Otimização da diagnose molecular de vírus, bactéria e fungo em cana-de-açúcar. - Portal Embrapa

RESUMO EXPANDI DO

121

OTIMIZAÇÃO

DA DIAGNOSE

MOLECULAR

DE VIRUS,

BACfÉRIA

E FUNGO EM CANA-DE-AÇÚCAR

1

'

H.E. SawazakP,

L

.

A

..

N. Sá

2,

M.Q. Alcântara

"

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V.L

.

P. Polez

3,

C.R

.

N.C

.

B.

Gonçalves',

R.F.A. Veiga

1,

C

.

A. Colombo'

'

Instituto

Agronômico,

Centro de Genética

Biologia Molecular

e Fitoquímica,

Biologia Molecular,

CP 28,

CEP 13012

-

970

,

Campinas,

SP

,

Brasi

l.

E-ma

i

l: henok@iac.sp.gov.br

RESUMO

Visando à otimização da diagnose molecular de plântulas de cana-de-açúcar, tentou-se desen-volver iniciadores específicos para escaldadura e ferrugem alaranjada, assim como a comparação da PCR comum e a PCR em Tempo Real (PCR/TR) de maior resolução, importante para doenças com grande período de latência, como as causadas por: 1- Bactérias, (a) raquitísmo-da-soqueira

(Leifsonin

xyli subsp. Xyli) e (b) escaldadura

(Xanthomonas

aibilineans);

2- Vírus, (a) amarelinho

(Sugarc.ane

Yellow Leal Vírus);

(b) mosaico

(Sugarcane Mosaic

Vírus) e

(c) fijivirus (fijí

disease vírus);

3- fungo, (a) carvão

(Sporisorium

scitamineum)

e (b) ferrugem alaranjada

(Puccinia kueh/tii).

As plântulas foram obtidas do quarentenário do lAC Os iniciadores da literatura para cana-de-açúcar detectaram especificamente o raquitismo, amarelinho, mosaico e fijivirus, enquanto os desenvol-vidos para PCR/TR para as mesmas doenças, incluindo a escaldadura e ferrugem alaranjada, possibilitaram

a

detecção com maior diluição das amostras. Os iniciadores da ferrugem alaran-jada, além de não detectarem a ferrugem marrom., também diferenciaram a ferrugem branca do milho. Os da escaldadura não foram específicos somente para o gênero Erunnia, enquanto que os da literatura não diferenciaram também outras espécies dos gêneros

Kanthomonas,

Pseudomonas,

Enoinia,

Stenotrophomona

e

Pantoea.

A otimização das diluições para PCR/TR a partir de cDNA foi de apenas lOX.Porém, para extratos de DNA de pLanta, foi maior, de lOOX a lOOOX,indicando a maior sensibilidade do método. Dos 28 pares de iniciadores testados, os melhores para o agente causal de cada doença e curvas de diluições (com eficiência de PCR de 1,05 a 1,28) são apresentados. PALA VRAS-CHA VE: Raquitismo-da-soqueira, amarelinho, mosaico, fijivirus, carvão, ferrugem

alaranjada.

ABSTRACT

OPTIMIZA TION OF MOLECULAR DIAGNOSIS FOR VIRUS, BACTERIA AND FUNGUS lN SUGARCANE. Aiming for optimizing the Jnolecular diagnosis of sugarcane seedlings, the development of specific primers for scald and oré}nge rust has been tested, as well the comparison of common PCR and the RT/PCR

ó

f

hígher resolution (Real Time PCR), important for diseases with extended latent period), such as those caused by: 1 - Bactéria, (a) ratoon stunting disease

(Leifsonin

xyli subsp. xyli) and (b) sugarcane leaf scald

(Xanthomonas albilineans)

2 - Viruses, (a) yellowing

(Sugarcane Yellow Leal Virus),

(b) mosaic

(Sugarcane Mosaic Vírus)

and

(c)

fijivirus

(fiji

diseasefijiuirus)

