UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA
CYNTHIA HAYNARA FERREIRA DA SILVA
POLISSACARÍDEOS SULFATADOS DA ALGA MARROM Dictyota
mertensii: AVALIAÇÃO DO EFEITO ANTIOXIDANTE
SINÉRGICO EM ASSOCIAÇÃO COM O ÁCIDO ASCÓRBICO E
PURIFICAÇÃO DE UMA FRAÇÃO
NATAL
2019
CYNTHIA HAYNARA FERREIRA DA SILVA
POLISSACARÍDEOS SULFATADOS DA ALGA MARROM Dictyota
mertensii: AVALIAÇÃO DO EFEITO ANTIOXIDANTE
SINÉRGICO EM ASSOCIAÇÃO COM O ÁCIDO ASCÓRBICO E
PURIFICAÇÃO DE UMA FRAÇÃO
Dissertação apresentada ao Departamento de Bioquímica da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Bioquímica.
Orientador: Prof. Dr. Leandro da Silva Costa
Co-Orientador: Prof. Dr. Hugo Alexandre de Oliveira Rocha
NATAL
2019
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas - SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial Prof. Leopoldo Nelson - -Centro de Biociências - CB
Silva, Cynthia Haynara Ferreira da.
Polissacarídeos sulfatados da alga marrom Dictyota mertensii: avaliação do efeito antioxidante sinérgico em associação com o
ácido ascórbico e purificação de uma fração / Cynthia Haynara Ferreira da Silva. - Natal, 2019.
84 f.: il.
Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Biociências. Programa de Pós-graduação em
Bioquímica.
Orientador: Prof. Dr. Leandro Silva Costa.
Coorientador: Prof. Dr. Hugo Alexandre de Oliveira Rocha.
1. Fucana - Dissertação. 2. Alga marrom - Dissertação. 3. Antioxidante sinérgico - Dissertação. 4. Ácido ascórbico - Dissertação. I. Costa, Leandro Silva. II. Rocha, Hugo Alexandre
de Oliveira. III. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. IV. Título.
Dedico esta obra
à minha família, em especial minha mãe, Iraneide Ferreira e minha avó, Maria Ferreira, ao meu namorado, Thainan Medeiros e a todos os meus amigos pelo apoio.
AGRADECIMENTOS
“Irei fazer de toda batalha uma oração.” Agradeço à Deus por ter me ouvido todas as vezes em que eu orei durante minhas batalhas. Foi onde eu me sustentei e tive forças para continuar.
Ao chegar até o final, só tenho a agradecer ao Pai por tamanha misericórdia.
A minha mainha, Iraneide, por todo apoio nessa jornada acadêmica. Muito obrigada, mainha, por toda palavra de conforto e todo carinho dado a mim. Foi muito importante para me manter
de pé durante os momentos difíceis. Mesmo eu estando longe, uma ligação, um “bom dia”, “Deus abençoe” me aproximava cada vez mais da senhora. A sua fé foi o que me fez seguir
em frente.
A minha vó, Maria Ferreira, por todo carinho dado a mim nas minhas idas ao interior descasar e me refugiar. Obrigada por me alegrar com as chamadas de vídeo, por entender minha falta
de tempo nas ligações. Muito obrigada, véinha.
Ao meu avô, João, por todas as orações que o senhor fez. A sua fé também me fez seguir em frente.
A todas as minhas tias, Maria, Elayne, Cristina, Ivoneide e Francisca e minhas primas, Taynara, Taline e Isabelly, por todos os momentos de descanso e por todo apoio nos momentos mais difíceis. Ter vocês como exemplo de mulheres batalhadoras me fez ser como
eu sou.
A minha tia Cristina e sua família, Higor e Higor Filho, por me acolher no início do mestrado. A minha tia Maria e sua família, Hygor e meu pitoquinho Cauã por terem me acolhido desde
a graduação!
Ao meu maravilhoso namorado, o princeso Thainan de Mederios, por todo apoio durante os momentos finais. Sem você eu não conseguiria! Você foi todo o meu suporte quando minha
família não poderia. Muito obrigada por estar em minha vida.
Aos meus amigos Paolla, Nathália e Vinícius por todos os momentos compartilhado no Clube Hobbi Wold (já que ninguém se encontra pessoalmente, né). Muito obrigada por todo apoio,
mesmo que a maioria deles tenha sido virtualmente, mas nossos encontros pelo CB sempre me faz relembrar que eu tenho vocês na minha vida! Amo muito vocês, migos! Ao Prof. Dr. Leandro por ter me apresentado ao Prof. Dr. Hugo e assim ter influenciado na
minha carreira acadêmica. Muito Obrigada pelo incentivo!
Ao Prof. Dr. Hugo por ter me orientado durante o desenvolvimento desse trabalho. Muito obrigada pelos ensinamentos e pelo incentivo na carreira acadêmica, pelo apoio durante o
mestrado!
Aos colegas do BIOPOL, Eder, Jefferson, Talita, Popó, Vinicius e muitos outros que convivi durante a iniciação científica e o mestrado. Muito obrigada por cada momento de
descontração, conversas, ajuda em experimentos..
Aos meus amigos e colegas da turma de mestrado, menino Aquiles, Thaís, Geovanna, Luiz, Lucas e Johny Whiskas. Muito obrigada pelo convívio durante as temidas disciplinas do
mestrado. Apresentar um seminário em inglês só foi menos vergonhoso porque vocês tornaram tudo mais leve!
Aos colegas de trabalho do GlicoBio Doulgas e Francielton, por todos os momentos de conversas durante o café.
Aos meus amigos de convívio do laboratório, que se tornaram amigos para a vida, Weslley, Raynara, Marília, Lucas Lisboa, Jayane, Rony, Maylla, Moacir, Adriana, Prof. Monique, e Lucas Alighieri. Muito obrigada por cada um de vocês estarem comigo nessa montanha russa
que é a pós graduação. Cada um, com sua personalidade, me ajudou de diferentes formas. Obrigada por me forçarem a tomar café só pra poder socializar e fofocar. Sou muito grata a
vocês por terem me ajudado com meu trabalho, mas também por me terem como amiga. Vocês tornam essa jornada mais feliz.
Em especial, ao meu amigo Lucas Alighieri, por me suportar todos os dias no laboratório e ainda em horário extra com minhas perguntas fora de hora. Amigo, muito obrigada por almoçar comigo no RU e me escutar reclamando de tudo. Obrigada por ter se tornado mais que um colega de laboratório, que me ajuda experimentos e puxando minha orelha, mas que
também me ajuda nos meus surtos (que são diários)!
À técnica da Cultura de células do dbq, Ana Katarina, que juntamente com Lucas Alighieri, me ajudou nos procedimentos dentro da cultura. Muito obrigada!
Aos funcionários do departamento de bioquímica, em especial, Matheus, Ricardo e Samara, por de ajudarem em todas as vezes que precisei.
Aos membros da banca de qualificação, Prof. Karol, Prof. Leonardo e Prof. Rafael, muito obrigada pelas contribuições.
Às Prof. Cinthia Telles e Prof. Luciana Guimarães por aceitarem participar da banca de defesa. Desde já, agradeço!
Ao Programa de Pós Graduação em Bioquímica da Universidade Federal do Rio Grande do Norte pelas condições necessárias para o desenvolvimento deste trabalho;
À Coordenação de Pessoal de Nível Superior (CAPES) e ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), pelo financiamento desta pesquisa.
