Universidade de Aveiro Departamento de Química Ano 2016
Joel
Oxidação de Compostos Fenólicos – Efeito na
Universidade de Aveiro Departamento de Química Ano 2016
Joel
Oxidação de Compostos Fenólicos – Efeito na
De Figueiredo Coelho
sua Bioatividade
Dissertação apresentada à Universidade de Aveiro para cumprimento dos requisitos necessários à obtenção do grau de Mestre em Biotecnologia (ramo Biotecnologia Industrial e Ambiental), realizada sob a orientação científica da Doutora Sónia Andreia Oliveira Santos e da Doutora Maria do Rosário Gonçalves dos Reis Marques Domingues, Professora Associada com Agregação ao Departamento de Química da Universidade de Aveiro
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o júri
presidente Prof. Doutora Ana Maria Rebelo Barreto Xavier
Professora auxiliar do Departamento de Química da Universidade de Aveiro
DoutoraEduarda Marlene Peixoto Silva
Investigadora da Faculdade de Farmácia da Universidade do Porto
Doutora Sónia Andreia Oliveira Santos
Investigadora de pós-doutoramento do Departamento de Química da Universidade de Aveiro
Prof. Doutora Maria Rosário Gonçalves Reis Marques Domingues
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agradecimentos Às minhas orientadoras Doutora Sónia Santos e Professora Doutora Rosário Domingues, agradeço a excelente orientação, a confiança em mim depositada, a incansável compreensão, e a enorme disponibilidade.
Aos amigos e colegas de laboratório, agradeço a amizade, o companheirismo e toda a ajuda prestada.
À família, agradeço o apoio incondicional, e a motivação fornecida.
Um sincero agradecimento a todos, por me fazerem continuar a sonhar. Os momentos partilhados serão lembrados com carinho.
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Palavras-chave
Ácido elágico, ácido clorogénico, ácido protocatequínico,
oxidação, radiação UV, ácido ascórbico, reação de Fenton, HPLC-MS, espetrometria de massa, DPPH, ABTS.
Resumo Reconhecendo a importância dos antioxidantes na proteção do organismo contra os efeitos nocivos dos radicais livres, e confirmando a escassez de material literário informativo acerca da estabilidade destas moléculas bem como de eventuais produtos de oxidação formados, surgiu a necessidade de estudar o efeito da oxidação em três compostos fenólicos selecionados por ainda não terem sido submetidos a este tipo de avaliação bem como pela sua reconhecida utilização em produtos comercializados. Os principais objetivos deste trabalho foram o estudo da oxidação de diferentes compostos fenólicos (ácido elágico, ácido clorogénico e ácido protocatequínico), quer por radicais formados pela reação de Fenton ou pela reação com ácido ascórbico, quer por espécies reativas formadas por radiação UV e avaliar se estes tinham impacto nas propriedades antioxidantes. Os produtos resultantes de oxidação foram identificados com recurso à cromatografia líquida acoplada à espetrometria de massa, tendo também sido avaliado o potencial antioxidante pelos métodos DPPH e ABTS. Não foram observados produtos de oxidação resultantes da degradação do ácido elágico através de nenhum dos métodos de oxidação testados, enquanto que quer o ácido clorogénico quer o ácido protocatequínico sofreram degradação ao longo do tempo quando expostos aos métodos de oxidação testados. Foram identificados 9 produtos de oxidação do ácido clorogénico de razão m/z 137, 191, 307, 353, 369, 371, 387 e 419 e um produto de oxidação m/z 169 para o ácido protocatequínico. O ácido clorogénico demonstrou menor estabilidade face aos métodos de oxidação testados. Embora este composto fenólico tenha demonstrado níveis superiores de degradação, de forma geral os produtos de oxidação gerados demonstram reter maior estabilidade da atividade antioxidante que os produtos resultantes da oxidação do ácido protocatequínico. Com base nos resultados, é possível afirmar que os três compostos fenólicos estudados apresentaram resultados promissores que confirmam a estabilidade das suas propriedades antioxidantes quando submetidos aos três processos de oxidação testados assegurando os benefícios da sua utilização na proteção da pele contra o efeito nocivo dos danos oxidativos causados pela exposição à radiação UV na forma de cosméticos para aplicação tópica, ou como suplementos alimentares para combater as espécies reativas de oxigénio formadas no organismo.
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Keywords
Ellagic acid, chlorogenic acid, protocatechuic acid,
oxidation, UV radiation, ascorbic acid, Fenton reaction, HPLC-MS, mass spectrometry, capillary electrophoresis, DPPH, ABTS.
Abstract Recognizing the importance of antioxidants in protecting the body against the damaging effects of free radicals, and confirming the lack of literature concerning the stability of these molecules as well as any oxidation products formed, there was a need to study the effect of oxidation in three selected phenolic compounds, since they had not been subjected to this kind of assessment, and also for their recognized use in commercial products. The main objectives of this experiment were to study the oxidation of different phenolics (ellagic acid, chlorogenic acid and protocatechuic acid), either by radicals formed by the Fenton reaction or by the reaction with ascorbic acid or by reactive species formed by UV radiation and evaluate if they had any impact on the antioxidant properties. The resulting oxidation products were identified by means of liquid chromatography coupled to mass spectrometry, and antioxidant activity has also been assessed by the DPPH and ABTS methods. There were no oxidation products resulting from the degradation of ellagic acid by any of the tested oxidation methods, while both chlorogenic acid and protocatechuic acid suffered degradation over time when exposed to the tested oxidation methods. We identified 9 chlorogenic acid oxidation products with ratio m/z 137, 191, 307, 353, 369, 371, 387 and 419 and an oxidation product of m/z 169 for protocatechuic acid. Chlorogenic acid showed less stability to the tested oxidation methods. Although this phenolic compound has demonstrated higher levels of degradation, generally its generated oxidation products demonstrate better antioxidant activity stability than the oxidation products resulting from protocatechuic acid oxidation. Based on the results, we can state that the three phenolic compounds studied showed promising results that confirm the stability of its antioxidant properties when subjected to the three oxidation processes tested, ensuring the benefits of its use in protecting the skin from harmful effects of oxidative damage caused by exposure to UV radiation in the form of cosmetics for topical application, or as food supplements to combat reactive oxygen species formed in the body.
