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Dissertação de Mestrado
Natal/RN,
fevereiro
de 2019
MATEUS GERMANO SOUZA LIRA
OS PEIXES-ANFÍBIOS DO COMPLEXO Kryptolebias marmoratus (CYPRINODONTIFORMES: CYNOLEBIIDAE) NOS MANGUEZAIS NEOTROPICAIS: HISTÓRIA NATURAL, DISTRIBUIÇÃO GEOGRÁFICA E
MATEUS GERMANO SOUZA LIRA
Os peixes-anfíbios do complexo Kryptolebias marmoratus (Cyprinodontiformes: Cynolebiidae) nos manguezais neotropicais: história natural, distribuição
geográfica e ecologia evolutiva
Defesa de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Sistemática e Evolução da Universidade Federal de Rio Grande do Norte como requisito parcial para obtenção de título de mestre.
Orientador: Prof. Dr. Sergio Maia Queiroz Lima. Co-orientador: Dr. Helder Mateus Viana Espírito-Santo
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Natal – RN Fevereiro de 2019
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas - SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial Prof. Leopoldo Nelson - Centro de Biociências - CB
Lira, Mateus Germano Souza.
Os peixes anfíbios do complexo Kryptolebias marmoratus
(Cyprinodontiformes: Cynolebiidae) nos manguezais neotropicais: história natural, distribuição geográfica e ecologia evolutiva / Mateus Germano Souza Lira. - Natal, 2019.
61 f.: il.
Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Biociências. Programa de Pós-Graduação em
Sistemática e Evolução.
Orientador: Prof. Dr. Sergio Maia Queiroz Lima.
Coorientador: Prof. Dr. Helder Mateus Viana Espírito-Santo.
1. Filogeografia - Dissertação. 2. Conservação - Dissertação. 3. Micro-habitat - Dissertação. 4. Hermafroditismo - Dissertação. I. Lima, Sergio Maia Queiroz. II. Espírito-Santo, Helder Mateus Viana. III. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. IV. Título.
MATEUS GERMANO SOUZA LIRA
OS PEIXES-ANFÍBIOS DO COMPLEXO KRYPTOLEBIAS MARMORATUS (CYPRINODONTIFORMES: CYNOLEBIIDAE) NOS MANGUEZAIS NEOTROPICAIS: HISTÓRIA NATURAL, DISTRIBUIÇÃO GEOGRÁFICA E
ECOLOGIA EVOLUTIVA
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Sistemática e Evolução da Universidade Federal de Rio Grande do Norte, em cumprimento às exigências para obtenção do título de Mestre em Sistemática e Evolução.
Aprovada em: 26 de fevereiro de 2019
COMISSÃO EXAMINADORA
Dr. Felipe Camurugi Almeida Guimarães –
Universidade Federal do Rio Grande do Norte
Dr. Carlos Eduardo Rocha Duarte Alencar –
Universidade do Estado do Rio Grande do Norte
______________________________________________________________________ Dr. Sergio Maia Queiroz Lima –
Universidade Federal do Rio Grande do Norte
Dedico esse trabalho a Elisângela Souza e Silva Lira, por tudo que me foi permitido escolher, ser e seguir.
AGRADECIMENTOS
A colaboração para alcance dos resultados e produtos deste estudo vieram de lugares e pessoas diferentes, em proporções diferentes, que somados, me possibilitou tanto na produção dos resultados, como também em um aprendizado tão importante quanto.
Agradeço imensamente ao meu orientador Sergio Maia Queiroz Lima, pelo comprometimento em me orientar e fazer dessa experiência uma grande lição de aprendizagem, me oferecendo construções e desconstruções de ideias e pensamentos. Agradeço além de tudo, a paciência com meu ritmo produtivo, a compreensão pelos anseios corriqueiros, o incentivo em períodos de desânimo e inquietação, pelas conversas não academicistas e por ter sido um fiel escudeiro em todas as etapas dessa dissertação.
Agradeço também ao meu co-orientador Helder Matheus Viana Espírito-Santo, por me acolher nessa viagem pelos manguezais e poder me apresentar um mundo de possibilidades. Sou grato pelo apoio em todas a instâncias, profissionais e psicológicas, além de poder tê-lo como amigo e parceiro nas atividades de campo.
Aos colaboradores e peças fundamentais para que esse estudo fosse concretizado, o meu muito obrigado, em especial a Waldir Miron Berbel-Filho, que embarcou nesse mundo de lama afim de compreender melhor a biologia desses pequenos dos manguezais. Agradecer a Profª Dra. Sonia Consuegra Del-Olmo da Swansea University, Reino Unido e o Dr. Andrey Tatarenkov, pelo apoio com os dados moleculares. Ao professor Caliman por disponibilizar o Caiaque para uso em campo.
A Ana Beatriz Benneman, Átila Dantas e Yuri Abrantes por sempre estarem comigo em campo e por entender minhas preocupações e chatices e, acima de tudo, por serem os melhores companheiros de atividades e confidentes da vida.
A todos os amigos e amigas que depositaram confiança e positividade sobre meus esforços. A todos os familiares, principalmente minha Mãe, Elisângela Souza e Silva Lira, que me ofereceu o maior suporte de todos. Não tenho como descrever o quão importante cada etapa dessa experiência foi para minha ontologia.
RESUMO
A família Cynolebiidae, pertencente a ordem Cyprinodontiformes, conhecida pelos peculiares peixes-anuais e não anuais, compõe um grupo diversificado de pequenos peixes que vivem em ambientes aquáticos temporários ou perenes rasos. Com cerca de 350 espécies válidas e ampla distribuição geográfica em diversos micro-habitats. Dentre as linhagens não-anuais está um grupo monofilético do gênero Kryptolebias, composta por sete espécies nominais válidas, ocorrendo da Flórida nos Estados Unidos a Santa Catarina no Brasil. Dentro do gênero, destacamos o grupo de espécies K. marmoratus (K.
hermaphroditus, K. marmoratus e K. ocellatus) exclusivas de regiões estuarinas. Essas
linhagens apresentam uma confusa taxonomia, com diagnose e distribuição geográfica incerta, devido à incompatibilidade de informações morfológicas e moleculares. Portanto, uma ampla amostragem ao longo dos manguezais da costa brasileira foi feita nos últimos anos para levantamento de dados moleculares, morfológicos e ecológicos, afim de determinar quais espécies ocorrem no país e sua distribuição geográfica, assim como fornecer dados ecológicos originais destas linhagens. Foram amostradas localidades registradas em artigos e banco de dados online, inclusive a localidade-tipo, assim como novos registros, incluindo algumas áreas protegidas. Todas as coletas foram feitas de forma ativa, com peneiras de mão, além de coletas com esforço padronizado em parcelas delimitadas, aferições de dados ambientais e fauna acompanhante, fornecendo informações ecológicas. Com os dados obtidos, as áreas de ocorrência das espécies do complexo K. marmoratus para o Brasil foram ampliadas. O limite do clado Sul (K.
hermaphroditus) foi expandido em cerca de 300 km ao sul, na ESEC Jureia-Itatins em
São Paulo, e do clado Central de aproximadamente 1.590 km para o sul, na bacia do rio Marajó, no Pará. Novos registros foram feitos além do Pará, no Piauí, Ceará, Bahia, Sergipe. As populações de K. hermaphroditus que apresentaram indivíduos com fenótipo masculino, só foram registrados em localidades do Sudeste que apresentavam dados abióticos extremos, o que levanta a hipótese de que a perda da integridade ambiental possa ativar gatilhos no desenvolvimento que resultem em machos primários. As supostas lacunas de ocorrência nos manguezais do Brasil mostram que de fato a espécie apresenta ampla distribuição geográfica, mas ocupa um micro-habiat especifico, composto de poças rasas, difíceis de serem acessadas e geralmente negligenciadas por ictiólogos. Esses são os primeiros dados ecológicos padronizados de K. hermaphroditus, uma espécie que por suas peculiaridades reprodutivas e fisiológicas apresenta elevado potencial para estudos
experimentais e ambientais. Os dados moleculares apontaram para uma maior diversidade genéticas nas populações nordeste, e um extrema homogeneidade no Sudeste com um único haplótipo, além de indicar que os indivíduos do Pará estão inseridos no clado Central, indicando a presença de duas linhagens distintas do complexo K. marmoratus no Norte do Brasil. Foram identificadas três linhagens na costa brasileira associadas com os regimes de marés (norte macrotidal, nordeste mesotidal, e sudeste microtidal). Assim, as diferenças morfológicas encontradas em estudo prévio podem indicar uma separação de populações, ao invés de espécies, entre o sudeste e nordeste, que pode estar realçada pela reprodução individual peculiar deste grupo de vertebrados.
