 50% dos tumores, indicando a possível contribuição destes fatores no processo de neovascularização e fibrose nestes

(28)

8 tumores. Embora os autores tenham encontrado baixa expressão do TGFB1, a localização dessa proteína foi observada nas células endoteliais e nos fibroblastos, sugerindo sua participação na formação do componente estromal. O aumento da expressão protéica do IGF2 foi observado em 53% das amostras, sugerindo que este fator de crescimento pode ser um regulador de crescimento em angiofibromas nasofaringeais. Coutinho-Camillo et al. (2003) analisaram o padrão do imprinting e os níveis de expressão dos genes IGF2 e H19 em ANJs. Alterações na região de imprinting IGF2/H19 foram observadas, assim como, aumento da expressão dos genes IGF2 em 8/24 ANJs (36,8%) e H19 em 7/19 ANJs (36,8%).

A expressão do TGFB1 foi associada com aumento da densidade dos vasos, sugerindo a importância deste fator de crescimento para composição do estroma e promoção vascular (Schuon et al., 2007). Outras análises que utilizaram imunohistoquímica desta proteína demonstraram intensa marcação nuclear e citoplasmática nos fibroblastos e no endotélio, sugerindo uma associação do TGFB1 na proliferação das células estromais e angiogênese em ANJs (Dillard et al., 2000; Saylam et al., 2006). Zang et al. (2003) detectaram intensa imunorreatividade da proteína TGFB3 nos dois componentes do tumor. Em contraste, observaram uma fraca imunorreatividade para as proteínas BMP4, assim como, ausência de marcação para os receptores IGF1 (nos tumores e controles). Além disso, o NGF foi detectado nas células endoteliais e nos fibroblastos, sugerindo seu papel na promoção do crescimento vascular em angiofibromas juvenis.

O fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) tem sido avaliado nestes tumores. Brieger et al. (2004) observaram que VEGF estava freqüentemente expresso

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9 nas células estromais; e sugeriram que nos vasos estaria associado com a proliferação e promoção da vascularização no tumor. Em adição, Saylan et al. (2006) demonstraram marcação positiva para VEGF em 24 dos 27 casos analisados. Em um estudo recente, Ponti et al. (2008) avaliaram o receptor do fator de crescimento endotelial vascular 2 (VEGFR2) e relataram marcação positiva nos quatro casos analisados.

A análise imunohistoquímica das células estromais, particularmente dentro da zona proliferativa do tumor, foi realizada utilizando anticorpos para diversos fatores de crescimento e oncoproteínas incluindo Bcl2 e CD117 (Kit). O estudo demonstrou que a maioria das células estromais apresentou um imunofenótipo sem evidência de diferenciação epitelial, endotelial ou outro tipo de diferenciação específica (Pauli et al., 2008).

A etiologia deste tumor permanece desconhecida. Alguns autores acreditam que o ANJ é uma malformação vascular baseados em análises morfológicas, por métodos de expressão protéica (imunohistoquímica) e por microscopia eletrônica (Schick et al., 2004; Beham et al., Liang et al., 2000; Sennes et al., 2005). Outros, baseados em evidências genéticas e moleculares, sugerem que as células estromais dos são de fato as células neoplásicas dos ANJs (Gautham et al., 2002; Rippel et al., 2003).

4. Genes Supressores Tumorais e Oncogenes

O genoma do câncer é repleto de alterações que perturbam o funcionamento normal de proto-oncogenes e genes supressores de tumor que podem atuar em diversos processos como controle do crescimento, desenvolvimento e diferenciação

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10 celular, reparo e modificação DNA. Em angiofibromas nasofaríngeos, diversos genes foram relacionados com seu desenvolvimento.

Um dos genes mais citados na literatura desse raro tumor é o APC. Este gene é um marcador importante no diagnóstico de pacientes FAP (familial adenomatous poliposis). Tem sido relatada uma associação 25 vezes mais freqüente a presença de ANJ em adolescentes com FAP quando comparados com a população controle da mesma idade (Giardiello et al., 1993). A FAP é um termo coletivo utilizado para designar o grupo de doenças ou síndromes relacionadas com a polipose adenomatosa colônica que se manifesta pela presença de adenomas no trato gastrointestinal, particularmente cólon e reto, no final da infância e início da adolescência (Greenberger et al., 1990). Esta condição apresenta um padrão de herança autossômica dominante e está diretamente associada com alto risco de desenvolvimento de câncer colorretal. O gene APC (15 éxons), mapeado em 5q21, codifica uma proteína com atividade supressora tumoral. Mutações neste gene, particularmente no éxon 15, são observadas em dois terços dos pacientes FAP (Miyoshi et al., 1992). A proteína APC, associada a uma quinase (GSK3B), promove a fosforilação dos resíduos serina/treonina codificados no éxon 3 do gene B-catenina e, conseqüentemente, leva à degradação da proteína (Behrens et al., 1996; Barth et al., 1997). Em adição, a proteína B-catenina no citoplasma pode se ligar seletivamente ao AR, atuando como ativador transcricional deste gene, ou a fatores de transcrição da via de sinalização Wnt, assim como, com o componente submembranoso da E-caderina mediando a adesão celular (Behrens et al., 1996; Barth et al., 1997). A maioria dos adenomas e carcinomas colorretais

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11 apresentou inativação bialélica do gene APC ou mutações ativadoras no gene B-catenina (Kinzier et al., 1996; Sparks et al., 1998).