RESUMO
As macroalgas marinhas são organismos que possuem grande diversidade biológica e ampla distribuição geográfica. Por causa dessa disponibilidade, elas são importantes para diversas áreas de conhecimento, como área ambiental, econômica e científica. As macroalgas sintetizam diversos compostos orgânicos com funções bioativas e, dentre esses, estão os polissacarídeos sulfatados (PS). Os PS de algas marrons (fucanas e fucoidans) apresentam diversas atividades, inclusive atividade antioxidante, e esta pode ser potencializada com o uso em conjunto de outros antioxidantes. O potencial antioxidante de PS obtidos da Dictyota mertensii já é relatado na literatura, entretanto, este se apresenta abaixo do encontrado com outros PS de macroalgas. Desse modo, objetivou-se avaliar o efeito sinérgico da atividade antioxidante de PS obtidos da macroalga D. mertensii em combinação com o ácido ascórbico. Espécimes da alga foram coletados do litoral potiguar e submetidos ao processo proteólise e fracionamento diferencial com acetona para obtenção dos PS, o que levou a obtenção de 6 frações (F0.3; F0.5; F0.7; F1.0; F1.5; F2.1). Essas frações polissacarídicas foram submetidas análises químicas e físicas para determinar sua composição e como resultado, observou-se que a D. mertensii sintetiza PS estruturalmente diversos. Observou-se que as frações são ricas em heteropolissacarídeos, em que há predominância dos monossacarídeos fucose, ácido glucurônico e xilose nas frações F0.3, F0.5, F1.0, F1.5 e F2.1. Além desses monossacarídeos, foi observado predominância de glicose e galactose em F1.0 e F1.5. A fração F0.7 é composta principalmente por fucose e ácido glucurônico. Foram observados três padrões de migração eletroforética nas frações: um perfil mais lento foi observado nas frações F0.3, F0.5 e F0.7; um perfil intermediário na F1.0 e um perfil mais rápido nas frações F1.5 e F2.1. Observou-se também valores diferenciados para a quantificação de açúcares totais e sulfato nas frações. Destaca-se as frações F0.7 e F0.5 com percentuais de açúcares de 85% e 66%, respectivamente em relação ao sulfato, destaca-se as frações F1.0 e F0.7, com 40,2% e 32% , respectivamente. As frações foram ainda avaliadas quanto ao potencial antioxidante em combinação com o ácido ascórbico em testes in vitro e em cultura de células. Como resultado, observou-se um aumento do potencial antioxidante proveniente do efeito sinérgico dos PS e do ácido ascórbico em todas as frações, com destaque para a F0.7, na qual foi observado potencialização de mais de 100% na capacidade antioxidante total e 40% na atividade de poder redutor. Com a análise de viabilidade celular em células epiteliais renais de cachorro (MDCK), por meio do ensaio de redução do brometo de 3-(4,5-dimetil-tiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio (MTT), foi possível observar diminuição da viabilidade celular apenas com o uso das fração F1.5, e F1.0 e F2.0 na concentração de 1 mg/mL. O potencial efeito sinérgico na atividade antioxidante em cultura de células foi avaliado pelo modelo de estresse oxidativo induzido por peróxido de hidrogênio em células MDCK. Como resultado, foi observado efeito protetor somente com as frações F0.5, F0.7 e F1.0, avaliadas isoladamente. A fração F0.7 foi escolhida para os passos de purificação e após a utilização de dispositivos de ultracentrifugação, cromatografia de troca iônica e cromatografia de gel filtração (HPLC), as análise demonstraram que a F0.7 é composta por três populações principais de PS. Os dados aqui encontrados abrem caminho para continuação dos estudos para a proposição da estrutura de pelo menos um PS, bem como entender melhor o efeito sinérgico desses polissacarídeos com o ácido ascórbico.
ABSTRACT
Seaweed are organisms with great biological diversity and wide geographicol distribution. Considering of avaliability, they are important for several areas of knowledge, such as environmental, economic and scientific. They have several organic compounds with bioactive functions, and among these are sulfated polysaccharides (SP). The brown seaweed SP (fucans and fucoidans) have several activities, including antioxidant activity, which may be enhanced by the presence of other antioxidants The antioxidant potential of PS obtained from D. mertensii is already reported in the literature. However, this is below what is found in other PS. Thus, the objective is to evaluate the synergistic effect of antioxidant activity in combination with ascorbic acid. The algal were collected SP from Potiguar coast and submitted to proteolysis and differential acetone fractionation to obtain PS, which led to obtaining 6 fractions (F0.3; F0.5; F0.7; F1.0; F1.5; F2.1). Polysaccharide fractions were subjected to chemical and physical analyzes to determine their composition and as a result, D. mertensii synthesizes structurally different PS. It was observed that the fractions are rich in heteropolysaccharides, with predominance of monosaccharides fucose, glucuronic acid and xylose in the fractions F0.3, F0.5, F1.0, F1,5 e F2.0. In addition to these monosaccharides, glucose and galactose was observed in F1.0 and F1.5. The F0.7 fraction is composed mainly of fucose and glucuronic acid. Three patterns of electrophoretic migration were observed in fractions: a slower profile was observed in fractions F0.3, F0.5 and F0.7; an intermediate profile in F1.0 and a faster profile in fractions F1.5 and F2.1. Different values were also observed for the quantification of total sugars and sulfate in fractions. A higher percentage of sugars was observed in fractions F0.7 and F0.5, with 85% and 66%, respectively, and higher sulfate percentages were observed in fractions F1.0 and F0.7, with 40.2% and 32%, respectively. Fractions were evaluated for antioxidant potential in combination with ascorbic acid in in vitro and cell culture tests. As a result, there was an increase in antioxidant potential from the synergistic effect of PS and ascorbic acid in all fractions, with emphasis on F0.7, in which potentiation of over 100% in total antioxidant capacity and 40% in reducing power activity. The analysis of cell viability in dog renal epithelial cells (MDCK) by the 3- (4,5-dimethyl-thiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide reduction assay (MTT), It was possible to observe decreased cell viability only with the use of fraction F1.5, and F1.0 and F2.0 at a concentration of 1 mg / mL The potential synergistic effect on antioxidant activity in cell culture was evaluated by the hydrogen peroxide induced oxidative stress model in MDCK cells. As a result, a protective effect was observed only with fractions F0.5, F0.7 and F1.0, evaluated separately. The F0.7 fraction was chosen for the purification steps and after the use of ultracentrifugation, ion exchange chromatography and gel filtration chromatography (HPLC) devices, the analyzes showed that F0.7 is composed of three main PS populations. The data found here open the way for further studies to propose the structure of at least one PS, as well as better understand the synergistic effect of these polysaccharides with ascorbic acid.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Redução completa e incompleta do Oxigênio. O2 – oxigênio molecular; .O2 -íon superóxido , H2O2- peróxido de hidrogênio, HO.- radial hidroxila, OH - grupamento hidroxila
-, H2O – molécula de água. Fonte: CÂMARA, 2015. ... 23
Figura 2: Reação de Fenton e Haber-Weiss. O2 – oxigênio molecular; .O2 -íon superóxido , H2O2- peróxido de hidrogênio, HO.- radial hidroxila, OH - grupamento hidroxila -, H2O – molécula de água. Fonte: PRESA, 2018... 23
Figura 3: Alga marrom Dictyota mertensii (C.Martius) Kutzing. Fonte: autoria própria. ... 30
Figura 4 Sequência de utilização dos dispositivos de filtração AMICON. ... 40
Figura 5: Fluxograma de etapas de purificação da fração F0.7. ... 41
Figura 6: Rendimento total de polissacarídeo (%) obtidos nas frações cetônicas da Dictyota metensii em relação soma da massa seca obtida com as 6 frações polissacarídicas. ... 43
Figura 7: Perfil eletroforético das frações polissacarídicas obtidas da alga marrom Dictyota mertensii. dicionou-se 50μg de cada fração polissacarídica em poços da lâmina de gel de agarose feito com tampão PDA 0,05M. Após a corrida em 110V, a lâmina foi colocada em CETAVLON 0,1% e corada com azul de toluidina 0,1%. Or-Origem. Fonte: autoria própria. ... 44
Figura 8: Espectro Infravermelho por transformada de Fourier das frações polissacarídicas obtidas da alga marrom Dictyota mertensii. Fonte: autoria própria. ... 47
Figura 9: Avaliação da atividade antioxidante total (CAT) das frações polissacarídicas da alga marrom Dictyota mertensii e seu efeito sinérgico com Ácido Ascórbico (0,01 mg/mL). O resultado é expresso em equivalente de ácido ascórbico (mg/ g de amostra). A letra x representa diferença significativa entre a mesma concentração e amostra, em condições diferentes. Os números 1,2,3 indicam diferença estatística entre amostras diferentes, na mesma condição (p<0,05). ... 49
Figura 10: Potencialização da atividade antioxidante total das frações polissacarídicas da alga marrom Dictyota mertensii e o Ácido ascórbico em relação ao efeito aditivo de ambos os componentes. Os números 1,2,3,4,5 indicam diferença estatística entre as frações (p<0,05). . 50
Figura 11: Avaliação da atividade de poder redutor das frações polissacarídicas da alga marrom
ascórbico (0,025 mg/mL). A-G- frações polissacarídicas. As letras “a” e “b” indicam diferença estatística entre concentrações diferentes da mesma amostra e condição. A letra x representa diferença significativa entre a mesma concentração e amostra, em condições diferentes. (p<0,05). ... 52
Figura 12: Potencialização da atividade de poder redutor das frações polissacarídicas da alga marrom Dictyota mertensii e o Ácido ascórbico em relação ao efeito aditivo de ambos os componentes. ... 52
Figura 13: Influência das frações polissacarídicas da alga D. mertensii e da interação das mesmas com ácido ascórbico (0,01 mg/mL) na viabilidade celular de células da linhagem MDCK. “- ”Controle e amostras sem adição de ácido ascórbico. “+” Controle e amostras com adição de ácido ascórbico. O símbolo * indica estatística em relação ao respectivo controle. As letras “a” e “b” indicam diferença estatística entre concentrações diferentes da mesma amostra e condição. A letra x representa diferença significativa entre a mesma concentração e amostra, em condições diferentes. (p<0,05).Contr.-Controle. ... 53
Figura 14: Influencia das frações polissacarídicas da alga D. mertensii e da interação das mesmas com ácido ascórbico (0,01 mg/mL) na viabilidade celular de células da linhagem MDCK frente ao estresse oxidativo. “-AA ”Controle e amostras sem adição de ácido ascórbico. “+AA” Controle e amostras com adição de ácido ascórbico. O símbolo * indica diferença estatística em relação ao seu respectivo controle. A letra x representa diferença significativa entre a mesma concentração e amostra, em condições diferentes. (p<0,05). ... 54
Figura 15: Rendimento das frações obtidas com a utilização de dispositivos de filtração a partir da fração polissacarídica F0.7. ... 56
Figura 16: Rendimento das frações obtidas da cromatografia de troca iônica a partir da fração polissacarídica F0.7. ... 57
Figura 17: Perfil eletroforético das frações obtidas na cromatografia de troca-iônica a partir da fração polissacarídica F0.7 da alga marrom Dictyota mertensii. Or- Origem. ... 58
Figura 18: Cromatograma da fração F05M obtido da cromatografia de gel filtração. ... 60
Figura 19: Cromatograma HPLC da fração F05M para observação do perfil polissacarídeo. 60
Figura 20: Lâmina em gel de agarose com as amostras obtidas do fracionamento cetônico (F0.7), amostras acima de 100 kDa (F1), amostras obtidas da cromatografia de troca iônica (F05M) e as amostras obtidas da cromatografia de gel filtração (PI, PII e PII). Or- Origem. 61
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Atividades farmacológicas de fucanas obtidas de algas marrons. ... 19 Tabela 2: Fucanas obtidas de diferentes algas que apresentam potencial antioxidante. . 25 Tabela 3: Caracterização química: dosagem de açúcares totais, sulfato, proteínas totais, compostos fenólicos e composição monossacarídica das frações polissacarídicas da alga D.