Palavras-chave: Kryptolebias hermaphroditus, hermafroditismo, conservação, micro-habitat, filogeografia, ecologia.
ABSTRACT
The Cynolebiidae family, belonging to the order Cyprinodontiformes, known for the peculiar annual and non-annual fish, make up a diverse group of small fish that live in temporary or shallow perennial aquatic environments. With about 350 valid species and wide geographical distribution in various microhabitats. Among non-annual strains is a monophyletic group of the genus Kryptolebias, composed of seven valid nominal species, occurring from Florida in the United States to Santa Catarina in Brazil. Within the genus, we highlight the group of species K. marmoratus (K. hermaphroditus, K. marmoratus and K. ocellatus) exclusive of estuarine regions. These strains have a confusing taxonomy, with uncertain diagnosis and geographical distribution, due to the incompatibility of morphological and molecular information. Therefore, a large sampling along the mangroves of the Brazilian coast has been done in the last years to survey molecular, morphological and ecological data, in order to determine which species occur in the country and their geographical distribution, as well as to provide original ecological data of these strains. We sampled localities recorded in articles and online databases, including the standard locality, as well as new records, including some protected areas. All collections were actively performed with hand sieves, as well as collections with standardized effort in delimited plots, environmental data measurements and accompanying fauna, providing ecological information. With the obtained data, the areas of occurrence of the species of the K. marmoratus complex for Brazil were expanded. The southern clade (K. hermaphroditus) boundary was expanded about 300 km south at the ESEC Jureia-Itatins in São Paulo and the Central clade approximately 1,590 km south at the Marajó river basin in Pará. New records were made beyond Pará, Piauí, Ceará, Bahia, Sergipe. K. hermaphroditus populations that presented individuals with male phenotype were only recorded in southeastern localities that presented extreme abiotic data, which raises the hypothesis that the loss of environmental integrity may trigger developmental triggers that result in primary males. The alleged gaps in the Brazilian mangroves show that the species does indeed have a wide geographical distribution, but occupies a specific microhabitat, composed of shallow pools that are difficult to access and often neglected by ichthyologists. These are the first standardized ecological data of K. hermaphroditus, a species that due to its reproductive and physiological peculiarities has high potential for experimental and environmental studies. The molecular data pointed to a greater genetic diversity in the northeast populations, and an extreme homogeneity in the southeast with a single haplotype, besides indicating that the
individuals from Pará are inserted in the Central clade, indicating the presence of two distinct K. marmoratus strains. in northern Brazil. Three strains on the Brazilian coast associated with tidal regimes (north macrotidal, northeastern mesotidal, and southeast microtidal) were identified. Thus, the morphological differences found in a previous study may indicate a separation of populations, rather than species, between the southeast and northeast, which may be enhanced by the peculiar individual reproduction of this group of vertebrates.
Keywords: Kryptolebias hermaphroditus, hermaphroditism, conservation, micro-habitat, phylogeography, ecology.
Sumário
1. INTRODUÇÃO ... 14
1.1 - Manguezais do Atlântico Leste...14
1.2 - Histórico taxonômico e distribuição...15
1.3 - Estudos ecológicos...18 2. OBJETIVOS ... 21 2.1 - Objetivo geral ... 21 2.2 - Objetivos específicos ... 21 3. MATERIAIS E MÉTODOS ... 22 3.1 - Dados geográficos ... 22 3.2 - Dados moleculares ...23 3.3 - Dados ecológicos ...25 4. RESULTADOS ...28 4.1. Distribuição geográfica ... 28 4.2 – Dados moleculares ... 33 4.3 Dados Ecológicos ... 40 4.3.1 - Habitats ... 40 4.3.2 – Parâmetros ambientais ... 41 4.3.3 – Dieta ... 44 4.3.4 – Predação ... 45 4.3.5 – Fauna acompanhante ... 45 4.3.6 – Densidade populacional ... 48 5. CONSERVAÇÃO ... 49 6. DISCUSSÃO ...51 7. CONCLUSÕES ...56 8. REFERÊNCIAS ... 57
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Um exemplo de como foi inferido a distância da localidade amostrada até o mar. Utilizamos a função régua no Google Earth Pro, perfazendo o possível trajeto do peixe nos canais até a desembocadura do estuário, podendo ser numa baía ou no próprio mar ...23
Figura 02. Disposição das parcelas 7x7 m em dois manguezais do Rio Grande do Norte. As parcelas estão representadas por quadrados verdes e localizadas em porções a jusante, intermediária e a montante. Imagens produzidas no Google Earth Pro ...27
Figura 3. Distribuição das localidades para as espécies do complexo K. marmoratus utilizadas nesse estudo. São diferenciados no mapa, as novas ocorrências e as ocorrências já conhecidas, como também as localidades na qual os indivíduos foram identificados com marcadores moleculares. Na Tabela 1 fornecemos informações mais detalhadas sobre as localidades. As linhas finas representam as ecorregiões marinhas (sensu Spalding et al., 2007), e o verde, representa os manguezais das Américas ...32
Figura 4. Árvore filogenética de máxima verossimilhança (Maximum Likelihood) com Coi do complexo Kryptolebias marmoratus (Tatarenkov et al., 2017), além sequências originais desse estudo. A faixa rosa mostrando o agrupamento da localidade do Pará com as linhagens do clado Central sensu Tatarenkov et al. (2017) ...34
Figura 5. Rede de haplótipos do gene mitocondrial citocromo oxidase I para as localidades dos clados Central e Sul do complexo Kryptolebias marmoratus nos manguezais neotropicais ...37
Figura 6. Mapas com mostrando os resultados para as análises no Geneland, exibindo em (a) a estimativa dos limites para as populações recuperadas, onde os pontos pretos correspondem as localidades amostradas e (b-d) é exibido a probabilidade posterior de cada localidade está inserida em um cluster (zonas tidais), onde as áreas claras estão associadas a alta probabilidade dessas localidades pertencer a um determinado cluster ..39
Figura 7. - Fotos da maioria das localidades amostradas durante as coletas entre 2017 e 2018, mostrando a diversidade de habitats que as espécies do complexo K. marmoratus ocorrem. (A) Luís Correia – Piauí; (B) Jericoacoara, Ceará; (C-D) Guamaré, Rio Grande do Norte; (E) Ceará-Mirim, Rio Grande do Norte; (F-G) Curimatáu, Rio Grande do Norte; (H) Maracaípe, Pernambuco; (I-J) Coqueiral, Espírito Santo; (K-L) Santa Cruz, Espírito
Santo; (M) Ilha do Fundão, Rio de Janeiro; (N) Piracão, Rio de Janeiro; (O) Picinguaba, São Paulo e (P) Peruíbe, São Paulo ...43
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. –Localidades conhecidas e de nova ocorrência para espécies do clado Central e Sul. As siglas representam as localidades. Para as populações que foram utilizados marcadores moleculares para delimitação filogeográficas e de diversidade genética, é informado o número de sequências utilizadas. As ecorregiões marinha se basearam no estudo do Spalding et al. (2007). As referências mostram de qual estudo foi retirada as informações de Coi e das coordenadas, além de mostrar o que estar sendo apresentado nesse estudo. Os números sobrescritos se referem respectivamente às seguintes Unidades de Conservação: 1- Parque Nacional de Jericoacoara; 2 – Reserva Extrativista de Canavieiras; 3 – Área de Proteção Ambiental de Guapimirim; 4 – Parque Estadual da Serra do Mar – Núcleo Picinguaba; 5 – Estação Ecológica Juréia-Itatins ...29
Tabela 2. – Índices de diversidade genética para as populações do clado Central (sobrescrito C) e Sul (sobrescrito S). Sendo N = número de sequências por localidade, H = número de haplótipos, S = número de sítios polimórficos, h = diversidade haplotípica, π = diversidade nucleotídica e testes de neutralidade FS Fu e D Tajima ...35 Tabela 3. - Distribuição dos haplótipos para as populações utilizadas na reconstrução filogenética, além dos novos registros proposto por esse estudo. As barras acinzentadas correspondem as quebras populacionais das localidades do Brasil, onde o cinza mais claro representa a população da região macrotidal (Pará), cinza intermediário as populações da região mesotidial (Nordeste) e o cinza mais escuro, as populações da região microtidal (Sudeste) ...36
Tabela 4. - AMOVA para as linhagens do Brasil, utilizando locos microssatélites para três níveis de estruturação populacional hierárquico ...38
1. INTRODUÇÃO
1.1 Manguezais do Atlântico Leste
Os manguezais estão localizados em regiões intertidais, formado entre zonas transicionais terrestres e marinhas, com distribuição latitudinal restrita para regiões tropical e subtropical do planeta (Giri et al. 2011, López-Angarita et al. 2016).
