CONIC-SEMESP

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CATEGORIA: CONCLUÍDO

CATEGORIA:

ÁREA: CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E SAÚDE

ÁREA:

SUBÁREA: Enfermagem

SUBÁREA:

INSTITUIÇÃO(ÕES): UNIVERSIDADE PAULISTA - UNIP

INSTITUIÇÃO(ÕES):

AUTOR(ES): SARA ESTER BARBOSA

AUTOR(ES):

ORIENTADOR(ES): LAURA CRISTINA DA CRUZ DOMINCIANO

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Vice-Reitoria de Pós-Graduação e Pesquisa da Universidade Paulista - UNIP

Resumo: A persistência e resistência de microrganismos em superfícies

hospitalares causam infecções preocupantes em pacientes. Este estudo

verificou a ação da oleuropeína (OLE) e do hipoclorito de sódio, 1% (HS)

isolados e misturados contra Staphylococcus aureus (SA) em

suspensão, mantidas sob -80ºC em Brain Heart Infusion, glicerol 15%

(v/v), armazenados no laboratório de Microbiologia da UNIP São José

do Rio Pardo/SP. A resistência a sanitizantes foi avaliada pela

Concentração Inibitória Mínima (CIM) para SA (cepa ATCC 25923)

Laborclin® Brasil, utilizando-se o método de diluição em caldo, que

mede quantitativamente a atividade in vitro de um agente antimicrobiano

contra um determinado isolado bacteriano e incubados a 37ºC/24 h para

comparação visual dos tubos. Para o método disco difusão em ágar

(DDA), após correção das bactérias em 10

8

UFC (escala 0,5 McFarland)

foram plaqueadas pela técnica swab de algodão padronizado,

esterilizado, para espalhamento da suspensão na placa de Petri

contendo TSA (Ágar Tríptico de Soja, Sigma-Aldrich). Colocou-se discos

de 6mm de papel filtro, esterilizados, embebidos nos sanitizantes e

incubados em estufa a 37ºC/24h, seguida da leitura dos halos de

inibição. Os resultados para a CIM foram iguais para HS e HS+OLE

(diluição 1:2, 25%) e OLE (1:2, 50%). Para DDA, OLE (0,03% p/v 8.7 ±

0.8) mostrou maior halo de inibição. Conclui-se que OLE, agente natural,

tem ação antimicrobiana e que os efeitos do sanitizante químico HS

perdem efeito quando são diluídos, então recomenda-se que a limpeza

de superfícies não tenha diluições do sanitizante em água para ter mais

eficácia na inibição total das bactérias. Por fim, os resultados de OLE o

confirmam como potencial sanitizante natural, podendo-se sugerir uma

comercialização dos resíduos da Oliveira, cujo acúmulo impacta

negativamente o solo e os lençóis freáticos por sua fitotoxidade.

Palavras-Chave: Staphylococcus aureus. Oleuropeína. Folhas de

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Abstract: The persistence and resistance of microorganisms on hospital

surfaces causes worrying infections in patients. This study verified the

action of oleuropein (OLE) and sodium hypochlorite, 1% (HS) isolated

and mixed against Staphylococcus aureus (SA) in suspension, kept

under -80ºC in Brain Heart Infusion, glycerol 15% (v / v) , stored at the

UNIP Microbiology Laboratory São José do Rio Pardo / SP. Resistance

to sanitizers was evaluated by the Minimum Inhibitory Concentration

(MIC) for SA (strain ATCC 25923) Laborclin® Brazil, using the broth

dilution method, which quantitatively measures the in vitro activity of an

antimicrobial agent against a particular bacterial isolate and incubated at

37 ° C / 24 h for visual comparison of the tubes. For the agar diffusion

method (DDA), after correction of the bacteria in 108 CFU (0.5

McFarland scale) were plated by the standardized, sterilized cotton swab

technique for spreading the suspension in the Petri dish containing TSA

(Tryptic Agar of Soy, Sigma-Aldrich). 6mm filter paper disks were

sterilized, soaked in the sanitizers and incubated in an oven at 37ºC /

24h, followed by reading the inhibition halos. The results for MIC were

the same for HS and HS + OLE (1: 2, 25% dilution) and OLE (1: 2, 50%).