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Lista de abreviaturas:
ABTS 2,2'-azino-bis (3-etilbenzotiazolina-6- ácido sulfónico)
AC ácido clorogénico
AE ácido elágico
AP ácido protocatequínico
APCI ionização química a pressão atmosférica (do inglês “atmospheric pressure chemical ionization”)
API ionização a pressão atmosférica (do inglês “atmospheric pressure ionization”)
Asc•- radical semi-desidroascorbato
AscH ácido desidroascórbico
AscH- ascorbato
AscH2 ácido ascórbico
ATP adenosina trifosfato
CAT catalase
CID dissociação induzida por colisão (do inglês “collision induced dissociation”)
CML leucemia mielóide crónica (do inglês “chronic myelogenous leukemia”)
COX-2 ciclo-oxigenase-2
CQA ácido cafeoilquínico (do inglês “caffeoylquinic acid”)
DAD detetor por arranjo de díodos (do inglês “diode array detector”)
DL50 dose letal 50%
DNA ácido desoxirribonucleico (do inglês “deoxyribonucleic acid”)
DPPH• radical 2,2-difenil-1-picril-hidrazilo
DSS sulfato de sódio dextrano (do inglês “dextran sulfate sodium”)
ECZ eletroforese capilar de zona
EOF fluxo eletroosmótico (do inglês electroosmotic flow”)
ESI ionização por electrospray (do inglês “electrospray ionization”)
FAS ácido gordo sintase (do inglês “fatty acid synthase”)
FQA ácido feruloilquínico (do inglês “feruloylquinic acid”)
G6Pase glucose-6-fosfatase
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GPx glutationa peroxidase
GR glutationa reductase
GSH glutationa
GSSG dissulfureto de glutationa
HBV vírus da hepatite B (do inglês “hepatitis B virus”)
HMG 3-hidroxi-3-metilglutaril
HNE 4-hidroxi-2-nonenal
HPLC cromatografia líquida de alta resolução (do inglês “high performance liquid chromatography”)
IL isoleucina
LC cromatografia líquida
LC-MS cromatografia líquida acoplada a espetrometria de massa (do inglês “liquid chromatography coupled to mass spectrometry”)
LDL lipoproteínas de baixa densidade (do inglês “low density lipoprotein”)
LPS lipopolissacáridos
m/z razão massa/carga
MAPK proteína ativada por mitógeno (do inglês “mitogen activated protein kinase”)
MDA malondialdeído
Mn manganês
MPO mieloperoxidase
MPP+ catião 1-metil-4-fenilpiridina
MS espetrometria de massa (do inglês “mass spectrometry”)
MSn espetrometria de massa em tandem
NADP fosfato de dinucleótido de adenina e nicotinamida (do inglês “nicotinamide adenine dinucleotide phosphate”)
NADPH fosfato de dinucleótido de adenina e nicotinamida protonado
NF fator nuclear (do inglês “nuclear factor”)
NO óxido nítrico
NOS óxido nítrico sintase
NMP N-metil pirrolidona
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pCoQA ácido p-cumaroilquínico
PGE2 prostaglandina E2
pKa constante de dissociação ácida
Q quadrupolo
RB retinoblastoma
ROS espécies reativas de oxigénio (do inglês “reactive oxygen species”)
SOD superóxido dismutase
TEA trietanolamina
TLC cromatografia em camada fina (do inglês “thin-layer chromatography”)
TNF fator de necrose tumoral (do inglês “tumor necrosis factor”)
TOF tempo de voo (do inglês “time of flight”)
TPA 12-O-tetradecanoilforbol-13-acetato
UHPLC cromatografia líquida de pressão ultraelevada (do inglês “ultra high
performance liquid chromatography”)
UV ultravioleta
UV-vis ultravioleta-visível
V volt
VEGF fator de crescimento endotelial vascular (do inglês “vascular endothelial growth factor”)
W watt
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Índice
1 Introdução ... 1 1.1 Objetivos ... 2 1.2 Revisão bibliográfica ... 2 1.2.1 Compostos fenólicos ... 41.2.1.1 Ácido elágico (AE) ... 4
1.2.1.2 Ácido clorogénico (AC) ... 5
1.2.1.3 Ácido protocatequínico (AP) ... 7
1.2.2 Aplicações dos compostos fenólicos ... 8
1.2.2.1 Aplicações do ácido elágico ... 8
1.2.2.2 Aplicações do ácido clorogénico ... 9
1.2.2.3 Aplicações do ácido protocatequínico ... 10
1.2.3 Espécies reativas de oxigénio (ROS) ... 12
1.2.3.1 Tipos de espécies reativas de oxigénio ... 13
1.2.3.2 Danos provocados por ROS ... 15
1.2.3.3 Defesas antioxidantes ... 17
1.2.4 Mecanismos de oxidação ... 20
1.2.4.1 Radiação UV ... 21
1.2.4.2 Reação ácido ascórbico/ ... 21
1.2.4.3 Reação de Fenton ... 22
1.2.5 Técnica de separação - HPLC ... 23
1.2.6 Técnicas de deteção de HPLC ... 25
1.2.6.1 Espetrofotometria de UV-visível (UV-vis) ... 25
1.2.6.2 Espetrometria de massa (MS) ... 26
1.2.6.2.1 Fontes de ionização ... 27
1.2.6.2.2 Analisadores de massa ... 29
1.2.7 Eletroforese capilar de zona (ECZ) ... 30
1.2.8 Avaliação da atividade antioxidante ... 33
1.2.8.1 Método do radical DPPH ... 34
1.2.8.2 Método do catião radical ABTS ... 35
x
2.1 Reagentes e equipamentos ... 37
2.2 Oxidação do ácido elágico ... 37
2.2.1 Oxidação por irradiação com radiação UV ... 37
2.2.2 Oxidação por ácido ascórbico/ ... 38
2.2.3 Oxidação por reação de Fenton ... 39
2.3 Oxidação dos ácidos clorogénico e protocatequínico ... 39
2.3.1 Oxidação por irradiação com radiação UV ... 39
2.3.2 Oxidação por ácido ascórbico/ ... 40
2.3.3 Oxidação por reação de Fenton ... 41
2.4 Análise por eletroforese capilar de zona ... 42
2.5 Análise por UHPLC-MS ... 42
2.5.1 Separação dos compostos oxidados por UHPLC ... 42
2.5.2 Identificação dos compostos oxidados por MS ... 43
2.5.3 Quantificação dos compostos por UHPLC ... 43
2.6 Análise da atividade antioxidante dos compostos oxidados ... 44
2.6.1 Análise antioxidante por DPPH ... 44
2.6.2 Análise antioxidante por ABTS ... 44
3 Resultados e discussão ... 45
3.1 Oxidação do ácido elágico ... 45
3.1.1 Efeito da oxidação resultante de irradiação UV ... 45
3.1.2 Efeito da oxidação do ácido elágico por ácido ascórbico/ ... 48
3.1.3 Efeito da oxidação do ácido elágico por reação de Fenton ... 49
3.2 Oxidação para ácido clorogénico e ácido protocatequínico ... 50
3.2.1 Avaliação do efeito do processo de oxidação ... 50
3.2.2 Identificação dos produtos de oxidação ... 53
3.2.3 Atividades antioxidantes ... 58
4 Conclusões ... 65
5 Anexos ... 67
1
1 Introdução
Atualmente, e à medida que a informação se torna cada vez mais acessível, existe uma elevada preocupação por parte da população com os malefícios causados por espécies reativas de oxigénio (ROS), assim como na forma como os compostos antioxidantes desempenham um papel importante na proteção contra estas espécies. De facto, nas últimas décadas tem existido um enorme interesse nestes compostos de origem natural, quer devido às suas inúmeras atividades biológicas quer à sua bio-disponibilidade. No entanto, ainda são poucos os estudos sobre os produtos resultantes da sua oxidação, assim como do efeito nas suas propriedades antioxidantes. De entre os diversos antioxidantes existentes, destacam-se os compostos fenólicos.
Em primeiro lugar, são apresentados os objetivos deste trabalho de dissertação. Uma vez que foi efetuado o estudo da oxidação de três compostos fenólicos (ácido elágico, ácido clorogénico, e ácido protocatequínico) selecionados por ainda não terem sido submetidos a este tipo de avaliação bem como pela sua reconhecida utilização em produtos comercializados, procedeu-se numa primeira instância à caracterização destas moléculas bem como das sua inerentes propriedades, com o auxílio da literatura.
O leitor será posteriormente contextualizado quanto às moléculas que estão normalmente associadas aos processos de oxidação que ocorrem no organismo, capítulo em que se indicam as espécies reativas de oxigénio (ROS), fazendo referência ao seu processo de formação, danos resultantes da sua atuação, e ainda principais defesas antioxidantes responsáveis por atuar contra os efeitos nocivos destas moléculas. Posteriormente, foi efetuada uma ligação entre a informação adquirida, e efetuou-se uma demonstração dos mecanismos associados a cada método de oxidação testado, de maneira a perceber os principais intervenientes nesses processos, e de que forma irão influenciar os dados obtidos.