Considerando estas evidências, alguns autores investigaram a associação da via de sinalização APC/B-catenina em ANJ. Ferouz et al. (1995) não observaram mutações no gene APC em nove casos Estudados. Em concordância, Guertl et al. (2000) analisaram 11 amostras de ANJs provenientes de nove pacientes para mutações na região MCR do gene APC e para perda de heterozigose (LOH) no locus APC. Os autores não observaram mutação ou LOH nestas amostras. Em outro estudo para análise de mutações no gene APC e para o gene B-catenina, Abraham et al. (2001) não encontraram mutações na região MCR do gene APC. Contudo, foram observadas mutações ativadoras no gene B-catenina em 75% dos ANJ. Valanzano et al. (2005) analisaram um paciente portador de FAP afetado com ANJ para seqüências do gene APC e a presença de mutações no gene B-catenina, particularmente no éxon 3, no DNA do sangue e do tecido tumoral. Foram detectadas mutações frameshift na região de ligação da B-catenina no gene APC tanto no sangue como no tumor. Um recente estudo demonstrou a presença de uma mutação no gene APC em um dos pacientes com ANJ e FAP. A mesma mutação também foi observada na geração antecessora, cujo portador apresentava um fenótipo clássico de FAP, com polipose colorretal. Além disso, a análise imunohistoquímica deste caso demonstrou ausência de marcação para a proteína APC (Ponti et al., 2008).

Na maioria dos estudos em angiofibromas nasofaringeos, a localização imunohistoquímica da proteína B-catenina foi observada apenas no núcleo das células

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12 estromais, sugerindo que as mesmas são as células neoplásicas nestes tumores (Abraham et al., 2001; Rippel et al., 2003; Zang et al., 2003; Ponti et al., 2008).

O gene TP53 é um dos genes supressores tumorais mais bem caracterizados, sendo que a ativação fisiológica deste gene resulta na parada do ciclo celular ou apoptose (Bertheau et al., 2008). Nagai et al. (1996) relataram o aumento da expressão do TP53 em ANJ. Schick et al. (2005) não detectaram alterações do gene supressor tumoral TP53 nos casos analisados quando foram utilizadas as metodologias de Western blot e imunohistoquímica.

Outros genes avaliados neste tumor foram os da família RAS. Mutações nestes genes foram associadas a vários tumores sólidos, contudo, Coutinho et al. (1999) analisaram os códons 12, 13, 59 e 61 dos genes K-RAS e H-RAS em ANJs, mas não observaram mutações nestes genes.

Em um estudo utilizando a metodologia de Northern blot, Nagai et al. (1996) não observaram variação na expressão do gene MYC em ANJ e tecido normal. Entretanto, Schick et al. (2006) encontraram expressão aumentada deste oncogene em 3/7 ANJs analisados. Ainda nestes casos, os autores relataram um aumento do nível de transcritos e protéico do oncogene MYC. Os achados sugeriram a associação do oncogene MYC com o comportamento de crescimento agressivo dos ANJs.

O gene ERBB2/HER-2/neu está localizado no cromossomo 17 (17q12-q21) e codifica um receptor tirosina-quinase de transmembrana, que é membro da família de receptores do fator de crescimento epidermal (Menard et al., 2001). A amplificação do HER-2 é observada em 25% dos cânceres de mama e está associado com fenótipo tumoral agressivo e pior prognóstico (Nanda, 2007). Em angiofibromas nasofaríngeos,

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13 não foram observadas alterações significativas na expressão deste gene (Schick et al., 2005).

Há um número extremamente limitado de relatos sobre angiofibromas nasofaríngeos juvenis. Atualmente, há uma busca pelo conhecimento do comportamento biológico peculiar desses tumores, assim como, pela determinação de genes como possíveis marcadores moleculares e que poderiam auxiliar o tratamento destes pacientes jovens com angiofibromas nasofaringeais.

5. Análise Citogenética

Há um número limitado de estudos citogenéticos em ANJs. Um estudo recente relatou a presença de cariótipos normais em nove ANJs por bandamento GTG (Gil et al., 2008).