Nos manguezais, encontram-se uma grande diversidade de espécies, além de suas áreas estuarinas e de águas rasas servirem como berçário para muitas espécies de peixes e invertebrados (Lacerda et al. 2002). Ocupa uma área de aproximadamente 17 x 106 ha em todo globo e 4.5 x 106 ha no continente americano (Ferreira et al. 2015, Blaber & Barletta 2016).
Nas Américas, as florestas de mangue estão distribuídas do sul dos Estados Unidos ao sul do Brasil, abrangendo a Costa do Caribe e do Atlântico, além de uma faixa restrita para a costa do Pacífico (Lacerda et al. 2002). Para o Brasil estima-se um total de 1.114.398 ha, correspondendo a 7,1% da cobertura total do ecossistema pelo globo (Magris & Barreto 2010).
O regime de marés na costa brasileira exibe uma variação decrescente em relação à Linha do Equador, oscilando entre um e sete metros, e estão divididas em três categorias relacionadas com a amplitude de marés (Lacerda et al. 2002).
A costa macrotidal, que corresponde as regiões com amplitude de maré acima de quatro metros, se estendem entre a foz do rio Oiapoque, no cabo Orange no Amapá, à planície de encosta do rio Parnaíba no Piauí; a costa mesotidal, com variações entre dois e quatro metros, entre a foz do rio Parnaíba e o sul da Bahia; finalizando com a costa microtidal, que possui as variações mais baixas de amplitude maré, com marés abaixo de dois metros, localizada entre o sul da Bahia e o Chuí no Rio Grande do Sul (Knoppers et al. 1999, Magris & Barreto 2010).
Os manguezais do Brasil, abrangem regiões de diferentes regimes climáticos e de flora diversa, perfazendo sistemas tropicais áridos e úmidos, como nos manguezais do Norte e Nordeste, que incluem a Amazônia, além dos fiordes do Sul (Blaber & Barletta 2016).
Nos manguezais do Norte, na região macrotidal, teremos um clima equatorial quente com grande pluviosidade. Formada por uma paisagem litorânea composta por manguezal e algumas partes de floresta amazônica com alta sedimentação provinda da bacia do Amazonas (Anthony et al. 2010, Fernandez et al. 2019).
No Nordeste, correspondente a região mesotidal, teremos drenagens menores, com exceção do rio São Francisco, uma plataforma continental arenosa e um clima semi-árido, o
que reflete na baixa precipitação. Alto adensamento populacional e nas regiões estuarinas, intensa produção de camarões (Fernandez et al.2019).
As adaptações da fauna e da flora dentro do ecossistema manguezal possuem uma grande variação, como ampla tolerância as variantes ambientais, além da capacidade de sobrevivência em diferentes ambientes, que vão de poças rasas salobras a grandes canais de fluxo marinho (Magris & Barreto, 2010).
A fragmentação do ecossistema manguezal, vem sido causada através da conversão desse ambiente para fins de atividades de aquicultura, agricultura, desenvolvimento urbano e turismo (Giri et al 2010). Mais de 50% dos manguezais mundial foram removidos até a última década e, recentemente, foi estimado que a taxa de desmatamento global é de até 0,39% ao ano, a partir dos anos 2000 (Magris & Barreto, 2010, Hamilton & Fries 2018).
1.2 Histórico taxonômico e distribuição
A família Cynolebiidae, anteriormente conhecida como Rivulidae, pertence à ordem Cyprinodontiformes, conhecida pelos peixes anuais que apresentam ciclo de vida curto em ambientes temporários e ovos de resistência (Costa 2009). Essa família abrange um grupo diversificado de pequenos peixes (entre 30 e 100 mm de comprimento total) com acentuado dimorfismo sexual, no qual os machos podem ter vistosos padrões de coloração e nadadeiras alongadas (Costa 1998).
Com cerca de 350 espécies válidas descritas e ampla distribuição geográfica em diversos micro-habitats aquáticos continentais, estes peixes popularmente conhecidos como killifishes são geralmente encontrados em córregos e pântanos rasos de água doce, com poucas espécies encontradas em águas salobras (Costa 2011, 2013).
Além do mais, a família possui espécies anfíbias nos representantes de manguezal, que são respiradores bimodais, com capacidade de respirar parcial ou totalmente fora d’água (Turko & Wright 2015).
Estão inseridas em duas subfamílias, Kryptolebiatinae e Rivulinae (Costa, 2009, 2011 e 2013; Turko & Wright 2015). Na subfamília Kryptolebiatinae, estão os cinolebíideos não-anuais, dentre estes os representantes do gênero Kryptolebias Costa, composto por sete espécies nominais válidas. Esse gênero abriga a maior diversidade de habitats, de pequenos riachos correntes à manguezais, além de diversificados modos reprodutivos, representadas por espécies dioicas à hermafroditas endocruzantes (Costa et al. 2010).
Com ocorrência da Flórida nos EUA a Santa Catarina no Brasil, as espécies de água doce são dioicas e possuem distribuição geográfica restrita e, com exceção da pouco conhecida
K. campelloi do Pará (Costa 1990), as demais espécies estão ameaçadas de extinção, como K. brasiliensis (Valenciennes, 1821) e K. gracilis, Costa 2007, ambas do Rio de Janeiro,
classificadas como criticamente ameaçadas (Brasil 2014).
Enquanto as espécies estuarinas K. hermaphroditus, Costa 2011, K. marmoratus, Poey, 1880 e K. ocellatus (Hensel, 1868), que apresentam diferentes graus de hermafroditismo, estão mais amplamente distribuídas (Vermeulen & Hrbek 2005; Costa 2011, 2009; Taylor 2012) ao longo dos estuários do Atlântico Oeste nas Américas (Costa, 2013), foram classificadas como quase ameaçadas no Brasil (ICMBio).
Com a primeira descrição de uma espécie atualmente atribuída ao gênero Kryptolebias Costa datada do século XIX, anteriormente conhecido como Rivulus, um controverso histórico nomenclatural e taxonômico para as espécies estuarinas marcam os 150 anos de estudos das espécies do grupo K. marmoratus (Lira et al. 2015, Berbel-Filho et al. 2016), resultando em uma taxonomia confusa e com limites de distribuição geográfica imprecisos (Tatarenkov et al. 2017).
Desde a descrição de Hensel para Rivulus ocellatus (= Kryptolebias ocellatus) em 1868, a partir de um único espécime coletado no Rio de Janeiro, os problemas em relação a determinação taxonômica desse gênero geraram algumas dúvidas, principalmente entre os anos de 1906 e 1984, quando foram sugeridas as primeiras proposições de sinonímias para as espécies estuarinas (Costa. 2006).
