UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE FACULDADE DE FARMÁCIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS APLICADAS A PRODUTOS PARA A SAÚDE
AVALIAÇÃO DA AÇÃO DE BIOCIDAS E PAPAÍNA NA FORMAÇÃO DE BIOFILMES EM AMOSTRAS HOSPITALARES DE Staphylococcus epidermidis E
Staphylococcus haemolyticus RESISTENTES A METICILINA
HANNA LARA DA CRUZ DINÉAS DE OLIVEIRA
NITERÓI, 2013
UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE FACULDADE DE FARMÁCIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS APLICADAS A PRODUTOS PARA A SAÚDE
AVALIAÇÃO DA AÇÃO DE BIOCIDAS E PAPAÍNA NA FORMAÇÃO DE BIOFILMES EM AMOSTRAS HOSPITALARES DE Staphylococcus epidermidis E
Staphylococcus haemolyticus RESISTENTES A METICILINA
HANNA LARA DA CRUZ DINÉAS DE OLIVEIRA
ORIENTADORA: Prof.ª Drª LENISE ARNEIRO TEIXEIRA
NITERÓI, 2013
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciências Aplicadas a Produtos para Saúde da Faculdade de Farmácia da Universidade Federal Fluminense para obtenção do título de Mestre.
O482 Oliveira, Hanna Lara da Cruz Dinéas de
Avaliação da ação de biocidas e papaína na formação de biofilmes em amostras hospitalares de Staphylococcus epidermidis e Staphylococcus
haemolyticus resistentes a meticilina/ Hanna Lara da Cruz Dinéas de Oliveira; Orientadora: Lenise Arneiro Teixeira – Niterói, 2013.
717
Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal Fluminense, 2013-05-05
1. Staphylococcus epidemridis. 2. Biofilme. 3. Staphylococcus haemolyticus. I. Teixeira, Lenise Arneiro. II. Título
HANNA LARA DA CRUZ DINÉAS DE OLIVEIRA
AVALIAÇÃO DA AÇÃO DE BIOCIDAS E PAPAÍNA NA FORMAÇÃO DE BIOFILMES EM AMOSTRAS HOSPITALARES DE Staphylococcus epidermidis E
Staphylococcus haemolyticus RESISTENTES A METICILINA
BANCA EXAMINADORA
Profª. LENISE ARNEIRO TEIXEIRA - Orientadora Universidade Federal Fluminense – UFF
Profª APOENA DE AGUIAR RIBEIRO Universidade Federal Fluminense – UFF
Profª BERNADETE TEIXEIRA FERREIRA CARVALHO Universidade Federal do Rio de Janeiro – UFRJ
Profº LEONARDO ROCCHETTO COELHO Universidade Federal do Rio de Janeiro – UFRJ
Niterói 2013
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciências Aplicadas a Produtos para Saúde da Faculdade de Farmácia da Universidade Federal Fluminense como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre.
Dedico esta conquista à minha família...
Ao meu marido Maurício, pelo incentivo, apoio irrestrito, suporte emocional, mas principalmente por seu amor... Aos meus queridos pais e à minha irmã, pelo exemplo de dedicação, humanismo e pelo apoio incondicional em todos os momentos.
E a todos que acreditaram em meus esforços e em minha dedicação.
AGRADECIMENTOS
A Deus, por me amparar nos momentos difíceis, me dar força interior para superar as dificuldades, mostrar os caminho nas horas incertas e me suprir em todas as minhas necessidades.
Ao meus pais e minha irmã, por serem exemplos de honradez e dedicação, sempre presentes e me dando a força necessária para continuar, me apoiando incondicionalmente nos momentos mais adversos.
Ao meu marido Maurício, por toda a paciência, amor, confiança e compreensão nos momentos mais delicados. Pelo ombro amigo dado no decorrer do percurso, o meu reconhecimento.
Agradeço ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Aplicadas a Produtos para a Saúde da Universidade Federal Fluminense, a oportunidade que me concedeu para realizar este mestrado.
Agradeço a todos os meus professores, em particular à minha orientadora Lenise, pela orientação, amizade e dedicação.
Aos professores Geraldo Renato de Paula, Débora Omena Futuro e Luciana Maria Ramirez Esper, por todas as recomendações e sugestões.
A professora Ana Ventura (Laboratório de Neuroquímica, Instituto de Biologia, UFF) pela confiança em disponibilizar o seu laboratório para as leituras microscópicas.
Aos colegas do Laboratório de Controle Microbiológico (UFF), em especial ao Sr. Vilmar e à Muniqui, sempre tão prestativos.
Aos amigos dos laboratórios da Faculdade de Farmácia, em especial à Manu, Leila, e Lívia pela atenção e pelas conversas, sobretudo nos momentos mais difíceis.
Por fim, gostaria de agradecer aos meus amigos e familiares, pelo carinho e pela compreensão nos momentos dedicados aos estudos, a todos que contribuíram direta ou indiretamente para que esse trabalho fosse realizado.
"Enquanto estiver vivo, sinta-se vivo. Se sentir saudades do que fazia, volte a fazê-lo. Não viva de fotografias amareladas... Continue, quando todos esperam que desistas. Não deixe que enferruje o ferro que existe em você. Faça com que em vez de pena, tenham respeito por você. Quando não conseguir correr através dos anos, trote. Quando não conseguir trotar, caminhe. Quando não conseguir caminhar, use uma bengala. Mas nunca se detenha." Madre Teresa de Calcutá
RESUMO
Os estafilococos coagulase negativos emergem como importantes patógenos nosocomiais, frequentemente isolados em bacteremias humanas, fato intimamente relacionado com o aumento do uso de dispositivos médicos ao longo dos últimos anos. Sua capacidade de aderir a superfícies poliméricas e produzir biofilmes constitui o principal fator de virulência associado a estes dispositivos. A fim de minimizar esta possibilidade, antissépticos são largamente utilizados para desinfecção de pele e mucosas na rotina hospitalar, no entanto, tem-se observado uma diminuição da susceptibilidade bacteriana a estes agentes. A diminuição da susceptibilidade dos microrganismos a antissépticos, associados a sua capacidade de formar biofilmes tem elevado a morbidade, mortalidade, período de internação e os custos relativos ao cuidado com a saúde. No estudo aqui apresentado, foram analisadas 81 cepas de Staphylococcus epidermidis resistentes a meticilina (MRSE) e 55 cepas de Staphylococcus haemolyticus resistentes a meticilina (MRSHa), todas resistentes a meticilina, isoladas de pacientes internados em hospital Universitário localizado na cidade de Niterói-RJ nos anos de 2008 e 2010. A determinação do perfil de susceptibilidade aos biocidas triclosan, clorexidina e cloreto de benzalcônio mostrou que frente ao triclosan, as amostras apresentaram as menores taxas de susceptibilidade bacteriana. Papaína não apresentou atividade antibacteriana. Entretanto, foi capaz de reduzir expressivamente a formação de biofilme (p<0,06) em ambas as espécies, mostrando-se a mais eficiente entre os produtos analisados. Foi capaz também de desintegrar biofilmes maduros formados por Staphylococcus epidermidis. Os biocidas não levaram à redução significante de biofilmes, exceto a clorexidina, que foi capaz de reduzir a formação do biofilme pelas MRSE. Foi possível verificar que cepas de MRSHa tratadas com cloreto de benzalcônio têm 40% menos probabilidade de formar biofilme se comparada às tratadas com triclosan e clorexidina. A análise estatística nos mostrou que a expressão do gene qacA/B influenciou significativamente a formação de biofilme e confirmou a relação existente entre os valores de concentração mínima inibitória (CMI) e a formação de biofilme (p< 0,001).
Palavras-chaves: Staphylococcus epidermidis; Staphylococcus haemolyticus; biocidas, biofilmes.