Schick et al. (2003) avaliaram a distribuição dos cromossomos sexuais e do gene AR em amostras de arquivo (em blocos de parafina) de ANJs, utilizando a metodologia de FISH (hibridação fluorescente in situ). Foram utilizadas sondas específicas para os centrômeros dos cromossomos 1, X e Y, assim como, para o gene AR (mapeado em Xq11-q12). Os autores observaram perdas significativas no cromossomo Y e ganhos no cromossomo X, de forma que, 25% dos núcleos observados apresentaram duas cópias do gene AR. Os autores sugeriram que ganhos do gene AR em ANJs indicariam que estes tumores são dependentes de andrógenos. O mesmo grupo em 2005 avaliou a associação do TP53 e ERBB2 em sete ANJ por hibridação fluorescente in situ, utilizando sondas para o centrômero do cromossomo 17

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14 e sondas específicas para os genes TP53 e HER-2/neu, Foram observadas perdas destas regiões para ambos os genes em 5 dos 7 casos (10,5 a 30% dos núcleos). Não foi observada amplificação (Schick et al. 2005). Em 2006, os autores também avaliaram o gene MYC por hibridação fluorescente in situ, utilizando sondas específicas para esta região gênica e para o centrômero do cromossomo 8. Observaram-se significantes perdas e ganhos em 8q24, demonstrando a heterogeneidade do protoncogene MYC em ANJ (Schick et al. 2006).

Alteração cromossômica Metodologia

N de casos analisados Referência Ganhos em 6q, 7q, 8q, 12p, 13q, 14q, 18q, 21q e X Perdas em 17, 19p, 22q e Y CGH 3 Schick et al. (2002) Ganhos em X

Perdas em Y FISH 7 Schick et al. (2003)

Ganhos em 4q, 6q, and 8q

Perdas em Y CGH 7 Brunner et al. (2003)

Perdas em 17p e q FISH 7 Schick et al. (2005)

Ganhos e perdas em 8q FISH 7 Schick et al. (2006)

Ganhos em 1p, 9q, 10q, 12q, 16q, 17q, 19p, 19q, 20q e 22q Perdas em 4 CGH 17 Heinrich et al. (2007) Ganhos em 4q, 6, 12, and X Perdas em 8, 16, 17, 22, and Y CGH e

CGHarray 29 Schick et al. (2007)

Cariótipo normal Banda GTG 9 Gil et al. (2008)

Tabela 3. Alterações cromossômicas freqüentemente observadas em ANJs.

Abreviaturas: CGH – Hibridação genômica comparativa; FISH – Hibridação in situ; Banda GTG andamento GTG (Modificado Coutinho-Camillo et al.,2008).

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15 6. Hibridação Genômica Comparativa Cromossômica (CGH)

A CGH foi primeiramente descrita em 1992 por Kallioniemi et al. O desenvolvimento da hibridação genômica comparativa permite a análise de alterações cromossômicas em todo genoma, independente da avaliação de células metafásicas do tecido alvo (Ojopi et al., 2000; Lichter et al., 2000). Esta técnica requer a obtenção de DNA das células a serem investigadas e, desta forma, é uma abordagem que apresenta vantagens na investigação de desequilíbrios genômicos, especialmente em tumores sólidos (Rogatto et al., 2000).

A detecção de ganhos e perdas específicas no genoma abriu caminho não apenas para a pesquisa na área de oncogenética, permitindo a descoberta de uma série de novos genes relacionados com o câncer, mas também trouxe implicações na área clínica, permitindo a implantação de diagnósticos diferenciados, avaliação prognóstica de algumas doenças e o direcionamento de tratamentos (Gebhart et al., 2004; Rogatto et al., 2004) .

Para a análise da CGH em tumores, todo o genoma das células tumorais e das células controle é utilizado como sondas por hibridação fluorescente in situ (FISH) e em metáfases normais. O método permite a detecção de perdas e ganhos em regiões cromossômicas no genoma tumoral pela comparação da intensidade dos sinais de fluorescência. Tanto o DNA tumoral (marcado com biotina dUTP, detectado por fluoresceína-avidina - coloração verde, por exemplo) quanto o de referência (marcado com digoxigenina dUTP, detectado por anti-digoxigenina-rodamina - coloração vermelha, por exemplo) são marcados em razões molares iguais e posteriormente misturados na razão de 1:1. A hibridação das seqüências repetitivas é bloqueada pela

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16 adição da DNA humano Cot-1. A proporção dos sinais de fluorescência é mensurada ao longo do eixo longitudinal de cada cromossomo. Assim, os sinais de fluorescência resultantes são quantitativamente analisados, usando um sistema digital de análise de imagens (Rogatto et al., 2004).

