Avaliação do comportamento morfogenético de Pinus caribaea Morelet var. hondurensis Barr. & Golf. in vitro

Texto

(1)AVALIAÇAO DO COMPORTAMENTO MORFOGENETICO DE. Pinus caribaea MoRELET var. hondurensis BARR. & GOLF. "in vi t.ro ... CRISTINA VIEIRA DE ALMEIDA Bióloga. Orientador: Prof. Dr. ANTONIO NATAL GONÇALVES. Dissertação apresentada à Es cola Superior de Agricultura "Luiz de Queiroz", da Univer sidade de São Paulo, para ob tenção do titulo de Mestre em Agronomia. Ãrea de Concentra ção: Solos e Nutrição de Plan tas.. PIRACICABA. Estado de São Paulo - Brasil Fevereiro - 1991.

(2) Ficha catalográfica preparada pela Seção .de Livros da Divisão de Biblioteca e Documentação - PCAP/USP A447a. Almeida, Cristina Vieira de Avaliação do comportamento morfogenético de Pinus caribaea Morelet var. hondurensis Barr.:';l'i.:©:càfaH. :P±-,::m: racicaba, 1991. 74p. ilus. �Gd :G,;::;.: ·�·,r:n.t:";;:\ ,,, , ..; Diss. (Mestre) Bibliografia. 1. Pinheiro - Calo - Histologia 2. Pinheiro - Com portamento morfogenético 3. Pinheiro - Cultura de te cido 4. Pinheiro - Propagação "ín vítro" 1. Escola Su períor de Agricultura Luiz de Queiroz, Piracicaba. CDD. 634.9751.

(3) AVALIAÇÃO DO COMPORTAMENTO MORFOGENÉTICO DE. Pin.c.u CJVÚ.ba.ea. Morelet. Var.. hon.d.u.Jtemi.6. Barr & Go!f.. 11. in vi-. tro". CRISTINA VIEIRA DE ALMEIDA. ···. Prof. Dr. Antonio Natal Gonçalves. ESALQ/USP. Prof. Dr. Luiz Antônio Roche}le,_::. ESALQ/USi'. Prof. Dr. Murilo de Melo. ESALQ/USP. tf. Dr. Antonio Natal Gonçalves. Orientador.

(4) ii.. Ãs. minhas filhas CAROLINA. e LtVIA. e a meu marido MARC!LIO�. D E D I C O.. A meus pais. DÉCIO e MARLEY. O F E R E Ç O..

(5) iii.. AGRADECIMENTOS Ao Prof. Dr. Antonio Natal Gonçalves por. desempenho na orientação deste trabalho.. Ao Prof. Dr. Otto Jesu Crocomo,. agradecimento, pela orientação no inicio ra.. de. um. seu. especial. minha. carrei-. Ao Prof. Marcilio de Almeida pela excepcional. colaboração durante toda a realização desta pesquisa. Ã. Duratex Florestal pelo fornecimento do. terial vegetal utilizado neste trabalho.. Ao Depto. de Botânica - ESALQ/USP, pela. uti. Ao Phocus Studium,. Fued. lização de seus laboratórios de Anatomia e cidos.. na. Cultura. pessoa. do. de. Sr .. Kraide Sobrinho, pelos serviços prestados, dedicação e zade.. ração.. ma. Ao amigo Renato Colletti Jr. por sua. Ã. amiga Lúcia H. Pavan Forti por. tivo e colaboração. Ã. seu. todos que direta ou indiretamente,. raram na execução do presente trabalho.. Te. ami. colabo-. incen. colabo-.

(6) i. SUMÃRI0. Página. RESUMO •••••••••••••••••••••••••••••••••••.••.••••• SUMMARY ••••••••••••••••••• • ••••••••••••••.••••••••. 1.. vi. viii. INTRODUÇ.AD •••••••••••.• • .•• •••.•• ••.•..••••.•.•. 01. 2. REVIS.AD DE LITERATURA •• • •• • ••••••• •••••••••••••. 03. let var. hondurens.i.s Barr. & Golf .••.•..... 03. 2.1. Descrição da espécie. Pinus caribaea. More-. 2.2. Morfogênese .......••.•......•........•..... 2.3. Citomorfogênese. 2.3.1. Sities e planos de divisão ••••••••.. 2.4. Embriogénese . ..... . .. . . ......... . ........... 2.4.1. Aspectos da embriogênese somática ... 2.4.2. Embriogénese somática direta ........ 06. 10. 12 16. 16. 20. 2.4.3. Embriogênese somática indireta ...... 23. 3. MATERIAL E MeT0D0S ••••• •••••••••••••••••••••••• 3.1. Local de realização do trabalho ............ 28. 3.2.1. Enxertia seriada e poda sucessiva ... 28. 2.5. Organogênese .... .. . .. ...................... 25. 28. 3.2. Determinação da fonte de explante .......... 28. 3.2.2. Caracteristicas do explante •.•••.... 29. 3.3. Protocolo de esterilização ................ 3.4. Inoculação dos explantes ...............•... 3.5. Estabelecimento da cultura ..... ......•..... 3.6. Fases experimentais .. ...................... 29. 30 31. 31. 1 ...••............... 31. 3.7. Avaliações . ....... . .. ....... .. .. ........... 34. 3.6.1. Experimento n. 3.6.2. Experimento n. ° º. 2. V.. 32.

(7) V.. 3.7.1. Citológicas. 3.7.2. Anátomo-histológica 4. RESULTADOS E DISCUSSÃO 4.1. Experimento n ° 1. 4.2. Experimento n ° 2 5. CONCLUSOES. .............-........................ REFEReNCIAS BIBLIOGRÃFICAS. Página 34 34 42. 42. 63. 64 65.

(8) vi AVALIAÇÃO DO COMPORTAMENTO MORFOGENÊTICO DE. Pinus caribaeae Morelet var.. hondurensis Barr. & Golf.. "in vit.ro". Autora: Cristina Vieira de Almeida Orientador: Prof. Dr. Antonio Natal Gonçalves. RESUMO Os principais objetivos deste trabalho foram: a) determinação do meio de cultura adequado para a. obtenção. de gemas adventícias; b) indução de caulogênese e. embriogê. nese somática; c) avaliação anátomo-histológica a partir de explantes de gemas de Pinus caribaea Morelet. de. var. hondu-. rensis Barr. & Golf. "in vitro". Gemas axilares obtidas de 3a. poda de 2a. enxertia seriada, foram. utilizadas. Foram cultivados em meio de cultura. de. como. sucessiva explantes.. MURASHIGE. &. SKOOG. (1964) e EEUWENS (1976), complementados com as vitaminas MOREL & WETMORE (1951).. Foram. feitas. modificações. de. quali-. quantitativas dos reguladores de crescimento. A análise dos resultados. permitiram. as. se. guintes conclusões: 1. a seqüência de transferências: 1/2 MS para MS + ANA + BA + vitaminas de Morel +. 4Og. de. sacarose.

(9) V. para o meio de cultura de Eeuwens. foi necessária. mental para a indução de caulogênese; 2. Pinus caribaea Morelet var.. a. e. funda-. caulogênese. hondurensis Barr . & Golf.,. trou-se viável, 3. a organogênese indireta. apresentou. capacidade de multiplicação de gemas adventícias e de axilares; 4. a embriogênese somática indireta foi uma vez obtido calos com células. embri6nicas,. ii. em mosalta. gemas. possível,. agregados. e. embriões; 5. calos de coloração clara ou branco gelatinoso e friáveis, são fortes indicadores de morfogênese; anátomo-histológica. mostrou-se. essencial. informações do comportamento das células.. por. 6. análise oferecer.

(10) Vi i i EVALUATION OF THE MORPHOGENETIC BEHAVIOR OF. Pinus caribaea Morelet var.. hondurensis Barr. & Golf.. "in vi tro". Author: Cristina Vieira de Almeida Adviser: Prof. Dr. António Natal Gonçalves. SUMMARY The. objectives. of. this. determination of adequate tissue culture titious bud production;. e). were:. media. caulogenesis. b). bryogenesis induction and. work. and. for. a). adven-. somatic. em-. anatomic-histologicevaluation. from shoot explants of Pinus caribaea. Morelet. var.. hondu-. rensis in vi tro. collected. Shoots hedging. of. second. serial. explants and cultivated in EEUWENS (1976) (1951). media,. vitamins.. third. from. grafting MURASHIGE. supplemented. Quali quantitative. trees &. successive. were. SKOOG. used. (1962). as and. WETMORE. with MOREL &. modifications. were. made on the growth regulators rise. The analysis of the results allowed the following conclusions: 1. the. sequences. of. to. draw. transfers:. 1/2 MS to MS + ANA + BA + Morel vitamins + 40 g/1 sucrose to. Eeuwens was necessary and nesis,. fundamental. to. induce. 2. the caulogenesis in Pinus caribaea. cauloge-. Morelet. var..