ABSTRACT
Coagulase negative staphylococci have emerged as important nosocomial pathogens, commonly isolated in human bacteremia, a fact closely related to the increased use of medical devices over the last few years. Its ability to adhere to polymer surfaces and produce biofilms is the main virulence factor associated with these devices. To minimize this possibility, antiseptics are widely used for disinfection of skin and mucosa in routine hospital, however, there has been an increase in bacterial resistance to these agents. Decreased susceptibility of microorganisms to antiseptics, associated with its ability to form biofilms has high morbidity, mortality, length of stay and costs related to health care. In the study presented here, we analyzed 81 strains of methicillin-resistant Staphylococcus epidermidis (MRSE) and 55 strains of methicillin-resistant Staphylococcus haemolyticus (MRSHa), all meticillin- resistant, isolated from patients hospitalized at University Hospital in the city of Niterói, Rio de Janeiro in 2008 and 2010. The determination of the susceptibility profile of biocides triclosan, chlorhexidine and benzalkonium chloride demonstrated that front of triclosan, the strains have the biggest rates of bacterial susceptibility. Papain showed no antibacterial activity. However, it was able to significantly reduce biofilm formation (p <0.06) in both species, being the most efficient among the analyzed products. It was also able to degrade established biofilms formed by Staphylococcus epidermidis. Biocides showed no significant reduction of biofilms, except chlorhexidine, which was able to reduce biofilm formation by MRSE. We noticed that strains MRSHa treated with benzalkonium chloride are 40% less likely to form biofilm compared to those treated with chlorhexidine and triclosan. Statistical analysis showed that the gene expression qacA/B was significantly influential to biofilm formation and confirmed positive relationship between the values of MIC and biofilm formation (p <0.001).
Keywords: Staphylococcus epidermidis; Staphylococcus haemolyticus; biocides, biofilms.
LISTA DE TABELAS E FIGURAS
Tabela 1. Concentrações finais dos antissépticos e da papaína adicionados ao àgar Mueller-Hinton para a determinação da concentração mínima inibitória.
Tabela 2. Concentração mínima inibitórias de cloreto de benzalcônio, clorexidina e triclosan para Staphylococcus epidermidis e Staphylococcus haemolyticus resistentes a meticilina.
Tabela 3. Susceptibilidade a biocidas e capacidade de formação de biofilme pelas amostras Staphylococcus epidermidis resistentes a meticilina (MRSE)
Tabela 4. Susceptibilidade a biocidas e capacidade de formação do biofilme pelas amostras de Staphylococcus haemolyticus resistente a meticilina(MRSHa)
Figura 1. Representação gráfica do comportamento das cepas estafilocócicas resistentes à meticilina com relação à formação de biofilmes em placas de poliestireno. (A) Staphylococcus epidermidis resistentes a meticilina- MRSE (B) Staphylococcus haemolyticus resistentes a meticilina – MRSHa.
Figura 2. Microscopia de campo Invertido da cepa de MRSE 173/08 produtora moderada de biofilme em placa de poliestireno. (A) Cepa sem tratamento; (B) Cepa na presença de cloreto de benzalcônio a 0,25 µg/mL; (C) Cepa na presença de clorexidina a 8 µg/mL; (d) Cepa na presença de triclosan a 0,02 µg/mL; (E) Cepa na presença de papaína a 2,5% e (F) Cepa na presença de papaína a 5%. Aumento de 40x.
Figura 3. Microscopia de campo Invertido da cepa de MRSE 81/08 produtora forte de biofilme em placa de poliestireno. (A) Cepa sem tratamento; (B) Cepa na presença de cloreto de benzalcônio a 2 µg/mL; (C) Cepa na presença de clorexidina a 2 µg/mL; (d) Cepa na presença de triclosan a 0,08 µg/mL; (E) Cepa na presença de papaína a 2,5% e (F) Cepa na presença de papaína a 5%. Aumento de 40x.
Figura 4. Microscopia de campo Invertido da cepa 37/08, uma MRSHa com produção moderada de biofilme em placa de poliestireno. (A) Cepa sem tratamento; (B) Cepa na presença de cloreto de benzalcônio a 4 µg/mL; (C) Cepa na presença de clorexidina a 1 µg/mL; (d) Cepa na presença de triclosan a 0,64 µg/mL; (E) Cepa na presença de papaína a 2,5% e (F) Cepa na presença de papaína a 5%. Aumento de 40x.
Figura 5. Microscopia de campo Invertido da cepa 33/08, uma MRSHa com produção moderada de biofilme em placa de poliestireno. (A) Cepa sem tratamento; (B) Cepa na presença de cloreto de benzalcônio a 2 µg/mL; (C) Cepa na presença de clorexidina a 0,5 µg/mL; (d) Cepa na presença de triclosan a 0,32 µg/mL; (E) Cepa na presença de papaína a 2,5% e (F) Cepa na presença de papaína a 5%. Aumento de 40x.
Figura 6. Boxplot das densidades ópticas dos biofilmes formados por cepas estafilocócicas que não receberam tratamento em comparação com aquelas tratadas com papaína 2,5% por um período de 20 horas. (A)Staphylococcus haemolyticus resistentes a meticilina – MRSHa; (B) Staphylococcus epidermidis resistentes a meticilina – MRSE
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
Aap- Accumulation associated protein (proteína associada ao acúmulo de biofilme) agr – gene regulador acessório
AI – auto-indutoras
ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária ATCC – American type culture collection
Atl – Autolisina
Bap- Biofilm associated protein (proteína associada ao biofilme) BPD/BPR – Diretório europeu de produtos biocidas
BZT - benzethonium chloride (cloreto de benzetônio) CDC – Center for disease control and prevention CMI – Concentração mínima inibitória
CLSI – Clinical and Laboratory Standards Institute DIMED – Divisão de medicamentos
DISAD – Divisão de saneantes e domissanitários DM – Dispositivo médico
DMSO – Dimetil sulfóxido
DOb – Densidade óptica de biofilme DOc – Densidade óptica de crescimento ECN – Estafilococos coagulase negativo FDA – Food and Drug Administration
IACS – Infecções associadas ao cuidado com a saúde MDR – Multidrug resistance (Resistência à múltiplas drogas) MFS – Major facilitator superfamily (Superfamília facilitadora)
MH – Ágar Mueller-Hinton
MRSE – Staphylococcus epidermidis resistentes à meticilina MRSHa – Staphylococcus haemolyticus resistentes à meticilina MS – Ministério da saúde
NHSN – National Healthcare Safety Network NNIS – National Nosocomial Infection Surveillance PCR – Reação em cadeia da polymerase
PHMB – polyhexamethylene biguanide (Polihexametileno biguanida) PIA – Adesina intercelular polissacarídica
PSM – Modulina fenol solúvel
QAC – Compostos quaternários de amônio
qac – gene relacionado à diminuição de tolerância a biocidas QS – Quorum – sensing
RND – Resistance/nodulation/cell division (Resistência/Nodulação/Divisão celular) SMR – Small multidrug resistance (Pequena Resistência a Múltiplas Drogas) SVS – Secretaria de vigilância sanitária
TSA – Trypic Soy Agar (ágar triptona de soja) TSB – Trypic Soy Broth (caldo triptona de soja) UB – Unidade de Biofilme
UTI – Unidade de tratamento intensivo WHO – World health organization
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 Staphylococcus epidermidis e Staphylococcus haemolyticus emergem no cenário das infecções associadas aos dispositivos médicos
2.2 Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus haemolyticus e formação de biofilmes em superfícies biopoliméricas
2.3 A utilização de biocidas no controle de microrganismos patogênicos
2.3.1 Triclosan
2.3.2 Digluconato de clorexidina 2.3.3 Cloreto de benzalcônio
2.4 Redução da susceptibilidade bacteriana aantissépticos 2.5 Papaína 3. OBJETIVO GERAL 3.1 Objetivos específicos 4. MATERIAIS E MÉTODOS 4.1 Microrganismos 4.2 Soluções 4.2.1 Biocidas 4.2.2 Papaína
4.3 Métodos para a determinação da concentração mínima inibitória
4.3.1 Teste de diluição em ágar 4.3.2 Teste de diluição em caldo
4.4 Métodos moleculares para detecção do gene qacA/B 4.4.1 Extração do DNA bacteriano
4.4.2 Detecção do gene qacA/B
4.5 Teste de Aderência e formação de Biofilme a. 4.8 Microscopia invertida 37 b. 4.9 Análise estatística 37 5. 5. RESULTADOS 38 15 17 18 19 18 19 19 19 23 19 24 19 25 19 26 19 27 19 28 19 30 19 30 19 31 19 31 19 31 19 32 19 32 19 32 19 33 34 34 34 35 32
4.6 Capacidade de redução da formação do biofilme na presença de biocidas e papaína
4.7 Avaliação da ação da papaína sobre biofilmes maduros produzidos por estafilococos
4.8 Microscopia invertida 4.9 Análise estatística 5. RESULTADOS
5.1 Susceptibilidade dos estafilococos a antissépticos e papaína
5.2 Detecção do gene qacA/B
5.3 Formação de biofilme pelas cepas estafilocócicas
5.4 Influência de biocidas e papaína na formação de biofilmes
5.5 Capacidade da papaína em degradar biofilmes maduros. 6. DISCUSSÃO 7. CONCLUSÃO REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ANEXOS 36 37 37 37 38 39 39 40 39 41 42 49 51 62 38
1. INTRODUÇÃO
A utilização cada vez mais frequente de dispositivos médicos implantáveis, tais como próteses, implantes e cateteres, se tornaram indispensáveis para a medicina moderna (Von Eiff et al., 2005). Entretanto, tais procedimentos têm favorecido o surgimento de infecções, principalmente em pacientes imunocomprometidos, resultando em morbidade, mortalidade e aumento dos custos para a saúde pública (Donlan, 2011).