For DDA, OLE (0.03% w / v 8.7 ± 0.8) showed greater inhibition halo. It is

concluded that OLE, a natural agent, has an antimicrobial action and that

the effects of the chemical sanitizer HS lose their effect when diluted, so

it is recommended that surface cleaning do not dilute the sanitizer in

water to be more effective in total inhibition of bacteria. Finally, OLE

results confirm it as a potential natural sanitizer, and it may be suggested

that Oliveira's residues are commercialized, whose accumulation

negatively impacts soil and groundwater by its phytotoxicity.

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SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO ...4 1.1 Referencial Teórico ...5 1.1.1 Staphylococcus aureus ... 5 1.1.2 Oleuropeína ... 6 1.1.3 Hipoclorito de Sódio ... 7 1.2 Objetivos ...9 1.2.1 Objetivos gerais: ... 9 1.1.1 Objetivos Específicos: ... 9 1.3 Justificativa ...9 2. MATERIAL E MÉTODOS ... 10 2.1 Isolado bacteriano ... 10

2.2 Avaliação comparativa da atividade bactericida da oleuropeína com o sanitizante químico Hidróxido de Sódio ... 11

2.2.1 Perfil de resistência por determinação da Concentração Inibitória Mínima ... 11

2.2.2 Teste de Resistência através de Disco Difusão em Ágar ... 13

2.3 Períodos do Estudo ... 14

2.4 Aspectos Éticos ... 14

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 15

3.1 Concentração Inibitória Mínima ... 15

3.2 Disco Difusão ... 16

4. CONCLUSÃO ... 18

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1.

INTRODUÇÃO

Com o avanço e a resistência dos microrganismos que podem causar infecções relacionadas à assistência a saúde, as instituições que prestam serviços à saúde vêm investindo no treinamento de seus funcionários e novas fórmulas de saneantes, com o objetivo de minimizar as Infecções Hospitalares (IH).

Um dos treinamentos recebido é sobre a higienização das mãos, sendo medida individual mais simples e menos dispendiosa para prevenir a propagação das infecções relacionadas à assistência de saúde (ANVISA, 2007). Outro treinamento é como realizar a limpeza correta das superfícies, sendo ela, um grande reservatório para microrganismos, contribuindo para que ocorra uma infecção cruzada.

O profissional, ao entrar em contato com superfícies, pode depositar ali grandes cargas microbianas, quando não há correta higienização das mãos, por exemplo. Com isso os instrumentos utilizados para o atendimento ao paciente, quando colocado sobre essas superfícies com microrganismos, também são contaminados, ocasionando assim uma infecção hospitalar.

A infecção hospitalar é definida como aquela adquirida durante a internação do paciente ou mesmo após a alta quando puder ser relacionada com a internação ou procedimentos hospitalares (ANVISA, 2014). A mesma, dificulta o quadro do paciente levando-o a uma internação mais longa, onde geram mais custos a ele e para a unidade de saúde e pode até mesmo leva-lo à morte, quando não tratada corretamente. Mas não são somente os pacientes que correm riscos, o profissional de saúde, quando não são feitos os procedimentos corretos de higienização, estando susceptível a se contaminar com microrganismos.

Os hospitais, para diminuir a proliferação dessas bactérias nas superfícies, usam saneantes comuns, como água e sabão, álcool a 70% e hipoclorito de sódio a 1%, além de usar as técnicas para a limpeza.

O Hipoclorito de Sódio (HS) a 1% é um grande saneante utilizado pelos hospitais possuindo uma grande ação bactericida, sua ação é contra vários tipos de microrganismos como Candida albicans, Trichophyton mentagrophytes, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Mycobacterium bovis, Salmonella choleraesuis, Mycobacterium smegmatis e Staphylococcus aureus.

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O álcool 70% também é um forte bactericida, sendo composto por 70% de álcool e 30% de água. A água abre a parede celular para o álcool entrar, destruindo assim a função da bactéria. Esses saneantes comuns servem para realizar a limpeza e desinfecção de materiais e superfícies.

Com base nisso, pesquisas feitas com um extrato da folha de Oliveira, mostra que a Oleuropeína (OLE), composto bioativo, é também um forte sanitizante contra microrganismos em suspensão. Sua ação, por ser de origem vegetal, rompe a membrana celular da bactéria, causando sua morte.

A extração comercial do fruto de Oliveira gera enorme quantidade de resíduos sólidos, ou seja, as folhas e ramos quando acumuladas em grande quantidade no solo, podem impactar negativamente na sua população microbiana, além dos lençóis freáticos, por sua elevada fitotoxicidade (ROIG; CAYELA; SÁNCHEZ-MONEDERO, 2006) havendo uma importante necessidade de se utilizar essas folhas.