mertensii. ... 46
Tabela 4: Resumo dos sinais obtidos na espectroscopia de infravermelho por transformada de Fourier das frações polissacarídicas da alga Dictyota mertensii. ... 47 Tabela 5: Caracterização química das frações obtidas da cromatografia de troca iônica a partir da fração polissacarídica F1. ... 59
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
OC Grau Celsius
AA Ácido ascórbico
ATCC American Type Culture Collection ANOVA Analise de variância
BIOPOL Laboratório de Biotecnologia de Polímeros Naturais BSA Albumina sérica bovina
CAT Capacidade Antioxidante Total CM Centímetros
CTV Cloreto de brometo de N-cety-N-N-N-trimetilamonio DMEM Dulbecco´s Modified Eagle Medium
DNA Ácido desoxirribonucleico EB Extrato bruto
EDTA Ácido etilenodimino tetra-acético ERO’S Espécies reativas de oxigênio Fe2+ Ferro Ferroso
Fu Fucose g Grama G Gravidade Gal Galactose
GlcA Ácido Glucurônico Gli Glicose
h Hora
H2O2 Peróxido de hidrogênio
IUPAC “International Union of Pure and Applied Chemistry” KBr Brometo de potássio
KDa Kilodaltons
LQCPol Laboratório de química de Coordenação e Polímeros (LQCPol) M Molaridade
Man Manose mg Miligrama mM Milimolar mL Mililitro
MDCK Madin-Darby Canine Kidney cells (Células renais de cachorro) MTT 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl) 2,5-diphenil tetrazolium bromide NM Nanômetro
O2- Sequestro do radical superóxido
OH- Sequestro do radical hidroxila
OR Origem
PDA 1,3-diaminopropano pH Potencial hidrogeniônico
SÚMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ... 17
1.1 ALGAS MARINHAS ... 17
1.2 POLISSACARÍDEOS SULFATADOS DE MACROALGAS MARINHAS. ... 18
1.2.1 Polissacarídeos sulfatados de algas marrons: aplicações farmacológicas. ... 19
1.2.2 Polissacarídeos sulfatados extraídos da alga marrom Dictyota mertensii. ... 26
1.3 COMBINAÇÃO DE COMPONENTES: EFEITO SINÉRGICO. ... 27
2 OBJETIVOS ... 29
2.1 Objetivo geral... 29
2.2 Objetivos específicos ... 29
3 MATERIAIS E MÉTODOS ... 30
3.1 MATERIAL BIOLÓGICO ... 30
3.1.1 Alga marinha Dictyota mertensii ... 30
3.1.2 Linhagem celular ... 30
3.2 OUTROS MATERIAIS ... 31
3.2.1 Reagentes ... 31
3.2.2 Equipamentos ... 31
3.3 OBTENÇÃO DAS FRAÇÕES POLISSACARÍDICAS ... 32
3.3.1 Delipidação e despigmentação ... 32
3.3.2 Proteólise ... 33
3.3.3 Fracionamento do extrato bruto de polissacarídeos ... 33
3.4 CARACTERIZAÇÃO FISICO-QUÍMICA... 33
3.4.1 Dosagem de açúcar total ... 33
3.4.2 Dosagem de sulfato ... 34
3.4.3 Dosagem de proteínas ... 34
3.4.4 Dosagem de compostos fenólicos... 34
3.4.5 Composição monossacarídica... 34
3.4.6 Eletroforese em gel de agarose ... 34
3.4.7 Espectroscopia de Infravermelho por Transformada de Fourier (FTIR) ... 35
3.5 AVALIAÇÃO DO EFEITO SINÉRGICO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE in vitro...35
3.5.1 Capacidade Antioxidante Total (CAT)... 36
3.5.2 Atividade de Poder redutor ... 36
3.5.4 Avaliação da capacidade se sequestro radical hidroxila (OH-) ... 37
3.5.5 Atividade quelante de íon ferro (F2+) ... 37
3.6 AVALIAÇÃO DO EFEITO SINÉRGICO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE EM CÉLULA: ... 38
3.6.1 Análise da viabilidade celular por meio do ensaio de redução de MTT a formazan...38
3.6.2 Análise do efeito sinérgico das frações polissacarídicas com ácido ascórbico no teste estresse oxidativo induzido com peróxido de hidrogênio ... 38
3.6.3 Determinação da condição de estresse oxidativo ... 39
3.6.4 Avaliação da viabilidade celular (por meio da redução de MTT) submetidas ao oxidativo induzido por peróxido de hidrogênio frente as frações polissacaíridicas na ausência e presença de ácido ascórbico ... 39
3.7 PURIFICAÇÃO DA FRAÇÃO POLISSACARÍDICA F0.7 ... 40
3.7.1 Separação por massa molecular (kda): ... 40
3.7.2 Cromatografia líquida de troca iônica: ... 40
3.7.3 Cromatografia líquida de gel filtração: ... 41
3.8 ANÁLISES ESTÁTISTICAS:... 42
4 RESULTADOS ... 43
4.1 RENDIMENTO E CARACTERIZAÇÃO DOS POLISSACARÍDEOS OBTIDOS DA ALGA MARROM Dictyota mertensii: ... 43
4.1.1 Extração e rendimento ... 43
4.1.2 Caracterização fisico-quimica: ... 44
4.2 AVALIAÇÃO DO EFEITO SINÉRGICO DAS FRAÇÕES POLISSACARÍDICAS DA D. mertensii COM O ÁCIDO ASCÓRBICO NA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE in vitro ...48
4.2.1 Avaliação da capacidade sequestradora dos radicais superóxido e hidroxila e atividade quelante do íon ferro ... 48
4.2.2 Determinação da concentração de ácido ascórbico para os testes de CAT e poder redutor ...48
4.2.3 Avaliação do efeito sinérgico das frações polissacarídicas com o ácido ascórbico na CAT ...48
4.2.4 Avaliação do efeito sinérgico das frações polissacarídicas com o ácido ascórbico no poder redutor: ... 50
4.3 AVALIAÇÃO DO EFEITO SINÉRGICO DAS FRAÇÕES POLISSACARÍDICAS DA D. mertensii COM O ÁCIDO ASCÓRBICO NA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE EM CÉLULA: ... 53
4.3.1 Avaliação da viabilidade celular das frações polissacarídicas na ausência e presença de ácido ascórbico. ... 53
4.3.2 Avaliação da viabilidade celular as frações polissacarídicas na ausência e
presença de ácido ascórbico no estresse oxidativo por peróxido de hidrogênio. ... 54
4.4.1 Separação por tamanho molecular com dispositivo AMICON 100 kDa. ... 55
4.4.2 Cromatografia líquida de troca iônica. ... 56
4.4.3 Caracterização físico-química das populações polissacarídicas obtidas da cromatografia de troca iônica a partir da fração F1. ... 56
4.4.4 Cromatografia líquida de gel filtração. ... 59
4.4.5 Perfil eletroforético do pico I, pico II e pico III obtidos da cromatografia de gel filtração a partir da F05M: ... 60
5 DISCUSSÃO ... 62
6 CONCLUSÃO ... 70
1 INTRODUÇÃO 1.1 ALGAS MARINHAS
Algas, originado do latim “Algae”, compreende um grupo, sem valor taxonômico, de organismos fotossintetizantes aquáticos. Esse grupo de organismos pode ainda subdividir-se em macroalgas ou microalgas, classificação que leva em consideração o tamanho desses organismos. As macroalgas marinhas são ainda classificadas de acordo com a pigmentação que elas sintetizam, em algas verdes, pertencentes ao táxon Chloroplastida; algas vermelhas, pertencentes ao táxon Rhodophyceae; e algas marrons, pertencentes ao táxon Stramenopiles (ADL et al., 2012).