Nesse sentido, os Estafilococos Coagulase Negativos (ECN), em especial os Staphylococcus epidermidis, seguidos dos Staphylococcus haemolyticus têm ganhado destaque, uma vez que têm sido frequentemente isolados em infecções associadas a dispositivos médicos (Vuong & Otto 2002; Falcone et al, 2006; Koksal et al., 2009; Kristof et al., 2011; Rosado et al., 2011). Os problemas de infecções associadas ao uso destes dispositivos têm sido tão numerosos, que alguns pesquisadores têm sugerido o reconhecimento de uma nova classe de doenças: “infecções crônicas associadas a polímeros” (Götz F, 2002).
A infecção geralmente acontece pela contaminação ocorrida devido a lesões teciduais provocadas pelos procedimentos de inserção do dispositivo, os quais podem carrear bactérias de um sítio não estéril para um sítio estéril, ou ainda pela adesão das bactérias às superfícies dos dispositivos médicos e posterior produção de biofilme. A inserção de próteses durante artroplastias tem apresentado dados assustadores, com previsão de incidência de infecções associadas à colocação de prótese de quadril e joelho atingindo os 50% em 2030 (Oduwole et al., 2011). O tratamento para este tipo de infecção é difícil, haja vista que quando esse filme
biológico é formado, frequentemente, o paciente tem que ser submetido à cirurgia para retirada do implante contaminado, pois o acesso de antimicrobianos e de células do sistema imune às bactérias torna-se dificultado pela imensa quantidade de material amorfo embebendo tais microrganismos (Götz, 2002).
A fim de se diminuir a colonização microbiana durante a execução destes procedimentos, biocidas têm sido utilizados. Como estes produtos são estrategicamente utilizados para reduzir a carga microbiana e diminuir possíveis contaminações, iniciamos este trabalho verificando a susceptibilidade bacteriana frente a clorexidina, triclosan, cloreto de benzalcônio, e frente a enzima papaína.
No entanto, tem-se observado ao longo dos anos, diminuição da susceptibilidade bacteriana aos agentes biocidas, principalmente aos quaternários de amônio e biguanidas (Smith e Hunter, 2008). A diminuição da susceptibilidade tem sido associada com a hiperexpressão ou aquisição de bombas de efluxo codificadas pela família de genes qac (Noguchi et al., 2006), localizados em plasmídeos. Devido a isso, estudamos a possível correlação entre a presença deste gene e a susceptibilidade bacteriana diminuída aos biocidas.
Finalmente, como a capacidade de formação de biofilme por cepas de ECN pode resultar em prejuízos para a saúde de pacientes, principalmente os imunocomprometidos, realizamos um estudo no qual verificamos a influência dos biocidas, em concentrações submínimas inibitória, sobre a formação de biofilmes estafilocócicos. Em paralelo, averiguamos a capacidade da papaína reduzir a formação dos biofilmes e desestabilizar os biofilmes já formados pelas cepas estafilocócicas em estudo.
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
Ao longo dos últimos anos, as infecções associadas ao cuidado com a saúde (IACS) têm atribuído importantes consequências econômicas aos sistemas de saúde dos países ao redor do mundo (CDC, 2011). O uso de dispositivos médicos invasivos como cateteres, linhas centrais e ventiladores frequentemente são associadas às altas taxas de infecção, principalmente em unidades de tratamento intensivo (WHO, 2011). Como consequência, prolongam o tempo de hospitalização e aumentam as chances de microrganismos se tornarem resistentes a antimicrobianos, implicando diretamente no aumento dos custos ao sistema de saúde, no aumento no número de óbitos, provocando um grande prejuízo aos serviços relacionados à saúde (CDC, 2009; WHO, 2011).
Um estudo divulgado pelo NNIS – National Nosocomial Infection Surveillance (Richards et al., 2000) mostrou que 97% das infecções de trato urinário e 87% das bacteremias primárias associavam-se a pacientes em uso de cateteres. Além disso, estima-se que na Europa, as IACS impliquem em perdas anuais de aproximadamente € 7 bilhões (WHO, 2011). Bacteremias associadas a cateteres em países europeus aumentam o tempo de internação entre 4 e 14 dias, e representam custo anual de aproximadamente €130 milhões na França e €53.9 milhões no Reino Unido (Tacconelli et al., 2009).
Somando-se a isso, estudos realizados na França, Alemanha e Itália revelaram que Staphylococcus aureus; enterobactérias; Pseudomonas spp.; enterococos; Escherichia coli ; Candida spp ; Acinetobacter spp e estafilococos coagulase negativos foram os principais patógenos associados às infecções
adquiridas em unidades de tratamento intensivo (De Rosa et al., 2008; Malacarne et al., 2010; WHO, 2011).
2.1 Staphylococcus epidermidis e Staphylococcus haemolyticus emergem
no cenário das infecções associadas aos dispositivos médicos
Os Staphylococcus epidermidis e os Staphylococcus haemolyticus são microrganismos participantes da microbiota de pele e mucosas de humanos e são isolados principalmente de axilas, cabeça e narinas (Kloos & Musselwhite ,1975; Larson, et al., 1986,; Ziebuhr et al., 2006). Acredita-se que eles apresentam relação benigna em humanos saudáveis, proporcionando atividade probiótica ao prevenir a colonização destes sítios por microrganismos patogênicos (Otto, 2009; Otto, 2012).
No entanto, dentre os ECN, essas duas espécies bacterianas, principalmente os S. epidermidis, representam os principais agentes de infecções associadas com dispositivos médicos (Vuong & Otto 2002; Falcone et al, 2006; Keim et al., 2011; Koksal et al., 2009; Kristof et al., 2011), emergindo no cenário das infecções, principalmente devido ao aumento do número de processos cirúrgicos de colocação de próteses, implantes, e ao uso constante de cateteres (Tambe et al., 2001). Essas infecções normalmente se iniciam com a introdução da bactéria através de seu carreamento a partir da pele do paciente ou do profissional da saúde durante a inserção do dispositivo médico, ou ainda pela adesão de bactérias às superfícies destes dispositivos. O sítio de inserção do dispositivo na pele e os conectores de cateteres são as principais fontes de colonização. A partir do sítio contaminado, microrganismos podem migrar pela superfície do dispositivo e ganhar a corrente sanguínea, levando à bacteremia e possível sepse (Cheung e Otto, 2010). Assim, microrganismos anteriormente considerados saprofíticos, hoje são apontados como importantes agentes de infecções hospitalares, acometendo pacientes imunocomprometidos, principalmente idosos, neonatos e pessoas com doenças crônicas (Donlan, 2011).
Cabe ressaltar que a terapia antibiótica para infecções causadas pelos ECN é dificultada devido principalmente a multirresistência destes microrganismos, uma vez que a maioria recebeu o gene mecA, que codifica uma proteína ligante de penicilina adicional (PBP2a), tornando a resistência a meticilina muito comum entre indivíduos hospitalizados (Horstkotte et al., 2002). Devido a isso, a resistência a meticilina entre os Staphylococcus epidermidis (MRSE - methicillin-resistant S. epidermidis) vem atingindo faixas de 75% em nível global (Diekema et al., 2000). Por outro lado, os S. haemolyticus representam cerca de 10% a 20% dos ECN isolados da clínica de forma geral (Ohara-Nemoto et al., 2008). O fato torna-se de maior importância porque os S. haemolyticus apresentam altos níveis de resistência antimicrobiana e podem atuar como reservatório de determinantes genéticos servindo como doadores de genes de resistência a estafilococos mais virulentos (Correa et al., 2008; Fredheim et al., 2009).