3 - Fungus, (a) smut (Sporisorium

scitamineum)

and (b) orange rust

(Puccinia

kueJl1!Íl)

has been compared. Seedlings were obtained from IAC quarantine. The sugarcane primers from literature have detected ratoon stunting, yellowing, mosaic and fijivirus while the primers developed for RT/PCRfor the same diseases, induding rust orange and scald, allowed the detection of samples wíth greater dilution. The primers for orange rust, did not amplify for brown rust and also differentiated the white rust of com. The developed primers for scald only were not specific for the genus Enoinia, while the others from literature haven't differentiated also others specíes of the genus

Xanthomonas, Pseudomtmas,

Enuinia,

Stenotrophomonas

and

Pantoea.

The optimization of cONA dilutions for RT /PCR about 10X,but for plant DNA extract, was greater, from 100X to 1000X,

2Embrapa Meio Ambiente, Jaguariúna, SP, Brasil.

3Embrapa Biotecnologia, Brasília, DF;, Brasil

·Centro de Tecnologia Canavieira, Piracicaba, SP, Brasil. "Auxílio financeiro - CNPq/MAPA Edital no.64/2008. -Bolsista CNPq.

indicating the higher sensiti

v

it

y

of methodology

.

From 28 primer pairs tested, the best for the

c

a

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ACGCGCTA

A

CC

G

TCGTAGACA

112 55

33

2

FijiF

CGAA

G

CTCAAC

TTG

A

T

G

110 43

143Am

R

TC

C

TC

GCA

C

A

GCGT

TT

CC

11

2

55

44

1Fi

j

iR

GGTT

A

C

GG

TCAG

A

CfGT

11

0

43

7AmF2

ACCGC

r

CAC

G

A

AG

GAATGTC

61

5

0

lF

eLR

F

CC

fT

AGT

AA

C

G

G

CGA

G

T

GAA

77

42

67AmR2

ACCACfCGCCGAGT

C

TCTCl'

61

50

77FeLR

AA TTA

C

AACTCAG

A

CTCCfT

77

42

32AmF

ACGCGC

T

A

ACCG

TCCTAGACA

1

0

8 5

6

5

01

F

e

LF

TnG

A

TG

G

AATGC

f

T

AAG

ATTCAGGAA

153 50

139AmR

CG

C

ACAGCGTITCCTCCAA

1

0

8

S6

6S3F

e

L

R

AC

f

C

GC

A

A

G

CA

T

GTTAG

A

CTCC

TT

GG

153

5

0

211MosF

CAT

C

TCCAA

C

A

TT

CCGGCAA

110

48

57

F

e

L

F

AAA

C

GAGTCTGAG

T

TCTAATTT

66

42

320MosR

TCGCTG

AAG

TC

CA

TATCGTG

11

0

48

12

2

F

eLR

T

T

TC

A

A

CAGA

C

TT

ATACATG

G

T

66

4

2

286MosF

C

A

GAG

CGAT

AC

A

TG

CC

A

CG

A

69

4

9

5

72F

eLF

TTTATT

A

C

TG

A

G

GATGTTG

141 44

354.M.osR

AGGC

A

T

AC

CG

CGCTAAGCfA

69

49

7

1

2

Fe

L

R

AAAG

A

C

G

A

TC

C

CATTTAC

141 44

R

ESULTA

DO

S

o

m

e

lh

or i

ni

c

iador

pa

r

a aumento

d

a e

spe

ci

fi

ci

-dade

d

a es

c

a

ldadu

r

a

fo

i o

27E

scF /5

71

E

s

c

R com ane

-la

m

en

to

a 64

()

C p

o

r 40 segundos.