O ambiente aquático em que tais organismos habitam, principalmente na costa litorânea, proporciona abundância tanto de diversidade quanto de distribuição, devido aos fatores abióticos como iluminação, salinidade, movimento da água, substratos e nutrientes aos quais esses organismos são expostos (MARINHO-SORIANO, 2007; LOURENÇO,2006). Por essa biodiversidade e grande distribuição, as algas marinhas são organismos que possuem importância desde a esfera ecológica a esfera industrial (GUPTA; ABU-GJANNAM, 2011).
As macroalgas marinhas possuem um papel fundamental no ecossistema marinho (OMAR, 2010). São organismos que estão na base das relações ecológicas, servindo de alimento para animais, como tartarugas, bem como propiciar um ambiente de reprodução para diferentes espécies de organismos aquáticos. Por esse motivo, são utilizadas como bioindicadores de impactos ambientais por “expor” rapidamente as mudanças ambientais naturais e não naturais (OMAR, 2010). Além dessas funções, elas são descritas como organismos protetores do ambiente aquático por absorverem contaminantes, como por exemplo metais, em sua biomassa, diminuindo assim, a contaminação de outros organismos (VIDOTTI; ROLEMBERG, 2004).
Economicamente, as algas marinhas movimentam a indústria de diferentes setores, como a agricultura, alimentícia e farmacêutica. Com isso, estima-se que a colheita global de algas rendeu quase 7 bilhões dólares, sendo a China e a Indonésia responsáveis pela produção de quase 95%. Na indústria alimentícia, 40% das quase 4 milhões de toneladas produzidas são utilizadas tanto na alimentação direta como na produção de espessantes (WELLS et al., 2017). Já na agricultura, as macroalgas são utilizadas na forma seca ou de extratos e comercializadas em escala global como fertilizantes, prevenindo o desenvolvimentos de pragas agrícolas, bem como adubos, permitindo o crescimento das plantas (ABDEL-RAOUF; A AL-HOMAIDAN; M, 2012), além de serem utilizadas no tratamento de efluentes como bioacumuladores de metais
(DOSHI et al., 2008). A utilização de macroalgas também é recorrente na medicina tradicional, principalmente em países asiáticos, uma vez que o consumo é maior nesses países. Nestes, as algas são utilizadas na forma chás ou infusões, com o intuito de prevenir, tratar ou curar algumas doenças ou sinais/sintomas de doenças, como febre, diarreia e diurese, por exemplo (MALHOTRA; SINGH, 2008), tornando-se, posteriormente, bastante utilizadas em formulações de cosméticos e produtos naturais vendidos como fármacos (CHEN et al., 2016). Os produtos de origem natural despertam interesse, seja da esfera científica até a esfera populacional/social, desde muito tempo (DIAS; URBAN; ROESSNERO, 2012). O ambiente marinho possui uma biodiversidade enorme que se torna uma fonte rica desses produtos naturais. As algas marinhas tem gerado um interesse especial na produção de moléculas orgânicas que são utilizados como referência de produtos naturais, dentre eles se destacam os polissacarídeos sulfatados (PS). Os PS são umas das macromoléculas mais interessantes, possuindo um vasto espectro de potencialidades no uso medicinal, farmacêutico e biotecnológico (SANJEEWA et al., 2018).
1.2 POLISSACARÍDEOS SULFATADOS DE MACROALGAS MARINHAS.
Polissacarídeos sulfatados são moléculas complexas formadas por monossacarídeos unidos por ligações glicosídicas e que possuem sulfato como substituintes (WIJESEKARA; PANGESTUTIA; KIM, 2011).
Esses polímeros, nas algas, são constituintes de sua parede celular e, juntamente com outras moléculas, formam uma matriz mucilaginosa (DENIAUD-BOUET et al., 2017). A função biológica dos PS nas macroalgas marinhas ainda não é bem definida, entretanto, se discute que eles são importantes para manter o equilíbrio osmótico na retenção de íons e água nos períodos de maré baixa (TORODE et al., 2016). A característica higroscópica dos polissacarídeos permite que as algas se tornem flexíveis para suportar a movimentação das ondas, além de contribuir na disposição dos folíolos ou estruturas semelhantes de modo que seja possível a alga absorver a energia luminosa necessária para realizar a fotossíntese (PERCIVAL; MCDOWEL, 1968, ARAD; LEVY-ONTMAN, 2010).
Os PS são moléculas extremamente versáteis em relação a sua estrutura, podendo existir com uma vasta combinação de monossacarídeos, ligações glicosídicas e grau de sulfatação. Embora haja grande diversidade dos PS, tendo em vista a grande diversidade também de algas marinhas, as espécies tendem a sintetizar polissacarídeos predominantes dentro de cada grupo taxonômico (MORYA; KIM; KIM, 2011).
Assim, algas verdes (Chloroplastida) sintetizam uma grande variedade de polissacarídeos sulfatados. Os predominantes são as arabinanas e galactanas, entretanto, pode-se encontrar polissacarídeos sulfatados ricos em ramnopode-se e também heteropolissacarídeos, contendo xilose, manose e galactose (COSTA et al., 2012; WANG et al., 2014; BARBOSA et
al., 2019; SABRY et al., 2019). As algas vermelhas (Rhodophyceae) sintetizam como
polissacarídeo sulfatado principal, que de acordo com sua composição e grau de sulfatação são divididas em: agaranas e carragenanas (RAPOSO; MORAIS; MORAIS, 2015). Já algas marrons (Stramenopiles) sintetizam principalmente polissacarídeos contendo α-L-fucose sulfatada, denominados de fucanas, ou fucoidans (DENIAUD-BOUET et al., 2017). Por ser foco desse trabalho, esses PS serão abordados, em maiores detalhes, na próxima seção.
1.2.1 Polissacarídeos sulfatados de algas marrons: aplicações farmacológicas.
As algas marrons estão distribuídas em mais de 250 gêneros e englobam mais de 2000 espécies. Estas algas sintetizam polissacarídeos sulfatados denominados de fucanas: homo e heterofucanas, estas últimas também conhecidas como fucoidans. Todavia, esta terminologia não é bem definida entre autores, inclusive, para facilitar o entendimento, alguns utilizam a denominação de polissacarídeos sulfatados ricos em fucose (DENIAUD-BOUET et al., 2017). Entretanto, a International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC) define que fucanas são homopolissacarídeos constituídos por mais de 90% de α-L-fucose e que pelo menos uma parte dessas fucoses são sulfatadas, já fucoidan são heteropolissacarídeos que contem menos de 90% de α-L-fucose em sua composição, além de outros monossacarídeos (ROCHA; ALVES; LEITE, 2011).
As fucanas de algas marrons possuem uma variedade estrutural em relação ao grau de ramificação, composição monossacarídica, grau e posição de sulfatação e tamanho molecular. A combinação dessas características estruturais faz com que se aumente o grau de complexidade na estrutura final desses polímeros (PEREIRA et al., 1999; MORYA; KIM; KIM, 2012). É justamente essa diversidade estrutural que vai proporcionar as diversas propriedades farmacológicas que são atribuídas a esses polímeros, cujo resumo dessas propriedades estão na tabela 01.