Seegers (1984), determinou em um estudo taxonômico, a identidade de K. ocellatus, o qual considerou coespecífico de K. marmoratus, partindo pelo princípio da prioridade cronológica, sugerindo que K. marmoratus fosse uma subespécie de K. ocellatus, esse último descrito doze anos antes que sua espécie-irmã. Nesse mesmo estudo descreveu uma nova espécie para o gênero, a partir de espécimes coletados no Brasil e criados em aquário, no caso,
K. caudomarginatus (Costa 2006, 2011).
Na década de 90, alguns autores discutiram sobre a identidade taxonômica dessas espécies afim de esclarecer os possíveis problemas que contribuíam para esse empasse taxonômico (e.g. Lazara, 1990, Seegers, 1991, Lazara & Smith, 1991, 1994, Costa, 1994). Atualmente algumas espécies estão sinonimizadas, e embora haja três estudos taxonômicos, incluindo descrições e redescrições, acarretando em mudanças na diagnose das espécies a delimitação das mesmas permanece em aberto.
Dentre as principais publicações taxonômicas recentes se destacam: redescrição K.
ocellatus e K. caudomarginatus (Costa, 2006), descrição de K. hermaphroditus e realocação de K. caudomarginatus para K. ocellatus (Costa, 2011), além de um trabalho que sugere novos
dados morfológicos e de distribuição geográfica de K. marmoratus, K. hermaphroditus e K.
ocellatus no Brasil (Costa, 2016).
No entanto, a taxonomia e distribuição geográfica do complexo K. marmoratus ainda é controversa, principalmente pela dificuldade na identificação morfológica das espécies estuarinas nos manguezais na América e discordância com os dados moleculares (Tatarenkov
et al. 2017).
Inicialmente descrita para o Sudeste do Brasil (Costa 2009), K. hermaphroditus foi registrada nos estuários de Mata Atlântica, dos rios Ceará-Mirim e Curimataú, ambos no Rio Grande do Norte, além de registros em coleções em Pernambuco e Alagoas (Lira et al. 2015), como também para o Pará (Guimarães-Costa et al. 2017).
Durante muito tempo a espécie conhecida basicamente pelo fenótipo hermafrodita no
Brasil foi considerada como K. marmoratus, visto que a maior parte dos caracteres diagnósticos em cinolebiídeos estão relacionados ao padrão de colorido dos machos. Até que Tatarenkov et
al. (2009) mostrou que os exemplares do Brasil compunham uma espécie bem definida
molecularmente, restringindo K. marmoratus aos manguezais da Flórida e do Caribe.
Essa espécie hermafrodita do Brasil, previamente reconhecida como K. ocellatus na verdade não havia sido descrita em decorrência de uma confusão dos tipos de K. ocellatus com
K. caudomarginatus, e a espécie foi formalmente descrita como K. hermaphroditus (Costa
2011). No entanto, recentemente Costa (2016) atribuiu os peixes coletados nos manguezais do nordeste do Brasil (Rio Grande do Norte, Pernambuco e Alagoas) como K. marmoratus, expandindo sua distribuição geográfica até Alagoas.
Entretanto essa diagnose se baseou em poucos caracteres morfológicos, principalmente
de padrão de colorido e em supostas diferenças de micro-habitat (Costa 2016). Contudo, ainda existe uma grande incongruência em relação a delimitação taxonômica, distribuição geográfica e padrões dispersivos destas espécies de manguezais (Avise & Tatarenkov 2015).
De acordo com dados moleculares (Tatarenkov et al. 2017) o táxon que ocorre no nordeste brasileiro é o mesmo do Sudeste (K. hermaphroditus), discordando dos dados morfológicos de Costa (2016).
Nesse amplo estudo filogeográfico, indicaram três linhagens genéticas distintas no complexo K. marmoratus: o clado Norte, abrangendo populações da Flórida, Bahamas e Caribe
Ocidental; o clado Central, ocupando o sul e sudeste do Caribe e as Grandes Antilhas e, o clado Sul, que incluí as regiões nordeste e sudeste do Brasil, mostrando incompatibilidade de informações morfológicas e moleculares para as linhagens brasileiras.
Até então, só existia ocorrência para essas espécies estuarinas de Kryptolebias para o Brasil nas regiões nordeste, sudeste e sul. Porém recentemente um exemplar coletado na praia de Ajuruteua, no Pará, estabelecendo o primeiro registro para a região Norte do país (Guimarães-Costa et al. 2017).
Esse exemplar foi identificado como K. hermaphroditus baseado em dados morfológicos e moleculares (gene mitocondrial 16S), além de reconhecer uma lacuna amostral entre o Rio Grande do Norte e o Pará (Guimarães-Costa et al. 2017).
Além do mais, K. hermaphroditus foi descrita como uma espécie composta por uma população de “fêmeas” hermafroditas que realizam autofecundação, condição que é considerada exclusiva (junto com K. marmoratus) entre os vertebrados (Costa 2010; 2011), entretanto, recentemente foi coletado um espécime com fenótipo masculino no manguezal do rio Ceará-Mirim, Rio Grande do Norte (Berbel-Filho et al. 2016) e alguns no Rio de Janeiro e Espírito Santo (Costa 2016).
Esses resultados mostram como o conhecimento dessas linhagens de manguezais ainda é incipiente, e que a variabilidade morfológica, genética e ecológica da espécie precisa ser melhor explorada. O registro recente em diversos estuários do nordeste do Brasil indica carência de dados, e sua suposta ausência na costa da Bahia a Sergipe, e do Pará ao Rio Grande do Norte, pode ser um artefato amostral, e não uma barreira que separaria as supostas espécies-irmãs.
Sem falar que as bacias costeiras do Nordeste do Brasil apresentam ictiofauna parcialmente conhecida, tanto pelas amostragens insuficientes na escala regional (Rosa et al. 2003; 2004; Paiva et al. 2014), quanto local (microhabitats), o que torna o número de espécies subestimado (Langeani et al. 2009). Isso é mais preocupante se considerarmos que no Brasil, os peixes de água doce representam o grupo com o maior número de espécies ameaçadas (Brasil 2014), onde os cinolebíideos são as espécies mais ameaçadas.
1.3 Estudos ecológicos
Para K. marmoratus, representado pelo clado Norte no estudo de Tatarenkov et al. (2017), foi relatado nos poucos trabalhos ecológicos realizados (ver Taylor 2012) uma íntima ligação com a vegetação predominante de mangue vermelho, Rhizophora mangle L., além de associação com mangue preto Avicennia nitida Jacq (Richards et al. 2011).
Essa associação é atribuída à formação de micro-habitats específicos nas áreas de manguezal onde predominam essas espécies arbóreas, como poças rasas, estagnadas e intermitentemente secas, vastas áreas alagadas, valas ou canais, e até o acúmulo de água dentro ou sob troncos, assim como na serrapilheira, cocos e resíduos sólidos. Além de estarem associados a tocas de caranguejos, mais especificamente de duas espécies, Cardisoma
guanhumi (Lattreille), popularmente conhecido como guaiamú, e do caranguejo-uçá Ucides cordatus (Linnaeus) (Taylor, 2012).
É atribuído o hábito fossorial para K. marmoratus, que além de utilizar tocas de caranguejos maiores, como os já citados, podem refugiar-se em períodos de baixa-maré, em tocas de caranguejos menores, como Uca spp., encontrados em poças de águas rasas, que são de difícil amostragem e podem findar subestimando o uso dessas tocas e a densidade populacional nesses micro-habitats (Davis et al. 1990, Taylor 2008, 2012).
O grande interesse pelas espécies de Kryptolebias¸ se iniciou com os trabalhos de Harrington (1961), que reportou primeiramente a capacidade autofecundante da espécie K.
marmoratus, tornando-a um excelente modelo para estudos experimentais, sendo utilizado
atualmente por diversas áreas da ciência, como carcinogênese, teratogênese, ecotoxicologia, mutagênese e fisiologia (Costa 2006).