O poder de resolução da CGH para detectar ganhos e perdas de pequenas regiões genômicas depende do grau de condensação dos cromossomos metafásicos e do número de cópias deletadas ou duplicadas na amostra tumoral. Para amplificações, o limite de detecção é atingido quando a unidade total do amplicon (tamanho da região amplificada multiplicada pelo número de cópias) é maior do que 2Mbp (Piper et al., 1995). Um baixo número de ganhos e perdas, como trissomias e deleções, é detectado somente quando a região não-balanceada tem pelo menos 10 Mbp (Kallioniemi et al., 1994; Bentz et al., 1998).

Dentre as vantagens dessa metodologia, está a possibilidade de localização de seqüências em excesso ou ausentes no genoma tumoral, a triagem para aberrações não balanceadas, a não necessidade de preparações cromossômicas das amostras tumorais e a detecção de deleções de 10-20 Mbp que não podem ser distinguidas por bandamento G. A principal limitação da técnica é a não detecção de rearranjos cromossômicos, como translocações recíprocas ou inversões. A segurança e sensibilidade desta metodologia são estritamente dependentes da homogeneidade das amostras de DNA isoladas. Se a amostra de DNA contém mais de 50% de células não tumorais (por exemplo: estroma normal), as alterações em células esporádicas ou em baixas freqüências, incluindo monossomias e trissomias escapam da detecção (Rogatto et al., 2000).

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17 Considerando que a CGH permite a triagem de alterações em todo genoma e que a maior aplicação desta metodologia esta centrada no campo da genética em diversos tumores, a CGH tem sido aplicada com sucesso tanto pesquisa como na citogenética clínica do câncer (Daniely et al., 1998; Turleau et al., 2000; Kirchhoff et al., 2007). Contudo, a sensibilidade na detecção de alterações genômicas é extremamente reduzida. A Hibridação Genômica Comparativa de Alta Resolução (HR-CGH) (Kirchhoff et al., 1997; 1998) é uma ferramenta que possibilita o aumento da sensibilidade e especificidade na detecção de não balanceamentos genômicos. Este procedimento permite a detecção de deleções no alcance de 3–5 Mbp, utilizando intervalos de referência padronizados com amostras normais em detrimento de intervalos fixados (Kichhoff et al., 1999; 2001).

Temos conhecimento de quatro relatos em literatura utilizando CGH cromossômico em angiofibromas, contudo, nenhum deles utilizou a metodologia CGH de alta resolução (Tabela 1). Schick et al. (2002) avaliaram três angiofibromas e relataram ganhos de 3q, 4q, 5q, 6q, 7q, 8q, 12p, 12q, 13q, 14q, 18q, 21q e X, e a perda do Y. Segundo os autores, o ganho no cromossomo X e a perda no cromossomo Y podem estar relacionados com a manifestação do tumor em pacientes adolescentes do sexo masculino. Além disso, regiões de ganhos no cromossomo 8, particularmente em 8q12-q22, foram observadas nos três casos. Os autores também relataram, em todos os casos, ganho na região 6p12-p21, sítio do fator de crescimento endotelial vascular, envolvido na angiogênese. Foram identificadas perdas no cromossomo 17, que podem influenciar a regulação do gene supressor tumoral TP53.

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18 Outro estudo realizado pelo mesmo grupo (Schick et al., 2007), utilizando CGH cromossômico, identificou diversas alterações cromossômicas em 29 amostras de ANJ, sendo que, duas destas foram analisadas por CGH-array. Trezentos e onze regiões genômicas de ganhos e perdas foram detectadas por CGH cromossômico. As regiões de ganhos mais freqüentes foram observadas em 4q, 6, 12 e X, enquanto regiões perdas foram observadas nos cromossomos 8, 16, 17, 22 e Y. A análise de CGH-array em dois tumores da série confirmou a presença das alterações cromossômicas detectadas por CGH cromossômico, revelando a amplificação de genes como AURKA (20q13. 2) e MDM2 (12q) que poderiam estar relacionados com a patogênese dos ANJs (Schick et al., 2007).

Em outro estudo utilizando CGH cromossômico, Brunner et al. (2003) avaliaram sete angiofibromas e relataram várias anormalidades em 18 cromossomos diferentes. Os autores detectaram ganhos nos cromossomos 4q, 6q e 8q e perda do cromossomo Y (presente em quatro angiofibromas).

Heinrich et al. (2007) avaliaram 22 amostras de ANJs, incluindo seis casos que apresentaram recorrências, por CGH cromossômico. Foram observados ganhos em 2/13 tumores primários que não apresentaram recorrência. Foram detectados múltiplos ganhos em 2/4 amostras que apresentaram recorrência primária. Contudo, nos casos com recorrência secundária, nenhum dado significante foi observado. Entre as 22 amostras, foram observados ganhos freqüentes em 1p, 9q, 10q, 12q, 16p, 16q, 17q, 19p, 19q, 20q e 22q e perdas foram encontradas em um único caso, especificamente no cromossomo 4. Segundo os autores, a ativação de oncogenes é mais freqüente do que a inativação de genes supressores tumorais.