(11) 1 X .. indirect. organo. genese shows high capacity for adventitious bud and. axilary. hondurensis showed to be viable,. bud produc tion,. 4.. 3.. the. the indirect somatic. embryogenisis. possible since embryogenic callus was produced,. 5. light or. white gelatinous and friable calli are strong indicators morphogenesis,. 6. the anatomic-histologic. was. analysis. of. showed. to be essential by giving information on cell behavior..

(12) 1. t INTRODUÇlO Os objetivos dos trabalhos com árvores utili zando-se a cultura de células. e. tecidos. como. alternativa. para a propagá-las são: otimizar os sistemas de produção mudas ou clones, manutenção e/ou aumento da produtividade. de e. outras fases de programa de melhoramento florestal. Um dos processos de micropropagação envolve o desenvolvimento. de. clones a partir de gemas que são. indu-. zidas sob condições de laboratório (in vitro). Na estratégia de multiplicação de gemas axilares gemas da base das. folhas. axilares. é. importante sejam. que. as. constantemente. retiradas, para que novas gemas axilares possam se desenvolver e crescer. A técnica in vitro é uma maneira impar de estudar os eventos. morfogenéticos,. pois. esta. metodologia. permite expor de forma experimental, os explantes às combinações quali-quantitativas dos reguladores mento e condições ambientais.. se. de. várias cresci.

(13) 2. Quando se estuda morfogênese in vitro, faz-se necessário. a. utilização. de. explantes. estimulo (CHRISTIANSON & WARNICK, 1983). apropriado de indução,. as. células. determinadas, através de um modelo. do. que. respondam. Após. um. explante. especifico. ao. periodo tornam-se. de. diferen. ciação. A capacidade de um explante de (caulogênese), pode ser determinada. formar. ramos. pela observação de. resposta na proliferação de ramos em meio de. cultura. de estimulo, após terem sido induzidos por um breve de tempo (CHRISTIANSON & WARNICK, 1983).. livre. periodo. Espera-se. formação de calos possa ter uma importância nos controle do crescimento, podendo direcionar. a. sua. que. a. estudos. de. formação. de. órgãos ou mesmo de plantas inteiras, a partir de espécies de valor comercial que apresentam dificuldades. para. a. gação vegetativa (DURZAN & CAMPBELL, 1974; DURZAN. propa. et. alii,. 1973). Uma vez que se tenha optado pela de cultura in vitro, o presente trabalho teve. metodologia como. objeti-. vos: A. Determinar meios de cultura mais adequados para a obtenção de gemas adventícias; 8. Induzir cauloqênese direta e/ou indireta; C. Avaliar tados obtidos.. histomorfologicamente. os. resul-.

(14) 3. 2. REVISÃO DE LITERATURA 2.1. Descrição da espécie Pinus caribaea Morelet var.. hondurensis Barr. & Golf. No Brasil, o Pinus caribaea Morelet pode considerada uma das espécies mais importantes, a qual vem se desenvolvendo um extenso menta. genético. e. atividade. programa. económica. ser. partir de. da. melhora-. (KAGEYAMA,. 1980).. Destaca-se nessa espécie a boa qualidade da madeira, para produção de polpa de celulose de. fibra. para. papel,. caxilhos,. baten-. longa. para a indústria de construção civil como. a. tes,portas, forros; indústria quimica (resina e. derivados),. além do uso para proteção do solo. A familia Pinaceae é a maior. e. impor-. mais. tante da ordem Coniferae, abrangendo nove gêneros e duzentas e dez espécies, sendo o qênero Pinus o que mais nessa ordem, abrangendo. muitas. espécies,. tribuidas pelo Hemisfério Norte até os subtropicais nas índias Ocidentais,. se. destaca. amplamente. paises. Arquipélago. dis-. tropicais das. e. Fili-.

(15) 4. pinas, Antilhas, Ilhas Bahamas, México, Guatemala, Honduras, Nicaráqua, com maior ocorrência nos climas. temperados,. mas. sem ultrapassar o Equador . O gênero Pinus agrupadas de acordo com as. compreende. noventa. caracteristicas. espécies. organográficas.. Pinus. Pilger, citado por VIDAL (1962), divide o gênero. nos. seguintes subgéneros: Haploxylon, com os pinhos brancos, não resinosos e folhas. Diploxilon,. e. penta-fasciculadas;. abrange os pinhos produtores de madeira mais clara,. que. colori-. da, resinosa, com duas folhas na haste foliar . Dentre as espécies do se encontra o. Pinus. caribaea. (1973), ocorrem conjuntamente. Pinus elliottii (no. sul. da. Morelet, em. Diploxilon,. subgénero que. segundo. populações. naturais. Pinus. Flórida),. LAMB com. ocidentalis�. Pinus cubensis e Pinus tropicalis (no oeste de Cuba),. rece-. bendo nomes locais como Pinus caribaea (inglês), pitch pine, pino de la Costa, pino colorado, ocote. pino. blanco,. cari-. baea de Honduras e pino macho. Sequndo LAMB (1973), o Pinus caribaea Morelet var.. hondurensis Barr. et. Golf. apresenta. lares, abertas nas extremidades dos ramos persistentes por dois anos. fascículos de três ..,. Al1111mMc;. As. mesmas. triangular, com. 1,5. rigidas, de cor verde. mm. de. escura. de. largura e. (em. acicu-. cachos). são. quatro. vP?Pc;. quinze e vinte e cinco centimetros. folhas. dispostas e. cinco,. comprimento, ou. menos,. amarelecida,. e. em com. secção. serreada,. ligeiramente.

(16) 5. brilhante com estômatos em linha e em toda a sua superfície, de dois a oito canais resiniferos, internos e apenas um mediano.. biformes,. Apresenta hipodermes. com três a cinco camadas de células, bainha de mi 1 imetros de l Arri11rA, mr1rrnn r l r1rr1,. de. raramente. espesso. dez. doze. a. e. escura. tornando-se. persistente. As flores são estrobiformes, femininas em maior percentaqem na parte. alojando-se. superior. da. as. copa,. enquanto as masculinas se concentram em maior quantidade. na. parte basal da mesma, sendo portanto espécie monóica.. A. polinização é predominantemente alógama e anemófila. Os cones quando jovens são eretos e reflexos, em pedúnculos, escamosos de 1 a 1,5 cm de largura, des, brilhantes e com apêndices pequenos.. elipsóimaduros. Quando. são geralmente reflexos, simétricos, deciduos, com 6 a 14 cm de comprimento (FARJON, 1984). As sementes são ovóides, triangulares largasem uma das extremidades, pontiagudas em ambos tremas,. ligeiramente qrossas e coloridas, com. do qametófilo feminino e o. tecido. ou. exarti-. Interna-. tecido. externo. os. asas. culadas, membranosas e de fácil remoção mecânica. mente, proteqendo o embrião encontra-se o. mais. nutritivo. integumento. como a capa protetora da semente. Nesta variedade arima descrita, destaca-se número de cotilédones que varia entre comum 7 e 8.. 5. e. 9,. sendo. o. mais. O hipocótilo, entretanto, é frequentemente. de.

(17) 6. cor avermelhada, causada pela presença daantocianina dina, que esporadicamente aparece nos cotilédones.. malvi15. Após. dias da germinação os cotilédones atingem seu tamanho máximo e acima deles logo aparece. um. folhas. feixe de. primárias,. que assume a função de folhaqem. As folhas secundárias normalmente denominadas de aciculas. podem. aparecer. primeira estação de. ocasionalmente. crescimento,. durante o segundo ano.. As. mas. folhas. em. as. folhas. primárias. às. da. final. acontece. geral,. primárias. irregulares na sua aparência em relação após 2 ou 3 anos,. no. sempre. são. e. secundárias,. são. completamente. substituidas pelas secundárias. Os representantes arbóreos, alcançam até 45 m de altura, tronco pode chegar a 1,35 m de diâmetro à ramos são retos e ascendentes, capa densa e. estreita.. A. altura. nas. do. adultos, que. reto,. normalmente. formando casca. quando. Os. peito.. normalmente árvores. uma. jovens. é. delgada, rugosa, sulcada e cor gris, e nas adultas se tornam fissuradas em placas achatadas, retangulares de. cor. escura. esfoliativa.. 2.2. Morfogênese. Morfogênese é definida como sendo. alterações. no crescimento e/ou no desenvolvimento, produzindo. mudanças.