De seguida é feita uma alusão aos principais equipamentos usados durante o trabalho laboratorial e informação quanto ao seu funcionamento, nomeadamente cromatografia líquida acoplada a espetrometria de massa (UHPLC-MS) e eletroforese capilar de zona (ECZ).São ainda referenciados os dois métodos DPPH e ABTS, usados para avaliar a atividade antioxidante das amostras submetidas a processos de oxidação. Numa etapa intermédia do trabalho, são descritos os reagentes, equipamentos e procedimentos experimentais utilizados durante a realização deste trabalho. Finalmente são
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apresentados e discutidos os resultados obtidos pela oxidação dos três compostos fenólicos, pelos três métodos de oxidação testados, e apresentadas as principais conclusões a que chegámos.
1.1 Objetivos
Os principais objetivos deste trabalho foram o estudo da oxidação de três compostos fenólicos, nomeadamente o ácido elágico, ácido clorogénico e ácido protocatequínico, quer por radicais formados pela reação de Fenton ou pela reação com ácido ascórbico, quer por espécies reativas formadas por radiação UV e avaliar se estes tinham impacto nas propriedades antioxidantes. Os produtos resultantes de oxidação foram identificados com recurso à cromatografia líquida de alta resolução (UHPLC) acoplada à espetrometria de massa (MS), tendo também sido avaliado o potencial antioxidante pelos métodos DPPH e ABTS.
1.2 Revisão bibliográfica
1.2.1 Compostos fenólicos
Existem mais de 8000 compostos fenólicos distintos identificados, que ocorrem naturalmente e se encontram dispersos por várias espécies do reino vegetal. A sua designação por fenólicos, advém de estes possuírem pelo menos um anel aromático com um ou mais grupos hidroxilo ligados. A classificação atual divide a categoria geral de compostos fenólicos em polifenóis e fenóis simples, baseado unicamente no número de subunidades de benzeno presentes. Os polifenóis que possuem duas subunidades de benzeno incluem os flavonóides, enquanto os compostos complexos possuindo três ou mais subunidades de benzeno constituem os taninos (hidrolisáveis e condensados). Os compostos fenólicos podem ser classificados em dois grupos, os flavonóides e os não-flavonóides. Os flavonóides contém 15 átomos de carbono, com dois anéis aromáticos ligados por uma ponte de três átomos de carbono, formando uma estrutura comum (C6-C3-C6) (Tabela 1). Eles são o grupo de fenólicos mais numerosos e amplamente distribuídos e
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incluem os flavonóis, flavonas, flavan-3-óis, antocianidinas, flavanonas, isoflavonas e taninos condensados (polímeros de flavan-3-óis, designados proantocianidinas). Os principais não-flavonóides são os ácidos fenólicos de estrutura característica (C6-C1), os ácidos hidroxicinâmicos de estrutura (C6-C3) e seus derivados conjugados, os polifenóis estilbenos (C6-C2-C6), e os taninos hidrolisáveis, bem como os derivados resultantes da sua hidrólise (1).
Os compostos fenólicos representam uma importante classe de compostos antioxidantes, sendo a sua atividade antioxidante diretamente resultante da quantidade de grupos hidroxilo ligados aos anéis aromáticos e também pela sua posição, pois a eliminação de espécies reativas ocorre pela transferência de protões (H+) ou por interações eletrónicas com os radicais livres, que possibilitam a estabilização dos eletrões desemparelhados (1).
Tabela 1. Estrutura característica de compostos fenólicos e polifenólicos.
Carbonos Classificação Estrutura básica
Acetofenonas Ácido fenilacético Ácidos hidroxicinâmicos Ácidos fenólicos Cumarinas Naftoquinonas Xantonas Estilbenos Flavonóides
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1.2.1.1 Ácido elágico (AE)
O ácido elágico é um polifenol que se encontra em diversas fontes vegetais existindo em quantidades significativas especialmente em frutos silvestres, nomeadamente framboesas, amoras, morangos, groselhas, mirtilos e arandos (2–5). Estas frutas vermelhas, por serem bastante consumidas, nomeadamente na preparação de bebidas ou outros alimentos como por exemplo compotas, são a principal fonte de ácido elágico em dietas ocidentais (6). O elevado poder antioxidante em sumos de romã foi igualmente associado ao grande teor de ácido elágico nesta fruta (7).
Este composto fenólico existe também em alguns frutos secos, principalmente em nozes (8). Tendo sido também identificado em vários tipos de mel, o ácido elágico foi proposto como um marcador floral para o mel de urze (9). De entre as várias espécies de uvas existentes, o ácido elágico apenas foi detetado na uva muscadínea (Vitis rotundifolia), tendo sido também detetado no sumo e vinho obtidos desta (10). Outro estudo permitiu identificar o ácido elágico como o principal constituinte fenólico em bebidas alcoólicas envelhecidas em barris de carvalho, sendo a sua presença justificada pela transferência deste composto da madeira para a bebida (11).
Quimicamente designada por 2,3,7,8-tetrahidroxi-cromeno[5,4,3-cde]-cromeno-5,10-diona (12), a molécula de ácido elágico apresenta elevada estabilidade termodinâmica devido aos dois anéis aromáticos que representam o domínio lipofílico. Por outro lado, os quatro grupos OH e as duas lactonas representam a região hidrofílica, os quais podem respetivamente atuar como dadores ou aceitadores de hidrogénio (Figura 1) (13).
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As propriedades da molécula de ácido elágico conferem-lhe uma reduzida solubilidade na maioria dos solventes, sendo por exemplo bastante insolúvel em água. Este composto apresenta razoável solubilidade em metanol e etanol, bem como em N-metil pirrolidona (NMP) (que é recomendado como um potenciador na penetração da pele para utilização em terapia transdérmica em seres humanos), em trietanolamina (TEA) (que é utilizado para a formação do sais em soluções injetáveis e preparações tópicas) após a adição de uma pequena quantidade de água (possivelmente devido à formação de sal de AE com TEA em presença de água), e em polietileno-glicol (400) (que é usado como um veículo em formas de dosagem parenterais, sendo miscíveis com ambos os solventes aquosos e orgânicos) (13). Na indústria farmacêutica, a formulação e administração de ácido elágico requer a sua solubilização em solventes seguros e aceitáveis. Testes de solubilidade permitiram verificar que este composto fenólico de natureza ligeiramente ácida, demonstra um aumento da solubilidade com o aumento do pH sendo mais solúvel em solventes alcalinos (13).
1.2.1.2 Ácido clorogénico
(AC)Os ácidos clorogénicos são uma família de conjugados de ácidos cinâmicos, formados pela esterificação do ácido quínico com um dos ácidos cinâmicos (mono-ésteres), ou mais (di-, tri- ou tetra-ésteres). Os ácidos cinâmicos estão amplamente distribuídos em bebidas e alimentos de origem vegetal sob a forma de conjugados. Os ácidos cinâmicos diferem apenas na substituição do anel, sendo os mais comuns o ácido p-cumárico (4-hidroxicinâmico), ácido caféico (ácido 3,4-di-hidroxicinâmico) e ácido ferúlico (3-metoxi, 4-hidroxicinâmico) (Figura 2). Estes podem ser libertados por meio de hidrólise a partir dos respetivos conjugados mono-ésteres, nomeadamente ácidos cafeoilquínicos (CQA), feruloilquínicos (FQA) e p-cumaroilquínicos (pCoQA) (Figura 3). Existem ainda outras famílias de conjugados de ácidos cinâmicos, substituindo o ácido quínico por outra molécula como por exemplo o ácido málico ou tartárico, embora sejam menos frequentes (14).