N

a

Fi

gura 1 estão

aprese

n

ta

d

os

o

s

f

ra

gmentos

amplif

i

cado

s

c

om o par

de

pr

i

m

e

r 27

Es

cF

/

5

7

1EscR com duas condiç

õ

es

:

A

-a

ne

l

am

e

nto

a

64

°

C por 40 s

e

gundo

s

e B

-

anelamento

a 6

2

"<

:

p

or 4

0

segundos

,

onde se ver

if

ica a

amplifi-cação

d

o

fr

ag

men

t

o

de 544pb a

p

enas

pelo DN A da

Xant

h

omona

s

aibiii

ne

an

s

(8) e da provável

Erun

ni

a

sp

.

(9), p

or

q

ue

o

B

L

AST dos fragmentos

das bactérias 3,

7 e 9, não foi

conc

l

u

s

i

v

o,

i

ndicando

se

r

ou o gêne

r

o

P

an

t

o

e

a

ou

Erwini

a

.

Como em alguma

repetiç

ã

o

de

re

a

çã

o

,

a bactér

ia

7 amplificou o fragmento

de 544pb

,

en

quanto

a

bactéria

6

(Pantoea sp

.

jEnt

e

roba

c

t

er

sp.

)

n

un

ca

ampl

i

ficou

o

fragmento

esperado.

Prova

v

e

l

-mente, a

ba

c

t

ér

ia 9

é

do g

ên

ero

E

n

oi

n

i

a

, a

m

e

no

s

que a

b

a

c

t

é

r

i

a

6

s

e

j

a

uma enterobacter,

o que

i

nd

ic

ar

i

a a não

esp

e

c

i

fi

c

i

dade

em

r

elação

à

P

ant

oea

.

Porém

,

também

;

a

ba

ctéri

a 9 pode

s

er uma Xanthomona

s

albilineans,

i

nd

ic

ando

que o par de primer 27EscF/571EscR

foi

es

pe

c

í

f

i

co

em rel

a

ção

ao

s

gênero

s

estudados.

Em

t

emperat

u

ra

de anelamento

a 60

"

C por 1 minuto

,

observou

-

se

a amplificação

de vários

fragmentos

,

s

e

n

d

o c

omum pa

r

a todos os gêneros

,

a ampl

i

ficação

de c

e

rca

d

e

400 pb obser

v

ada

na Figura

1 para as

ba

c

t

éri

as

3

e

4

que nunc

a a

m

p

l

ificar

am

o fr

agm

e

nt

o

e

sperado

,

mesmo

s

endo

a

ba

cté

ri

a

4 uma

K

a

n

ih

o-m

on

a

.

Portant

o

,

o par d

e i

n

ic

iador

27E

scF

/571

E

scR

rep

re

senta

um a

va

nço

,

poi

s

os da lite

r

atura

,

como

o

prim

er

de D

AVIES

e

t ai

.

(2008) da Figu

ra

2

,

não di

fe

-ren

ci

ou

e

sp

é

cies dos gên

e

ros

Eno

inia

, Kan

thom

o

na

s,

P

se

udomo

n

a

s,

S

te

n

otro

ph

om

ona

e P

ani

oea.

Para

-

a

ferrugem

alaranjada

,

o pa

r

de iniciado

r

FL57F /FL7I

.

2R somente f

o

i esp

e

cífico com anelamen

-to a 65

°

C

.

.

l

i

!0

:

30 segundos

.

E

sse

s i

n

ici

adores

,

al

ém

de não detectarem

a ferrugem

marrom

,

da me

s

ma

forma que os da

l

iteratura

(

A

rME,

2006

;

S

AWAZA[(]

et

al

.

, 20

1

0)

,

também

d

i

fere

nc

iaram

a

f

errugem

branca

do milho com o aumento

da tempe

r

atu

r

a

e

menor

tempo de ane

l

arnento

.

Todas as 40 amostras

testadas com

o P

CR foram

confi

r

madas

em tempo real

.