No entanto, a maioria dos estudos focaram nessa espécie do hemisfério norte, e os estudos das demais espécies do gênero são basicamente sobre taxonomia e filogeografia (e.g. Costa 2004, 2006, 2011, 20016; Tatarenkov et al. 2009, 2012, 2017, 2018). Em contraste, são ausentes ou pouco explorados dados básicos sobre a processos evolutivos e ecológicos das demais espécies do gênero (Costa, 2010; Taylor 2012).
Taylor (2012) reuniu informações de anos de observações sobre a história natural e ecologia do grupo K. marmoratus, focado principalmente nas espécies do grupo que se encontram na América do Norte e Central. Entretanto, não houve nenhum estudo ecológico com a espécie-irmã K. hermaphroditus, além de redescrições e notas breves sobre habitat e distribuição geográfica (e.g. Costa 2006, 2011 e 2016).
Portanto, os resultados obtidos com esse estudo contribuirão para a indicação dos limites geográficos paras as linhagens do complexo K. marmoratus nos manguezais neotropicais, como também fornecer informação sobre a autoecologia de K. hermaphroditus, além de reunir dados moleculares que auxiliarão no entendimento da diversidade genética entre as populações,
indicando quais populações são geneticamente mais diversas, nos mostrando caminhos para a elaboração de estratégias conservacionistas para as espécies do complexo.
Além do mais, com os resultados obtidos pretendemos esclarecer as discrepâncias taxonômicas e identificar as lacunas de conhecimento existentes entre os recentes estudos taxonômicos (Costa 2016) e moleculares (Tatarenkov et al. 2017), permitindo entender melhor a história natural, distribuição geográfica, ecologia e diversidade genética dos Kryptolebias de manguezal.
2. OBJETIVOS
2.1– Objetivo geral
Realizar um estudo autoecológico, com dados recém coletados e de coleções, afim de preencher as lacunas existentes sobre os limites geográficos, biologia e padrões microevolutivos, do complexo de espécies K. marmoratus nos manguezais neotropicais, além de indicar as populações de maior diversidade genética para as linhagens neotropicais.
2.2– Objetivos específicos
2.2.1. Estabelecer os limites geográficos da distribuição das espécies afim de identificar
as possíveis barreiras e lacunas existentes entre as linhagens, como também indicar novas áreas de ocorrência.
2.2.2. Estabelecer o número de populações e quais possuem maior diversidade genética
no Brasil, avaliando os registros em Unidades de Conservação, relacionando o nível de ameaça das espécies com o grau de proteção, além de indicar populações mais diversificadas geneticamente para conservação.
2.2.3. Descrever a história natural do complexo K. marmoratus, objetivando uma
comparação ecológica e evolutiva encontrada nas linhagens dos clados Norte, Central e do Sul, com dados fornecidos pela literatura, além dos coletados.
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1. Dados geográficos
Foram feitas coletas em manguezais do Norte, Nordeste, Sudeste e Sul do Brasil, baseando-se em localidades já amostradas, disponíveis na literatura e em bancos de dados online (SpeciesLink, NeoDat, GBif).
As coletas no Sul e Sudeste foram realizadas durante os meses de agosto e setembro de 2017, com recursos da National Geographic Society, através do projeto Sex in the mangroves:
epigenetic versus genetic diversity in three fish species with different mating systems living in unstable environments (# 46116), aprovado em nome da Dra. Sonia Consuegra Del-Olmo da
Swansea University, Reino Unido. Nessa expedição, foram realizadas coletas nos estados de Santa Catarina, Paraná, São Paulo, Rio de Janeiro e Espírito Santo, onde ocorrem duas espécies exclusivas de manguezal, K. hermaphroditus e K. ocellatus, as vezes em sintopia.
Entre fevereiro de 2017 e novembro de 2018, foram realizadas coletas adicionais, no intuito de cobrir as principais lacunas amostrais em manguezais de outros estados, cobrindo a lacuna do litoral Norte do Brasil, do Pará até o norte do Rio Grande do Norte (Macau e Guamaré), incluindo Piauí e Ceará, além do litoral leste, de Sergipe a Bahia (Canavieiras) (Tabela 1).
As coletas foram feitas através de captura ativa, com redes de mão de malha fina (1mm) e medindo 0.6 x 0.45 m. O material coletado está depositado na coleção ictiológica da Universidade Federal do Rio Grande do Norte.
As medições para estabelecer a distância que as localidades estavam do mar e dos canais adjacentes, foram feitos através do Google Earth Pro, utilizando a ferramenta “régua” na função “caminho”, onde um trajeto similar a possível movimentação do peixe foi replicada do ponto amostrado até a desembocadura da bacia no mar ou baía (Fig. 1).
Com todos os pontos georreferenciados e plotados em um mapa e identificados através do gene mitocondrial citocromo oxidase I (Fig.2), conseguimos estimar os novos limites de distribuição entre as espécies do clado Central e do Sul, como também expandir os limites de ocorrência no Brasil. Isso também nos possibilitou indicar quais localidades estão dentro de unidades de conservação e inferir sobre novas propostas conservacionistas paras essas áreas.
Figura 1. Um exemplo de como foi inferido a distância de cada localidade do complexo Kryptolebias
marmoratus da costa brasileira até o mar. Utilizamos a função régua no Google Earth Pro, perfazendo o possível
trajeto do peixe nos canais até a desembocadura do estuário, podendo ser numa baía ou no próprio mar.
3.2 Dados moleculares
Removemos uma porção do músculo do flanco direito e de nadadeiras de alguns exemplares por localidade para análises moleculares. Os indivíduos menores, foram alocados por inteiro em criotubos contendo etanol 99,9 % P.A. e mantidos em freezer nas caixas da coleção de tecidos do Laboratório de Ictiologia Sistemática e Evolutiva da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (TIUFRN).
Seguindo a metodologia anteriormente utilizada por Tatarenkov et al. (2009, 2011, 2017), foi realizada a extração do DNA genômico e a amplificação do gene mitocondrial citocromo oxidase I. Os dados moleculares foram gerados em parceria entre a Universidade Federal do Rio Grande do Norte e duas instituições internacionais, conhecidas por possuir grande experiência no estudo com Kryptolebias, através do projeto “Evolução, história natural e conservação de peixes rivulídeos não-anuais do gênero Kryptolebias (Actinopterygii:
Cyprinodontiformes: Rivulidae)”, sendo elas: a Swansea University (SU), País de Gales (Dra. Sonia Consuegra Del-Olmo e o Dr. Carlos Garcia de Leaniz) e a University of California Irvine (UCI), Estados Unidos (Dr. Andrey Tatarenkov).
No total foram utilizadas sequências de 187 indivíduos das localidades amostradas, juntamente com outras dos clados Central e Sul de outros estudos do gênero (Tatarenkov et al., 2012, 2017). Além disso, seis sequências de K. marmoratus, como representantes do clado Norte (Bahamas e Belize), além de três sequências de K. ocellatus (Rio de Janeiro), estes últimos usados como grupo externos, foram utilizados na construção filogenética (localidades essas que não foram incluídas no mapa).
Tanto na filogenia como nas demais análises filogeográficas foram utilizadas 30 sequências de espécimes do complexo K. marmoratus correspondentes ao clado Central (Cuba, Porto Rico, Panamá, Aruba e Bonaire), juntamente com 145 sequências de 25 localidades amostradas no Brasil, 10 destas são dados originais de Coi (ver mapa).
Para determinação da identidade (clados), diversidade e estrutura populacional (populações de maior diversidade genética) utilizamos o gene mitocondrial Coi (codificador da subunidade I da citocromo oxidase) do complexo K. marmoratus para as localidades no Brasil (ver legenda da Fig1).
Sendo assim, inicialmente foi feita a identificação das espécies por via molecular usando a delimitação de Tatarenkov et al. (2017), atribuída por meio de uma filogenia molecular de máxima verossimilhança, alinhados com o algoritmo Cluster W no programa MEGA 7 (Kumar
et al.2016), para inferir a qual clado pertencia cada indivíduo.