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Figura 2. Estrutura dos ácidos cinâmicos mais comuns.
Figura 3. Reação de hidrólise do ácido cafeoilquínico.
O ácido 5-O-cafeoilquínico (5-CQA) é o ácido clorogénico mais abundante na natureza, contudo esta classe de ácidos cafeoilquínicos possui mais isómeros em função do local de ligação ao ácido quínico, o 3-O-cafeoilquínico (3-CQA) e o 4-O-cafeoilquínico (4-CQA). Estes três isómeros apresentam atividades antioxidantes bastante semelhantes, o que significa que a posição de esterificação do ácido quínico com o ácido caféico não tem nenhuma influência na propriedade antioxidante (15). O ácido clorogénico é um antioxidante natural, viável de ser utilizado em formulações cosméticas que visam proteger a pele contra o efeito nocivo dos danos oxidativos causados pela exposição à radiação UV. Quando aplicado topicamente antes da irradiação, este composto fenólico atua eficazmente na redução de danos do ADN, impede a formação de eritemas e aumenta a viabilidade celular (16,17). Contudo, por ser uma molécula que em contacto com a pele facilmente entra na circulação sistémica, sendo rapidamente metabolizada, é conveniente utilizar formulações tópicas que permitam uma libertação prolongada de AC para garantir proteção, mesmo durante longas exposições solares (18,19).
O AC (Figura 4) está presente em concentrações elevadas em grãos de café, maçãs, mirtilos, e diversas plantas usadas em infusões/chás (14,20,21).
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Figura 4. Estrutura química do ácido clorogénico.
1.2.1.3 Ácido protocatequínico (AP)
O ácido protocatequínico (ácido 3,4-dihidroxibenzóico) é um composto fenólico presente numa ampla variedade de frutas e vegetais, tais como azeitonas, uvas brancas e framboesas (Figura 5). Este composto relativamente simples, exerce efeitos biológicos benéficos sobre a saúde. O AP possui propriedades antioxidantes pelo que possui aplicações na proteção contra o stress oxidativo, sendo também um bom anti-inflamatório (22,23).
Figura 5. Estrutura química do ácido protocatequínico.
Numa outra perspetiva, este composto fenólico é um dos principais poluentes presentes em efluentes próximos de indústrias dedicadas a extração e produção de azeite, ou destilarias. Neste caso o tratamento biológico das águas residuais é ineficaz devido ao poder antimicrobiano de elevadas concentrações de AP, sendo no entanto utilizada radiação UV ou reação de Fenton para contornar este obstáculo e degradar o composto (24,25).
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1.2.2 Aplicações dos compostos fenólicos
Os ácidos elágico, clorogénico e protocatequínico possuem uma vasta gama de atividades biológicas, com efeitos benéficos para a saúde humana. De entre estas destacam-se as ações antioxidante, anti-inflamatória e anticancerígena, assim como o efeito antiviral do ácido elágico, a capacidade do ácido clorogénico para regulação dos metabolismos associados à glucose e aos lípidos, e o efeito antibacteriano do ácido protocatequínico. No capítulo seguinte iremos descrever mais em detalhe estas actividades.
1.2.2.1 Aplicações do ácido elágico
A importância do ácido elágico foi sistematizada na Tabela 2, onde são apresentadas as principais atividades biológicas e aplicações do ácido elágico com base em informações retiradas da literatura. O ácido elágico pode, por exemplo, inibir a secreção do antigénio HBeAg, o que implica a possível utilização deste composto fenólico como terapia para enfraquecer a tolerância imunológica de indivíduos infetados com hepatite B.
Tabela 2. Atividades biológicas e aplicações do ácido elágico. Atividade
biológica Local tipo de teste/células usadas aplicação referência
in vivo
inibição da expressão de óxido nítrico sintase (iNOS), ciclo-oxigenase-2 (COX-2), fator de necrose tumoral (TNF-α), interleucina (IL-6) e NF-kB/ ratos
prevenção de
cancro do cólon (26)
anti-inflamatório in vitro
inibição da expressão de IL-1β e TNF-α/ células pancreáticas prevenção de fibrose pancreática (27) in vivo
redução superior a 50% tanto na contagem de neutrófilos como na de eosinófilos, e inibição da expressão de citocinas IL-4, IL-5 e IL-13 igual ou superior a 50% / ratos com asma
tratamento de asma e outras alergias pulmonares (28) in vitro
redução de radicais livres DPPH, eliminação dos aniões superóxido e radical hidroxilo, ativação de enzimas antioxidantes superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT), e glutationa peroxidase (GPx) inibição da peroxidação lipídica provocada por H2O2 (29) antioxidante in vivo
diminuição de radicais livres, inibição de oxidação de LDL (lipoproteínas de baixa densidade), e inibição da expressão de caspase-8 e caspase-9/ coelhos
prevenção da
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in vivo
redução da degradação de fibras de colagénio responsáveis pela elasticidade da pele, diminuição da quantidade de rugas e inibição da expressão de metaloproteinases/ ratos submetidos a irradiação UVB
proteção contra oxidação por radiação UVB
(31)
in vitro
aumento da expressão do fator de transcrição para genes antioxidantes Nrf2, que origina aumento da expressão dos antioxidantes heme oxigenase 1 (HO-1) e superóxido dismutase (SOD)/ células humanas
proteção contra oxidação por radiação UVA
(32)
in vitro
ativação da expressão de genes p53/p21 supressores de tumores, com consequente paragem do ciclo celular em fase G1 após 48h/ células cancerígenas apoptose de células cancerígenas (33) anticancerígeno in vitro
inibição da expressão do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF165), diminuição dos
níveis de ATP para valores inferiores a 50%, e inibição da expressão de metaloproteinases igual ou superior a 50%/ células cancerígenas mamárias, do cólon e da próstata
apoptose de células cancerígenas
(34)
in vivo inibição de 25% da totalidade de enzimas do
citocromo P450/ ratos prevenção da formação de tumores (35) antiviral in vitro
bloqueio da secreção do antigénio HBeAg extracelular/ cultura de células infetadas com vírus da hepatite B (HBV) terapia para indivíduos infetados por HBV (36) in vivo
produção de anticorpos para o antigénio HBeAg e aumento da resposta imunológica/ ratos transgénicos produtores do antigénio HBeAg terapia para indivíduos infetados por HBV (37)
1.2.2.2 Aplicações do ácido clorogénico
A importância do ácido clorogénico foi sistematizada na Tabela 3, onde são apresentadas as principais atividades biológicas e aplicações do ácido clorogénico com base em informações retiradas da literatura. O ácido clorogénico pode, por exemplo, inibir a síntese de ácidos gordos e estimular a sua oxidação no fígado, podendo ser utilizado como agente de redução do peso corporal e regulação do metabolismo lipídico.