Todos os

i

n

i

c

i

adores tes

-tados perm

i

tiram

a ampl

i

ficaç

ã

o

de produt

o

s. Porém

,

do

s

cerca de 28 p

a

res de in

i

ciador

e

s,

os melhores pa

r

a

cada doença

e curvas

de dilu

i

ç

õ

es

r

eali

z

adas

com

fragmentos

amplif

i

cado

s

donados

em

plasm

í

deos

estão

a

presentados

com as

T

ab

e

las 2 a 8 de di

l

uição

com os CT

(

threshold

c

y

ele) e eficiência de PCR ob

-tidos (o coefi

c

iente

R

2

observado

par

a

todos

f

oi d

e

0(99) para ferrugem

alaranjada

(2)

,

fiji (3), mosaico

(4)

,

amarelinho

(5)

,

raqu

i

tismo

(

6)

,

esca

l

dadur

a

(7

)

e carvão (8)

.

Fig

.

l- Perfil de fragmentos amplificados usando

-

se o par de primer 27EscF/571EscR em duas condições de

anelamen-to A: 64°C/40s e B

:

62

"

C/40s, e o DNA das bactérias: 1

:

-Pseudomonl1s pie

c

ogtoesicida; 2-Pseudoxantlwmonas

sltwonensis

;

3

-

Envinía sp/panto

e

a sp.;

4-

Kanihomonas sp

.

;.5-Stenotrophomonas

maliophilia

;

6

-

Panto

e

a spjEnterobacter

sp.;

7-

Erunnia sp/

Pantoea sp

.

; 8

-

Xanthomonas albilinean

s

; 9-Xanthomonas alullineans/En

o

inia sp

.

/panto

e

a sp

.

; 10-controle negativo

;

P- Padrão

de 100pb (Ludwig Biotec)

.

Fig

.

2 - Perfil de PCR de fragmentos amplificados com os primers de Dx

v

is

e

r

aI.,

1998e o DNA das bactérias: 1 e

2,con-trole positivo de folha infectada com escaldadura;

3-

controle negativo de folha sadia; 4-

Pseudoxanthomonas

suuionen

s

i

s

ou sp.; S

-

Pantoea sp

.

/ Erunnia sp.; 6

-

Panioe

á

sp/Enuínia

'sp: 7-Xaitlhomonas sp.; 8-Pseudomonas putida/P

.

sp., 9-Pantoea

agglomeransjP

.

sp

.

; 10-Stenotrophomonas

maltophilia; 11- XanthomolUls albílineans; 12- Xanthomonas albilinean

s;

13

-

Xanthcr

mona

s

albilineans

;

14-

Pantoea sp

.

f

E

runn ia sp.; 15-Pantoea sp/En

u

inia

sp.

Tabela

2 -

Dados da curva de diluição para o iniciador 57FLF/ll2F.LR para a ferrugem alaranjada

.

Detector

Diluição

cr

No

.

copia plasmídeo Log no

.

plasmfdeo

FL57/122

100

.

000

20,00

36.000

.

000

7,56

FL57/122

1

.

000

.

000

23,88

3

.

600.000

6,56

FL57/122

1

.

000

.

000

24

,

18

3

.

600.000

6

,

56

FL57/122

10

.

000.000

26,26

360

.

000

5

,

56

FL57/122

10.000

.

000

26,26

360.000

5

,

56

FL57/122

100.000

.

000

29,36

36.000

4

,

56

FL57/122

100

.

000

.

000

29,36

36.000

4,56

FL57/122

1.000

.

000.000

32,27

3.600

3,56

FL57/122

10.000

.

000.000

35,23

360

2

,

56

FL57/122

NTC

Indeterminado

FL57j122

NTC

lndeterminado

A curva

de diluição

forneceu

a eficiência

de

PCR de

1,12

.