(18) 7. estruturais na célula ou. no. capazes. tecido,. de. originar. embriões somáticos (embriogênese somática) ou órgãos. adven. ticios (oraanoaênese). WARF T NG & PH T 1 1 T PS. crescimento. o. definem. ( .1 981 ) ,. termo. como mudanças quantitativas que ocorrem durante. o desenvolvimento, e também como as. mudanças. no tamanho de uma célula, órgão. no. ou. irreversiveis. organismo. inteiro.. Para o termo diferenciação, esses autores atribuem não só as alterações quantitativas no número e arranjo das células nos diferentes órgãos, mas também alterações qualitativas. Segundo CROCOMO (1974), a diferenciação desenvolvimento consistem muitos. tipos. em que uma única célula,. especializados. formarão o organismo adulto. tura e função. está na. Assim , a. células,. baseada. genética. diferenciação. àquilo que na célula faz com. que. finalmente. um. e. progra-. estreitamente gen. estru-. expressão. apropriadamente. está. que. na. o. produza. Esta exteriorização de. realidade. utilização da informação mada.. de. e. ligada. particular. ativo e proporcione a ação de uma enzima. ou aquilo que. seja faz. com que o outro gen seja inativo. Certas. rél11lAc;. 11uAnto. mais. diferenciadas,. mais vagarosamente se dividem, sendo também uma constante observação de que quanto menos diferenciadas,. mais. a. rapida-. mente sofrem divisão. Tecidos com células. diferenciadas. em meio de cultura, apresentam como primeira. colocados. modificação. o.

(19) 8. aparecimento de um tipo especial de câmbio (câmbio de. cica. trização), com produção de células bem menores que o. tecido. A estrutura e distribuição das. sugere. original.. organelas. F�tA fase pode ser interpretada como uma dediferenciação, que é ciação, com um novo padrão. seguida. de. produzem. crescimento, qrandes. que. células. uma. desenvolvimento:. câmbio vascular ou meristemóide. centros de. por. diferen-. periderme,. Os meristemóides tornam-se. quando. não. se. parenquimatosas. diferenciam,. na. periferia,. formando tecido normalmente conhecido como calo.. todas. Nem. as células do calo evoluem para células desse tipo,. algumas. podem se. floema.. diferenciar. em. e lementos. de. xilema. e. Outras células, como as pequenas células meristemáticas centros de crescimento, permanecem. indiferenciadas,. aparência de 11m merjstema apjcal.. Estas. produzir raízes (rizogênese) ou. caules. dos. com. estruturas. podem. (caulogênese),. com. Embriói-. toda a variação de tipos celulares desses órgãos. des também podem se desenvolver a partir dessas. a. massas. me. ristemáticas ou de células superficiais (embriogênese). Células isoladas podem ser colocadas em tura, suspensas em meio liquido.. Geralmente. diferenciadas, vacuolizadas (como as células. são do. cul-. células. parênquima. clorofiliano do mesófilo ou células isoladas de calos).. Em. culturas em suspensão, há grande variação de tamanho e forma das. células,. achatadas,. podendo. gigantes. então. apresentarem-se. multinucleadas,. esféricas,. isodiamétricas. ou.

(20) 9. alongadas, com baixa ou alta relação nucleoplasmática (RNP). Esses tipos são caracteristicos para a espécie, ou esta pode apresentar. uma. enorme. variação. dependente. do. meio. de. cultura. O fundamental do problema da diferenciação compreender como uma célula que filhas diferentes.. se. divide. produz. células. Supõe-se que um dos fatores fundamentais e muito. na diferenciação é o estabelecimento da polaridade. possível. que. as. é. condições. metabólicas. em. distintas de uma célula recém dividida possam. extremidades ser. diferen-. tes, devido a uma distribuição desigual de organelas, belecendo-se a polaridade.. Há casos entretanto,. polaridade parece preceder. à. em. celular .. divisão. difícil distinguir quando a polaridade é um fator. estaque. a. Ê. mesmo. de. dife. renciação, ou quando é uma manifestação dessa diferenciação. Além da polaridade, o meio. importante. na. diferenciação, podendo em certos casos, ser até um fator. no. estabelecimento desta.. é. Uma célula na planta,. está. cercada. de outras células, e esse ambiente faz com que as células se comportem de maneira. característica,. ciadas quando a diferenciação já foi mesmas células diferenciadas, se. mantendo-se estabelecida.. isoladas. cultura, podem se diferenciar novamente. capacidade de orgânico,. diferenciar. devem. ser. especialmente pela colocação. relação a outras células.. diferen-. e As. colocadas. em. limitações. impostas de. Essas. uma. pelo. à. meio. célula. em.

(21) 10. Para a compreensão da. diferenciação. deve-se levar em conta a existência de interações entre o património genético contido. as. caracteristicas estruturais e bioquimicas da planta como. um. � evidente que, em cada caso. cada. complexas e. todo.. em. celular. célula. especifico,. as. carac-. teristicas estruturais da célula podem refletir ou indicar a existência dessas interações. Em se tratand o de embriogênese. zigótica,. dos mais importantes fatores no inicio da diferenciação é estabelecimento da. polaridade,. um o. especialmente. no. zigoto.. Ela pode ser de certo modo controlada pelo meio. no. qual. zigoto se desenvolve.. No zigoto de Capsella. o. bursa-pastoris. observa-se uma distribuição polarizada no citoplasma, o qual torna-se agregado no polo da chalaza, e um grande vacúolo se forma no polo micropilar . produz duas células,. A. primeira. divisão. uma. grande. Nenhuma célula pode crescer, mudar de. forma,. uma pequena, terminal,. e. transversal. basal.. 2.3. Citomorfogênese. assumir, manter ou alterar o estado de polaridade,. diferen-. ciar-se ou dividir sem um concomitante controle e ajuste seu citoesqueleto.. Todos estes eventos ocorrem. eia durante a vida de uma célula. individual,. de. em. sequên-. em. tecidos.

(22) 11 órgãos. multicelulares e. são. coordenados. de. modo. que. população de células desenvolva-se harmonicamente e. a. produza. uma definida organização global. � um fenómeno geral na morfogênese de plantas que a formação. da. final. estrutura. seja. célula,. formação individual de cada. pela inserção da parede celular em. tendo locais. resultado sido. originada. planos. e. espe-. realmente. completa,. a. que exis-. tência de um controle qlobal que harmoniza e integra o tem. mato dentro da população total de células,. p lanta",. e. separados um do outro no. tempo. sido as. faz. pelas. confirmado. formato. o. for-. mais. Isto não significa que. recentes revisões (GREEN, 1980). fases de divisão celular. mesmo. "A planta. enfatizado pelo famoso provérbio de Bary células. não as células a. da. Isto não significa. cificos nas células pré-existentes. a célula tenha independência. o. da. célula. as. estejam. Eles,. na. GUNNING (1981), observou na célula apical. de. no. e. espaço.. verdade, estão relacionados em vários passos. �zolla pinnata, que a orientação da. expansão. celular. rigorosamente ligada à mitose, tanto que a célula aproximadamente, seu volume. depois. de. cada. expansão que conduziu a divisão na célula suavemente divisões. no e. jovem. merofito,. posteriormente. no. acompanhada. sem. pela. O eixo de. expansão. A. continua futuras. formação. tabiques (compartimentação celular) internos que proporção do volume celular.. recupera,. divisão.. apical,. inicio,. está. reduzem. de a. altera-se.

(23) 12 subtamente e in loco.. As células se. dividem. em. transversal e as sucessivas mitoses no inicio,. plano. um. restauram. o. volume celular para uma padronização no tamanho em cada tipo de célula, mas eventualmente deixam. possibilidades. para. a. expansão sem divisão, embora toda fileira de células alongue na mesma extensão, a. interrelação. entre. alongamento. número de divisões transversais varie com o tipo de Por exemplo, os elementos do xilema encerram. sua. e. o. célula. expansão,. no minimo trinta e duas vezes mais longos que seus vizinhos, as células do periciclo. A maioria dos órqãos de plantas,. exibem. uma. variedade de interrelações entre divisão e expansão celular. Duas possibilidades extremas são a ques) interna sem crescimento, e planta. como. um. cenócito,. sem. compartimentação a. expansão. do. (tabi-. corpo. da. compartimentação. nenhuma. raiz. de. e. planos. de. divisão direcionam o cenário para um subsequente. modelo. de. expansão. no. interna preparatória.. Além dessas observações,. Azolla ilustra como a. regulação. dos. sitias. diferenciação celular e orientam processos. de. a. local em que produzem um órgão.. 2.3.1. Sitios e planos de divisão. SINOTT &. BLOCH. (1941);. VENVERLOO. (1980), registraram que em células vacuolizadas, a. et. alii. formação.