Este trabalho visou a averiguação da oleuropeína a fim de saber se pode afetar na destruição de uma bactéria chamada Staphylococcus aureus, sendo uma bactéria da microbiota humana, que ao sair da sua área natural e entra em contato com outra parte do corpo pode causar doenças infecciosas desde as mais simples como espinhas e foliculite como até as mais graves como a meningite, pneumonia, endocardite, entre outras.

Dessa forma a pesquisa visa a melhora na remoção das bactérias em superfícies hospitalares e possível sugestão da comercialização dos resíduos (folhas e ramos) somo solução aos produtores de azeitona.

1.1 Referencial Teórico

1.1.1 Staphylococcus aureus

A S. aureus é uma bactéria que faz parte do grupo gram-positivo encontrados na microbiota humana, geralmente na pele e nas fossas nasais, sendo também um dos agentes patogênicos mais notados nas superfícies hospitalares. É um microrganismo que possui grande potencial de adaptação, sendo muito resistente a antibióticos e sanitizantes, principalmente quando está no processo de biofilme (BOTTARO, 2012).

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Esse microrganismo, mesmo estando presente na microbiota humana, é considerado um dos principais agentes de IH, podendo ser superficiais, relativamente benignas, como os abcessos cutâneos, infecções de feridas, ou agentes de infecções sistêmicas, como também pode provocar a pneumonia e a meningite, infecções potencialmente fatais.

Essas bactérias podem ocasionar uma infecção através das barreiras naturais dos pacientes, quando comprometida, ou seja, a pele não integra por cirurgias ou traumas, tornando-se um grande veículo para o alojamento e desenvolvimento bacteriano, ocasionando lesões.

S. aureus também podem invadir o organismo humano através de alimentos

infectados por suas toxinas, provocando uma intensa infecção intestinal, podendo também cair na corrente sanguínea e se alojar nos demais tecidos, causando infecções mais graves, onde não são controladas pelos antibióticos comuns (MILLEZI, 2012).

Além de sobreviver em ambientes hospitalares, a S. aureus também é encontrada em diversos locais de circulação humana, podendo ser transferido desses locais para novos hospedeiros, essa transmissão pode se dar por contato direto ou por meio de objetos contaminados. Dessa maneira, o portador da bactéria

S. aureus exerce um papel de extrema importância na epidemiologia e na

patogênese das infecções, sendo um grande fator de risco para o desencadeamento das mesmas no ambiente hospitalar (CAVALCANTI et al., 2005).

Um dos grandes problemas atuais, principalmente no ambiente hospitalar, é o desenvolvimento de infecção por cepas de S. aureus resistentes a antibióticos e sanitizantes. Com o aparecimento de biofilmes nas superfícies hospitalares, a resistência dessa bactéria vem só aumentando, pois os sanitizantes comuns usados nas instituições de saúde, muitas vezes não conseguem destruir as cepas impregnadas nas superfícies, causando, dessa forma, infecções hospitalares desde benignas até as fatais (SENGER; BIZANI, 2012).

1.1.2 Oleuropeína

A oliveira é uma árvore de vida longa que pertence à família das oleáceas, sendo do gênero Olea e da espécie Olea europaea. Seus primeiros estudos foram

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em 1854, quando foi estudado o pó da folha da oliveira, sendo utilizado para o tratamento da malária (LEE-HUANG et al., 2003).

A oliveira tem uma importância econômica grande por seu fruto, a azeitona e seu derivado, o azeite, além de trazer consigo vários compostos fenólicos, sendo um deles a oleuropeína, um dos compostos mais abundante na planta.

É um polifenol que ocupa cerca de 73% do total dos compostos (PEREIRA et al., 2007), a oleuropeína não está somente nas folhas, embora esteja com maior totalidade, mas também na casca e no fruto, dando o gosto amargo a eles.

Esse composto foi descoberto em 1908 por Bourquelet e Vintilesco (RANALLI et al., 2006) e possui grandes benefícios, na forma medicinal para os seres humanos, tendo diversas propriedades, além de ser uma substância não tóxica.