Tabela 1: Atividades farmacológicas de fucanas obtidas de algas marrons. Atividades Espécies de obtenção Referências
Antioxidante Laminaria japonica1; Sargassum palidum1; Undaria pinnatifida1 Sargassum filipendula2; Dictyopteris justii3; Cystoseira barbata4 1JIAO et al., 2011; 2COSTA et al., 2011a;
3MELO et al., 2013; 4SELLIMI et al., 2014
Antiproliferativa Ascophyllum. nodosum5;
Laminaria setchelli6; Macrocystis integrifólia6; Nereocytis leutkeana6; Ecklonia cava7; Dictyopteris membranacea8; Spatoglossum schröederi9; Sargassum horner10; Sargassum asperifolium11; Sargassum vulgare12; Sargassum fusiforme13; Sargassum filipendula14; Sargassum stenophyllum15; Laminaria brasiliensis15; Sargassum aquifolium16; Sargassum polycystum17 5ELLOUALI et al., 1993; 6YUAN & WALSH, 2006; 7ATHUKORALA et al., 2006; 8ZEID et al., 2014; 9ALMEIDA-LIMA et al.,2010; 10SHAO et al., 2015; 11RAAFAT et al., 2014; 12DORE et al., 2013; 13CHEN et al., 2012a; 14COSTA et al., 2011a; 15STEVAN et al., 2001;
16BILAN et al.,2017; 17PALANYSAMY et al., 2017
Antiinflamatória Lobophora variegata18; Fucus vesiculosus19; Sargassum vulgare20; Dictyota menstrualis21; Sargassum cristaefolium22; Sargassum horneri23; 18PAIVA et al., 2011; 19PARK et al., 2011; 20DORE, et al., 2013; 21ALBUQUERQUE et al., 2013; 22WU et al., 2016; 23SANJEEWA et al., 2017
Imunomodulatória Fucus vesiculosus24;
Sargassum hemiphyllum25; Padina gymnospora26 24KIM;JOO, 2008; 25HWANG et al., 2015; 26MARQUES et al., 2012. Impede a adesão celular Spatoglossum schröederi27; Laminaria brasiliensi15s; Sargassum stenophyllum15 27ROCHA, et al., 2001; 15STEVAN et al., 2001;
Antiangiogênica Fucus vesiculosus28;
Sargassum stenophyllum29; Undaria pinnatifida30; Sargassum vulgare20, Spatoglossum schröederi31; 28MATSUBARA et al., 2005; 29DIAS et al., 2005; 30LIU et al., 2012; 20DORE et al., 2013; 31MENEZES et al., 2018.
Antiadipogênica F. vesiculosus32 32YOKOTA et al., 2009 Anticoagulante Lessonia vadosa33;
Laminaria cichorioides34; Dictyota menstruallis21; Padyna gymnospora35; Dictyopteris justii36; Sargassum aquifolium37 33CHANDÍA; MATSUHIRO, 2008; 34YOON et al., 2007; 21ALBUQUERQUE et al., 2004; 35SILVA et al., 2005; 36MELO et al., 2013; 37BILAN
et al.,2017
Antitrombótica Ascophyllum nodosum38;
Spatoglossum schröederi39,40
38JIAO et al., 2011; 39ROCHA
et al., 2005; 40BARROSO et al., 2008 Fibrinolítica E. kurome41; F. vesiculosus42, 43 41DOCTOR et al., 1995; 42JIAO et al., 2011; 43NISHINO et al., 2000 Anticomplemento Ascophyllun nodosum44;
Laminaria cichorioides45; Laminaria japônica45; Sargassum thunbergii46 44TISSOT et al., 2003; 45ZVYAGINTSEVA et al., 2000; 46JIN et al., 2017
Antiviral Sargassum horneri47;
Cystoseira indica48; Sargassum swartzii49 47HOSHINO et al., 1998; 48MANDAL et al., 2007; 48HAYASHI, 2008;JIAO et al., 2011; 49DINESH et al., 2016 Hepato-protetora Fucus vesiculosus50;
C. okamuramus51
50NAKAZATO et al., 2010; 51HONG et al., 2011. Neuroprotetora Turbinaria decurren52 52MEENAKSHI et al., 2016
Fonte: Adaptada e atualizada de Negreiros (2015).
Como visto anteriormente, os polissacarídeos sulfatados apresentam inúmeras aplicabilidades farmacológicas e essa ampla aplicação está principalmente relacionada com a diversidade e complexidade estrutural que esses polímeros apresentam. Essa diversidade estrutural pode gerar dois pontos de vista: cada polissacarídeo possuí uma estrutura única, e assim, a descoberta de um novo polissacarídeo passa a ser visto como um potencial a ser reconhecido; o outro lado é a dificuldade em se determinar a estrutura desses polímeros, e assim, poder relacionar com suas atividades (ROCHA et al., 2001; LI et al., 2008; RAPOSO; MORAIS; MORAIS, 2015).
As atividades biológicas e farmacológicas dos polissacarídeos não depende, entretanto, somente de um tipo de característica isolada. Já é conhecido que a atividade anticoagulante de fucanas obtidos de invertebrados, por exemplo, não depende única e exclusivamente da presença de sulfato, mas sim de como esse sulfato está distribuído ao longo da molécula como
um todo Fucanas de invertebrados servem como modelo por possuírem uma estrutura mais simplificada do que fucanas de algas marinhas (MOURÃO, 2015). Além da distribuição do sulfato, já foi observado que a atividade antioxidante de polissacarídeos obtidos da Laminaria
japonica estava relacionada ao tamanho molecular desses polímeros (LI et al., 2008).
Relacionar a aplicação biotecnológica com a estrutura do polissacarídeo sulfatado é uma tarefa difícil para pesquisadores. Entretanto, há um esforço para identificar estruturalmente os polissacarídeos sulfatados utilizando técnicas apropriadas para, posteriormente, relaciona-las com as atividades farmacológicas (LI et al., 2008; JIÃO et al., 2011)
1.2.1.1 Atividade antioxidante de polissacarídeos sulfatados de algas marrons.
Espécies reativas são moléculas resultantes de processos de oxidação e redução e que, por possuírem elétrons desemparelhados ou por serem intermediários da formação destes, apresentam alta reatividade com moléculas orgânicas. Essas espécies reativas podem ser derivadas de oxigênio, de nitrogênio, enxofre e cloro (SOSA et al., 2013). As espécies reativas de oxigênio (ERO’s) são consideradas predominantes em sistemas biológicos (SCHIEBER; CHANDEL, 2014).
As ERO’s, são um grupo heterogêneo de moléculas e radicais derivadas do oxigênio molecular (O2). Dentre eles, os que são importante fisiologicamente são o peróxido de hidrogênio (H2O2), radical hidroxila (HO.) e íon superóxido (.O
2-) As ERO’s são caracterizadas
principalmente por serem capazes de reagir rapidamente e de modo inespecífico com componentes celulares devido ao tempo de meia vida curto que eles possuem (PISOSCHI; POP, 2015; SCHIMIDT et al., 2016).
A produção de dessas espécies reativas está em equilíbrio com agentes que os controlam. Entretanto, em casos de desbalanço, eles podem causar danos as células por reagirem com componentes celulares como DNA, proteínas e lipídeos (AUTEN; DAVIS, 2009). Devido a essa reatividade, os danos por ERO’s são geralmente associados a doenças degenerativas como doença de Alzheimer, doenças cardiovasculares (KHARPER et al., 2018), insuficiência sensorial, como as doenças relacionadas a visão, e doenças psiquiátricas, como esquizofrenia (BRIEGER et al., 2012).
A formação de ERO’s (Figura 01) pode estar associada, principalmente, a fatores biológicos, como processos de oxirredução na cadeia transportadora de elétrons (CTE), na
mitocôndria, que são responsáveis por 90% das ERO’s intracelulares (LUSCHACK, 2014). O processo de transferência de elétrons através dos complexos dispostos na membrana interna da mitocôndria é indispensável para a produção de moléculas energéticas para a célula. Ao fim do processo, é necessário que o oxigênio (O2) funcione como um aceptor de dois elétrons para ser reduzido a uma molécula de água. Esse é o resumo do processo em condições normais, entretanto, o oxigênio acaba sendo aceptor de elétrons, ao longo dos complexos, de forma desordenada, gerando principalmente o íon superóxido e consequentemente, outros ERO’S (LUSCHACK, 2014).
Figura 1:Redução completa e incompleta do Oxigênio. O2 – oxigênio molecular; .O2 -íon superóxido , H2O2-
peróxido de hidrogênio, HO.- radial hidroxila, OH - grupamento hidroxila -, H2O – molécula de água. Fonte:
CÂMARA, 2015.