A crescente importância clínica parece estar intimamente relacionada com o perfil de patogenicidade destes microrganismos (Mack et al., 2006), uma vez que ambos possuem capacidade de aderir a superfícies poliméricas e produzir biofilmes. Este último caracteriza o principal fator de virulência relacionado a infecções associadas a dispositivos médicos (Mack et al., 2006; Fredheim et al., 2009).
2.2 Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus haemolyticus e formação
de biofilmes em superfícies biopoliméricas
Biofilmes foram definidos por Costerton e colaboradores (1987) como uma comunidade bacteriana altamente estruturada aderida a uma superfície, formada por microrganismos e seus produtos extracelulares. Atualmente, sabe-se que microrganismos podem formar uma matriz biopolimérica, composta principalmente por polissacarídeos, proteínas e DNA extracelular, a qual envolve a comunidade bacteriana conferindo proteção contra os mecanismos de defesa do hospedeiro e contra produtos antimicrobianos (Von Eiff et al., 1999).
De forma geral sabe-se que a formação do biofilme é um processo multifatorial que envolve quatro fases distintas: adesão, acúmulo, maturação e desagregação (McCan et al., 2008).
A adesão é o ponto crítico para o desenvolvimento das infecções associadas aos dispositivos médicos. A ligação da bactéria pode ocorrer de forma direta à superfície polimérica do dispositivo ou através de interações com proteínas de matriz extracelular do hospedeiro. Estas proteínas de matriz juntamente com componentes macromoleculares presentes em fluídos corpóreos fazem parte de um filme que se forma envolta do dispositivo logo após a sua inserção, e que facilita a ligação bacteriana a este (Choong & Whitfield, 2000; Fitzpatrick et al., 2005; MacCan et al, 2008).
A ligação inicial de microrganismos planctônicos a biomateriais é dependente de uma série de variáveis físico-químicas, onde interações eletrostáticas, tensão da superfície, temperatura e pH parecem exercer papel fundamental (Dunne 2002). Além destas variáveis, proteínas de superfície estafilocócicas organizadas em estruturas semelhantes a fímbrias, como a SSP-1 (280kDa) e a SSP-2 (250kDa), medeiam a ligação dos S. epidermidis ao poliestireno (Veenestra et al., 1996).
Em superfícies bióticas, proteínas de superfícies de S. epidermidis estão envolvidas na ligação ao filme condicionante. A proteína AtlE (do inglês: surface-associated autolysin), que também está envolvida na ligação a superfícies poliméricas não envoltas por proteínas de matriz extracelular do hospedeiro, promove a ligação ao poliestireno, à vitronectina e ao fibrinogênio (Heilmann et al., 1997, McCan et al., 2008). Proteínas associadas à superfície celular SdrG, SdrF e SdrH interagem com a matriz extracelular, assim como a Embp, uma proteína ligante a fibronectina, e GehD, que se liga ao colágeno (Bowden et al., 2002; Von Eiff et al 2002; Williams et al., 2002). Além disso, o ácido teicóico comumente presente na parede celular de bactérias gram-positivas parece funcionar como uma molécula ligante entre o microrganismo e a fibronectina imobilizada em superfícies condicionadas (Hussain et al., 2001; Jabbouri & Sadovskaya, 2010).
Uma vez que os microrganismos estejam aderidos, a fase de acumulação é instalada. Esta se caracteriza pela produção de compostos para a adesão intercelular por meio de polissacarídeos extracelulares, adesinas polissacarídicas e
proteínas. A adesina intercelular polissacarídica (PIA), uma ß-1,6 - glicosaminoglicana composta de resíduos N-acetilados foi identificada como o principal componente da matriz extracelular dos S. epidermidis (Mack et al., 1996). A síntese deste composto é realizada por enzimas codificadas pelo operon icaADBC (Heilmann et al., 1996; Mack et al.,1996; Rohde et al., 2005) e regulado pelo gene icaR, localizado upstream ao códon de iniciação do icaA. A produção de PIA também envolve outros elementos regulatórios. Sigma B (σB
) e SarA, que atuam de forma independente um do outro, parecem regular fatores de virulência de ECN e a transcrição do operon icaADBC (Handke et al., 2007).
Embora PIA tenha papel essencial na formação de biofilmes em S. epidermidis, estudos têm revelado a emergência de isolados clínicos produtores de biofilme em que o gene ica não está presente (Qin et al., 2007). Chokr e colaboradores (2006) notaram que somente a síntese de PIA não parece ser suficiente para a formação de biofilmes, e sugeriu que estafilococos podem formar biofilmes de forma independente de PIA.
Em S. epidermidis, a proteína associada ao acúmulo (Aap) é fundamental na fase de acumulação durante a formação do biofilme (Rohde et al., 2005). Caracteriza-se por ser uma proteína ancorada na parece celular, e que pode ser encontrada em S. epidermidis em uma forma alongada (220 kDa) e uma truncada (140 kDa) (McCann et al., 2008). Sua transcrição parece ser regulada positivamente durante a formação do biofilme (Hennig et al., 2007) e sua expressão aumentada em produtores de biofilme independente de PIA. Embora a Aap possa mediar a formação do biofilme na ausência de PIA, cabe ressaltar que o comportamento microbiano é complexo, sendo assim, Aap poderia então ter papel de cooperação com a PIA quando esta for expressa (Mc Cann et al., 2008). Já a proteina associada ao biofilme (Bap), assim com a Aap, é uma proteína ancorada na parece celular bacteriana e parece exercer um importante papel nos biofilmes formados independentes de PIA em S. epidermidis. Bap parece facilitar a formação do biofilme compensando a deficiência de PIA na matriz polissacarídica (Cucarella et al., 2004).
Diferentemente dos S. epidermidis que já são bem caracterizados como microrganismos cujo principal fator de virulência está associado à produção de biofilme em dispositivos médicos (DM), ainda são poucos os estudos com S.
haemolyticus neste contexto. No entanto, tem sido relatada a formação de biofilmes por estes microrganismos, assim como a presença do operon ica e a presença de um polissacarídeo capsular, contudo, mecanismos relacionados à virulência e produção de biofilme ainda não foram elucidados (Foka et al., 2006; Flahaut et al., 2008; Fredheim et al., 2009).
Um biofilme maduro é caracterizado pela presença de microrganismos dentro da matriz envolvidos por um “slime”, formando várias camadas (Habash & Reid, 1999; Dunne 2002; MacCan et al., 2008). Nesta estrutura são encontradas microcolônias separadas por canais onde nutrientes e oxigênio chegam às células, e por onde resíduos e produtos tóxicos do metabolismo celular são eliminados (Habash & Reid, 1999).
Células bacterianas podem separar-se do biofilme, de forma individual ou em agregados. Esta característica é de fundamental importância para o espalhamento de infecções associadas com os DM, pois a disseminação das bactérias a partir do biofilme pode levar à colonização de sítios distantes do local inicial e ainda contribuir para infecções estafilocócicas agudas (Yarwood & Schlievert, 2003). Acredita-se que o gene regulador acessório (agr) do sistema quorum-sensing (QS) estafilocócico tenha papel chave no processo de desprendimento das células (Vuong et al., 2004a; Yarwood et al., 2004).
Sistemas quorum-sensing são descritos como sistemas de comunicação célula-célula envolvidos na regulação da expressão gênica em resposta a flutuações da densidade celular, permitindo à célula se condicionar a mudanças ambientais (Otto 2004a, b). Pequenas moléculas chamadas auto-indutoras (AI) ao acumular-se em nível crítico ativam os sistemas QS culminando com a transcrição de genes alvos, incluindo fatores de virulência (MacCan et al., 2008). Sistemas QS estafilocócicos tendem a reduzir a formação de biofilmes, possivelmente devido à expressão de proteases e queda da produção de adesinas após a ativação do agr (Kong et al., 2006; MacCan et al., 2008). Entretanto, Coelho e colaboradores (2008) verificaram que a incapacidade de algumas cepas de Staphylococcus aureus formarem ou acumularem biofilmes sobre superfícies de poliestireno não era influenciada pelo agr (Coelho et al., 2008).