Tabela 3. Atividades biológicas e aplicações do ácido clorogénico. Atividade
biológica Local tipo de teste/células usadas aplicação referência
anti-inflamatório
in vitro/ in vivo
inibição da produção de citocina inflamatória IL-8, inibição da expressão de citocinas pró-inflamatórias do cólon MIP-2 e IL-1β / células
prevenção de cancro do
cólon
10
intestinais humanas e ratos
in vitro elevada capacidade de remoção de radicais
DPPH e catiões radicais ABTS
proteção contra stress
oxidativo
(15)
antioxidante in vitro
aumento da viabilidade celular, redução da formação de corpos apoptóticos, redução da expressão das proteínas pró-apoptóticas Bax e caspase-3, e aumento da expressão de proteína anti-apoptótica Bcl-2/ células humanas
proteção contra oxidação por radiação UVB (16) anticancerígeno in vivo
inibição da formação do marcador de stress oxidativo 8-hidroxi-desoxiguanosina (8-OH-dG)/ ratos prevenção da formação de tumores (39) in vitro
inibição de quinase Bcr- Abl que conduz à ativação de p38 proteína quinase ativada por mitógeno (MAPK)/ células de pacientes com leucemia mielóide crónica (CML)
apoptose de várias linhas celulares leucémicas (40) antiviral in vitro
inibição da replicação de DNA do vírus da hepatite B (HBV), e inibição da secreção de antigénio de superfície (HBsAg)/ culturas de células terapia para indivíduos infetados por HBV (41) hipolipídico in vivo
redução do peso corporal em aproximadamente 16% e do peso de tecido adiposo epididimal em cerca de 46%, redução das concentrações de triglicéridos e colesterol, inibição das atividades da ácido gordo sintase (FAS), 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA-reductase (HMG-CoA redutase) e acil-CoA: colesterol aciltransferase (ACAT)/ ratos
redução do peso corporal e regulação do metabolismo lipídico (42) hipolipídico/ hipoglicémico in vitro/ in vivo
inibição da expressão de glucose-6-fosfatase (G6Pase) e consequente diminuição da produção de glucose, aumento da expressão e translocação de GLUT 4, aumento da captação de glucose nos músculos esqueléticos em cerca de 67.9% com consequente redução do nível de glucose no sangue, inibição de 37.8% da síntese de ácidos gordos em hepatócitos e diminuição dos níveis de ácidos gordos livres, triglicérido e colesterol no sangue/ hepatócitos e ratos redução do peso corporal e regulação dos níveis de glucose no organismo (43)
1.2.2.3 Aplicações do ácido protocatequínico
A importância do ácido protocatequínico foi sistematizada na Tabela 4, onde são apresentadas as principais atividades biológicas e aplicações do ácido protocatequínico com base em informações retiradas da literatura. O ácido protocatequínico pode, por exemplo, inibir o crescimento de estirpes bacterianas Gram-positivas e Gram-negativas provocando alterações na permeabilidade da membrana celular que conduzem à libertação
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do conteúdo citoplasmático para o meio extracelular, possuindo aplicações como conservante alimentar.
Tabela 4. Atividades biológicas e aplicações do ácido protocatequínico. Atividade
biológica Local tipo de teste/células usadas aplicação referência
anti-inflamatório in vitro
inibição da expressão de citocinas pró-inflamatórias TNF-α e IL-1β, dos mediadores inflamatórios óxido nítrico (NO) e prostaglandina E2 (PGE2), de enzimas pró-inflamatórias óxido nítrico-sintase (iNOS) e da ciclo-oxigenase-2 (COX-2), inibição da fosforilação de IkB-α, da translocação nuclear do fator de transcrição NF-kB, e da ativação de proteína quinase ativada por mitogénio (MAPK)/ células RAW 264.7
prevenção de
inflamações (44)
antioxidante in vitro
redução da apoptose celular induzida por 0,4 mM H2O2, aumento dos níveis de glutationa
(GSH) e da atividade de catalase/ células PC12 prevenção de doenças neurodegener ativas (45) in vitro
redução da apoptose celular, aumento dos níveis de GSH, redução da expressão de caspase-3 e aumento da expressão de Bcl-2/ células PC12 prevenção de doenças neurodegener ativas tais como a doença de Parkinson (46) anticancerígeno in vitro
apoptose de células leucémicas, aumento de 180% no nível de retinoblastoma (RB) hipofosforilado e diminuição da RB hiperfosforilada, redução da expressão da proteína Bcl-2 para 47%, e aumento da expressão da proteína Bax em 181%/ células leucémicas humanas apoptose de linhas celulares leucémicas (47) in vivo
inibição da incidência de tumores em ratos, inibição da produção de descarboxilase ornitina epidérmica (ODC), inibição da produção de mieloperoxidase (MPO), e redução da produção de H2O2 na pele/ ratos
prevenção da formação de
tumores
(48)
hipoglicémico in vitro
aumento dos níveis de absorção de glucose, e aumento dos níveis de expressão e translocação de GLUT4/ células adiposas de ratos e humanos regulação dos níveis de glucose em diabéticos (49) antibacteriano in vitro
inibição do crescimento bacteriano, inibição de crescimento de L. monocytogenes em queijo creme mantido à temperatura ambiente e sob refrigeração/ seis estirpes de bactérias Gram-positivas e Gram-negativas
conservante
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1.2.3 Espécies reativas de oxigénio (ROS)
As diversas aplicações dos compostos fenólicos anteriormente mencionados, e em particular a aplicação na área da cosmética e em protetores solares fazem com que estes compostos se encontrem frequentemente expostos a condições oxidativas e à presença de espécies reativas de oxigénio (ROS). Este facto levantou-nos algumas questões que originaram a hipótese subjacente ao tema deste trabalho, ou seja, qual o efeito dos ROS na estrutura e atividade dos ácidos elágico, clorogénico e protocatequínico? Para contextualizar a problemática iremos fazer uma breve referência às espécies reativas de oxigénio, suas propriedades e reatividade.
As ROS são produtos do metabolismo celular, que ocorrem naturalmente nos organismos vivos sendo continuamente produzidas em todos os organismos aeróbios, principalmente como consequência da respiração aeróbia. O termo ROS abrange não apenas os radicais livres derivados de oxigénio, tais como anião superóxido (O2•-) e radical hidroxilo (HO•), mas também espécies químicas não radicalares com potencial oxidante, tais como o peróxido de hidrogénio (H2O2). Os radicais livres podem ser definidos como moléculas ou fragmentos moleculares contendo um ou mais eletrões desemparelhados em orbitais atómicas ou moleculares, sendo por isso espécies altamente reativas uma vez que necessitam de eletrões para estabilizar a orbital externa (51).
As ROS são reconhecidas por desempenharem um duplo papel, uma vez que podem ser prejudiciais ou benéficas para os seres vivos (51). Em baixas/moderadas concentrações, os efeitos benéficos ocorrem em diversos processos fisiológicos, nomeadamente na defesa contra agentes infecciosos, na regulação de sistemas de sinalização celular, e na indução de uma resposta mitogénica. Quando, em sistemas biológicos, há uma superprodução de ROS e essa quantidade de espécies pró-oxidantes excede a capacidade supressora dos antioxidantes enzimáticos ou não enzimáticos, verifica-se o efeito prejudicial dos radicais livres, denominado stress oxidativo. O stress oxidativo é responsável por danificar macromoléculas celulares como lípidos, proteínas ou DNA, inibindo o seu normal funcionamento. Por este motivo tem sido implicado num elevado número de doenças humanas, nomeadamente em cancro, arteriosclerose, artrite, diabetes, distúrbios neurodegenerativos (ex: Alzheimer, Parkinson), bem como no processo de envelhecimento (51). O processo de "regulação redox" protege os organismos vivos de
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perturbações no estado de equilíbrio entre as reações metabólicas pró-oxidantes/antioxidantes.
Os ROS podem ser formados como produtos do normal metabolismo celular durante a respiração celular, sendo produzidos pelas mitocôndrias, em peroxissomas, pelo citocromo P450, e em neutrófilos, eosinófilos ou macrófagos durante a resposta inflamatória (52). Algumas fontes exógenas destas espécies radicalares, incluem a radiação ionizante (ex: radiação UV, raios-x, raios-gamma), ozono (O3), e muitos fármacos quimioterapêuticos (53).