(24) 13 de uma placa especialmente. posicionada. no. mostra. fragmossomos, antes dos núcleos entrarem em prófase, que a célula. antecipa. seus. divisão peln P�tahelerimento citoesqueleto especialmente. futuros. sitias. de. forma. uma. planos. de. particular. de. e. A. organizados.. entre a posição de um fragmossomo e a. os. citoplasma,. coincidência. formação. subsequente. de um fragmoplasto, não é tão prontamente vista quando, como na maioria das células meristemáticas, o componente vacuolar é muito redu7irln. ôTA (1961), centrifugou células de pêlos taminais em divisão e concluiu que um. modelo. especialmente. diferenciado é imprimido (antes da mitose) na torial do córtex citoplasmático, e. que. em. es. região. equa-. telófase,. essa. região é identificada e exerce uma força sobre as margens da placa da célula.. Sabe-se.. atualmente. variedade de células o "modelo. que. em. especialmente. inclui um cinturão de microtúbulos que é. uma. grande. diferenciado". formado. antes. prófase e transitoriamente envolve a célula no córtex plasmático no sitio onde, em telófase tardia. a. da. cito. beirada. da. placa da célul.=\ �e f1inrliri.=\ rnm .=is paredes parenta.is. PICKETT-HEAPS &. NORTHCOTE. esse cinturão de microtúbulos de banda de banda ocorre em raizes, ramos, folhas. e. (1966),. pré-prófase. pêlos. floriferas e em vários órgãos de criptógamas. tem sido observado em cultura de calos.. chamaram. suspensão. em. A. plantas. Esse fato não de. células. ou.

(25) 14 BUSBY & GUNNING (1980), afirmaram que a sença. da. banda de pré-prófase prediz a linha de. fusão. placa celular e paredes parentais quando presentes. um proqn6stico do fenómeno em. que. pre da. Este. a. banda. desaparece. prótase, e usando as palavras de ôTA,. ainda. em. é na. seu. local. GUNNING et alii (1978), observaram que. todas. fica como oue "imprimido".. as divisões formativas e proliferativas são precedidas desenvolvimento de uma banda de pré-profase, seja ela clinal, periclinal transversal,. simétrica. ou. pelo anti-. assimétrica,. sendo que a fidelidade dessa observação é extraordinária. Acredita-se que haja uma combinação entre. as. onde. os. instrusões qenéticas interna. e. sinais. externos,. microtúbulos da banda de pré-pr6fase não possam do que. participar. como. ferramenta. uma. regulação dos sities e planos de. fazer. mais. morfogenética. na. (PICKETT-HEAPS. divisão. &. NORTHCOTE, 1966; PICKETT-HEAPS, 1974). PACKARD & SATACK (1976); GALATIS (1979), GALATIS (1980), descreveram pode se tornar especializado ou deposição de um parede. sob. pré-prófase.. a. conjunto influência. que. talvez,. particular dos. Observaram ainda. o. &. MITRAKOS. sitio. cortical. estabilizado. de. microfibrilas. microtúbulos que. pela. pequenos. da. da. banda. da. espessamentos. da parede ocorrem sobre a b anda. Um argumento. alternativo,. pouca justiça para a economia e eficiência. que com. talvez a. faça. qual. as.

(26) 15. células em geral parecem operar, condição em que. os. túbulos da banda de pré-prófase não tem um papel. especifico. exceto como 1974).. um. reservatório. de. Sob este ponto de vista,. tubulina é. (PICKETT-HEAPS, que. sugerido. um. centro. zador de microtúbulos (HEPLER & PALEVITZ, 1974). orientação dos microtúbulos. eles. tem,. formam onde são feitos, porque o sitio cortical outras propriedades, um papel como o de. micro-. entre organi-. Contudo, a. na banda de pré-prófase. impressão de estar sendo altamente. controlada,. se. deu. a. tornando-se. dificil de aceitar que eles são meros produtos. Os microtúbulos não sintetizam. celulose. nem. influenciam a quantidade de síntese (GRIMM et alii, 1976), o que eles oferecem é um sentido de controle. espacial. toso na formação da parece celular. ajudando determinar a forma que será assumida pela. mages-. desse. modo. expansão. a. celular. (MARCHANT, 1979). Microtúbulos corticais são associados. com. desenvolvimento localizado da parede celular em três de organização.. O primeiro é. dentro. da. elementos do xilema e poros do estômato.. célula, O. niveis como. segundo,. respeito ao nível de desenvolvimento de toda a célula. células alongando, as fileiras transversais de. versais na parede.. em diz Em. microtúbulos. predominantemente se extendem ao longo das paredes dinais, as quais possuem inicialmente. o. longitu-. microfibrilas. trans-. Para o terceiro nível de organização, há. evidências de que a orientação dos microtúbulos é importante.

(27) 16. tanto na iniciação dos órqãos, como. nos. seus. subsequentes. pontos de desenvolvimento qlobal. A produção de um órgão radialmente por um órgão parental, com. polaridade. ápico-basal,. sistema. 1980), tem revelado que alterações. requer. polaridade.. que certas células submetam-se a uma mudança de Uma observação detalhada desse. simétrico. (HARDHAM. morfológicas,. et. al.ii,. são. cedidas por mudanças na orientação dos microtúbulos,. prejunta-. mente com mudanças em sua abundância. cruciais. no. citoesqueleto, ocorram num estágio extremamente inicial,. da. A. indicação. de. sequência morfoqenética global,. que. mudanças. são. fortes.. muito. Elas. ocorrem nas rél11lr1c; rlr1 f'IPrifPrir1 rln futuro meristema, o qual requer. uma. alteração. da. polaridade. em. para. sequência,. produzir a sua simetria radial.. 2.4. Embriogênese. 2.4.1. Aspectos da embriogênese somática. A embriogênese somática é qual as passando. células por. c;nmáTirr1c;. estágios. rlPc;PnvnlvPm. sucessivos,. desenvolvimento de embriões gaméticos.. um. pelo. processo. plantas. inteiras,. caracteristicos A técnica de. do. obten-. ção de plantas por embriogênese somática, foi realizada pela.

(28) 17. primeira vez utilizando-se de plantas de. cenoura,. resultados obtidos foram satisfatórios.. Em. riores, a. pode. totipotencia,. alta. ser. Sendo, que. destacam suas. a. importâncias. diz respeito a fonte de fármacos.. Muitas. cências qrandes ou. as. supe-. comprovada. pelos. que. pere-. onde. se. fibras. apresentam. suportam. e. inflares-. desenvolvimento. Aplicando-se a técnica de cultura. características. diversas partes da. árvores,. combustíveis,. árvores,. sementes. por. plantas. económicas para o homem, no que. dessas. extremamente úteis,. são. alimento,. estável por vários meses. in vitro,. delas. maioria. os. plantas. trabalhos recentemente realizados com várias nes.. onde. acima. facilitar. planta,. embriões imaturos, que são. descritas, a. manipulação. como:. assim. tornam-se. nucelo,. freqüentemente. com óvulo. difíceis. de. as e. se. trabalhar. O prolonqado ciclo árvores. com. totipotencia. atraso na maturidade. sexual.. de. vida. Em. das plantas obtidas via embriogênese Em árvores. espécies e. somática, de. principais sofrer. pode. confirmada,. partir de estruturas florais, o desempenho. anos para ser avaliado.. das. cultivadas a. a. fidelidade pode. floresta,. levar. onde. os. períodos de rotação são tipicamente bem superiores à fase de maturidade sexual, podem levar décadas para se determinar. a. eficiência da embriogênese somática, como um método. a. propagação de plantas.. para.

(29) 18 Considera-se. entre. diferença. a. embriogê-. adotado. nese zigótica e somática, o termo "embrióides". forma. RAGHAVAN, 1986, que coloca a embriogênese somática de distinta dos. embriões. produzidos. por. portanto o termo embrião somático será embriões. produzidos. partir. a. de. fusão. de. usado. cultura. gametas;. para de. por. definir. células. e. tecidos. O padrão embriogênico depende do estádio siológico do explante, que iniciará a obtenção de sendo. que. as. caracteristicas. do. explante,. para o controle. da. embriões,. concluir. Além desse fator, faz-se. morfogênese. in. vitro,. um. definirá. protocolo de cultura que será requerido para se embrioqênese somática.. fi. a. a. importante manipulação. fisica, do hormônio e do ambiente do material vegetal. Esse. sistema. ticamente: seleção seguidas de podas. de. de controle. (resultados. explante. seriadas,. envolvem. tamanho,. de. idade. e. respecenxertia,. fenótipo);. esterilização; meios de cultura (macro e microelementos quiacidez. da. solução); a utilização de hormônios pré e pós-inoculação. da. planta e finalmente o controle ambiental, com o objetivo. de. micos, carboidratos,. bem. dar às plantas in vitro,. como. o. condições. controle. da. adequadas. para. o. seu. desenvolvimento, são fatores praticamente já definidos, para cada espécie veqetal. O mBinr �rnhlPma a ser destacado,. princip�,1-. mente em se tratando de espécies florestais, é exatamente. a.