Peptídeos pró-inflamatórios, como modulinas fenol solúveis (PSM) parecem ser estritamente regulados pelo sistema QS agr (Vuong et al., 2004b). Toxinas Delta, uma das componentes da PSM, já identificada em S. epidermidis, e Staphylococcus haemolyticus (McKevitt et al., 1990; Mehlin et al., 1999), parecem inibir interações hidrofóbicas entre as superfícies celulares, reduzindo a tensão de superfície na interface do biofilme e, consequentemente, levando à separação e desagregação das células (MacCan et al., 2008). Outro sistema QS estafilocócico, identificado como luxS, também apresenta papel fundamental na desagregação de biofilmes bacterianos ao regular negativamente a transcrição de ica e a consequente produção de PIA (Xu et al., 2006).
2.3 A utilização de biocidas no controle de microrganismos patogênicos
A descontaminação dos ambientes são importantes intervenções a fim de se evitar a disseminação bacteriana. Metodologias que promovam o melhoramento das práticas de controle de infecção devem ser aplicadas, tendo como uma alternativa o uso de diferentes biocidas. Segundo o Diretório Europeu de Produtos Biocidas (BPD/BPR), estes são definidos como preparações ou substâncias ativas que tem por função inativar, prevenir ou controlar os efeitos químicos ou biológicos provocados por microrganismos nocivos. Podem apresentar-se sob 23 diferentes tipos, incluindo desinfetantes, antissépticos, conservantes, entre outros. São muito utilizados em produtos de higiene pessoal, alimentos e bebidas, produtos veterinários e inseticidas (Health and Executive Service, 2011).
Agentes antissépticos são definidos pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA, 2010) como “... substâncias aplicadas à pele para reduzir o número de agentes da microbiota transitória e residente.” Seu principal papel se dá ao prevenir a transmissão de microrganismos causadores de infecção às pessoas não infectadas e aos sítios estéreis. Seu uso tem sido altamente recomendado por instituições renomadas como o Center for Disease Control and Prevention (CDC), na preparação da pele para inserção de cateteres (O'Grady et al., 2011).
No Brasil, o Ministério da Saúde por meio da Divisão de Saneantes Domissanitários (DISAD), regulamenta os biocidas, e a Divisão de Medicamentos (DIMED) trata da normatização dos antissépticos (Reis et al., 2011). Os princípios ativos de antissépticos em uso no território nacional devem seguir as determinações estabelecidas pela Portaria n° 15, de 23 de agosto de 1988, da Secretaria de Vigilância Sanitária (SVS) do Ministério da Saúde (MS), ou outras que a complementem ou substitua.
2.3.1 Triclosan
Presente em enxaguantes bucais, dentifrícios, sabonetes e em outros produtos de higiene pessoal, o triclosan, tem se tornado cada vez mais frequente em ambientes hospitalares e domiciliares.
O triclosan é um produto sintético, não-iônico, de amplo espectro microbiano pertencente a classe dos bisfenóis (Newton et al., 2005). Moderadamente insolúvel em soluções aquosas, torna-se prontamente solúvel na presença da maioria dos solventes orgânicos, como etanol, dimetil sulfóxido (DMSO), propilenoglicol e polietilenoglicol (Yazdankhah et al., 2006).
Sabe-se que o triclosan em altas concentrações causa danos nas membranas celulares bacterianas levando à alteração da síntese lipídica e protéica. Em baixas concentrações, inibe a ação da enzima enoilacetil redutase (Enoyl acyl reductase -FabI), (Cottell et al, 2009), que atua na via de biossíntese de ácidos graxos. Em Escherichia coli foi observada a associação do triclosan a aminoácidos residuais formando um complexo ternário estável que se liga ao sítio ativo da enzima, inibindo a sua função (Cottell et al, 2009).
Embora seja utilizado em vários produtos disponíveis para a população e para instituições, a Food and Drug Administration (FDA) não tem evidências suficientes da segurança do triclosan, nem de seus benefícios extras para a saúde. Não se sabe se o produto pode apresentar riscos à saúde dos humanos. Alterações
hormonais em animais foram observadas quando estes foram expostos ao produto, porém ainda não se sabe se os mesmos efeitos podem ser observados em humanos. Além disso, estudos em bactérias têm sugerido a possibilidade do triclosan contribuir para o surgimento de resistência a antibióticos (FDA, 2010).
Estudos como o de Schweizer (2001) sugerem uma possível ligação entre a susceptibilidade diminuída ao triclosan e a resistência a antibióticos, uma vez que ambos dividem sistemas de efluxo multidrogas e causam a expresão de bombas de efluxo devido a seleção de mutações similares nos respectivos loci regulatórios. Geraldo e colaboradores (2008) sugerem que o uso do triclosan em associação com outros antissépticos pode oferecer menos risco de surgimento de mutantes resistentes.
2.3.2 Digluconato de clorexidina
O digluconato de clorexidina foi introduzido no Reino Unido em 1954, e desde então tem sido utilizado mundialmente como antisséptico tópico e desinfetante (Milstone et al., 2008; Silla et al., 2008). Pertencente à classe das biguanidas, é caracterizado por ser uma base forte com propriedades catiônicas. Devido a essa propriedade, é capaz de ligar-se à parede celular bacteriana, desestabilizando-a. Em baixas concentrações, consegue atravessar a parede celular, provavelmente por difusão passiva. O dano à permeabilidade da membrana resulta no extravazamento do material citoplasmático (McDonnell e Russell, 1999). Quando aplicada em altas concentrações, a clorexidina causa a coagulação de constituintes intracelulares (McDonnell e Russell, 1999), provavelmente devido a ligações entre proteínas (Ferraz et al., 2007 apud Fardal e Turnbull. 1986).
A clorexidina apresenta espectro de atividade contra bactérias gram-positivas e gram-negativas, aeróbios e anaeróbios facultativos, fungos e para alguns vírus como o HIV (Harbison e Hammer,1989). Apesar desse amplo espectro, não é efetiva contra bacilos álcool-ácido resistentes e esporos (Emilson,1977). Atualmente a
clorexidina encontra-se disponível comercialmente em diversas concentrações, variando de 0,5% a 4%, e em diferentes formulações, podendo ou não conter álcool isopropil ou etanol. Também é veiculada sob as formas de enxaguante bucal, aerossóis, géis, e em verniz, para fins odontológicos.
Sua utilização na odontologia remete a década de 1970, quando Löe e colaboradores (1976) demonstraram sua capacidade em reduzir a formação e o desenvolvimento de biofilmes bacterianos e a gengivite. A clorexidina, na forma de gluconato, tem sido também utilizada em banhos diários para a descolonização de pacientes hospitalizados nas concentrações de 2% e 4% a fim de aumentar a segurança dos pacientes e diminuir as taxas de IACS (Sievert et al., 2011).
Estudos recentes, no entanto, têm demonstrado susceptibilidade bacteriana reduzida a clorexidina (Smith et al., 2008; Wang et al., 2008; Akinkunmi e Lamikanra, 2012). Acredita-se que os mecanismos envolvidos incluam a inativação da droga e a hiperexpressão de bombas de efluxo. Porém, não se tem dados que comprovem a associação da redução da susceptibilidade como consequência da exposição repetida ao antisséptico.
2.3.3 Cloreto de benzalcônio
O cloreto de benzalcônio, um dos principais compostos quaternários de amônio (QAC), tem grande aplicação em loções corporais e protetores solar, limpadores faciais, descongestionantes nasais e colírios (Anvisa, 2012) sendo utilizado em alguns países também como desinfetante nos processos de produção de alimentos e no ambiente hospitalar (Moen et al., 2012).