1.2.3.1 Tipos de espécies reativas de oxigénio
Os organismos aeróbicos são capazes de atingir uma maior eficiência na produção de energia em comparação com os organismos anaeróbios, devido à cadeia respiratória mitocondrial. Na mitocôndria, em células de mamíferos, a cadeia transportadora de eletrões é a principal fonte de ATP, sendo portanto essencial à vida. Durante a síntese de ATP pela mitocôndria, cerca de 1-3% de todos os eletrões presentes na cadeia de transporte escapam para gerar o anião superóxido (O2•-) em vez de contribuir para a redução de oxigénio a água (52). O anião superóxido, considerado o ROS "primário", é assim maioritariamente produzido a partir de ambos os complexos I e III da cadeia transportadora de eletrões pela adição de um eletrão ao oxigénio molecular (O2) . Contudo, por possuir elevada carga, o anião é incapaz de atravessar membranas lipídicas, e consequentemente permanece concentrado no interior da mitocôndria não sendo muito reativo. O ROS "primário" pode ainda interagir com outras moléculas para gerar ROS "secundários", quer diretamente, quer através de enzimas ou processos catalisados por metais (51).
A enzima Mn-SOD é a principal responsável pela degradação do radical O2•-, que ao reagir com protões (H+) é convertido em peróxido de hidrogénio e oxigénio molecular . No entanto, se não for adequadamente destruído, este radical superóxido é
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capaz de inibir o funcionamento da mitocôndria pela inativação do centro ferro-enxofre (Fe-S) presente na cadeia transportadora de eletrões, causando danos acumulados ao longo do tempo que culminam em apoptose (51).
O H2O2 pode ser rapidamente formada a partir do radical O2•- pela atividade catalítica da enzima superóxido dismutase (SOD) ou, menos frequentemente, ser espontaneamente originado a partir de oxigénio molecular em peroxissomas. Apesar da sua menor reatividade em relação aos outros ROS, o H2O2 desempenha um papel importante na carcinogénese, uma vez que é capaz de se difundir pelas mitocôndrias e atravessar as membranas celulares, provocando vários tipos de lesão celular. O peróxido de hidrogénio é convertido em oxigénio molecular e água (H2O) pela catalase, glutationa peroxidase ou peroxirredoxinas (53). Os peroxissomas são os locais principais de consumo de oxigénio na célula e participam em várias funções metabólicas que utilizam oxigénio. O consumo de oxigénio no peroxissoma leva à produção de H2O2 que é então utilizado para oxidar uma variedade de moléculas. Este organelo também contém catalase, responsável pela decomposição do peróxido de hidrogénio, impedindo a acumulação deste composto tóxico. Quando os peroxissomas estão danificados ou o seu conteúdo enzimático desregulado, ocorre libertação de H2O2 para o citoplasma que vai contribuir significativamente para o stress oxidativo (51).
O radical HO• (radical hidroxilo) é um ROS que possui elevada reatividade pois apresenta uma estrutura eletrónica muito instável, sendo um perigoso radical com um tempo de vida muito curto in vivo. Por esta razão quando produzido, o radical hidroxilo é incapaz de se difundir, reagindo próximo do seu local de formação. Em condições de stress oxidativo, um excesso de superóxido (O2•-) é capaz de libertar ferro (Fe2+) para o meio ao interagir com moléculas in vivo que contenham ferro. O ferro libertado fica disponível para participar com H2O2, na reação de Fenton , gerando o radical hidroxilo altamente reativo (51). O radical HO• pode também ser formado pela reação de Haber-Weiss através da interação entre o radical superóxido e o peróxido de hidrogénio. O anião superóxido participa ainda na reciclagem dos iões metálicos oxidados (Fe3+)através da sua redução a ferro e oxigénio (51).
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A reação de Fenton também ocorre na presença de outros metais de transição, nomeadamente cobre, crómio ou cobalto (53).
1.2.3.2 Danos provocados por ROS
Pode ocorrer um vasto número de alterações devido a reações com ROS, como por exemplo a clivagem de DNA ou a oxidação das bases purina e pirimidina. Se os sistemas de reparação não forem capazes de regenerar imediatamente o DNA, isto irá originar mutações resultantes do emparelhamento de bases erradas durante a replicação. A lesão de DNA provocada por ROS mais estudada é a oxidação de guanina pela ação do radical HO•, que origina a 8-hidroxiguanina (8-OH-G), sendo esta alteração implicada em vários tipos de cancro (Figura 6) (53). No entanto, o DNA não será quantitativamente o alvo mais importante dos ROS, uma vez que este apenas está presente no núcleo e mitocôndrias.
Figura 6. Reação de oxidação da guanina pela ação do radical hidroxilo (53).
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Os radicais peroxilo (ROO•) são uma espécie de radicais reativos que podem também ser formados em sistemas vivos a partir de oxigénio, sendo o radical hidroperoxilo (HOO•) a forma mais simples deste tipo de moléculas. Uma vez formados, os radicais ROO• possuem capacidade para oxidar a camada lipídica polinsaturada de membranas celulares num processo designado por peroxidação lipídica. Os produtos resultantes das reações de peroxidação lipídica são uma diversidade de aldeídos, sendo os componentes maioritários o malondialdeído (MDA) e o 4-hidroxi-2-nonenal (HNE), reconhecidos por serem fortes mutagénicos e cancerígenos (53). Para além disso, a oxidação de lipoproteínas de baixa densidade (LDL) durante o stress oxidativo é também responsável pelo desenvolvimento de arteriosclerose (52).
Os radicais hidroxilo e/ou superóxido podem também proceder à oxidação das cadeias laterais dos vários tipos de aminoácidos em proteínas, particularmente os resíduos de cisteína e metionina. A oxidação dos resíduos de cisteína conduz à formação reversível de dissulfuretos mistos entre grupos tiol de proteínas (-SH) e tióis de baixo peso molecular como a GSH (S-glutatiolação), que vão alterar a função da enzima (53).
Em locais de inflamação também ocorre a formação de ROS em fagócitos ativados durante a resposta imunitária, pois tanto macrófagos como neutrófilos possuem a enzima NADPH oxidase, capaz de catalisar a redução de um eletrão na conversão de O2 a superóxido (O2•-). Este origina o peróxido de hidrogénio pela ação da enzima SOD, e posteriormente a enzima mieloperoxidase (MPO) também presente em fagócitos converte o H2O2 em ácido hipocloroso (HOCl) .
O ácido hipocloroso pode então originar espontaneamente o radical hidroxilo pela reação tipo Fenton ou tipo Haber-Weiss em que o peróxido de hidrogénio é substituído por HOCl. Estas ROS não radicalares são importantes na defesa antimicrobiana para matar bactérias extracelulares ou ingeridas pelos fagócitos. Infelizmente, as suas ações não estão limitadas à finalidade pretendida, e podem contribuir
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para os efeitos prejudiciais observados no processo oxidativo induzido por radicais livres (52).
1.2.3.3 Defesas antioxidantes
O sistema de defesa engloba antioxidantes endógenos e exógenos, bem como enzimáticos e não enzimáticos. Os antioxidantes enzimáticos incluem a superóxido dismutase (SOD), a glutationa peroxidase (GPx) e a catalase (CAT). Os antioxidantes não enzimáticos são representados pelo ácido ascórbico (vitamina C), α-tocoferol (vitamina E), glutationa (GSH), carotenóides, flavonóides, entre outros. Alguns antioxidantes atuam em ambiente hidrofílico, outros em ambiente hidrofóbico, e alguns agem em ambos os ambientes (53).
SODs foram as primeiras enzimas antioxidantes caracterizadas, sendo que três diferentes tipos de SOD são expressas em células humanas, a SOD dimérica de cobre-zinco (Cu,Zn-SOD) com 32 kDa que está presente principalmente no citoplasma, a SOD tetramérica de manganês (Mn-SOD) com 96 kDa particularmente característica das mitocôndrias e a SOD extracelular (EC-SOD), todas capazes de remover os radicais O2 •-que são degradados a H2O2 e oxigénio molecular (53).