Para as análises de diversidade genética, utilizamos o programa ALERQUIM 3.5 (Excoffier & Lischer, 2010) para calcular o número de haplótipos (H), de sítios polimórficos (S), os índices de diversidade haplotípica (h) e nucleotídica (π), além dos testes de neutralidade D de Tajima e FS de Fu para detectar desvios de estabilidade populacional, para cada localidade. Também foram testadas algumas hipóteses de estruturação através de uma Análise de Variância Molecular (AMOVA).
Utilizamos o programa POPART (Leigh & Bryant, 2015) para gerar a rede de haplótipos, que possibilitou entender a distribuição dos haplótipos, além de mostrar os passos mutacionais entre os mesmos.
Estes testes foram feitos no intuito de determinar se a variância molecular é melhor explicada de acordo com a taxonomia (dois clados para o Brasil, Clado Central e Sul) ou pelas três regiões de elevação da maré ao longo da costa brasileira sugeridas Knoppers et al. (1999) (macrotidal. mesotidal e microtidal).
Por fim, usamos o pacote Geneland (Guillot et al. 2005) através do programa R Development Core Team (2008) para determinar o número de linhagens na costa brasileira, e verificar se as quebras genéticas condizem com os limites das regiões tidais proposta por Knoppers et al. (1999). Determinamos um número populacional variando de um mínimo de duas e máximo de dez populações, para cinco corridas independentes. Cada corrida consistiu de 200 interações de burnin, seguidas de 10.000.000 interações amostradas, exibidas a cada 1.000 interações.
3.3 Dados ecológicos
Para a coleta dos dados ecológicos, tentamos reunir informações que nos possibilitassem comparações com os estudos realizados com K. marmoratus (clado Norte) (Taylor 2012). Nas localidades do Nordeste, Sudeste e Sul, foram medidas variáveis ambientais com auxílio de medidores portáteis, e sempre que possível foram feitas parcelas padronizadas para estimativas demográficas, de fauna acompanhante e caracterização do micro-habitat (tocas de caranguejos, tamanho da área alagada, etc), que mediam 7m x 7m (49 m²).
Porém, na região Sudeste, só foi possível executar essa amostragem padronizada em uma localidade (manguezal do rio Piracão, Espírito Santo), devido ao tempo curto. Entretanto, na maioria das localidades conseguimos aferir os dados abióticos paras as localidades de Coqueiral (COQ) e Aracruz (PIR), no Espírito Santo, manguezal do rio Iriri, em Magé (IRI), manguezal da Ilha do Fundão, Divinéia (FUN), manguezal do rio Piracão, Guaratiba (GUA), situadas no Rio de Janeiro, além do manguezal do rio Fazenda, em Picinguaba (PIC) e no manguezal na Estação Ecológica Juréia-Itatins, em Perúibe (JUR), ambas no estado de São Paulo (ver Tabela 1 para as localidades).
Para o Nordeste, dois manguezais do Rio Grande do Norte, sendo eles o manguezal do rio Ceará-Mirim, localizado no município de Extremoz (CEA) e o manguezal do rio Curimataú, no município de Canguaretama (CUR), foram possíveis realizar a metodologia padronizada sugerida para as localidades do Sul e Sudeste. Adicionalmente, as parcelas para essas duas
localidades foram distribuídas longitudinal ao longo do manguezal, em três porções distintas, mas a jusante, uma região intermediária e outra mais a montante, afim de abranger uma maior variação de habitats possível (Figura 02).
As espécies que conseguíamos identificar em campo, foram medidas e devolvidas ao seu habitat, enquanto as que não conseguíamos identificar, eram levadas, em solução aquosa de formal a 4%, para o laboratório para identificação e medição, onde posteriormente foram tombadas na coleção ictiológica da UFRN.
As espécies que foram coletadas junto com os Kryptolebias foram devidamente identificas para compor uma lista da fauna acompanhante, objetivando a construção de um cenário comparativo de possíveis competidores e predadores, baseado no estudo compilatório de história natural e ecologia publicado por Taylor (2012). Os dados ecológicos são apresentados de acordo com a regiões tidais da costa brasileira.
Afim de aferir a densidade demográfica, os números de indivíduos coletados por localidades foram tabelados, de acordo com seus respectivos lotes, servindo para inferir quais populações do Nordeste e Sudeste apresentaram maior densidade demográfica.
Para um estudo de dieta, os indivíduos coletados foram imediatamente anestesiados com eugenol (óleo de cravo) e alocados em uma solução de formol a 4%, para preservar o conteúdo estomacal. No total, 70 indivíduos de K. hermaphroditus foram coletados no manguezal do rio Ceará-Mirim para estudos tróficos, além de outras espécies de peixes da família Eleotridae, Poecilidae e Gobiidae, que servirão para estabelecer as relações ecológicas entre as espécies.
Figura 02. Disposição das parcelas 7x7 m em dois manguezais do Rio Grande do Norte. As parcelas estão representadas por quadrados verdes e localizadas em porções a jusante, intermediária e a montante. Imagens produzidas no Google Earth Pro.
4. RESULTADOS
4.1. Distribuição geográfica
Das 25 localidades amostradas (Tabela.1), 12 novos registros são somados a lista de ocorrência para as espécies do complexo K. marmoratus que ocorrem nos manguezais do Brasil, preenchendo uma lacuna histórica em relação a distribuição dessas espécies (Fig.3).
No Nordeste, foram registradas novas ocorrências para os estados do Piauí (, rio Portinho em Luís Correia, bacia do rio Parnaíba), Ceará (praia de Maceió em Camocim, e Parque Nacional de Jericoacoara, Jijoca de Jericoacoara), Sergipe (no estuário do rio Sergipe) e em duas localidades na Bahia, no manguezal do rio Salgado, na Reserva Extrativista de Canavieiras (em Canavieiras) e no rio Tejuípe (em Uruçuca).
Além disso, novos registros foram feitos mais a leste no Pará, em Vigia, que segundo os resultados filogenéticos, agrupou com o clado Central, ampliando os limites de distribuição desse clado em 2.838 km ao Sul, anteriormente distribuídos do Sul de Cuba, na baía de Guantanamo, até Bonaire (Tatarenkov et al. 2017).
Para região Sudeste, além dos registros já estabelecidos por trabalhos anteriores (e.g. Costa 2011, 2016), foi registrado uma nova localidade para K. hermaphroditus, pertencentes ao clado Sul, para o estado de São Paulo, no município de Perúibe, expandido também o limite de distribuição da espécie em 248 km ao sul, na ESEC Jureia-Itatins, além de indicar mais um registro para a espécie dentro de uma unidade de conservação.
Além disso, no município de Santa Cruz, localizado cerca de 4,7 km do ponto amostrado por Costa (2016), o qual possui o segundo registro para fenótipos masculinos de K.
hermaphroditus, também é tido como novo registro para a espécies no estado do Espírito Santo,
entretanto, apesar da proximidade entre as localidades, não foi coletado nenhum exemplar com fenótipo masculino em Santa Cruz.
29 As referências mostram de quais estudos foram retiradas as informações. Os números sobrescritos se referem respectivamente às seguintes Unidades de Conservação: 1- Parque Nacional de Jericoacoara; 2 – Reserva Extrativista de Canavieiras; 3 – Área de Proteção Ambiental de Guapimirim; 4 – Parque Estadual da Serra do Mar, Núcleo Picinguaba; 5 – Estação Ecológica Juréia-Itatins.