O cloreto de benzalcônio pode apresentar diferentes tamanhos de cadeia carbônica, podendo variar de oito a dezoito carbonos, conferindo propriedades químicas variadas (Smith, 2002). Em altas concentrações, o cloreto de benzalcônio apresenta-se eficaz contra bactérias, principalmente as gram-positivas, fungos, algas e vírus lipofílicos. Os compostos quaternários de amônio são mais efetivos em
solução neutra ou levemente alcalina, e sua atividade bactericida é consideravelmente reduzida em meio ácido (Hegstad et al., 2010). A presença de matéria orgânica ou alta densidade microbiana, causada por biofilme ou aderência à superfícies, pode reduzir a sua eficiência (Hegstad et al., 2010; )
Como apresentam propriedades surfactantes e são catiônicos, atuam na superfície celular, principalmente na membrana citoplasmática, causando uma série de alterações que culminam com o rompimento da membrana e o escape do conteúdo celular. Aumento de temperatura, do tempo de exposição e presença de quelantes, pode aumentar a sua eficácia (Hegtad et al., 2010). No entanto, as bactérias podem apresentar resistência ao agente, na maioria das vezes associada à expressão de bombas de efluxo, que atuam removendo o QAC da membrana, e podem ainda, estar associadas à diminuição da expressão de porinas (Russell, 1998).
2.4 Redução da susceptibilidade bacteriana a antissépticos
Semelhante ao que ocorre com antibióticos, bactérias também apresentam susceptibilidade variada a antissépticos e desinfetantes distintos. Tal fato se deve provavelmente pelos diferentes mecanismos de ação envolvidos, como por exemplo, a aquisição de plasmídeos (Russel, 1995).
No caso dos estafilococos, a resistência aos biocidas tem sido associada com hiperexpressão ou aquisição de bombas de efluxo (Russell, 1998). Os determinantes de bombas de efluxo, principalmente as que atuam retirando os quaternários de amônio, estão localizados em plasmídeos, e também conferem menor susceptibilidade a biguanidas, como a clorexidina, e ao triclosan (Poole, 2005).
Essas bombas podem ser específicas para um único substrato ou serem inespecíficas carreando múltiplas drogas (MDR). Estas últimas são largamente disseminadas em bactérias gram positivas e gram negativas, estando associadas principalmente a três famílias de proteínas: SMR (small multidrug resistance), MFS (major facilitator superfamily) e RND (resistance/nodulation/cell division).
Nos estafilococos, as bombas de efluxo que conferem resistência aos antissépticos costumam ser codificadas pelos genes qacA, qacB, qacG, qacH e qacJ (Paulsen et al., 1996; Bjorland et al., 2003; Correa et al., 2008; Hegstad et al.; 2010). Os genes qacA e qacB conferem resistência a biocidas catiônicos (Noguhi et al, 2005), estão relacionados à família MFS e são encontrados em plasmídeos grandes de multirresistência (Heir et al., 1999; Heir et al., 1998).
Estudos sugerem uma possível relação entre a presença do gene qac e a resistência a alguns antimicrobianos (Cookson, 2005; Zhang et al., 2011), uma vez que determinantes de resistência qac e os genes de resistência a antimicrobianos foram encontrados no mesmo plasmídeo, fato que agrega preocupação quanto a sua disseminação (Sidhu et al., 2001; Sidhu et al., 2002; Cookson, 2005; Zhang et al., 2011).
2.5 Papaína
Obtida a partir do látex extraído das folhas e frutos do mamão verde (Carica papaya), a papaína é uma enzima proteolítica bastante empregada em indústrias e laboratórios de pesquisas, principalmente associada a estudos com curativos aceleradores de cicatrização (Uhlig, 1998, Jaime et al., 2007). Classificada como uma superfamília, a papaína apresenta extensa atividade proteolítca incluindo peptídeos de cadeia curta, ésteres de aminoácidos e ligações amidas (Uhlig, 1998, Tsuge et al., 1999; Amri e Mamboya, 2012).
Sendo uma das proteases de cisteína mais bem caracterizadas, a enzima apresenta estabilidade e mostra-se ativa em uma série de condições, incluindo elevadas temperaturas e pH variante de 3,0 a 9,0. Sua estabilidade se dá devido às três pontes dissulfeto que criam forte interação entre as cadeias laterais (Cohen et al., 1986; Edwin & Jagannadham, 2000) e sua atividade proteolítica ocorre devido ao radical sulfidrila (SH) pertencente a cisteína do sítio ativo, que ataca a carbonila da cadeia peptídica liberando o aminoácido terminal, levando à quebra da cadeia protéica (Amri & Mamboya, 2012).
Na medicina, sua principal utilização tem sido vinculada ao tratamento de feridas e queimaduras, principalmente devido a sua atividade desbridante (Leite et al., 2012). A enzima pode ser seguramente aplicada sobre a pele, sem danificá-la, devido a antitripsina α-1, uma antiprotease plasmática que impede a ação da enzima no tecido humano saudável (Flindt, 1979). É também utilizada no tratamento de lesões esportivas, traumas e alergias (Amri & Mamboya, 2012).
Na odontologia, é empregada na forma de gel para a remoção de cáries. Isso é possível devido à quebra de cadeias polipeptídicas e hidrólise de ligações de colágeno, e tem como vantagem a não interferência nos materiais de restauração ligados à dentina (Lopes et al., 2007; Subramaniam & Gilhotra, 2011) .
Embora atividade antibacteriana seja relatada em bactérias gram-positivas e gram-negativas (Chukwuemeka e Anthoni, 2010; Bhardwaj et al., 2012), no estudo de Lima e colaboradores (2009), a papaína nas concentrações de 2%, 4%, 6%, 8%, 10%, 16% e 20%, não apresentou atividade antibacteriana contra Enterococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae e Salmonella typhi. Nos estudos onde houve atividade antibacteriana, acredita-se que a enzima tenha interagido com a membrana celular bacteriana, desestabilizando-a, resultando em choque osmótico e liberação do conteúdo citoplasmático (Seenivasan et al., 2010).
3. OBJETIVO GERAL
Este trabalho teve como objetivo verificar o comportamento de cepas de Staphylococcus epidermidis resistentes a meticilina (MRSE) e Staphylococcus haemolyticus resistentes a meticilina (MRSHa) frente aos biocidas triclosan, cloreto de benzalcônio, clorexidina e frente a diferentes concentrações de papaína, assim como avaliar a influência destes produtos na formação e na redução de biofilmes.
3.1 Objetivos específicos
Testar a susceptibilidade das amostras de MRSE e MRSHa frente aos biocidas citados acima e a papaína, determinando as concentrações mínimas inibitórias (CMI);
Detectar a presença do gene qacA/B através da técnica de PCR - reação de cadeia da polimerase;
Correlacionar a presença dos gene qacA/B e a diminuição da susceptibilidades aos biocidas;
Verificar a capacidade de formação de biofilmes das cepas envolvidas no estudo;
Correlacionar a CMI encontrada para cada cepa com a capacidade desta formar biofilme, e correlacionar a presença dos genes qacA/B com a capacidade das cepas formarem biofilme.
4. MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 Microrganismos
Foram avaliadas um total de 136 cepas bacterianas isoladas de pacientes internados no Hospital Universitário Antônio Pedro (UFF), localizado na cidade de Niterói, sendo 55 (40,4%) de Staphylococcus haemolyticus resistentes à meticilina (MRSHa) e 81 (59,6%) de Staphylococcus epidermidis resistentes à meticilina (MRSE) originárias de sítios como sangue, ponta de catéter, swab nasal e swab anal. Estas cepas foram gentilmente cedidas pelo laboratório de Microbiologia do Serviço de Patologia do HUAP no período de 2008 e 2010, e fazem parte da bacterioteca mantida no Laboratório de Controle Microbiológico da Faculdade de Farmácia – UFF. As espécies foram identificadas por métodos automatizados como o VITEK (Lab BioMérieux – Vitek Inc) ou o Sistema Micro Scan (Baxter Diagnostic Inc) e estão sendo mantidas estocadas em meio crioprotetor (glicerol a 10%, v/v) a -20ºC.
4.2.1 Biocidas
Os produtos triclosan, cloreto de benzalcônio e clorexidina foram empregados como agentes biocidas durante este trabalho. O triclosan foi diluído em dimetil sulfoxido (DMSO) estéril como recomendado (Yazdankhah et al., 2006) e os outros produtos foram diluídos em água bidestilada estéril. Todas as soluções foram estocadas sob-refrigeração por até 30 dias.
4.2.2 Papaína
A papaína (Prozyn, Brasil) foi solubilizada em água Mili-Q estéril e mantida sob-refrigeração por até 7 dias.