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19 O angiofibroma nasofaringeal juvenil é uma neoplasia de origem mesenquimal benigna que embora apareça em baixa freqüência na população, pode progredir para lesões avançadas e mostrar recorrência local. Por estas razões, este tumor raramente relatado em literatura é um modelo interessante na análise de alterações genômicas. Este estudo propõe a avaliação de amostras de angiofibromas nasofaringeais pela metodologia de CGH cromossômico de alta resolução. Alterações no número de cópias recorrentes serão validadas por análise de expressão gênica quantitativa. Os resultados deste estudo serão comparados com seguimento clínico e histopatológico, entre outras características para contribuir para a identificação de seqüências genômicas candidatas e com potencial para se tornarem biomarcadores moleculares.

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Objetivos Silveira, SM

20

Considerando que estudos citogenéticos e de genética molecular em angiofibroma nasofaringeal juvenil ainda são incipientes e, que a identificação de seqüências genômicas diretamente relacionadas com os vários estádios do tumor pode contribuir para o diagnóstico e o prognóstico, este estudo tem os seguintes objetivos:

• Analisar o perfil de ganhos e perdas genômicas, utilizando a metodologia de HR-CGH para identificar regiões consistentemente alteradas em amostras de ANJ e nos seus componentes endotelial e estromal;

• Identificar genes candidatos nas regiões genômicas alteradas e avaliar o nível de transcritos selecionados por RT-PCR quantitativa em tempo real; • Comparar e correlacionar os resultados das análises nos diferentes

componentes e os dados da expressão de transcritos com os dados clínicos e histopatológicos.

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Material e Métodos Silveira, SM

21 1. Caracterização das Amostras

Neste estudo, a análise de HR-CGH foi realizada utilizando dois grupos de amostras. O primeiro foi composto por 18 ANJ primários, não tratados previamente à cirurgia e que não foram microdissecados. O segundo grupo de amostras foi composto por nove destes ANJ cujos componentes endoteliais e estromal (fibroblastos) foram microdissecados a laser. A análise de qRT-PCR foi realizada nas 18 amostras do primeiro grupo. Três cornetos nasais obtidos de indivíduos da mesma faixa etária dos casos foram utilizados como controle na análise de expressão gênica. Após a cirurgia, os fragmentos tumorais foram mantidos a -80°C até o momento da extração dos ácidos nucléicos.

Todos os ANJs investigados neste estudo eram tumores primários, de pacientes não tratados previamente à cirurgia por quimioterapia ou radioterapia. Dois pacientes apresentaram recorrência ao seguimento clínico. A média de idade dos pacientes foi 18.1 anos. A tabela 4 apresenta as características clinicas dos 18 casos utilizados neste estudo. Todas as amostras de angiofibromas nasofaringeais juvenis, incluindo os cornetos nasais, foram colhidas à fresco durante o ato cirúrgico e são provenientes do Departamento de Otorrinolaringologia do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina, USP, São Paulo, os quais foram submetidos a tratamento cirúrgico e seguimento clínico sob supervisão do Prof. Dr. Ossamu Butugan. Este trabalho faz parte de um projeto de pesquisa colaborativo entre os Departamentos de Otorrinolaringologia (Prof. Dr. Ossamu Butugan) e Radiologia (Profa. Dra. Maria Mitzi Brentani) do Hospital das Clínicas, USP, SP e o Laboratório Neogene, Departamento

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22 de Urologia, Faculdade de Medicina de Botucatu, UNESP (Profa. Dra. Silvia Regina Rogatto). Todos os pacientes autorizaram a realização da pesquisa por Termo de Consentimento Livre e Esclarecido. O projeto de pesquisa foi aprovado pela Comissão de Ética e Pesquisa-CAPPesp da Diretoria Clínica do Hospital das Cínicas e da Faculdade de Medicina, USP, SP (Parecer n° 241/05) (Anexo).

Tabela 4. Informações clínicas e histopatológicas das 18 amostras de ANJ.

Abreviações: TP, tumor primário; Re, recorrência tumoral.

N° Caso Idade (anos) Seguimento

(meses) Classificação (estadio)

1 19 - - 2 17 TP (03) III 3 17 TP (27) III 4 14 TP (05) III 5 15 - III 6 21 TP (38) III 7 18 Re (27) - 8 15 TP (34) III 9 - 10 15 TP (22) III 11 - III 12 25 TP (33) III 13 25 TP (02) II 14 25 Re (12) II 15 17 TP (06) III 16 16 TP (29) II 17 14 TP (24) II 18 18 - II

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23 2. Microdissecção das Amostras

Nove amostras de ANJ foram microdissecadas a laser para obtenção das células endoteliais e dos fibroblastos separadamente. Secções de 4-6 μm de tecido congelado foram obtidas para cada caso, utilizando criostato convencional e armazenadas à -80°C. As lâminas de cada ANJ foram coradas com hematoxilina e eosina sem a montagem completa da mesma, sendo que a primeira lâmina de cada caso foi utilizada como referência para a microdissecção. Os cortes foram então microdissecados a laser para seleção e captura de células tumorais, com a utilização do aparelho Pix Cell II Laser Capture Microdissection (Arcturus, Inc., Califórnia, EUA), pertencente ao Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina – UNESP Botucatu, com a colaboração da Dra. Maria Aparecida Custódio Domingues, Depto de Patologia, Faculdade de Medicina, Botucatu, SP. A microdissecção a laser segue as recomendações de Coudry et al. (2007).