(30) 19 fonte que fornecerá os clones, então designados. explan. de. tes. O material vegetal utilizado como explante. é. restrito à tecidos que possam ser confiáveis na expressão de um genótipo conhecido.. Infelizmente, até a presente data, a. embrioqênese em espécies florestais. oode somente ser obtida a partir de material embriónico. SHARP et alii (1980, estádio de desenvolvimento do. 1982),. explante. afirmam critico. é. sucesso da embriogênese somática e sugerem, que in vitro não só permite coma também induz o. o. que. o. para. o. ambiente. desenvolvimento. dos embriões somáticos ou tecidos embrionários. Diversos autores vêem trabalhando em de coníferas, na tentativa de. induzir. brioqênese somática, dentre as. quais. 1976; BORNMAN & JANSSON, 1980; AITKEN. cultura. organogênese. e. (CAMPBELL. &. et. 1981;. alii,. em-. DURZAN, von. ARNOLD & ERIKSSON, 1981) com explantes juvenis (BONGA, 1974; SIMOLA & HONKANEM. 1983; NAGNAMI & BONGA, 1985),. utilizando. estruturas gametofiticas e finalmente (von ARNOLD SON, 1979; PATEL. &. &. ERIKS. THORPE, 1984; HAKMAN et alii, 1985; GUPTA. & DURZAN, 1986; HAKMAN &. FOWKE,. 1987a;. NAGNAMI. et. alii,. DUNSTAN. et. alii,. 1987), com explantes embriônicos. ABDULLAH et alii, 1987. e. 1987, observaram a ocorrência de organogênese em cultura explantes provenientes de árvores. maduras,. porém. com. de ex-.

(31) 20. plantes maduros não houve o desenvolvimento de. embriogênese. somática. Parece que as razões, que permitem alterar competência. do. desenvolvimento. de. de. tecidos. a. plantas. maduras, ainda permanecem obscuras. HICKS (1980), define determinação como. torna-se. potencial,. o processo pelo qual o desenvolvimento. sendo. restrito a uma rota especifica de diferenciação, porém, para que haja determinação, há necessidade que ocorra. competição se. que. Esta última acontece a partir do momento,. celular .. após. inicia uma seqüência de desenvolvimento que ocorrem. o. explante ser exposto à condições de indução. Segundo AMMIRAT0 (1985), a indução atua sando uma mudança na. competência. de. determinadas. (indução direta), ou então, desencadeia respostas. cau-. células de. dife. renciação celular (indução permissiva).. 2.4.2. Embriogênese somática direta. Neste caso,. a. clonagem. de. células embrio-. gênicas pré-determinadas, representa um método brioqênese direta pode ser. convertida. produzirá. pró-embriões. continuamente. Estes pró-embriões,. em. um em. a. em-. sistema. que. onde larga. escala.. por sua vez, podem se desenvolver faci-. litando o caminho para a exploração de um sistema de células.

(32) 21 pró-embrioqênicas determinadas (PEDC),. pro-. na. resultando. liferação de plantas inteiras. O sistema de clonagem por PEDC zado por uma fase denominada fase de calo, através. da. aglomeração. de. células. é. caracteri-. sendo. que. este. desorganizadas. que. consistem na proliferação em massas, de pró-embriões. Características. fenotipicas. do. calo. descritas por MITRA & CHATUVERDI (1972), em Citrus. foram. auranti. folia; LITZ & CONOVER (1982), com Carica papaya. A embriogênese somática em. exceto. conifera,. em Larix decidua, tem sido quase que exclusivamente restrita a explantes embrioqênicos. Tecidos embrioqênicos de Picea abies mostramse formados por. embriões. somáticos,. apresentando. células. tubulares, longas e desorganizadas (centros de. crescimento). que são embriões somáticos,. processo. passando. por. um. de. reiniciação de embriooênese (BACWAR et alii. 1987). GI IPTA. OI IR?AN (. &. 198A) ,. observaram que a seme-. 1 hança existente entre o tecido obtido in vitro durante. a. clivagem. poliembriónica. acentuada, que esse processo. tem. de. sido. e. in. coníferas, chamado. vivo. é. tão. "poli-. de. embriooênese somática". Em Pinus spp, as. evidências. indicam. que. a. embrioqênese é iniriArlA nn �Prirln rln suspensor, o que difere de Picea abies, cuja resposta se dá a partir do tecido dérmico.. O tecido do suspensor é mais viável,. em. epi-. estádios.

(33) 22 jovens dos pró-embriões em Pinus, a partir de embriões cotiledonares.. Para Pinus lambertiana. pré-. tem-se cultivado com. sucesso, tecido do suspensor de sementes maduras, para a. ob. tenção de tecido embriogênico (GUPTA & DURZAN, 1986). HAKMAN et alii, HAKMAN & FOWKE, 1987a;. DURZAN,. 1985; GUPTA &. NAGMANI et. alii,. 1987. 1986;. trabalhando. com cultura de embriões imaturos de coníferas, observaram desenvolvimento de células. embrionárias. rizadas, semelhantes às que ocorrem. pequenas. no. e. o. pola. desenvolvimento. de. embrião z ioótico. n11'trnc; .:u1'tnrPs como SALMIA,. 1975;. FOWKE, 1987b, observaram respectivamente em com coniferas,. o. desenvolvimento. de. HAKMAN. suas. células. &. pesquisas gigantes. e. estruturas multicelulares, apresentando aparente polaridade. HAKMAN et alii, 1985; afirmam que a formação de calos com friável, a partir de expiantes. NAGMANI & BDNGA, cor. de. branca. árvores. e. 1985. textura. maduras. carac. terizam a presença de células embriogênicas. O. desenvolvimento. de. células. pequenas e polarizadas, semelhantes as que senvolvimento de embriões zigóticos,. embrionárias. ocorrem. foram. no. de-. observadas. por. HAKMAN & FOWKE, 1987a; GUPTA & DURZAN, 1986. MacDOUGALL et alii (1988), observaram turas polares e multicelulares, nos calos obtidos de cultura de tecidos de expiantes Pinus contorta var.. latifolia.. Os. de. plantas. autores. a. estru partir. maduras. registraram. de o.

(34) 23. insucesso na reqeneração dessas plantas. e salientam. significado das células basais gigantes ainda é. que. o. desconheci. do. Células varunljzadas. e. formadas. lonqas,. partir de calos foram observadas em cultura de. a. embriogênese. somática reoistradas por HAKMAN & FOWKE (1987b). OWENS et. alii. (1982),. encontraram. distais pequenas formadas a partir de calos torta, bastante semelhantes às primeiras. de. células. Pinus. células. con. embrioná. rias de embriões zioóticos.. 2.4.3. Embriogênese somática indireta. Na maioria dos casos de células embriogênicas induzidas e determinadas (IEDC), o estimulo mais é forneico pela auxina no meio de cultura. pécies pode-se observar. que. a. muitas. es-. somática. via. Em. embriogênese. apropriado. calos, ou cultura de suspensão celular, requerem a aplicação de auxina, exceto em Coffea arabica, onde há necessidade. de. um estimulo utilizando-se citocinina (YASUDA et alii, 1985). A auxina, predominantemente usada. para. resultados (IEDC), tem sido o 2,4-D. a. (ácido. obtenção. destes. 2,4-Diclorofe-. noxiacético. Para algumas espécies, utiliza-se ANA naftalenoacético), AIB (ácido indol-butirico) e. AIA. (ácido (ácido. indolilacético), com o propósito de estimular as células dos.

(35) 24 calos cultivados. in. vitro. à. embriogenéti-. diferenciação. ca. observaram. WANN et alii (1987). espécies requerem a presença de auxina no inicial, ou seia. o mPin em que. o. que. meio. explante. de. foi. muitas cultura. inoculado. para induzir a dediferenciação (calo). Uma vez que. o calo embriogênico seja iniciaa. do, a maioria dos sistemas IEPC e PECO, utiliza para a manutenção e/ou expressão. do. auxina. embriogené-. potencial. tico. Sistemas envolvendo IEDCs são conhecidos pela presença de uma fase de calo, em muitas espécies sas,. onde. os. calos embriogênicos apresentam-se diferentes. dos calos não embriogênicos, sendo que as os. dois. tipos. de. calos. torna-se. macroscópico em rPlrlçãn ri rnr,. A. diferenças. perceptivel. textura. e. Estas diferenças entre os calos, podem ser identificar. lenho-. de. tecidos. embriológicos,. a. entre nivel. a. morfologia.. utilizadas. amais. que. sendo. para. destacável é a morfologia, onde os calos embriogênicos podem ser reconhecidos, por estarem. frequentemente. cobertos. por. de. uma. ser. uma. embriões somáticos. WFRR Pt �7ii (198�) observaram maneira geral, os. calos. embriogênicos. que,. tendem. a. matriz parenquimatosa friável contendo nódulos ou centros de crescimento,. com. coloração. creme. e. caracterizados. presença de uma espessa parede da célula mãe.. pela.