Sigla Localidade Área Latitude Longitude Coi Referência 1. GITC Baía de Guantanamo Cuba 21°47′25.2″N 71°40′11.9″W 1 Tatarenkov et al. 2017
2. PRNC Punta Maracayo Porto Rico 18°29′28.4″N 66°47′40.3″W 1 Tatarenkov et al. 2017
3. PRSC Sul de Porto Rico Porto Rico 17°56′57.0″N 66°52′06.0″W 3 Tatarenkov et al. 2017
4. ALMC Baía Almirante Panamá 09°21′12.2″N 82°15′31.5″W 4 Tatarenkov et al. 2017
5. CHIC Lagoa Chiriqui Panamá 09°00′40.7″N 81°47′27.1″W 12 Tatarenkov et al. 2017
6. ARBC Aterro de Parkietenbos Aruba 12°29′31.5″N 70°00′30.8″W 4 Tatarenkov et al. 2017
7. BNRC Baía Lac Bonaire 12°06′37.7″N 68°13′02.4″W 5 Tatarenkov et al. 2017
8. MARC Baía de Marajó, Vigia N Brasil 00°51'39.30"S 48°7'39.70" W 6 Esse estudo
9. AJUS Praia de Ajuruteua N Brasil 00°51ʹ05.69ʺS 46°36ʹ00.14ʺW - Guimarães-Costa et al. 2017
10. PORS Manguezal do rio Portinho NE Brasil 02°53'41.9"S 41°40'17.1"W - Esse estudo
12. JERS Jericoacoara1 NE Brasil 02°50'26.6"S 40°34'39.5"W - Esse estudo
13. MACS Manguezal de Macau NE Brasil 05°06'19.9"S 36°37'32.2"W 6 Esse estudo
14. GRES Manguezal de Guamaré NE Brasil 05°06'29.1"S 36°20'17.6"W 6 Esse estudo
15. CEAS Manguezal do rio Ceará-Mirim NE Brasil 05°40'25.88"S 35°14'14.48"W 4 Tatarenkov et al. 2017
16. CURS Manguezal do rio Curimataú NE Brasil 06°21′32.5″S 35°01′54.8″W 4 Tatarenkov et al. 2017
17. MPES Manguezal do rio Maracaípe NE Brasil 08°31′06.6″S 35°00′36.8″W 4 Tatarenkov et al. 2017
18. SERS Manguezal do rio Sergipe NE Brasil 10°58'13.7"S 37°3'13.2" W 2 Esse estudo
19. TIJS Estuário do rio Tejuípe NE Brasil 14°25'17.6"S 39°01'20.48"W - Esse estudo
20. SALS Estuário do rio Salgado2 NE Brasil 15°32'47.17"S 38°57'40.30" W 5 Esse estudo
21. COQS Alagado na praia de Coqueiral SE Brasil 19°56'3.44"S 40° 7'48.13"W 5 Costa, 2016
22. PIRS Manguezal do rio Piraquê-Açú SE Brasil 19°57'9.38"S 40° 9'55.50"W 3 Esse estudo
23. ARAS Lagoa de Araruama SE Brasil 22°50'31"S 42°12' 26" W - Costa, 2016
24. IRIS Manguezal do rio Irirí3 SE Brasil 22°39'48.79"S 43° 5'12.20"W 30 Esse estudo
25. FUNS Manguezal da Ilha do Fundão SE Brasil 22°52'2.48"S 43°13'27.48"W 29 Costa, 2016
26. MRPS Lagoa de Marapendi SE Brasil 23°00'52.31"S 43°24'20.56" W - Costa, 2016
28. GUAS Manguezal do rio Piracão SE Brasil 23°00′06.7″S 43°34′51.6″W 35 Costa, 2016
29. SEPS Baía de Sepetiba SE Brasil 22°54'01.48"S 43°49'31.34" W - Costa, 2016
30. MAGS Mangaratiba SE Brasil 22°57'54.05"S 44°02'36.50" W - Costa, 2016
31. PICS Manguezal no rio da Fazenda4 SE Brasil 23°22′01.0″S 44°50′13.4″W 2 Tatarenkov et al. 2017
32. JURS Manguezal do rio Guaraú5 SE Brasil 24°22'16.62"S 47° 1'1.44"W 3 Esse estudo
Figura 3. Localidades do complexo Kryptolebias marmoratus nos manguezais neotropicais. São diferenciados no mapa, as novas ocorrências e as ocorrências já conhecidas, como também as localidades que foram utilizadas marcadores moleculares, na Tabela 1 fornecemos informações mais detalhadas sobre as localidades. As marcações I, II e III correspondem aos limites tidais da costa brasileira, segundo
Knoppers et al. (1999), onde de I a II, teremos a região Macrotidal; de II a III, a região Mesotidal e de III
4.2 – Dados moleculares
Para a reconstrução filogenética utilizando o modelo estatístico de máxima verossimilhança (Maximum Likelihood) (Fig. 4), com um fragmento de 615 pares de bases (bp) do gene mitocondrial citocromo oxidase I.
Percebemos a mesma estruturação proposta por Tatarenkov et al. (2017), onde duas linhagens principais se formam, sendo a primeira representada pelas localidades referentes ao clado Norte, que para o presente trabalho foram utilizadas apenas duas localidades com o intuito de exibir em qual linhagens as populações recém coletadas estão inseridas, além de uma segunda linhagem composta por dois clados, Central e Sul, ambos ocorrendo no Brasil, com o primeiro registro de representantes do clado Central no norte do país.
Os indivíduos coletados na cidade Vigia, no Pará, tributário da bacia do Marajó (MAR), estão se agrupando com as populações do clado Central (sequência MAR02, barra rosa na figura 4), mostrando que por mais próximo que essa população esteja da localidade Ajuruteua (Guimarães-Costa et al. 2016), esta possui maior similaridade genética com as populações do clado Central, sugerindo uma zona de contato ou de sobreposição das linhagens, ou ainda, um limite de ocorrência para as espécies do clado Central.
Entretanto, por não possuirmos dados moleculares do indivíduo da localidade proposta por Guimarães-Costa et al. (2017), novos estudos moleculares são necessários com as populações que estão posicionadas mais ao leste da subdrenagem do Marajó, afim de confirmar o limite de distribuição para essas linhagens, além de indicar se essas novas localidades (Piauí e Ceará) amostradas pertencem ao clado Central ou Sul.
Para os dados de diversidade genética, encontramos uma variação de nove sítios e 14 haplótipos, sete pertencente ao clado Central e sete do clado Sul. Tatarenkov et al. (2017) indicaram altos valores de diversidade genética para as populações de Cuba (GIT) e Porto Rico (PRN e PRS), que estão inseridas no clado Central com maiores valores de diversidade haplotípica, variando entre 1 e 0.667 (Tabela 3).
Figura 4. – Árvore filogenética de máxima verossimilhança (Maximum Likelihood) com o gene mitocondrial citocromo oxidase I do complexo Kryptolebias marmoratus com a indicação dos clados de Tatarenkov et al. (2017), além das sequencias provindas dos novos registros sugeridos por esse estudo. A faixa rosa mostrando o agrupamento da localidade do Pará com as linhagens do clado Central. As localidades com * representam os dados originais desse estudo.
Paras as populações do Brasil, a localidade do Pará (MAR), que está também
inserida nas linhagens do clado Central apresentou diversidade haplotípica de 0.333, composta por dois haplótipos exclusivos. A maior diversidade haplotípica foi observado nas localidades do Nordeste, com Macau (MAC) a de maior valor (0.600), seguidas de Curimataú (CUR), ambas localizadas no Rio Grande do Norte e MPE (Maracaípe), em Pernambuco, com valores iguais (0.500) (Tabela 3). Nas localidades do Sudeste um único haplótipo compartilhado foi encontrado, exceto em Guaratiba (GUA) no Rio de Janeiro,
que apresentou dois haplótipos (h = 0.213). Esse cenário sugere um efeito fundador ou gargalo genético, no entanto os testes de neutralidade não identificaram desvios demográficos, em favor da primeira hipótese.
Tabela 2. – Índices de diversidade genética para as populações do clado Central (sobrescrito C) e Sul
(sobrescrito S). Sendo N = número de sequências por localidade, H = número de haplótipos, S = número de
sítios polimórficos, h = diversidade haplotípica, π = diversidade nucleotídica e testes de neutralidade FS Fu e D Tajima.
Nas populações do Nordeste observamos uma maior similaridade genética pelo compartilhamento do Hap8 entre todas a localidades dessa região (Tabela 4), além de apresentar uma maior diversidade genética, com haplótipos exclusivos para algumas localidades (Hap9 e 10 para Macau; Hap11 para Guamoré; Hap12 para Curimataú (MAC, GRE e CUR, respectivamente) e Hap13 para Maracaípe (MPE), em Pernambuco.