A leitura

dos CTs de 5 diluições

de

DNA de amostra

de ferrugem

laranja

:

20X

para

5/ ~L; 100X/ 5,0/ ~L; 100X/l

,

0/

~L; lOOOX/5,0/

~L;

1000/1,0/IlL,

forneceram

os respectivos

CT

de

34,52; 26,05; 25,73; 26,26

e

28,36,

indicando

a otimização

na faixa

das diluições

de

100X

a

1

.

000X.

de 1,14 e 1,13. As amostras de cDNA do amarelinho mostraram os melhores resultados com 1 J.1Lsem diluição até 2-5 IlL de amostra diluída ~penas 10X, indicando novamente que para amostras de cDNA não foi possível fazer muita diluição.

Foi observada para o iniciador 128EscF /257EscR da escaldadura a eficiência PCR del,12, enquan-to para os iniciadores 343CarF / 443CarvR e 261CarvF/354CarvR do carvão e as respectivas eficiências de PCR de 1,18 e 1,20.

CONCLUSÃO

Os

iniciadores da literatura para cana-de-açúcar detectaram especificamente o raquitismo, amareli-nho, mosaico e fijivirus, enquanto os desenvolvidos para PCR/TR para as mesmas doenças, incluindo a escaldadura e ferrugem alaranjada, possibilitaram a detecção com maior diluição das amostras.

O par de iniciadores FL57F /FL712R desen-volvido para ferrugem

alaranjada,

além de não detectar a ferrugem marrom, também diferenciou a ferrugem branca do milho. O par de iniciadores 27EscF/571EscR para escaldadura somente não foi específico para o gênero

Enoinia,

enquanto os da lite-ratura não diferenciam também espécies dos gêneros

Xanthomona

s,

Pseudomonas,

Erunnia,

Stenotrophomona

e

Panioea.

A otimização das diluições para PCR/TR

a

partir de cDNA foi de apenas 10X, porém, para extratos de DNA de planta, foi bem maior, de 100X a 1000X, indicando a maior sensibilidade do método.

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v.153, n.6, p.l031-1039, 2008.

Foi

observada

para

o

iniciador

32,33, indicando que as leituras a partir do

cDNA

332FijiF

j

441FijiR do fijivirus a eficiência de PCR

não permitiram muita diluição.

de 1,09, enquanto para os iniciadores do mosaico,

Foram

observadas

para

os iniciadores

286MosF1j355MosR1 e 287MosF j354MosR, as

32AmarFj139ArnarjR

e 7ArnarF2j67AmarR2, as

respectivas eficiência PCR de 1,0~ e 1,05. Para 51!L

respectivas eficiências PCR de 1,19e 1,28,enquanto

de cDNA de 5 amostras de mosaico diluídas 10X.

para os iniciadores do raquitismo 334RaqF/ 439RaqR

foram observados os CTs de 31,22; 31,55; 31,50;

e 363RaqF/439RaqR

,

as respectivas eficiências PCR

Tabela 3-Dados da curva de diluição para o iniciador 332FijiF / 441FijiR do fijivirus 286MosF1/355MosRl do mosaico.

Detector Diluição CT No. cópia Logplasm Detector Diluição CT No. cópia Log.

Plasmfdeo plasmfdeo plasm

Fij332/491 1.000.000 19,93 4.000.000 6,6 Mos286/354 1.000.000 20,55 2.500.000 6,31

Fij332/491 1.000.000 20,14 4.000.000 6,6 Mos286/354 1.000.000 21,02 2.500.000 6,31

Fij332/491 10.000.000 23,58 400.000 5,6 Mos286/354 10.000.000 24,00 250.000 5,31

Fij332/491 10.000.000 24,24 400.000 5,6 Mos286/354 10.000.000 24,00 250.000 5,31

Fij332/491 100.000.000 26,11 40.000 4,6 Mos286/354 100.000.000 27,41 25.000 4,31

Fij332/491 l00.0m.OOO 26,8 40.000 4,6 Mos286/354 100.000.000 27,41 25.000 4,31

Fij332/491 1.000.000.000 29,23 4.000 3,6 Mos2B6/354 1.000.000.000 30,33 2.500 3,31