(36) 25. Para NABORS et alii (1983), o fenótipo carac teristico de embriogênese não lenhosas, mas. também. está. está. confinado. presente. em. às. e spécies. cereais,. onde. a. embrioqênese bem sucedida, tem sido dependente da habilidade de reconhecer e segregar um calo embriogênico. fora. de. uma. cultura mista composta de ambos os calos embriogênicos e não embrioqênicos.. 2.5. Organogêses. Segundo HICKS (1980), a organogênese in vitro envolve uma variedade de seqüências complexas. de. de. vimento que resultam da manipulação experimental de uma planta.. Essas. seqüências,. que. podem. diferentes tipos de explant�s, terminam com. a. desenvolpartes. ocorrer. em. formação. de. órgãos diferenciados ou plantas inteiras.. Não se conhece ao. certo, a natureza. da. dos. eventos. iniciais. organogênese,. porém sabe-se que as alterações subcelulares em linhagens de células são direcionadas para a formação. primórdios. de. de. óroãas m I mPr i e; h==>mói fipc;.. Na maioria dos casos, os expiantes são zes de promover a formação florais, quando cultivados. de. ramos, raízes,. em. um. meio. ou. que. capa-. estruturas. forneça. sais. minerais, vitaminas, e uma fonte de carbono, mas que estejam destjt1tirlnc; rlP hnrmôninc; rl.=1. f'llanta.. Estes. processos. podem.

(37) 26. ser denominados de "organogênese adventicia" (CHRISTIANSON & WARNICK, 1983). Outro tipo de organogênese é a "não adventi cia" envolvendo a dediferenciação do explante e a indução de novos órqãos a partir. da. formação. de. calos. na. base. do. explante. THORPE. &. MURASHIGE. (1970);. THORPE. (1978;. 1980); BONNETT & TORREY (1966) consideram que órgãos. adven. tícios surgem de pequenos grupos de células. com. citoplasma. denso, denominados meristemóides. Recentemente, complexas, denominados. agregados. de. pró-meristemóides,. descritos. foram. durante os primeiros estágios de formação. menos. células. de. ramos. ticios em expiantes de cotilédones de Pinus radiata. adven(VILLA-. LOBOS et alii, 1985). Sequndo FLICK et alii, 1983, tante para a regeneração de. espécies. o. arbóreas. permas. é freqüentemente, a fonte de explantes. estâdio fisiolóqico da. matriz,. pode. fator de. que a transição da planta para a cultura. Gimnos-. A idade e o. contribuir. sucesso da organogêse em cultura celular.. limi-. para. o. Observam, também, é. seriamente. tressante, e plantas velhas ou senescentes podem não. es. sobre. viver a esta transição. WODZICKI, 1978; HARVEY & GRASHAM, 1969,. con-. sideraram que as variações de estação do ano, podem afetar a formação de calos à partir dos explantes,. pois. trações endógenas das auxinas podem variar muito.. as. concenEm. C oni-.

(38) 27. feras, por exemplo, a primavera e o verão, são ótimas estações para se iniciar a gemas laterais, indução do. sendo. cultura. ocorre devido a fatores como: dormência. considerados. do. florescimento,. que ou. câmbio. que. etc,. isto das podem. alterar respostas e/ou o sucesso da iniciação das culturas. KAO et alii, 1970, observaram uma variação no número de cromossomos das. plantas. em. longos. periodos. em. A orqanoqênese pode ser induzida a partir. de. cultura de suspensão celular.. suspensão celular ou cultura de calos, e a concentração reguladores de crescimento no. meio. para o controle do crescimento e da. de. cultura. é. morfogênese. dos. critica. (FLICK. et. alii, 1983). Esses autores. afirmam. geral, altas concentrações d e. auxinas. que. de. com. uma. maneira. baixas. concen-. trações de citocininas no meio. de. cultura. abundante proliferação celular. com a formação de calos.. freqüente que a aplicação de 2.4-D. sem outros iniciem a formação de calos. centração de citocinina. no. Por meio. outro de. indução de organogênese caulogenética.. uma. promovem. É. reguladores,. lado,. cultura, No caso. gênese rizoqenética, os autores consideram o uso. baixa. con. resulta de. na. organo-. de. auxina. sozinha ou com citocinina em baixa concentração. O tipo e a concentração relativa dos dores de crescimento são aspectos criticas para. o. regula controle. da morfoqênese como foi indicado por SKOOG & MILLER (1957)..

(39) 28. 3. MATERIAL E METODOS 3.1. Local de realização do trabalho. Os testes experimentais foram conduzidos Laboratórios de Cultura de Tecidos Veqetais dos tos de Ciências Florestais e de Botânica de Agricultura "Luiz. de. Queiróz". nos. Departamen. da Escola Superior. Universidade. de. São. Paulo, Campus de Piracicaba - SP.. 3.2. Determinação da �onte de explante. O material vegetal utilizado foram pinheiros, Pinus caribaea Morelet var.. hondurensis. gemas Barr/. de &. Golf., cedidos pela Duratex Florestal, localizada na Fazenda Monte Alegre em Agudos - SP.. 3.2.1. Enxertia seriada e poda sucessiva. As qemas utilizadas como fonte. de. explante,. foram resultantes de duas enxertias seriadas, realizadas. no.

(40) 29 viveiro.. No enxerto foram feitas três podas sucessivas e as. gemas foram coletadas e transportadas para o laboratório. 3.2.2. Caracteristicas do explante. As gemas. seccionadas. Pinus,. de. tinham. em. média cinco centimetros de comprimento e aciculas em estádio de desenvolvimento juvenil ou aciculas primárias. Considerou-se para esta seleção, além do a. manha da gema,. sua. apresentavam-se com. coloração,. coloração. sendo. verde. que. muito. aquelas clara. taque foram. desprezadas.. 3.3. Protocolo de esterilização. O protocolo de esterilização aplicado. obede-. ceu a seguinte ordem: a. Lavagem das gemas em água corrente; b. Secção das bases das gemas; c. Mergulho imediato dos explantes, em ção. esterilizante,. composta. por. bicloreto. de. solu-. mercúrio. (HgCl2) a 0,6'l., durante 15 minutos; d. Enxaguadura dos expiantes em água destila da estéril (por. 4. vezes sucessivas);. e. Lavagem das gemas em. suspensão. de. hipo-.

(41) 30 clarito de sódio comercial (Q-BOA) a 30%, durante. 15. minu. tos; f. Enxaguadura dos explantes em água destila da estéril (por 4 vezes sucessivas). os. Após esta última etapa,. foram. explantes. deixados em frascos contendo água apenas na base, durante 16 horas e então as etapas de b a f foram repetidas, sendo. que. depois deste procedimento, deu-se inicio. dos. a. inoculação. explantes em meios de cultura previamente estabelecidos. e importante salientar que. processos. de. realizados. em. esterilizada com álcool e fluxo. de. esterilização, a partir da câmara de fluxo laminar. etapa. os. foram. ar constante.. 3.4. Inoculação dos explantes. Os explantes foram inoculados em tubos de en saio (2,5 x 25,0 cm), com tampas de metal, contendo 15 ml de meio de cultura.. Foram usados, também, frascos de vidro, de. 5 cm de diâmetro, com tampa de papel alumínio. e. 20. ml. de. tipos. de. para. os. dois. recipiente, obedecendo-se rigorosamente. as. regras. meio de cultura sólido e. liquido. nuseio com o material, evitando ao máximo riscos que sem contribuir para um alto índice de contaminação crorganismos.. de. ma-. pudespor. mi-.

(42) 31 3.5. Estabelecimento da cultura. Os meios de cultura utilizados foram os de MURASHIGE& SKOOG, 1962 e EUWENS, 1976. Algumas alterações quali-quantitativas feitas em ambos os meios de cultura, tanto para. as. foram concen. trações salinas como vitaminicas e hormonais. O complexo vitaminice de MOREL & WETMORE, 1951 foi adicionado aos meios de cultura básicos. Após a inoculação dos explantes in vitro, estes foram mantidos em sala de crescimento,. com. temperatura. de 25 ± 1 ° C e as lâmpadas utilizadas para a iluminação foram GROW LUX, fluorescente luz do dia e incandescentes com fluxo luminoso de aproximadamente 1.000 lux. O fotoperioda foi programado. para. 16. horas. luz e 8 horas escuro.. 3.6. Fases experimentais. 3.6.1. Experimento n º 1. 1a. Etapa: Os explantes foram. inoculados. no. meio de cultura n ° 1 (Tabela 1) e após 40 dias, foram trans feridos para o meio de cultura n ° 3 (Tabela 3)..