O peróxido de hidrogênio, embora seja menos reativo que outros ERO’s, está envolvido em processos que favorece a formação do radical hidroxila, uma das ERO’s mais reativas. O peróxido de hidrogênio formado na redução incompleta do O2 pode participar da reação de Fenton com o íon ferroso (Fe2+) formando radical hidroxila. O peróxido de hidrogênio pode ainda participar da reação de Haber-Weiss reagindo com o íon superóxido e formando mais radicais hidroxila (figura 2) (VALKO et al., 2007).
Figura 2: Reação de Fenton e Haber-Weiss. O2 – oxigênio molecular; .O2 -íon superóxido , H2O2- peróxido de
Para evitar que esses radicais promovam danos ao serem formados, os sistemas biológicos possuem agentes que são denominados de antioxidantes. Antioxidantes são agentes que promovem a neutralização das espécies reativas, independente do mecanismo de ação (PISOSCHI; POP, 2015). Estes antioxidantes podem ser enzimáticos, como: superóxido dismutase (SOD), glutationa peroxidase e catalase e não enzimáticos ( que podem ser endógenos ou exógenos, como o α-tocoferol (vitamina E), ácido ascórbico (vitamina C), carotenoides, flavonoides, polifenois, dentre outros (DEVASAGAYAM et al., 2004).
O equilíbrio entre as espécies reativas e os agentes antioxidantes não causam efeitos deletérios, porém, com o aumento de ERO’s em detrimento de agentes antioxidantes, pode-se ocasionar o estresse oxidativo. O consumo de antioxidantes exógenos, principalmente proveniente da alimentação, é uma alternativa no complemento das defesas antioxidantes (POLJSAK, 2011).
Dentre os agentes antioxidantes exógenos citados, a vitamina C é uma das mais utilizadas devido a sua grande participação em processos biológicos, além de agentes antioxidantes, como participação em reações enzimáticas, produção de colágeno e auxílio no desenvolvimento cognitivo (TRAVICA et al., 2017). A vitamina C, também denominada de ácido ascórbico, é uma molécula solúvel em água, sintetizada principalmente por plantas e alguns animais. Entretanto, humanos não são aptos a sintetizar o ácido ascórbico devido a uma mutação do gene que codifica a enzima gulonolactona oxidase , essencial para a via de biossíntese (SMNORFF, 2018). Por tal motivo, é necessário que se tenha uma suplementação via alimentação ou formulações suplementares, tendo em vista que a falta dessa vitamina causa diversas complicações, tais como, a doença de escorbuto (PADAYATTY; LEVINE, 2016).
Além dos agentes antioxidantes comercialmente estabelecidos, surge o interesse em buscar antioxidantes naturais que possam ser utilizados como fonte exógena (SHAO et al., 2013b). E dentre essa problemática, as macroalgas marinhas surgem como uma fonte alternativa devido as intemperes ambientais que esses organismos são expostos, como por exemplo, exposição continua à radiação ultravioleta e salinidade. É sugerido que fucanas presentes na parede celular de macroalgas são agentes protetores contra o estresse oxidativo gerado (ROCHA et al., 2007; BALBOA et al., 2013).
A partir dessa linha de pesquisa, inúmeros trabalhos relatam o potencial antioxidante de polissacarídeos sulfatados obtidos de algas marrons, como consta na tabela 02. Embora os polissacarídeos sulfatados sejam potenciais agentes antioxidantes, essa atividade não é semelhante para todos os polímeros. Negreiros (2015) observa, por meio da análise de vários
trabalhos, que polissacarídeos obtidos de algas do gênero Sargassum apresentam baixa atividade de sequestrar radicais, entretanto, outros apresentam atividades significativas em quelar íons metálicos, como ferro ou cobre.
Tabela 2: Fucanas obtidas de diferentes algas que apresentam potencial antioxidante.
Espécie Referência
Ascophyllum mackaii GUIYAN et al., 2014
Canistrocarpus cervicornis
CAMARA, et al., 2011;COSTA
et al., 2010;
Cystoseira compressa HENTATI et al., 2018
Cystoseira barbata SELLIMI et al., 2014
Dictyota menstrualis COSTA et al., 2010;
Dictyota mertensii COSTA et al., 2010; FIDELIS et
al., 2019
Dictyopiteris delicatula COSTA et al., 2010;
MAGALHAES et al., 2011
Dictyopiteris justii MELO et al., 2013
Fucus vesiculosus RODRIGUEZ-JASSO et al.,
2014; SOUZA et al., 2007; RUPEÄREZ, AHRAZEM & LEAL, 2002
Lobophora variegata PAIVA et al., 2011
Padina gymnospora PAIVA et al., 2011;
VASANTHARAJA et al., 2019
Padina tetrastromatica MOHSIN, MAHADECAN & KURUP, et al., 2014
Sargassum binderi LIM et al., 2014
S. filipendula COSTA et al., 2010;
COSTA et al., 2011a
S. fulvellum KIM et al., 2007
S. fusiforme ZHOU et al., 2008; WANG et al.,
2018
S. henslouianum SHAO et al., 2013a
S. pallidum YE et al., 2008
S. plagiophyllum SURESH et al., 2013
S. polycystum PALANISAMY et al., 2017a
Sargassum tenerrimum RAGURAMAN et al., 2019
S. swartzii VIJAYABASKAR, VASEELA
& THIRUMARAN, 2012
S. vulgare DORE et al., 2013
Spatoglossum schröederi
COSTA et al., 2010;
Spatoglossum asperum PALANISAMY et al., 2017 Fonte: Adaptada e atualizada de Negreiros (2015).
Dentre esses trabalhos, destaca-se o desenvolvido por Costa e colaboradores (2010) em que avaliaram atividades farmacológicas, inclusive a atividade antioxidante, de 11 algas marinhas, dentre estas 6 algas marrons, a saber: Dictyota cervicornis (Kuetzing); Dictyopteris
delicatula (Lamouroux); Dictyota menstrualis (Hoyt, Schnetter); Dictyota mertensii (Martius,
Kuetzing); Sargassum filipendula (C. Agardh) e Spatoglossum schroederi (C. Agardh, Ku¨tzing). Dando continuidade a esse trabalho, escolheu-se a alga marrom Dictyota mertensii, como fonte de obtenção de polissacarídeos sulfatados.
1.2.2 Polissacarídeos sulfatados extraídos da alga marrom Dictyota mertensii.
Descrita em 1859 por Friedrich Kützing, Dictyota mertensii é uma macroalga bentônica de ocorrência restrita à região tropical do Brasil. Não se tem definições taxonômicas bem claras em relação às características enquanto espécie, assim os espécimes são avaliados com base nas definições gerais do gênero Dictyota. O gênero é composto por algas de cor marrom-amarelada ou marrom-esverdeada, fixas ao substrato por numerosos rizóides, apresentando talo achatado, parenquimatoso, em forma de fita, as vezes torcido em espiral, sem nervura, ramificado dicotomicamente, algumas vezes com aspecto cervicorne, margens lisas ou denteadas (FREITAS et al., 2007).
Trabalhos com polissacarídeos sulfatados obtidos do extrato da D, mertensii são alvo de pesquisas que mostram o potencial biológico, como mostram os dados apresentados por Queiroz et al (2008) que, ao analisarem frações ricas em polissacarídeos, identificaram que
esses eram capazes de ter ação antiviral (Anti-HIV); Costa e colaboradores (2010) relataram que extratos contendo polissacarídeos sulfatados obtidos dessa alga apresentaram atividade anticoagulante e antitumoral. Negreiros-Fernandes e colaboradores (2017) observaram as atividades bactericida, imunomodulatória e antriproliferativa de nanopartículas de prata conjugadas com fucanas obtidas da D. mertensii. Marques e colaboradores (2018) atribuíram que um extrato de polissacarídeos sulfatados da D. mertensii apresentou atividade anticoagulante.
A atividade antioxidante de polissacarídeos obtidos da D. mertensii também foi avaliado por Costa e colaboradores (2010), e mais recentemente por Fidelis e colaboradores (2019). Entretanto, observa-se que, apesar do potencial antioxidante presente, os resultados são considerados baixos em relação à atividade antioxidante de polissacarídeos sulfatados de outras algas das quais foram testadas por Costa (2010). Foi observado que extrato polissacarídico da
D. mertensii tem o menor potencial antioxidante dentre os extratos polissacarídicos testados.
1.3 COMBINAÇÃO DE COMPONENTES: EFEITO SINÉRGICO.
O desenvolvimento de certas complicações fisiológicas, em muitos casos, é proveniente da interação de sistemas de multicomponentes e processos o que torna difícil a utilização de apenas um componente para prevenção de tais processos. Nesse contexto, surge a proposta de combinação entre componentes visando o aumento da eficiência em determinada ação, denominada de efeito sinérgico, bem como a diminuição de efeitos adversos.