3. Extração do DNA

As amostras tiveram seu DNA extraído por meio do uso de digestão com proteinase K (Roche, Mannheim, Germany). Os cortes microdissecados foram incubadas em tampão de digestão (10 mM Tris pH 8,3; 1 mM EDTA; 0.5% Tween 20; 500 ug/mL de Proteinase K) durante 12 horas a 37oC. Os tubos com as amostras microdissecadas a laser foram invertidos para permitir a ação dos tampões de digestão. Procedeu-se a centrifugação e então o cap foi removido e observado para verificar a permanência de células não-digeridas. Em seguida, a enzima foi inativada por aquecimento a 95oC durante 10 minutos. O DNA foi extraído utilizando-se de 1mL solução de fenol: clorofórmio: álcool isoamílico (25:24:1) e por fim 1mL de clorofórmio: álcool isoamílico (24:1). O sobrenadante final foi transferido para outro tubo onde foi feita a precipitação do DNA adicionando-se etanol absoluto gelado e acetato de amônio 7M que permaneceu durante 12 horas a -20°C. Após centrifugação a 14.000 rpm por 20

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24 minutos o precipitado obtido foi eluído e quantificado em espectrofotômetro (Nanodrop Technologies, USA).

4. Hibridação Genômica Comparativa de Alta Resolução (HR-CGH) 4.1. Marcação e Hibridação

4.1.1. NICK TRANSLATION

A hibridação e a detecção do DNA teste e referência em preparações cromossômicas normais ocorreu como descrito por Kallioniemi et al. (1994). O DNA teste (tumoral) foi marcado por nick translation usando Biotina 14-dATP (Invitrogen, USA) e o DNA de referência (normal) com Digoxigenina 11-dUTP (Roche, USA). A digestão enzimática do DNA foi controlada para a obtenção de fragmentos entre 500 e 2000 pares de bases.

Na mistura, contendo DNA teste e referência (180-200ng cada) em quantidades equimolares, foi acrescida 5ug de Human Cot-1 DNA (Invitrogen, USA), precipitada em etanol. O produto foi mantido a -20ºC durante 12 horas ou, alternativamente, a -70ºC durante 1 hora. Após centrifugação a 14000 rpm, 4ºC durante 45 minutos, o precipitado foi lavado em etanol a 70%, centrifugado a vácuo por 5 minutos à 30°C. Adicionou-se em 30μL de Hybrisol VII (Q-Biogene). Desnaturou-se à 75ºC por 10 minutos seguidos por incubação à 37ºC por, no mínimo, 1h para pré-anelar.

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25 4.1.2. SCOMP (Single Cell Comparative Hybridization)

4.1.2.1. Primeira Amplificação por SCOMP

O DNA obtido das amostras microdissecadas (300-1200ng) foi diretamente utilizado na metodologia de SCOMP que permite a amplificação de amostras com 50 até 1,5 ng de DNA (Stoecklein et al., 2002). As reações de clivagem com a endonuclease de restrição MseI, ligação dos adaptadores e primeira amplificação pela PCR foram realizadas no mesmo tubo para prevenir a perda de fragmentos genômicos. Inicialmente, o DNA foi submetido à clivagem com 24U da endonuclase de restrição MseI (50 000 Unidades, New England Biolabs), em tampão universal (10mM de Tris-acetato pH 7.5, 10mM de Tris-acetato de magnésio, 50mM de Tris-acetato de potássio) a 37ºC durante 3 horas. A enzima foi inativada à 65ºC durante 5 minutos.

Em um tubo separado, os adaptadores foram formados pelo pareamento dos oligonuclotídeos LIB1 AGTGGGATTCCTGCTGTCAGT-3´) e ddMseI (5´-TAACTGACAGCdd-3´). Uma solução contendo 15nM de cada oligonucleotídeo em tampão universal foi submetida a um gradiente decrescente de temperatura de 65º a 15ºC (1 minuto por ºC). Após o pareamento dos oligonucleotídeos adaptadores, foram adicionados 1μL de dATP 10mM e 5U de T4 DNA ligase (Invitrogen – Life Technologies). Esta mistura foi transferida ao DNA tratado com a endonuclease MseI e incubada a 15ºC por 16 horas.