(43) 32 2a. Etapa: Os materiais transferidos meio de cultura n ° 3 (Tabela 3), após 30 dias. para. foram. o. trans-. feridos para o meio de cultura n ° 4 (Tabela 4). 3a. Etapa: Os explantes transferidos. para. o. meio de cultura n ° 4 (Tabela 4), permaneceram neste meio por 20 dias e então, foram transferidos para o meio. de. cultura. n º 1 (Tabela 1). 4:a. Etapa: Depois de 20 dias meio n ° 1 (Tabela 1), foi feita. a. de. repicagem. cultura. do. em. material,. mantendo-os no mesmo meio de cultura, repetidas vezes.. 5a. Etapa: Análise microscópica dos. resulta-. dos obtidos no experimento n ° 1.. 3.6.2. Experimento n º 2. la. Etapa: Os explantes foram. inoculados. meio de cultura n ° 2 (Tabela 2), por um periodo de 40. no. dias.. Depois deste tempo foram transferidos para o meio de cultura n ° 3 (Tabela 3).. 2a. Etapa: Trinta dias após. dos explantes para o meio de cultura. n°. a 3. transferência (Tabela. material foi analisado microscopicamente e então dos em 2 experimentos: 2A e 2B.. 3),. o. subdividi.

(44) 33. 3a. Etapa: foram. Experimento 2A: Os calos. para o meio de cultura liquido n ° 6 (Tabela. transferidos e. mantidos. do. explante. 6). sob agitação lenta, por um periodo de 20 dias.. Experimento 2B:A parte superior foi transferida e mantida no meio de cultura. nº. (Tabela. 3. 3). Ap6s 30 dias as gemas axilares foram isoladas. trans-. e. feridas para o mesmo meio de cultura, permanecendo por. mais. 45 dias.. 4a. Etapa: Experimento 2B: Os calos obtidos foram. repi. cado se transferidos para o meio de cultura n ° 2 (Tabela 2), onde permaneceram durante 50 dias, sendo. que. foram. trans-. feridos para o mesmo meio em periodos sucessivos de 10, 20 e 20 dias, com o objetivo de renovar as condições de. Foram realizadas nesta etapa, análise. cultura.. histomorfológica. dos. calos.. 5a. Etapa: Experimento 2B:As gemas adventicias formadas, foram individualizadas e transferidas para o. meio. tura n ° 5 (Tabela 5), por um periodo de 20 dias.. de. cul.

(45) 34. 3.7. Avaliaç5es. 3.7.1. Citológicas. Os calos obtidos in. vitro. foram. transferi. dos à uma placa de Petri contendo água destilada e então. as. células foram dissociadas. Com o auxilio de uma pipeta,. uma. quantidade da suspensão de células foi. uma. lâmina. de. vidro,. analisada. colocada. sobre. microscopicamente. com. e. o. auxilio de câmara clara foram confeccionadas as Figuras 11 e 12.. 3.7.2. Anátomo-histológica. Durante o período de cultura,. em. intervalos. regulares, de acordo com o final do período de cada cultura, amostras foram coletadas e fixadas em acético - álcool (FAA 50) (SASS, 1951),. ácido. formaldeido para. estudos. aná-. tomo-histológicos. O material foi desidradato em série terciária Após. de álcool butilico e então, embebido em parafina.. a. emblocagem, o material foi cortado em micrótomo de parafina, obtendo-se cortes com 10 a 12 nina e verde rápido (SASS, histológicas.. micras,. 1951),. e. A seguir o material foi. corados montados. com. terizado em microscópio óptico, fotografados e. lâminas. em. observado. safra-. e. com. caracauxilio.

(46) 35. de câmara clara (Figura 12).. foram. feitas. representações. esquemáticas.

(47) 36. Tabela 1. Composição do meio de. cu ltura. n°. 1.. mineral de MS (MURASHIGE & SKOOG, 1962).. Componentes Macronutr ientes. C oncentração (mM). NH:. 20,0. +. 20,0. N□ i K. Cl Ca. Na. Mg. 2+ + 2+. s□!Micronutrientes 2Fe. B0 2 Mn. 2+. Zn I. 2+. +. Cu. 2+. Co. Mo. Mesoinositol Tiamina. Sacarose Agar. pH. Formulação. 39,4. 6,0. 3,0. 0,2. 1,5. 1,5. (µM). 100,0. 100,0. 100,0. 30,0. 5,0. O,1. 0,1. 1,0. 100,0 mg/1. 0,4 mg/1. 30,0. g/1. 7,0 g/1. 5 ,8.

(48) 37. Tabela 2. Composição do meio de cultura n ° 2. Formulação mi neral 50% de MS (MURASHIGE & SKOOG, 1962).. Componentes Macronutrientes. C oncentração (mM). NHz. 10,00. +. 10,00. NOi K. Cl. 19,70. Ca. 2+. Mg. 2+. Na. +. so!. +. Micronutrientes Fe. Z+. Mn. Z+. B03. Zn. 2+. Cu. 2+. I. Co. 2+. Mo. Mesoinositol Tiamina. Sacarose Agar pH. 3,00. 1,50. o, 10. 0,75 0,75. (µM). 50,00 50,00. 50,00 15,00. 2,50. 0,05 0,05. 0,50. 100,00 mg/1 0,40 mg/1. 30,00 g/1 7,00 g/1 5,80.

(49) 38. Tabela 3. Composição do meio de. cultura. 3.. n°. mineral de MS (MURASHIGE & SK00G, 1962).. Formulação A. con-. centração de macro e micronutrientes igual ao meio. de cultura n ° 1. O meio foi. suplementado. com. vitaminas de Morei & Wetmore (1951).. Concentração. Componentes Ácido Naftaleno Acético. (ANA). Ácido Benzil Adenina (BA) Sacarose. Agar pH. 2,4 mg/1 0,8 mg/1. 40,0 g/1. 7,0 g/1. 5,8. Vitaminas de MOREL e WETMORE (1951). Mioinositol. Ácido nicotinice Piridoxina. Tiamina HCl Biatina. Ácido fól ico. Pantotenato de c�lcio. ( mg. 1. -1. 100,000. 1,000. 1,000 1,000. 0,010. 10,000. 1,000. ). as.

(50) 39. Tabela 4. Composição do meio de cultura n ° 1 formulação neral de MS (MURASHIGE & SKOOG, 1962).. A. mi. concen. tração de macro e micronutrientes igual ao do meio. de cultura n ° 1 e suplementado com as vitaminas de. Morel e Wetmore (1951).. Componentes Ãcido 2,4-Diclorofenoxiacético (2,4-D). Sacarose. Agar pH. Vitamina de MOREL & WETMORE (1951). Mioinositol. Ãcido nicotinice. Piridoxina. Tiamina HCl Biatina. Acido fólico. Pantotenato de cálcio. Concentração. 1, O mg/l. 40,0 mg/1. 7,0 g/1. 5,8. (mg. l. -1. ). 100,000. 1,000. 1,000. 1,000. 0,010. 10,000. 1,000.

(51) 40. Tabela 5. Composição do meio de cultura n ° 5. Formulação mi neral de EEUWENS, 1976.. Componentes Macronutrientes KN03. NH.c.NOs NH4Cl KCl. CaCl2.2H20. MgSo.c..7HzO KHzP04. NaH2P04.2H20. Concentração (mg.l. -1. 2.020,000 535,000. 1.491,000 294,000. 247,000. 312,000. Micronutrientes Na EDTA FeS0.c. HsB03. MnS04.4H20 Fe EDTA KI. Na2Mo04.2H20. 11,200. 32,500. 8,300. 0,240. CuSo4.5Hz0. 0,016. C0Cl2.6H20. 0,240. ZnS04.4H20. NiCl2.6H20. Mesoinositol. Tiamina. Sacarose. Agar pH. 7,200. 0,024. 100,0 mg/1 0,4 mg/1. 30,0 g/1. 7,0 g/1 5,8. ).

(52) 41. Tabela 6. Composição do meio de cultura líquido n °. 6.. For. m ulação mineral d o meio de cultura de MURASHIGE SKOOG (1962) e suplementado com. Morel e Wetmore (1951).. Componentes Ãcido Naftaleno Acético (ANA) Ãcido Benzil Adenina (BA). Sacarose pH. Vitaminas de MOREL & WETMORE (1951). Mesoinositol. Ãcido nicotínico Piridoxina. Tiamina HCl. Biatina. Ãcido fól ico. Pantotenato de cálcio. as. vitaminas. Concentração 2,4 mg/1. 0,8 mg/1. 40,0 g/1 5,8. ( mg.. 1. -1. 100,000. 1,000 1,000. 1,000. 0,010. 10,000. 1,000. ). &. de.