O termo sinergismo é utilizado para definir o efeito cumulativo gerado pela interação de mais de um componente quando este é maior do que a soma aditiva do efeito desses componentes avaliados isoladamente. Assim, a combinação de componentes com mesma atividade comprovada pode melhorar a ação isolada desses compostos (TALLARIDA, 2001). O sinergismo de componentes é comumente utilizado na farmacologia com a associação de fármacos que possuem mecanismos de atuação diferentes para atuar em patologias ocasionadas por múltiplos fatores, como por exemplo a hipertensão em que são combinados fármacos com o objetivo de aumentar a eficiência da ação anti-hipertensiva (KIM et al., 2016).
A prática de combinar efeitos de dois componentes também vem sendo bastante estudada na ação antioxidante. Já foi relatado que a ação combinada das vitaminas C e E com o β-caroteno melhorou a função cognitiva em idosos, por previr danos oxidativo (LI et al., 2015). A combinação de vitamina E (α-tocoferol) com extratos da planta Centella asiatica também demonstrou um efeito sinérgico em relação a atividade antioxidante (THOO, et al.,
2012). Em relação aos polissacarídeos, Tan et al. (2019) observaram o aumento da atividade antioxidante, em 4 vezes, de um biofilme sintetizado com quitosana e ácido ascórbico em comparação com o biofilme contendo apenas quitosana. Queiroz et al. (2019) observaram que a conjugação de dextrana com ácido gálico, antioxidante comercial reconhecido, melhora a atividade antioxidante das duas moléculas em questão.
Entretanto, ainda não se tem na literatura trabalhos que mostrem o melhoramento da atividade antioxidante de polissacarídeos sulfatados de algas utilizando antioxidantes comerciais como combinação. Costa e colaboradores (2010) ao analisarem a atividade antioxidante de extratos polissacarídeos obtidos da D. mertensii, observaram que o potencial antioxidante não era tão alto, com isso, surgiu o questionamento sobre a possível combinação de polissacarídeos sulfatados da D. mertensii com antioxidante já conhecido em possívelmente melhorar o potencial antioxidante e, assim, no futuro, impulsionar o cultivo e uso comercial de macrcoalgas encontradas no litoral do Rio Grande do Norte, sendo este o intuito do grupo no qual esta dissertação está inserida.
2 OBJETIVOS 2.1 Objetivo geral
Extrair e caracterizar polissacarídeos sulfatados da alga Dictyota mertensii, bem como avaliar o potencial antioxidante proveniente do efeito sinérgico dos polissacarídeos combinados com o ácido ascórbico e purificar polissacarídeos sulfatados a partir de uma das frações cetônicas.
2.2 Objetivos específicos
• Obter frações polissacarídicas a partir do extrato bruto da alga marrom D. mertensii; • Caracterizar físico-quimicamente os polissacarídeos sulfatados obtidos no
fracionamento;
• Avaliar o potencial antioxidante proveniente do efeito sinérgico das frações polissacarídicas em combinação com ácido ascórbico in vitro;
• Avaliar a citotoxicidade dos polissacarídeos sulfatados na presença e ausência do ácido ascórbico em células não tumorais;
• Avaliar a capacidade citoprotetora dos polissacarídeos sulfatados na presença e ausência do ácido ascórbico frente ao estresse oxidativo induzido por peróxido de hidrogênio; • Purificar polissacarídeos sulfatados de uma das frações polissacarídicas com melhor
3 MATERIAIS E MÉTODOS 3.1 MATERIAL BIOLÓGICO
3.1.1 Alga marinha Dictyota mertensii
Espécimes da alga Dictyota mertensii (Figura 3) (Herbário UFRN 23375) foram coletados na praia de Pirambúzios, no litoral sul potiguar (Rio Grande do Norte, Brasil, 6º 00’ 50,72’’ S/35º 10’83,52’’ O), entre dezembro de 2018 e fevereiro de 2019. Após a coleta, foram realizados os procedimentos básicos no Laboratório de Biotecnologia de Polímeros Naturais (BIOPOL), a saber: lavagem, triagem, desidratação em estufa a 60°C e trituração. O material triturado permaneceu armazenado em recipiente fechado, em temperatura ambiente, até o momento de utilização. Este estudo foi autorizado sob o código Sistema Nacional de Gestão do património Genético (SISGEN) nº A0D4240.
Figura 3: Alga marrom Dictyota mertensii (C.Martius) Kutzing. Fonte: autoria própria.
3.1.2 Linhagem celular
As células da linhagem epitelial renal (MDCK NLB-2 ATCC®) foram utilizadas para avaliação da viabilidade celular e avaliação da capacidade citoprotetora. As células foram cultivadas em meio DMEM (Dulbecco modification of. Minimum Essential Media) contendo
10% (v/v) de soro fetal bovino (SFB) e antibióticos (estreptomicina e penicilina – 15 mg/L de meio).
3.2 OUTROS MATERIAIS 3.2.1 Reagentes
- Azul de toluidina, acetona, ácido clorídrico, álcool etílico e brometo de cetiltrimetilamônio P.A., citrato de sódio, cloreto de bário, peróxido de hidrogênio foram adquiridos da CRQ (Diadema, SP, Brasil).
- Ácido etilenoaminoacético (EDTA) proveniente da VETEC (Duque de Caxias, RJ, Brasil);
- Ácido sulfúrico, álcool metílico, fosfato de sódio monobásico, fosfato de sódio dibasico, hidróxido de sódio, peróxido de hidrogênio, sulfato de ferro heptahidratado foram adquiridos da Diadma (SP, Brasil);
- Ácido gálico ( CAQ Casa da Quimica Ind. E Com. (Diadma, SP, Brasil); - Metionina ( Synth (Diadema, SP, Brasil);
- Ácido ascórbico, ferrozina, nitroblue tetrazolium (NBT), cloreto de sódio, 1,3-diaminopropano acetato,ferrozina, riboflavina, nitrito de sódio, albumina sérica bovina e violeta de pirocatecol, L-fucose, D-xilose, D -galactose, D -manose, D -glucose, D -arabnose, D -ramnose e ácido D -glucurônico (Sigma-Aldrich (São Paulo, SP, Brasil);
- Agarose (Standart Low-MR) (BioRAd Laboratories (Richmond, CA, EUA); - Cloreto de ferro e reagente Folin-Ciocalteau ( Merk (Darmstadt, Alemanha);
- Fenol e Molibdato de amônia sulfato de cobre, sulfato de potássio e sulfato de sódio ( Reagen Quimibrás Industrias Químicas S.A. (Rio de Janeiro, RJ, Brasil);
- Ácido acético glacial P.A. e Sulfato de cobre II (CRB–Cromato produtos químico Ltda (São Paulo, Brasil);
- 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH) ( FLUKA (Alemanha);
- Prozima (Preparação enzimática a base de protease alcalina PROLAV 750) (Prozyn Biosolutions, São Paulo, Brasil);
- Salicilato de sódio (FLUKA (Steinheim, Germany);
- Nitrato de prata (CASA AMERICANA (Sta. Cecília – SP).
- DMEM (Dulbecco´s Modified Eagle Medium) e soro fetal bovino (SFB) (Cultilab (Campinas, SP, Brasil).
- Agitador orbital modelo 255-B, banho maria e estufa modelo 515 de 2013 (FANEM Ltda (Piracicaba, SP, Brasil);
- Cuba para eletroforese em gel de agarose, modelo desenvolvido por Jaques e Col (1968), da Técnica Permatron Ltda. (São Paulo, SP, Brasil);
- Fontes de corrente contínua regulável desenvolvida pelo Dr. H. Rzeppa, Tecnica Permatron Ltda (São Paulo, SP, Brasil);
- Osmose reversa, Dertin Pump (Diaphragm Pump) Modelo 8809, Resina MB478, Work Pressure:70PSI, Volts: 24VDC, (São Paulo, SP, Brasil).
- Balança analítica de precisão e bomba a vácuo ( TECNAL (Piracicaba, SP, Brasil); - Centrifuga refrigerada da Thermo scientific, Modelo Sorvall Legend XRT, 2014 (Alemanha).
- Espectrofotômetro digital DR500 UV/VIS da Hach Company (Loveland, Colorado, EUA);
- Liofilizador - FreeZone4.5 (Labcon)
- Medidor de pH Orion Research, modelo 701 A/digital lonalyer (Cambrige, MA, EUA); - Bancada de fluxo laminar Pachane Pa300 (Piracicaba), SP, Brasil);
- Espectrofotômetro de microplacas foi obtido da Epoch – BioTek (Winooski, VT, USA); - Sistema de purificação de água BarnsteadTM NanopureTM – DISCONTINUED modelo 7146 e 7155. foi obtido da Thermo Scientific (California, USA);
- Espectrômetro FTIR- 8400S, modelo IRAffinity-1 (Shimadzu, Japão);
- Incubadora Themoforma Serie II Water CO2 Incubator HEPA Filter Model 3110 (USA).