Fij332/491 1.000.000.000 29,23 4.000 3,6 Mos286/354 1.000.000.000 30,33 2.500 3,31

fij332/491 10.סס0000000 32,04 400 2,6 Mos286/354 10.סס0000000 33,55 250 2,31

Fij332/491 10.000000<XXJ 33,06 400 2,6 Mos286/354 10.סס0000000 33,72 250 2,31

Fij332/491 NTC Indeterm Mos286/354 NTC Indeterm

Fij332/491 NTC Indeterm Mos286/354 NTC lndeterm

Tabela 4 - Dados da curva de diluição para o indiciador 32AmarF /139Amar/R do amarelinho.

Detector Diluição

cr

No. cópia Log Detector Diluição CT No. cópia Logplasm

plasm plasm plasmldeo

Am32/139 100.000 18,42 34.000.000 7,53 Raq334/439 100.000 17,81 2.970.000 6,47 Am32/139 100.000 18,46 34.000.000 7,53 Raq334/439 100.000 18,21 2.970.000 6,47 Am32/139 1.000.000 21,26 3.400.000 6,53 Raq334/439 1.000.000 20,38 297.000 5,47 Am32/139 1.000.000 20,63 3.400.000 6,53 Raq334/439 1.000.000 20,38 297.000 5,47 Am32/139 10.000.000 23,30 340.000 5,53 Raq334/439 10.000.סס00 23,14 29.700 4,47 Am::l2/139 10.000.000 23,09 340.000 5,53 Raq334/439 •.10.000.סס00 23,14 29.700 4,47 Am32/139 1.00.000.000 26,34 34.000 4,53 Raq334/439 100.000.000 25,39 2.970 3,47 Am32/139 100.000.000 26,21 34.000 4,53 Rag334/439 100.000.000 25,39 2.970 3,47 Am32/139 1.000.000.00 29,40 3.400 3,53 Raq334/439 ,1·000·000.000 29,41 297 2,47 Am32/139 10.00.000.000 32,40 340 2,53 Raq334/439 1.000.000.000 29,41 297 2,47

Am32/139 NTC 38,51 Raq334/ 43~~ NTC indeterm

Am32/139 NTC 37,58 Raq334/439 NTC indeterm

Tabela 5-Dados da curva de diluição para o iniciador 128EscF /257EscR da escaldadura,

Detector Diluição CT No. cópia Logplasm Detector Diluição CT No. cópia Logplasm

plasmideo plasmideo Escl28/258 1.000.000 18,80 3.500.000 6,54 261/354 10.000.000 18,80 180.000 6,26 Esc128/257 1.000.000 18,80 3.500.000 6,54 261/354 10.000.000 18,80 180.000 6,26 Escl28/257 10.000.000 21,40 350.000 5,54 261/354 100.000.000 21,46 18.000 5,26 Esc128/257 10.000.000 22,09 350.000 5,54 261/354 100.000.000 22,09 18.000 5,26 Esc128/257 100.000.000 25,00 35.000 4,54 261/354 1.000.000.000 25.59 1.800 4,26 EscI28/257 100.000.000 25,00 35.000 4,54 261/354 1.000.000.000 25,63 1.800 4,26 Esc128/257 1.000.000.000 28,10 3.500 3,54 261/354 10.000.000.000 30,07 180 3,26 Escl28/257 1.000.000.000 28,90 3.500 3,54 261/354 10.000.000.000 30,07 180 3,36 Esc128/257 10.000.000.000 31,08 350 2,54 261/354 100.000.000.000 35,59 18 2,26 Esc128/257 10.000.000.000 31,08 350 2,54 261/354 100.000.000.000 30,07 18 2,26 Escl28/257 NTC 37,8 261/354 NTC indeterm

EscI28/257 NTC Indeterm 261/354 NTC indeterm