Após a ligação dos adaptadores, o kit Expand Long PCR System (Roche) foi utilizado para a amplificação primária. A reação foi realizada em um volume final de 41μL contendo 2.5mM de cada dNTP, 3μL de Expand Long Template buffer 1, 1μL

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26 Expand Long Template Pol Mix 3,5U/μL e 35μL de água ultra-pura estéril. A amplificação ocorreu em um termociclador programável PTC 200 (MJ Research) e consistiu de 1 ciclo de 68ºC por 3 minutos; 15 ciclos de 94ºC por 40 segundos, 57ºC por 30 segundos e 68ºC por 1 minuto e 30 segundos com 1 segundo adicional/ciclo; 8 ciclos de 94ºC por 40 segundos, 57ºC por 30 segundos com 1 segundo adicional/ciclo e 68ºC por 1 minuto e 45 segundos com 1 segundo adicional/ciclo; 22 ciclos de 94ºC por 40 segundos, 65ºC por 30 segundos e 68ºC por 1 minuto e 53 segundos com 1 segundo adicional/ciclo e 1 ciclo de 68ºC por 3 minutos e 40 segundos. Os produtos amplificados foram purificados usando o QIAquick PCR Amplification Kit (QIAGEN).

4.1.2.2. Segunda Amplificação

Dois μL do produto purificado foram utilizados como molde numa segunda reação de amplificação para marcação dos fragmentos, contendo 4μL de Expand Long Template buffer 1, 6μL do oligonucleotídeo LIB1 10μM, 1,4μL de 7/8 Nucleotide Mix (10mM de cada dGTP, dATP e dCTP + 8,75μL de dTTP) e 1,75μL de digoxigenina 11-dUTP (para o DNA de referência) ou biotina 16-11-dUTP (para o DNA teste), 2μL de polimerase mix 5U/μL. As condições de amplificação foram: 1 ciclo de 94ºC por 1 minuto, 60ºC por 30 segundos, 72ºC por 2 minutos; 10 ciclos de 94ºC por 30 segundos, 60ºC por 30 segundos e 72ºC por 2 minutos com 20 segundos adicionais/ciclo. O oligonucleotideo LIB1 foi removido pelo tratamento com a enzima de restrição Tru/MseI (Fermentas), conforme as instruções recomendadas pelo fornecedor e a mesma foi inativada à 65ºC por 3 horas.

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27 Alíquotas contendo 8μg de DNA teste (18μL de DNA marcado com biotina 16-dUTP) e 8μg do DNA de referência (18 μL de DNA marcado com digoxigenina 11-dUTP) foram co-precipitadas na presença de 100 μL de Human Cot-1 DNA e de 10μL DNA de esperma de salmão, 10μL de acetato de sódio 3M e 400μL de etanol absoluto gelado. O tubo foi mantido à -20ºC durante uma noite ou, alternativamente, a -70ºC durante 1 hora. Após centrifugação a 14000 rpm, 4ºC durante 45 minutos, o precipitado foi lavado em etanol a 70%, centrifugado à vácuo, sendo que o mesmo foi ressuspendido em 30μL de Hybrisol VII (Q-Biogene), desnaturado à 75ºC por 10 minutos e mantidos à 37ºC por, no mínimo, 1h para etapa de pré-anelamento.

4.2. Preparações Cromossômicas

A cultura de sangue periférico de indivíduos normais seguiu o protocolo de Moorhead et al (1960) com algumas modificações. Em resumo, uma alíquota de 500 uL linfócitos obtidos após punção de sangue periférico com o anticoagulante heparina foi estimulado com fitohemaglutinina (Sigma, USA) por 71 horas à 37ºC. Adicionou-se colchicina (Invitrogen, USA) 0,0016% por 1 hora adicional à 37ºC. Utilizou-se KCl 0,075M como solução hipotônica e fixador recém-preparado (metanol:ácido acético 3:1). Procedeu-se à desidratação das lâminas em uma série de etanol 70%, 90% e 100% durante 4 minutos. Após estarem secas, as lâminas foram envelhecidas por um período de três a quatro semanas antes do procedimento de hibridação e estocadas à 4ºC para uso posterior.