4.3 Métodos para a determinação da concentração mínima inibitória
4.3.1 Teste de diluição em ágar
A determinação da susceptibilidade aos antissépticos e à papaína foi realizada através do método de diluição em ágar Mueller-Hinton (HiMedia, India) conforme estabelecido pelo Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, 2012). A concentração mínima inibitória (CMI) foi determinada como a menor concentração do biocida da papaína em que não houve crescimento bacteriano visível e foi expresso em µg/mL. Cepas de Staphylococcus aureus (ATCC 6538), e Staphylococcus epidermidis (ATCC12228), cedidas pelo Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde (Fiocruz/RJ), foram utilizadas como controles.
O meio Mueller-Hinton foi preparado conforme instruções do fabricante, sendo autoclavado e resfriado em banho-maria até 45 – 50ºC. Foram adicionadas a este diluições respectivas de cada biocida e de papaína (tabela 1). A mistura foi então vertida em placas de Petri formando uma camada de aproximadamente 4 mm. As placas foram solidificadas em temperatura ambiente, e armazenadas em temperatura de 2-8°C por no máximo 5 dias. Placas controles com Mueller Hinton agar mas sem adição dos produtos também foram utilizadas.
Amostras bacterianas foram semeadas em placas de ágar triptona de soja (TSA - Oxoid LTD, Inglaterra) e incubadas por 18-24 horas, tiveram colônias suspensas em solução salina estéril (0,85%; p/v) até atingirem turbidez semelhante a escala de 0,5 da solução padrão de McFarland (aproximadamente 108 UFC/mL). Em seguida, foi preparada uma diluição do inoculo de 1:10 em solução salina. Aproximadamente 1 µL de cada nova suspensão foram aplicados no meio de cultura com o auxílio de aplicador de Steers. As amostras foram inoculadas inicialmente em placas controle sem os produtos, seguidas de inoculações em diluições crescentes, e por fim, em outra placa controle para verificar se houve transferência de agentes antissépticos e papaína entre as aplicações. As placas foram incubadas por 24 h a 37°C e no dia seguinte, foi realizada a leitura através da observação do crescimento bacteriano.
As cepas bacterianas de MRSE e MRSHa que apresentaram CMI ≥ 4 µg/mL foram consideradas como resistentes ao cloreto de benzalcônio (Zmatar et al., 2011). Aquelas com CMI ≥ 8 µg/mL foram classificadas como resistentes a clorexidina (Karpanen et al., 2008; Nuryastuti et al., 2009) e aquelas que apresentaram CMI ≥ 1,75 µg/mL, resistentes ao triclosan (Cottel et al., 2009).
4.3.2 Teste de diluição em caldo
Para a determinação da susceptibilidade bacteriana à papaína também foi realizado o método de macrodiluição em caldo conforme estabelecido pelo Clinical and Laboratory Standart Institute (CLSI, 2012). Para tanto, uma suspensão bacteriana com turbidez semelhante a solução da escala 0,5 de McFarland foi
preparada. Em seguida, foi feita uma diluição de 1:10 em solução salina, e então 1 mL desta suspensão foi transferida para tubos contendo 1 mL de meio Mueller-Hinton (HiMedia, India) previamente adicionado das diferentes concentrações de papaína (1%, 2.5%, 5% e 10%). Os tubos foram incubados em estufa 36ºC por 24 horas, e no dia seguinte, foi realizada a leitura através da observação da turvação dos meios de cultura contidos nos tubos.
4.4 Métodos moleculares para detecção do gene qacA/B
4.4.1 Extração do DNA bacteriano
A detecção dos genes qacA/B foi conduzida por meio da reação em cadeia da polimerase (PCR). Para isso, o DNA bacteriano foi extraído através da metodologia descrita por Pacheco e colaboradores (1997). Bactérias semeadas em TSA foram incubadas a 37°C por 24 horas. Três colônias foram transferidas para Eppendorfs contendo 500 µL de tampão TE (10 mM de Tris-HCL, pH 7.4 + 1 mM de EDTA, pH 8.0). Estes foram centrifugados a 3000 rpm por 2 minutos, e o sobrenadante foi descartado. O precipitado de células foi ressuspenso em 200 µL de tampão TE, seguido de fervura em banho-maria por 10 minutos, e nova centrifugação a 3000 rpm por 1 minuto. Aproximadamente 10 µL do sobrenadante foi utilizado para a reação de PCR.
4.4.2 Detecção do gene qacA/B
A reação do PCR para a detecção do gene qacA/B foi realizada através da mistura de 10 µL de DNA genômico purificado, 20 pmol/ do par de primers foward (TGGCCCTTTCTTTAGGGTTT) e reverse (ATTCCATTGAGTGCCTTTGC), 50 µM de dNTP (ATP, TTP, GTP e CTP), 2U de Taq DNA polimerase, 5 µL 10X Buffer (Invitrogen), e 23 µL de água bidestilada, totalizando um volume final de 50 µL. A
reação de amplificação foi realizada no termociclador Biocycle MJ25+ (Biosystems, Brasil) programado para desnaturação inicial de 94°C por 3 min, 30 ciclos de 95°C por 60 s, 53°C por 60 s e 72ºC por 2 min. A extensão final foi de 72°C por 2 min. Os produtos de PCR foram submetidos à eletroforese convencional em gel de agarose a 1,5% em TBE 0.5X (50 mM de Tris-borato + 1 mM de EDTA, pH 8) a 90V por 50 min, posteriormente tratado com brometo de etídio a 0,5% (p/v) e visualizados em transiluminador de luz ultra-violeta (Vilber Loumart, França). Um fragmento de 198 bp foi correspondente ao gene qacA/B.
As condições das reações e o programa de amplificação para o qacA/B seguiu o critério estabelecido por Smith e colaboradores (2008). Como as amostras apresentavam resistência à meticilina, o gene mecA foi utilizado como controle positivo. O gene foi detectado através de um fragmento de 164 bp e amplificado através de desnaturação inicial a 94°C por 30 segundos, seguida de 25 ciclos de 30 segundos a 55°C e extensão final de 72°C por 1 minuto (Araujo et al., 2006).
4.5 Teste de Aderência e formação de Biofilme
Para a realização deste procedimento foram utilizadas placas para microtitulação de fundo plano compostas de poliestireno com 96 poços (Nunclon, Nunc InterMed, Rochester, NY, EUA). As cepas analisadas foram semeadas por esgotamento em TSA, incubadas a 37°C, e após 24 horas, colônias foram repicadas para tubos contendo caldo triptona de soja (TSB, Oxoid LTD, Inglaterra) suplementado com 1% de glicose (p/v). Estas foram incubadas overnight com leve agitação. Cada cultura foi diluída (1:100) em TSB suplementado com 1% de glicose e 200 µL foram aplicados a cada 2 poços. Cada placa foi incubada por 20 h a 37°C. No dia seguinte, inicialmente procedeu-se a leitura da densidade óptica de crescimento (DOc) através de leitor de espectofotometria no comprimento de onda de 570nm. Em seguida, a placa foi lavada com solução salina estéril (0,85%; p/v) e as bactérias foram fixadas a 65ºC por 1 h. A cada poço, foram adicionados 200 µL de solução de cristal violeta, deixadas por 1 min, e em seguida retiradas através da
lavagem com água destilada estéril. A água foi evaporada, a densidade ótica do possível biofilme (DOb) foi medida novamente a 570 nm. A unidade de biofilme (UB) foi calculada usando a fórmula: DOb/DOc. As cepas foram classificadas como formadoras ou não de biofilme de acordo com Araujo e colaboradores (2006). Assim, tomando-se por base a medida de UB para o S. pyogenes como 0,182, as cepas de S. epidermidis e S. haemolyticus que apresentaram UB < 0,182 foram definidas como não aderentes e as que apresentaram resultados iguais ou maiores que 0,182 foram classificadas como aderentes e descriminadas como se segue: 0,182 < UB < 0,364, fracamente aderentes; 0,364 < UB < 0,728, moderadamente aderentes e UB > 0,728, fortemente aderentes. S. epidermidis 70D e S. pyogenes 75194 foram usadas como controle positivo e negativo, respectivamente.
4.6 Capacidade de redução da formação do biofilme na presença de biocidas e papaína
Para este experimento foram utilizados tubos de TSB contendo 1% de glicose (p/v) suplementados com biocidas, de modo que obtivéssemos ½ e ¼ da concentração mínima de cada cepa, obtidas no teste descrito no item 4.2.1. Foram utilizados também tubos com 1% de glicose (p/v) suplementados com 2,5% ou 5% de uma solução de papaína (p/v).