. N H S H Π FS Fu D Tajima GIT C 1 1 0 1.000 0 0 0 PRN C 1 0 0 1.000 0 0 0 PRS C 3 2 1 0.667 0,001084 0,2 0 ALM C 4 1 0 0 0 0,200 0 CHI C 12 2 0 0.166 0 -0.475 -1.140 ARB C 4 1 0 0 0 0 0 BNR C 5 1 0 0 0 0 0 MAR C 6 2 1 0.333 0.000542 -0,002 -0.933 MAC S 6 3 2 0.600 0.001409 -0,426 -0.050 GRE S 6 2 2 0.333 0.001084 0,952 -1.131 CEA S 4 1 0 0 0 0 0 CUR S 4 2 1 0.500 0.000813 0,171 -0.612 MPE S 4 2 1 0.500 0.000813 0,171 -0.612 SER S 2 1 0 0 0 0 0 SAL S 5 1 0 0 0 0 0 COQ S 5 1 0 0 0 0 0 PIR S 3 1 0 0 0 0 0 IRI S 30 1 0 0 0 0 0 FUN S 29 1 0 0 0 0 0 GUA S 34 2 1 0.213 0.000348 0,276 -0.187 PIC S 2 1 0 0 0 0 0 JUR S 3 1 0 0 0 0 0
Tabela 3. - Distribuição dos haplótipos para as populações utilizadas na reconstrução filogenética, além dos novos registros proposto por esse estudo. As barras acinzentadas correspondem as quebras populacionais das localidades do Brasil, onde o cinza mais claro representa a população da região macrotidal (Pará), cinza intermediário as populações da região mesotidial (Nordeste) e o cinza mais escuro, as populações da região microtidal (Sudeste).
A rede de haplótipos (Figrua 5) nos mostra melhor a estruturação dessas populações, permitindo-nos inferir que para o clado Sul, tal como sugerido por Tatarenkov et al. (2017) é representada pela espécie K. hermaphroditus, visto que abrange a localidade-tipo, em Guaratiba, no Rio de Janeiro.
Hap1 Hap2 Hap3 Hap4 Hap5 Hap6 Hap7 Hap8 Hap9 Hap10 Hap11 Hap12 Hap13 Hap14
GIT C 1 PRN C 1 PRS C 2 1 ALM C 4 CHI C 11 1 ARB C 4 BNR C 5 MAC S 4 1 1 GRE S 5 1 CEA S 4 CUR S 3 1 MPE S 3 1 SER S 2 SAL S 5 COQ S 5 PIR S 3 IRI S 30 FUN S 29 GUA S 4 30 PIC S 2 JUR S 3 MAR C 5 1
Figura 5. – Rede de haplótipos das localidades dos clados Central e do Sul do complexo de espécies K. marmoratus nos manguezais neotropicais.
A população do nordeste é mais diversificada geneticamente que a do Sudeste, que compartilham basicamente um único haplótipo (Hap14). Isso sugere uma maior atenção para essas localidades de maior diversidade genética, principalmente pela menor densidade demográfica que apresentam em relação às do sudeste.
A distribuição da variação genética pode ser observada na Tabela 5. Na AMOVA foram testadas duas hipóteses de estruturação na costa brasileira, uma de acordo com a filogenia (dois clados existentes no Brasil, clado Central no Pará, e do Sul, demais localidades) mostrou diferenças significativas em todos os níveis hierárquicos (P<0,001), explicarando 88% da variação total.
Para o segundo teste, onde consideramos três regiões tidais para a costa brasileira, também mostrou diferenças significativas em todos os níveis hierárquicos, com valores maiores para diferenças entre os grupos (FCT) que o teste taxonômico, mostrando valores de 91.02%. Esse resultado indica a presença de pelo menos três populações na costa brasileira, relacionadas com a divisão tidal.
Tabela 4. – AMOVA das linhagens do complexo Kryptolebias marmoratus do Brasil, utilizando o gene mitocondrial da citocromo oxidase I para três níveis de estruturação populacional hierárquico.
Source of variation d.f. Sum of squares Variance components % of variation Significance (P)
Test 1 (structure: phylogeny; 2 clades)
Among groups (FCT) 1 159.966 2.75315 Va 88.39 < 0,001
Among populations within groups (FSC) 20 42.686 0.28698 Vb 9.21 < 0,001
Within populations (FST) 151 11.279 0.07470 Vc 2.40 < 0,001
Total 172 213.931 311.483
FCT: 0.0883, FSC: 0.793, FST: 0.976
Teste 2 (structure: geography, 3 regions tidal)
Among groups (FCT) 2 48.776 0.84412 Va 91.02 < 0,001
Among populations within groups (FSC) 12 1.696 0.00754 Vb 0.81 < 0,001
Within populations (FST) 128 9.168 0.07575 Vc 8.17 < 0,001
Total 142 60.168 0.92741
FCT: 0.910, FSC: 0.090, FST: 0.918
Com Geneland, conseguimos valores iguais para as cinco corridas independentes, resultando em três populações, para as localidades do Brasil. Na Figura 6 podemos
observar melhor essas designações populacionais, onde enxergamos tanto os limites das populações recuperadas, quanto a probabilidade posterior de pertencer a cada cluster. Esse resultado é concordante com a AMOVA que testou o cenário de zonas tidais de Knoppers et al. (1999) (macro, micro e mesotidal).
Figura 6. Mapas com mostrando os resultados para as análises no Geneland, exibindo em (a) a estimativa dos limites para as populações recuperadas, onde os pontos pretos correspondem as localidades amostradas e (b-d) é exibido a probabilidade posterior de cada localidade está inserida em um cluster, onde as áreas claras estão associadas a alta probabilidade dessas localidades pertencer a um determinado cluster.
4.3 Dados Ecológicos
4.3.1 - Habitats
Para K. hermaphroditus encontramos um cenário parecido com os estudos ecológicos realizados com K. marmoratus (e.g. Davis et al. 1990, Taylor, 1990 e 2012), clado Norte. Entretanto, algumas diferenças foram encontradas para as populações do Brasil, estruturas por três populações dentro do Clado Central e Sul. O Pará, inserido no clado Central, localizado na região macrotidal, enquanto Nordeste, localizado na região mestoidal e o Sudeste, inserido na região macrotidal, correspondem ao clado Sul.
Para as espécies que ocorrem no Brasil (K. hermaphroditus e K. ocellatus), iremos encontrar além da relação das mesmas com R. mangle, o mangue vermelho, associação com outra espécie arbórea de manguezal, a Laguncularia racemosa (L.) C.F.Gaertn, conhecida como mangue branco. Podendo ser a vegetação predominante em algumas ocasiões, ou ainda ocorrer em sintopia com R. mangle.
A variação de micro-habitats para as populações dos clados Central e Sul, também se assemelha com as do Caldo Norte, podendo ser pequenas poças visualmente rasas, com variação de profundidade entre 0,5 e 22 cm, áreas alagadas, substrato com quantidade significativa de serrapilheira, e com grande aporte de matéria orgânica. Em outros casos com substrato mais arenoso.
Substratos mais arenosos foram observados em localidades de maior proximidade com o mar, como em Camocim, no Ceará que fica localizado a 562 m da foz com e em Picinguaba, São Paulo, distante 1.048 m do mar.
Outro cenário não observado nos estudos ecológicos com K. marmoratus (clado Norte) (Richards et al. 2011; Taylor 2012) é a relação que as espécies do clado Sul, populações do Nordeste, como em Luís Correia no Parnaíba, onde os espécimes foram coletados entre os pneumatóforos L. racemosa. Isso se repetiu para ESEC de Juréia-Itatins, em Peruíbe, São Paulo, onde na ausência de mangue-vermelho, comumente encontramos os indivíduos de K. hermaphroditus em pequenas poças rasas, escondidos entre os pneumatóforos.
Na tentativa de investigar os possíveis micro-habitats ocupados pelas espécies de