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28 4.3. Condições de Hibridação e Tratamento Pós-Hibridação

As lâminas foram desidratadas em etanol 70%, 80% e 90% (5 minutos cada) e secas a temperatura ambiente. Após a secagem das lâminas, as mesmas foram incubadas em 10% pepsina (Sigma, USA) e 0,01N HCl a 5 min (37ºC). As lâminas foram transferidas em 2XSSC por 5 min (37ºC), seguidas de desidratação em série de etanol 70%, 80% e 90%. Incubou-se em 70% formamida/2XSSC durante 2 min à 72ºC para desnaturação. Após a desnaturação, transferiu-se imediatamente para uma série de etanol 70%, 80% e 100% gelado por 5 min cada. As lâminas foram secas antes da hibridação. A hibridação se processou pela adição de 30μL da sonda em lamínula, aplicação sobre a lâmina, vedação com rubber cement e incubação em câmara escura à 37ºC por 72 horas. Posteriormente, processou-se a lavagem em formamida 50%/2XSSC por 5 min, duas vezes à 45ºC (solução pré-aquecida). A reação foi bloqueada com 40μL de bloqueador I (0,1M Tris HCL; 0,15M NaCl; 0,5%BSA) e 40μL de TNB (3% albumina bovina sérica, 0,1% Tween 20; 4XSSC) por 30 minutos à 37ºC (câmara escura). O DNA biotinilado foi detectado utilizando-se avidina-fluoresceína isotiocianato (FITC) (Roche, Indianápolis, USA), enquanto o DNA com a digoxigenina foi detectado por anti-dig-rodamina (Roche, Mannheim, Germany), na proporção de 9:1. As lâminas foram sobrepostas com lamínula e incubadas em câmara escura durante 30 minutos à 37ºC. Procedeu-se a lavagem em 4XSSC/0,1% de Tween 20 à 45ºC durante 5 min, por três vezes. As lâminas foram contra-coradas com 8μL de VectaShield Mounting Media for Fluorescence com DAPI (Vector, UK).

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29 4.4. Seleção e Captura de Imagens

Na seleção das metáfases considerou-se o sinal de hibridação em cada cromossomo individualmente, o sinal de hibridação uniforme na célula, o baixo nível de sinais não específicos (background), cromossomos bem espalhados e com pouca ou nenhuma sobreposição, o padrão com no mínimo 400 bandas por lote haplóide e a resolução do bandamento em DAPI reverso para a identificação cromossômica.

Foram capturadas, em média, 30 metáfases de cada amostra usando o microscópio Olympus BX61 conectado a um conjunto automático de filtros com um filtro excitador band pass para UV/FITC (490nm), DAPI (360nm) e rodamina (570nm) em objetiva 100X e uma câmara CCD de alta resolução. A análise das metáfases capturadas procedeu-se usando o software Applied Spectral Imaging CGH View 3.0. Com este software a razão da intensidade de fluorescência rodamina:FITC foi expressa como uma razão vermelho:verde. As regiões cromossômicas de ganhos e perdas foram definidas baseando-se em uma biblioteca de amostras normais, construída a partir da marcação reversa (biotina e digoxigenina), utilizando-se DNA masculino (Invitrogen) e DNA feminino (placenta) com um limite de confiança de 99.5%. Foram capturadas e analisadas 150 metáfases para a construção da biblioteca de referência. Os intervalos de referência são extraídos da biblioteca que delimita o padrão normal dos experimentos considerando os mesmos critérios de seleção de metáfases, padrão de hibridação e condições gerais de análise pré-estabelecidas. O intervalo de referência é assinalado em azul e representa o intervalo de confiança das amostras normais. As barras indicando perdas (vermelho) e ganhos (verde) aparecem quando o

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30 intervalo de referência da amostra não se sobrepõe ao do intervalo de referência da biblioteca. O arquivo gerado da biblioteca de casos normais foi utilizado na comparação de cada um dos casos. As razões médias dos perfis finais foram determinadas a partir de metáfases que mostraram um padrão homogêneo de hibridação (em média, 15 a 18 células em cada caso). Ao final da análise, todas as metáfases capturadas foram agrupadas.

5. RT-PCR Quantitativa em Tempo Real 5.1. Extração de RNA total

O tecido tumoral congelado foi pulverizado em nitrogênio líquido e o RNA foi extraído utilizando o Rneasy Mini Kit (Qiagen GmbH, Hilden, Germany), de acordo com as recomendações do fabricante. Em resumo, aproximadamente 30mg de tecido tumoral microdissecado foi adequadamente pulverizado em cadinho com nitrogênio líquido. Após a pulverização, adicionou-se 600μL de do tampão RLT, que permaneceu em temperatura ambiente até adquirir consistência líquido-viscosa pela lise das células do tecido. Esse material foi transferido para um tubo de 2mL, agitado manualmente durante 1 minuto e centrifugado por 3 minutos a 13.200 rpm em temperatura ambiente. O sobrenadante foi transferido para outro tubo e foi adicionado 350μL de etanol 70% (preparado com água DEPC). Essa mistura foi transferida para a mini coluna acoplada em tubo coletor e foi centrifugada por 15 segundos a 10.000 rpm em temperatura ambiente. Adicionou-se 700μL do tampão RW1 na mini coluna e centrifugou-se por 15 segundos a 10.000 rpm em temperatura ambiente. A seguir, 500μL do tampão RPE foi