A catalase é uma enzima antioxidante tetramérica pesando 240 kDa. É principalmente peroxisomal, embora também esteja presente na fração citoplasmática. Esta enzima é responsável pela remoção de vários fenóis, álcoois e peróxido de hidrogénio . A catalase é uma das enzimas conhecidas mais eficiente, não ficando saturada por H2O2 independentemente da concentração (53).
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As enzimas GPx são um grupo de enzimas capazes de reduzir peróxidos de hidrogénio, usando GSH como substrato que é oxidado a dissulfureto de glutationa (GSSG) (Figura 7) (53).
Figura 7. Estruturas da glutationa (GSH) e do dissulfureto de glutationa (GSSG) (53).
A molécula glutationa é um tripéptido constituído pelos aminoácidos ácido glutâmico, cisteína e glicina (Glu-Cys-Gly), sendo a proteína tiol mais abundante em células eucariotas, atingindo concentrações milimolares tanto no citoplasma como no núcleo e mitocôndrias. Este antioxidante funciona como um tampão durante a “regulação redox”, mantendo um ambiente redox intracelular ideal para o bom funcionamento das proteínas sendo oxidado a GSSG durante o stress oxidativo ao reduzir o peróxido de hidrogênio e peróxidos lipídicos (ROOH) pela ação catalítica da enzima GPx.
A glutationa reductase (GR) é uma flavoenzima que permite a redução de GSSG a GSH através da oxidação de NADPH para NADP+ . A proporção de GSH/GSSG é uma boa medida para expressar o stress oxidativo em células (53).
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A vitamina C (ácido ascórbico) é um antioxidante muito importante, que atua em ambientes aquosos do corpo, tais como nos pulmões e nos olhos. A vitamina C coopera com a vitamina E para regenerar α-tocoferol a partir de radicais α-tocoferol em membranas e lipoproteínas. O ácido ascórbico tem dois grupos hidroxilo ionizáveis, sendo portanto um di-ácido (AscH2). Em condições de pH fisiológico, 99,9% da vitamina C está presente como AscH-, e apenas pequenas proporções como AscH2 (0,05%) e Asc2- (0,004%) (Figura 8). O produto da oxidação do ascorbato (AscH-) por muitas espécies ROS é o radical semi-desidroascorbato (Asc•-), um radical pouco reativo que pode ser convertido de volta a ascorbato por enzimas dependentes de NADH. A vitamina C protege as membranas contra a peroxidação lipídica, evitando por exemplo a oxidação de LDLs, que desempenham um papel importante na arteriosclerose (52).
Figura 8. Formas do ácido ascórbico em função do pH, e sua reação com radicais (R•) (53)
A vitamina E é uma vitamina liposolúvel que existe em oito formas diferentes. A forma mais ativa de vitamina E em seres humanos é o α-tocoferol, sendo um poderoso antioxidante biológico. O α-tocoferol é considerado o principal antioxidante utilizado pelas células e a sua principal função é a proteção contra a peroxidação lipídica. Evidências recentes sugerem que o α-tocoferol e o ácido ascórbico (principal antioxidante de fase aquosa) funcionam em conjunto numa reação de tipo cíclica. Durante este processo, o α-tocoferol é convertido no radical α-α-tocoferol pela doação de um hidrogénio a um lípido ou radical peróxido lipídico. O radical α-tocoferol (forma oxidada) pode assim ser reduzido para a forma original α-tocoferol pelo ácido ascórbico (Figura 9) (52).
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Figura 9. Reação cíclica entre vitamina E e vitamina C, durante a proteção contra
peroxidação lipídica (52).
O efeito do stress oxidativo em compostos fenólicos utilizados como antioxidantes é ainda pouco conhecido, bem como é desconhecido o efeito dos possíveis produtos de oxidação de fenólicos que se possam formar.
1.2.4 Mecanismos de oxidação
Os compostos fenólicos ácido elágico, clorogénico e protocatequínico foram expostos a três processos de oxidação distintos, radiação UV, reação com ácido ascórbico ou reação de Fenton, de modo a estudar o comportamento dos compostos ao interagirem com as espécies reativas características formadas, bem como os produtos de oxidação gerados para cada um dos mecanismos usados. Desta forma, nas próximas reações deste documento iremos rever os mecanismos de cada um destes processos de oxidação.
Vitamina E
Vitamina E•
Vitamina C• (Asc•−)
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1.2.4.1 Radiação UV
Em soluções irradiadas com UV, a oxidação do composto fenólico ocorre por fotólise direta. Utilizando uma solução aquosa contendo apenas o composto fenólico estudado, e considerando que a penetração da radiação UV se faz sentir principalmente à superfície do meio aquoso, a água (H2O) será o interveniente maioritário na formação de ROS. As moléculas de água sujeitas a radiação UV, podem gerar a espécie excitada H2O*, que posteriormente dá origem aos radicais livres HO• e H• , bem como eletrões hidratados (eaq
−) . O composto fenólico também pode ser diretamente excitado conduzindo à sua fotoionização ou dissociação radicalar. A matriz de reações denota que os principais intervenientes na oxidação do composto fenólico serão os radicais HO• e H•, contudo também o anião superóxido (O2•−) e o radical hidroperoxilo (HO2•) poderão exercer um importante papel oxidativo, dependendo da concentração de oxigénio dissolvido no meio reacional (54,55).
1.2.4.2 Reação ácido ascórbico/
O ácido ascórbico é um agente redutor, amplamente reconhecido como um poderoso antioxidante na proteção contra os efeitos prejudiciais dos radicais livres. O ascorbato pode no entanto exercer um efeito oxidativo e consequentemente originar ROS. Este processo é iniciado pela formação de radicais ascorbato resultantes da reação entre ácido ascórbico na presença de iões cobre (Cu2+) . A posterior interação do
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radical ascorbato com oxigénio dissolvido no meio reacional gera o radical hidroperoxilo (HO2•) e ácido dehidroascórbico (C6H6O6) . Sabendo que o ácido ascórbico (C6H8O6) e o ião cobre são os constituintes maioritários presentes em solução, com base no mecanismo reacional é possível propor que o radical ascorbato (C6H7O6•) será o principal interveniente na oxidação do composto fenólico. Os radicais hidroperoxilo (HO2•), peróxido de hidrogénio (H2O2) e hidroxilo (HO•) desempenharão um papel secundário com importância relevante em função da quantidade de oxigénio dissolvido no meio reacional (56,57).
1.2.4.3 Reação de Fenton
A reação de Fenton é um processo de oxidação que se baseia na geração do radical hidroxilo. O radical HO• resulta da decomposição de peróxido de hidrogénio na presença de iões de ferro, e possui elevada reatividade pois apresenta uma estrutura eletrónica muito instável . O mecanismo de oxidação de um composto fenólico pelo processo de Fenton é bastante complexo pois envolve a formação de outros ROS. Sabendo que o ião ferro (Fe2+) e o peróxido de hidrogénio (H2O2) serão os constituintes maioritários em solução, os principais intervenientes no mecanismo de oxidação do composto fenólico serão o peróxido de hidrogénio e o radical hidroxilo, e num segundo plano o radical hidroperoxilo (HO2•) . O processo de Fenton pode ser utilizado para estudar os efeitos provocados pela interação de compostos fenólicos na presença de ROS. Outras aplicações envolvem a utilização de Fenton no tratamento de águas residuais, desempenhando um importante papel na degradação de matéria orgânica.