Inicialmente as cepas bacterianas foram semeadas em TSA, e incubadas a 36°C por 24 horas. Em seguida, colônias foram transferidas para o TSB suplementado com 1% de glicose (p/v) e mantidas em agitação overnight conforme descrito por Amaral e colaboradores (2006). No dia seguinte, para cada cepa crescida no tubo anteriormente incubado, foram feitas diluições de 1:100 para os tubos contendo ½ de CMI e ¼ de CMI de cada biocida, e 2,5% e 5% de papaína. Estes foram homogeneizados individualmente em vórtex e em seguida, 200 µL da suspensão foram transferidos para os poços da placa de poliestireno. Para cada diluição foram utilizados dois poços. As placas foram incubadas em estufa a 36°C por 20 horas e o procedimento seguiu conforme descrito anteriormente. A verificação da redução do biofilme foi feita através da comparação das UB obtidas na presença e na ausência dos agentes estudados.
4.7 Avaliação da ação da papaína sobre biofilmes maduros produzidos por estafilococos
A fim de avaliar a influência da papaína sobre biofilmes maduros, bactérias foram cultivadas em placas de poliestireno conforme descrito anteriormente. Após a leitura da DOc seguida do processo de lavagem inicial da placa, cada poço foi tratado com 200 μL de solução de papaína a 2,5% e incubados por 20 horas em estufa a 36°C. Após o tratamento, os poços foram gentilmente lavados, fixados, e corados conforme descrito no item 4.5.
4.8 Microscopia invertida
Para a visualização em maiores detalhes do biofilme formado sobre as placas de poliestireno, estas foram submetidas a técnica de microscopia invertida utilizando Microscópio Nikon Eclipse, modelo TE 2000-U, instalado no laboratório de Neuroquímica do Instituto de Biologia da Universidade Federal Fluminense. Para tanto, foram analisadas 5 cepas de MRSE e 5 cepas de MRSHa. Para cada grupo existiam 2 cepas fortemente produtoras de biofilme(40%), 1 produtora moderada (20%), 1 produtora fraca (20%), e 1 não produtora (20%). Foram realizadas leituras em pelo menos 5 diferentes campos para cada poço.
4.9 Análise estatística
A análise estatística das variáveis foi obtida através de regressão logística. Para a comparação entre os grupos foi realizado teste ANOVA seguido do teste de Tukey. O teste t-student foi utilizado para a comparação de amostras independentes. Os testes estatísticos foram realizados através do software (S-Plus 8.0). Foi adotado o nível de segurança de 90% (p ≤ 0,10) para que os resultados fossem considerados significativos.
5. RESULTADOS
5.1 Susceptibilidade dos estafilococos a antissépticos e papaína
As concentrações mínimas inibitórias obtidas a partir da análise das 136 cepas apresentaram resultados variados de acordo com o produto analisado. As CMI das cepas submetidas ao triclosan variaram de ≥ 0,04 µg/mL a ≤ 5,12 µg/mL, enquanto que as cepas submetidas ao cloreto de benzalcônio e clorexidina apresentaram valores de CMI mais elevados, variando de ≥ 0,5 µg/mL até ≤ 64 µg/mL (Tabela 2).
Ao analisar o comportamento bacteriano frente ao cloreto de benzalcônio pode-se perceber altos níveis de resistência ao produto, uma vez que 63% (51/81) das cepas de MRSE e 92,7% (51/55) cepas de MRSHa apresentaram CMI > 4 µg/mL. O mesmo pode ser observado com relação a clorexidina, pois 14,8% (12/81) das cepas de MRSE tratadas com esse antisséptico apresentaram CMI >8 µg/mL. Assim como ocorreu na análise do cloreto de benzalcônio, as cepas de MRSHa também apresentaram menores níveis de susceptibilidade a clorexidina com 38,2% (21/55) exibindo CMI >8 µg/mL. Também foi observado que, em comparação aos outros produtos, os microrganismos testados apresentaram maiores níveis de susceptibilidade ao triclosan, pois 7,4% (6/81) das cepas de MRSE e 9,1% (5/55) cepas MRSHa apresentaram CMI> 1,75 µg/mL. Além disso, foi verificado que as cepas de MRSHa apresentaram menor susceptibilidade ao triclosan quando comparadas às cepas de MHSE. Os valores de CMI50 e CMI90 respectivos para cada espécie e antissépticos estão disponibilizados na tabela 2.
Opondo-se aos resultados obtidos para os biocidas, verificou-se que nenhuma das cepas analisadas nos testes de diluição em placa e diluição em caldo foi susceptível às diferentes concentrações de papaína (1%, 2,5%, 5% e 10%) utilizadas nesse estudo.
5.2 Detecção do gene qacA/B
Com relação à presença dos genes qacA/B, observou-se que 36,4% (20/55) das cepas de MRSHa apresentavam os genes. Padrão semelhante foi encontrado para os MRSE, onde 33,3% (27/81) das cepas analisadas apresentaram qacA/B. A análise estatística mostrou que existe relação entre a presença do gene qacA/B, o aumento da resistência aos biocidas e a capacidade de formação de biofilme. Entretanto, neste trabalho, não ficou constatado significante influência do gene qacA/B para a variável espécie (p>0,1).
5.3 Formação de biofilme pelas cepas estafilocócicas
A capacidade das cepas estafilocócicas formarem biofilme foi avaliada a partir da seleção de 30 cepas de cada espécie, escolhidas de forma randômica. Assim, das 30 cepas de MRSE testadas, 14 (46,7%) foram classificadas como não aderentes, ou seja, não produtoras de biofilme. Com isso, a maioria das cepas, 16 (53,3%) cepas foram consideradas produtoras de biofilme e classificadas, segundo Araujo e colaboradores (2006) como: fracamente aderentes: 5/30 (16,6%); moderadamente aderentes: 6/30 (20,1%) e fortemente aderentes: 5/30 (16,6%). Tais resultados foram ilustrados na figura 1a e podem ser observados com maiores detalhes na tabela 3.
Também foi verificado que não houve diferença significativa entre os MRSE e MRSHa, uma vez que das 30 cepas de MRSHa analisadas, 21 (70%) foram capazes de formar o filme biológico, sendo classificadas como: fracamente aderente 8/30 (26,7%), moderadamente aderentes: 5/30 (16,7%) e fortemente aderentes: 8/30 (26,7%). Portanto, nove cepas de MRSHa (30%) não foram capazes de aderir à microplaca, sendo classificadas como não produtoras de biofilme. Estes resultados foram ilustrados na figura 1b e podem ser observados com maiores detalhes na tabela 4.
5.4 Influência de biocidas e papaína na formação de biofilmes
As mesmas 60 cepas descritas anteriormente foram cultivadas em meios de cultura acrescidos de glicose a 1% e adicionados de biocidas, nas concentrações de ½ ¼ da CMI, e nas concentrações de 2,5% e 5% de papaína.
Confrontando as densidades ópticas de biofilme das cepas tratadas com as não tratadas, constatou-se que o cloreto de benzalcônio não alterou a capacidade de cepas de MRSE (p= 0,820) e MRSHa (p =0,139) formarem biofilmes quando tratadas com 1/2 ou ¼ das concentrações mínimas inibitórias. O mesmo ocorreu com o triclosan, que não influenciou os valores obtidos para cepas de MRSE (p=0,334) e MRSHa (p=0,520). O tratamento com a clorexidina também não promoveu efeitos redutores contra os MRSHa (p=0,350) tratados com ½ da CMI e ¼ da CMI. Entretanto, diferentemente do observado para os outros biocidas, a presença da clorexidina provocou uma diminuição significativa nos biofilmes formados por MRSE (p=0,06) tratados por ambas as concentrações submínimas inibitórias. Tais resultados podem ser observados em maiores detalhes nas figuras 2, 3, 4 e 5.
Cabe ressaltar que embora todos os antissépticos tenham sido ineficazes em reduzir biofilmes bacterianos produzidos por MRSHa, o cloreto de benzalcônio parece ser o menos propício a formar o filme biológico, apresentando até 40% menos chances quando comparado com o triclosan e a clorexidina.