(53) 42. 4. RESULTADOS E DISCUSSÃO 4.1. Experimento n º 1. 1a Etapa: O material inoculado permaneceu te inalterado durante os 40 dias de cultura no. aparentemen meio. n°. 1.. Pode-se atribuir este resultado à alta concentração de macro e microelementos que compõem o meio de cultura de & SKOOG (1962), impedindo ou retardando. MURASHIGE. quaisquer. manifes. tações morfológicas visiveis do explante, como o alongamento do ramo, o desenvolvimento das gemas axilares e/ou. o. cres. cimento de calo.. 2a. Etapa: Trinta dias após o. cultivo. do. expiante com. meio n ° 3, observou-se a formação de calo basal, ração branca e aspecto não friável. sença e/ou a concentração do complexo. Notou-se. que. vitaminice,. em. colo-. a. pre-. do. car. boidrato e de reguladores de crescimento no meio de cultura, tornaram a base do explante capaz de produzir calo,. porém,.

(54) 43. morfogeneticamente não competente. para. diferen-. a. ciação. Ainda, observou-se que a parte superior. do. explan. te ficou totalmente necrosada, restando apenas o calo basal. A principio, estes. resultados. parecem. firmar as afirmações de SKOOG & MILLER, 1957, onde. o. critico no controle do crescimento e morfogênese, é centração dos reguladores de crescimento. se observar neste experimento,. os. eram. fator a. con-. Porém, como pode-. reguladores. menta foram essenciais para a indução do calo. calos que se formaram. con-. morfogeneticamente. de. cresci-. Contudo, não. os. compe-. tentes.. 3a. Etapa:. Durante o periodo de. vinte. dias,. transferidos para o meio de cultura n º 4, progressiva oxidação,. caminhando. da. os. calos. apresentaram. base. para. o. uma. ápice,. atingindo o calo todo no final deste periodo. Este resultad o indica que. a. adição. e/ou. a. concentração de 2,4-D, bem como suas interações no. meio. cultura, apresentavam um efeito. difundiu. seletivo. que. se. de. pelas células do calo. De acordo com as afirmações de FLICK et alii, 1983, o 2,4-D é uma. auxina. freqüentemente. utilizada. para. induzir a formação de calo n o explante. Como pode ser confirmado neste experimento, o 2,4-D teve uma participação fundamental na. proliferação. do.

(55) 44 calo. Porém a presença dessa auxina num periodo tornou-se prejudicial às células, permitindo a. prolongado, oxidação. do. calo.. 4a. Etapa:. Os calos totalmente oxidados que foram trans feridos para o meio de cultura n ° 1, mostraram a formação de pequenos agregados de células brancas na superfície após dias de cultura.. isola-. Estes agregados de células, quando. dos e transferidos para o mesmo. meio. produziram calos amarelo-claros. e. de. 20. cultura. morfologica-. compactos,. mente semelhantes aos calos obtidos na etapa. 1) ,. n°. (Figura. 2. 1) •. Esses resultados concordam. com. as. observa-. ções feitas na 3a. etapa do experimento, mostrando uma. ten-. ciência na ação do 2,4-D, de apresentar efeito seletivo sobre o calo, onde proporcionou a divisão das células, mantendo capacidade de crescimento. dos. para o meio de cultura n ° 1, !adores de crescimento.. calos,. quando. totalmente. transferidas. isentos. Neste meio de cultura,. a. regu-. de as. células. não se tornaram competentes para a diferenciação celular.. 5a.. Et.apa:. obti-. Na análise microscópica dos resultados dos no experimento n ° 1, observou-se a presença alongadas, com relação nucleoplasmática (RNP). de. células. baixa,. indi-.

(56) 45. cando serem células parenquimatosas não meristemáticas e não embriónicas (Figura 11). As células apresentavam-se. uni-. frouxamente. das, sem a formação de centros meristemáticos, e sem. estru. turas que pudessem se assemelhar a tecidos. A RNP baixa indica um maior volume mático que o volume nuclear. o. citoplasma. encontra-se. citoplas-. Portanto, pode-se concluir que vacuolizado. que caracteriza a especialização. e. celular,. pouco com. denso, redução. o na. totipotência das células meristemáticas ou embriónicas, onde o citoplasma encontra-se mais denso, menos vacuolizado volume nuclear mais acentuado, devido. à. intensa. e. o. atividade. mitótica. CHALUPA et alii, 1976,. obtiveram. semelhantes quando trabalharam com hipocótilos de Pinus banksiana.. Atribuíram. estas. células do calo, à presença e/ou. a. naftaleno acético (ANA) no meio. de. resultados e. radículas. caracteristicas. concentração cultura.. do Os. das. ácido autores. afirmam que a auxina aumentou consideravelmente o volume. de. água das células, tornando-as grandes e portanto, com volume citoplasmático acentuadamente maior que o volume nuclear.. 4.2.. Experimento n ° 2. 1a. Etapa. Os expiantes inoculados no. meio. de. cultura.

(57) 46. n ° 2 apresentaram a formação de calos basais,. de. coloração. amarelo-claro e bastante friáveis, no final de 40 dias. HAKMAN et alii, 1985, afirmam coloração clara e aspecto. friável,. que. formados. à. calos. de. partir. de. explantes de árvores maduras, caracterizam o desenvolvimento de embriões somáticos. Acredita-se que a concentração. de. sais. mi. nerais, mesmo na ausência de reguladores de crescimento, foi capaz de induzir a formação de calos na base dos A redução da. concentração,. além. de. diminuir. seletividade observada no experimento n ° 1,. explantes. a. não. possivel a. alterou. capacidade de produção endógena de hormônios pelo explante.. 2a. Etapa:. A análise microscópica dos calos meio de cultura n ° 3, foi feita após tura.. trinta. Observou-se a presença de células. obtidos. dias. de. alongadas com. no culRNP. baixa, tipicas de calo, células isodiamétricas com RNP alta, indiferenciadas (embriônicas) e ainda,. agregados. celulares. em forma globular, semelhantes à fase inicial. de. desenvol. vimento de um embrião zig6tico (Figura 12).. Os. agregados. celulares formaram estruturas compactas. com. protuberâncias. semelhantes ao suspensor. THOMSON (1945) observou que há uma. tendência. entre as coniferas de apresentarem divisões celulares embriônicas.. Esta observação associada à de DURZAN. poli&. CHA-.

(58) 47 banksiana. quando. cultivadas em meio de cultura embriogênico, adquirem. formas. LUPA (1976), de que as células. ovais,. com. celular.. polaridade. As células. Pinus. de. nitidamente. filhas. prececendo. permanecem. em. a. divisão. agregados. formam o suspensor e o proembrião, confirmando. a. que. seqüência. de células obtidas neste experimento (Figura 12). Devido a formação de calo basal, e menta das gemas axilares da parte superior. do. intumeci-. explante,. o. experimento foi dividido em 2 partes: experimento 2A e 2B. O experimento 2A objetivou avaliar a dade dos calos para a indireta.. indução. embriogênese. de. O experimento 2B, avaliou a capacidade. capacisomática parte. da. superior do explante para a organogêse caulogenética.. 3a. Etapa: Experimento 2A Os. calos. cultivados. liquido(n º 6), sob agitação. Após. 20. em. meio. dias. de. de. cultura. cultura. mostraram escuros e mortos, sem nenhuma indicação. de. se. cres. cimento ou de diferenciação, após análise microscópica. Transferências em curto prazo, poderiam impedir a morte das células embri6nicas.. Isto seria. para evitar estresse nutricional, como também, dições do meio de cultura mais adequados.. necessário manter. con-.

(59) 48. Experiment.o 2B A parte superior do explante, isolada do calo basal, foi mantida no meio de cultura n °. 3,. por. quando observou-se um aumento. no. intumescimento. gradativo. 30. dias,. das gemas axilares. Estas gemas axilares foram isoladas e neceram no meio de cultura n ° 3 por mais 15 mostraram a formação de calo basal,. perma. dias.. friável,. Então,. de. coloração. amarelo citrino e de rápido crescimento (Figura 2). As aciculas. das. gemas. necrosaram. axilares. totalmente no final de 45 dias e o expiante. totalmente. foi. recoberto. O rápido crescimento do calo basal, devido à alta taxa de divisão celular, causou. no. explante,. fisiológico, resultando oxidação fenólica. um. estresse das. total. gemas. axilares. O estresse do expiante pode ser. atribuido. não diferenciação de vasos condutores pelas células do não ocorrendo a condução. de. nutrientes. para. o. à. calo. explante,. ocasionando desta forma, sua morte por oxidação.. 4-a. Et.apa: Experiment.o 2B Após os dez primeiros dias, os calos transfe ridos para o meio de cultura n ° 2, apresentaram pontos refilados sob toda superficie.. elo-. Nesta fase, observou-se. acentuada redução na taxa de crescimento do. calo.. O. uma que.