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É um processo económico que não requer reagentes complexos e que ocorre em condições ambientais de pressão e temperatura, para além de possuir tempos de reação relativamente curtos (58,59).
1.2.5 Técnica de separação - HPLC
Atualmente, existe cada vez mais necessidade em conhecer os perfis químicos dos antioxidantes presentes em diferentes plantas, e entre as diferentes variedades da mesma planta, de modo a estudar propriedades e aplicações desses compostos. Embora as técnicas cromatográficas convencionais como a cromatografia em camada fina (TLC) e cromatografia em coluna (CC) ainda sejam utilizadas como ferramentas de separação para muitos antioxidantes devido ao baixo custo, em geral estas não possuem a sensibilidade e resolução que são muitas vezes necessárias para a deteção destes compostos em quantidades vestigiais. A cromatografia gasosa (GC) atende a esses requisitos, contudo o seu uso é um pouco limitado uma vez que a maioria dos antioxidantes não são voláteis. Portanto, a cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) é talvez a técnica cromatográfica mais utilizada e confiável para a separação, identificação e quantificação de compostos fenólicos. A versatilidade da HPLC é igualmente auxiliada pelos diferentes métodos de deteção, entre os quais o detetor UV-vis, por arranjo de díodos (DAD) e a espetrometria de massa (MS) (60).
Na cromatografia líquida a separação de compostos é feita numa fase estacionária com base nas interações com uma fase móvel. Ao contrário do que acontece na cromatografia de fase “normal”, na cromatografia de fase reversa utiliza-se uma fase
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estacionária hidrofóbica e uma fase móvel hidrofílica. Consequentemente, quanto mais hidrofóbicas forem as moléculas presentes na fase móvel polar, maior será a sua tendência para se ligarem fortemente à fase estacionária hidrofóbica, enquanto as moléculas hidrofílicas na fase móvel atravessam a coluna e são eluídas em primeiro. As moléculas mais hidrofóbicas serão eluídas, diminuindo a polaridade da fase móvel pela utilização de um solvente orgânico apolar cujo gradiente de concentração aumenta ao longo do tempo, o que vai reduzir as interações hidrofóbicas. Apesar da diversidade de fases estacionárias disponíveis, as colunas de HPLC escolhidas para a separação de compostos fenólicos têm sido maioritariamente colunas de fase reversa, contendo uma fase estacionária de sílica C18 com diâmetro interno variando de 2,1 a 5 mm. Contudo em estudos com espetrometria de massa acoplada à cromatografia líquida, foi relatada a utilização de colunas com menor diâmetro interno (1,1 mm a 2,1 mm) (61).
Os sistemas de eluição de gradiente linear envolvem geralmente a utilização de um solvente binário constituído por uma fase aquosa (solvente A) e por uma fase orgânica (solvente B), em que a composição (fase aquosa-fase orgânica) se vai alterando durante o processo de separação. Tipicamente, é adicionado um ácido à fase aquosa, sendo o ácido acético e o fórmico os mais utilizados, embora o uso de outros ácidos tenha sido referenciado, como os ácidos sulfúrico, perclórico, fosfórico, trifluoroacético e clorídrico. Os solventes orgânicos predominantemente usados são o metanol e o acetonitrilo, no entanto outros solventes como o propanol, butanol, tetra-hidrofurano ou acetato de etilo também podem ser utilizados. Os tempos de corrida variam entre 30 a 150 min, dependendo do tipo de coluna e complexidade de amostras analisadas. Os caudais variam dependendo da coluna e tamanho de partícula. Normalmente os volumes de injeção relatados variam de 10 a 20 μL. As temperaturas de acondicionamento da coluna variam de 20 a 45 °C. O controlo de temperatura tem-se mostrado necessário principalmente na reprodutibilidade (61). A cromatografia líquida acoplada a espetrometria de massa (LC-MS) tem sido utilizada amplamente e com sucesso na caracterização de composto fenólicos das mais diversas origens, incluindo o ácido elágico (62,63), o ácido clorogénico (64,65) e o ácido protocatequínico (66,67).
Neste trabalho as amostras foram quantificadas por UHPLC (cromatografia líquida a pressão ultra-elevada). A diferença entre UHPLC e HPLC, é que no UHPLC se utiliza uma fase estacionária com tamanhos de partículas de menores dimensões, ao mesmo
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tempo em que se operam a pressões mais elevadas para garantir um maior caudal. Tal resulta numa melhor resolução, isto é, melhor separação dos compostos, num menor período de tempo do que em HPLC.
1.2.6 Técnicas de deteção de HPLC
Um dos detetores de HPLC mais usados para compostos fenólicos são os detetores de UV-vis ou DAD. A desvantagem deste método de deteção é a ausência de informação estrutural e alguma falta de especificidade levando à possibilidade de interferência na matriz da amostra e errada atribuição de picos. Ao longo dos últimos anos, o acoplamento de detetores de espetrometria de massa (MS) em sistemas de cromatografia líquida tornou possível a identificação e caracterização estrutural de compostos fenólicos, sendo atualmente a técnica analítica usada na identificação e quantificação de compostos desconhecidos em amostras não purificadas.
1.2.6.1 Espetrofotometria de UV-visível (UV-vis)
A espetrofotometria de UV-vis tem sido muito utilizada para a deteção de compostos fenólicos, pois a grande maioria destes compostos possui anéis aromáticos que absorvem luz na região do ultravioleta e do visível. A conjugação entre a informação do espetro UV-vis, obtido pelo detetor DAD para cada pico de eluição de uma amostra, e o respetivo tempo de retenção, pode conduzir à identificação dos analitos por comparação com padrões submetidos ao mesmo procedimento. Além de permitir obter o espetro UV-vis para cada pico, o detetor DAD é ainda capaz de simultaneamente fornecer os cromatogramas a diferentes comprimentos de onda, o que melhora significativamente o desempenho do sistema de separação, particularmente quando numa amostra está presente a mistura de diferentes compostos fenólicos. Quando são selecionados os comprimentos de onda (λ) mais adequados (ex: λ onde as absorções são máximas = λmax) todos os compostos fenólicos podem ser detetados com maior sensibilidade (60). Apesar do UV-vis associado a DAD fornecer informações úteis para a identificação de compostos fenólicos, é
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muitas vezes um método limitado quando as amostras contêm compostos muito semelhantes. Por exemplo, sabendo que os ácidos fenólicos contendo um anel ácido benzóico possuem λmax na gama entre 200-290 nm, e que os derivados de ácido cinâmico apresentam λmax entre 270-360 nm, se para além de terem picos de absorção muito próximos também possuírem tempos de retenção semelhantes vai impossibilitar a inequívoca identificação dos analitos, pois ao contrário dos detetores MS, esta técnica não permite a identificação de estruturas dos compostos (60,61).
1.2.6.2 Espetrometria de massa (MS)
A espetrometria de massa é uma técnica analítica que produz iões moleculares, sendo estes posteriormente detetados em função da sua razão massa-carga (m/z). O funcionamento dos espectrómetros de massa contempla quatro etapas fundamentais. Após a introdução da amostra, são gerados iões pela fonte de ionização, operando a pressão atmosférica ou a pressões de vácuo. A criação destas espécies carregadas é necessária para possibilitar a separação de iões de acordo com a sua razão de m/z num analisador de massa. Finalmente, ocorre a deteção dos iões, quer fisicamente como uma corrente de iões que chega ao detetor, quer através da deteção de frequências orbitais como uma corrente de imagem (Figura 10) (68).
Figura 10. Esquema do funcionamento de um espectrómetro de massa (68). Gás Líquido Sólido Introdução da amostra Fonte de ionização Analisador de massa Sistema de deteção Computador