3.3 OBTENÇÃO DAS FRAÇÕES POLISSACARÍDICAS
O material contendo os polissacarídeos sulfatados foi obtido por processos sequenciais, os quais são descritos logo abaixo:
3.3.1 Delipidação e despigmentação
O processo de extração de polissacarídeos sulfatados iniciou-se com a retirada dos lipídios e pigmentos, de acordo com o método utilizado por Farias (1992). 200g de alga seca foram colocados em um béquer e a ele adicionado dois volumes de etanol PA. A mistura (alga triturada + etanol PA) descansou em temperatura ambiente, com a troca do solvente realizada após 24 horas, período em que o etanol apresentou saturação. O processo foi repetido durante seis dias. Ao término desse período, o material sólido foi separado por filtração, exposto para secagem, obtendo assim a alga delipidada.
3.3.2 Proteólise
A proteólise tem por objetivo degradar as proteínas da matriz extracelular por ação enzimática e assim liberar os polissacarídeos que interagem com elas. Nessa etapa, adicionou-se dois volumes de NaCl (0,25M) ao pó da alga e fez-adicionou-se ajuste do pH para 8,0. Posteriormente, adicionou-se a Prozima (mistura de proteases) na proporção de 15 mg de enzima para 1 g de alga seca. Este material ficou por 18 horas em banho maria a 60 ºC. Após o período, o material foi filtrado para retirar a porção sólida e a solução salina rica em polissacarídeo foi então centrifugada (10.000 x g por 15 minutos, a 4 °C ) para retirada de fragmentos que não foram retidos na filtração. Ao fim desta, desprezou-se o precipitado e armazenou-se o extrato total de polissacarídeo para o fracionamento cetônico.
3.3.3 Fracionamento do extrato bruto de polissacarídeos
O extrato total de polissacarídeos foi submetido ao fracionamento com volumes crescentes de acetona P.A., baseado no método descrito por Magalhães et al. (2011). O fracionamento com acetona separa, por precipitação, diferentes populações de polissacarídeos com base na afinidade destes polímeros com a água. Ao extrato total de polissacarídeos, foram adicionados volumes crescentes de acetona, iniciando-se com 0,3 volumes, seguido de 0,5v, 0,7v,1,0v, 1,5v e 2,1v. De forma sucinta, o processo se deu da seguinte forma: após a adição da acetona, o material foi deixado em ambiente refrigerado, a 4º C, por 18 horas e em seguida, submetido a centrifugação a 10.000 x g, a 4 °C, por 20 minutos, para obtenção do precipitado, que posteriormente, foi seco em sistema de pressão reduzida, triturado e armazenado. O sobrenadante oriundo da centrifugação foi submetido a nova precipitação com o volume seguinte de acetona. Ao final desse fracionamento, as frações polissacarídicas obtidas foram nomeadas de acordo com o volume de acetona utilizado para sua obtenção/precipitação, a saber: F0.3, F0.5, F0.7, F1.0, F1.5, F2.1.
3.4 CARACTERIZAÇÃO FISICO-QUÍMICA 3.4.1 Dosagem de açúcar total
A quantificação de açúcares totais foi realizada pelo método fenol/ácido sulfúrico proposto por Dubois et al. (1956). Neste, é formado o composto furfural oriundo da ligação fenol-açúcar, a partir da desidratação com ácido sulfúrico. O padrão utilizado foi o monossacarídeo L-fucose e a mensuração foi feita pela leitura em espectrofotômetro a 490 nm.
3.4.2 Dosagem de sulfato
O sulfato presente nas frações polissacarídicas foi quantificado pelo método de gelatina-bário proposto por Dogson & Pirce (1962). O sulfato presente na solução se liga ao cloreto de bário (BaCl2). O padrão utilizado foi o sulfato de sódio e a mensuração foi feita pela leitura em espectrofotômetro a 500 nm.
3.4.3 Dosagem de proteínas
A quantificação de contaminantes proteicos foi realizada pelo método de Bradford (1976). O reagente coomassie brilliant blue R-250, presente no reagente de Bradford, interage com as cadeias laterais básicas ou aromáticas dos aminoácidos. A albumina sérica bovina foi utilizada como padrão e a mensuração foi feita pela leitura em espectrofotômetro a 595nm.
3.4.4 Dosagem de compostos fenólicos
A quantificação de contaminantes fenólicos foi realizada pelo método utilizado proposto por Swain Hills (1959). A leitura foi realizada em espectrofotômetro a 765 nm. O ácido gálico foi utilizado como padrão.
3.4.5 Composição monossacarídica
A identificação das unidades monossacarídicas que compõem as frações cetônicas foi realizada pelo método utilizado por Fidelis e colaboradores (2014). As amostras foram submetidas a hidrólise com ácido sulfúrico 2 N por 2 horas e posteriormente aplicadas em cromatográfica líquida de alta performance (HPLC). Os padrões de monossacarídeos utilizados foram: L-fucose, D-xilose, D-galactose, D-manose, D-glucose e ácido D-glucurônico.
3.4.6 Eletroforese em gel de agarose
A eletroforese em gel de agarose foi realizada de acordo com o método de Dietrich e Dietrich (1977). Foi realizada para avaliar o perfil de mobilidade eletroforética, bem como observar a presença de populações distintas dos polissacarídeos sulfatados obtidos nas frações polissacarídicas. O gel foi preparado com 0,55% (m/v) de agarose em tampão 1,3-diaminopropano acetato (PDA) 0,05M e colocado sobre lâminas de vidro. Nesse gel foram feitas cavidades (poços) e aplicados 50 μg das amostras. Posteriormente, o gel (lâmina), em uma cuba refrigerada a 4º C, foi submetido a corrente contínua (0,3A 110V. Vale salientar que a parte da gel que continha os poços se encontravam próximas ao polo negativo e que a corrida se originou-se desse polo em direção ao polo positivo. Ao final, o gel foi submerso em de
brometo de cetiltrimetilamônio (CETAVLON) 0,1% (v/v), por no mínimo 4 horas, para a precipitação dos polissacarídeos. Após o período de descanso no cetavlon, o gel foi seco sob fluxo de ar quente e corado com azul de toluidina 0,1% (p/v). Em seguida, utilizou-se a solução descorante, essa composta por ácido acético acético 1% (v/v) e 49% (v/v) em água, com secagem em temperatura ambiente. A visualização do perfil eletroforético se deu pelo fato do corante azul de toluidina se ligar aos polissacarídeos sulfatados chamado de metacromasia. Com isso, pode-se avaliar o perfil de mobilidade eletroforética, bem como a disposição das bandas e populações.
3.4.7 Espectroscopia de Infravermelho por Transformada de Fourier (FTIR)
As análises de FTIR foram realizadas a partir de uma colaboração com o Laboratório de química de Coordenação e Polímeros (LQCPol) do Instituto de Química, UFRN, Natal/RN, sob a responsabilidade do Prof. Dr. Daniel Pontes. 5 mg de cada fração cetônica foram prensados com 5 mg de brometo de potássio (KBr), formando uma pastilha, que foi analisada em um espectrômetro Shimadzu FTIR-8400S. Foram realizadas 20 varreduras na faixa de 400cm-1 a 4000cm-1.
3.5 AVALIAÇÃO DO EFEITO SINÉRGICO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE in
vitro
Para avaliar o efeito sinérgico dos polissacarídeos obtidos das frações cetônicas, foram realizados cinco testes antioxidantes: Capacidade total antioxidante, poder redutor, sequestro de radical superóxido e hidroxila e atividade quelante de ferro.
O Ácido ascórbico (AA) foi utilizado como antioxidante comercial para efeito comparativo. Para cada teste citado, foi realizado uma curva de calibração que relaciona a atividade antioxidante do AA com a sua concentração testada, esta variando de 0,001 a 1 mg/mL. Com isso, foi possível determinar a concentração de ácido ascórbico cuja a atividade corresponde entre 50 a 90% , sendo esta a concentração a ser utilizada na avaliação do efeito sinérgico. Para cada teste, foi determinado uma concentração de AA.
Os resultados foram expressos em efeito aditivo, que corresponde a soma da atividade do AA com a atividade dos polissacarídeos isoladamente (equação 1), ambas determinadas isoladamente e em efeito sinérgico, que corresponde ao valor da atividade antioxidante dos dois componentes (fração e AA) obtido quando estes foram colocados em uma mesma solução.