Esta substância esta fortemente engajada na saúde, atuante em várias áreas, como na redução de inflamações, combate de infecções bactérias e viral, sendo que ao entrar no organismo, a oleuropeína vai se transformar em um ácido elenóico, que detém a produção de aminoácidos virais, dificultando a sua reprodução, é também um fortalecimento do sistema imunológico, onde atua na complementação da atividade da vitamina C, vitamina essencial para o funcionamento do sistema imunológico, é um agente anticancerígeno, onde ajuda a retardar o desenvolvimento de células cancerígenas, além de combater várias doenças como doenças cardiovasculares, onde é um redutor da pressão arterial e previne coágulos, sendo também preventivo da osteoporose, doença que acelera a perda óssea, a oleuropeína reverte esse processo, pois aumenta a produção de osteoblastos, células que ajuda a reconstrução óssea (MILLEZI, 2012).

Outro benefício é sua atividade antibacteriana, onde inibe a produção de bactérias que causam grandes males a saúde como a S. aureus. Além disso, a OLE se mostra um eficiente sanitizante orgânico, que, por sua origem, facilita a penetração na membrana celular, destruindo assim as bactérias resistentes a sanitizantes comuns.

1.1.3 Hipoclorito de Sódio

O ambiente hospitalar tem sido um foco de disseminação de diversos microrganismos. Embora não devessem atuar como reservatórios de patógenos potencialmente causadores de infecções, tem cada vez mais se aproximado disso,

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demonstrando altos indices de contaminações cruzadas, devido às superfícies que não são higienizadas corretamente.

O uso de sanitizantes, etapa complementar da higienização, tem por função eliminar os microrganismos patogênicos e reduzir a níveis aceitáveis os deteriorantes (DOMINCIANO, 2015). A sanificação eficiente previne contaminações posteriores e serve para assegurar a qualidade microbiológica das superfícies, devendo ser realizada antes do uso dos equipamentos para evitar a multiplicação de organismos indesejáveis (NASCIMENTO; DELGADO; BARBARIC, 2010).

O HS é sanitizante comercial utilizado para desinfecção, geralmente em ambientes hospitalares, podendo ser utilizado em superfícies e instrumentos. É um desinfetante utilizado em variadas concentrações, neste caso, em 1%. É talvez o mais utilizado por ter ação rápida, fácil aplicação e completa dissociação na água (JAY, 2005).

O HS pertence aos compostos clorados e é o único sanitizante desse grupo que é permitido pela legislação brasileira. Atua melhor em ambientes de pH ácido (DOMINCIANO, 2015). Com a destruição da cápsula bacteriana de proteção e oxidação do protoplasma celular exerce a sua ação sanitizante, formando cloraminas tóxicas que alteram a permeabilidade celular e impedem a regeneração enzimática (SREBERNICH, 2007).

O sanitizante HS tem alta função de descontaminação quando utilizado corretamente, além disso, há todo um cuidado para a dissolução, pois quanto mais dissolvido em água ele for, menor será sua ação antibacteriana, impedindo assim a eliminação completa das bactérias em superfícies, consequentemente, causando o biofilme bacteriano.

Além de ser utilizado para lugares mais complexos como o ambiente hospitalar, o HS exerce sua função também em cuidados relacionados com alimentos, como por exemplo, desinfecções de verduras antes do seu preparo, como também em limpezas gerais de casas e roupas, sempre utilizado cada um em sua devida concentração. As concentrações desse sanitizante são variadas, porém, quanto menor for sua concentração, mais dificultoso se encontra a descontaminação bacteriana.

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1.2 Objetivos

1.2.1 Objetivo geral:

Pesquisar se há dificuldades de higienização de superfícies e quais os fatores dificultadores e auxiliadores desta prática, a fim de sugerir novas práticas que agreguem diminuição de microrganismos em suspensão, multirresistentes, com o objetivo de reduzir os riscos de infecção hospitalar.

1.1.1 Objetivos Específicos:

 Verificar em laboratório se a oleuropeína, pode ser indicada como sanitizante orgânico e se é um antimicrobiano que pode ser indicado para higienização de superfícies;

 Verificar em laboratório se o hipoclorito de sódio 1% utilizado e padronizado como desinfetante/sanitizante de superfícies hospitalares reduz microrganismos em suspensão de Staphylococcus aureus.

 Verificar se a mistura dos dois sanitizantes (OLE + HS 1%) são mais potentes na redução de microrganismos em suspensão de S. aureus.

 Sugerir a comercialização das folhas e ramos se a OLE se mostrar um potente sanitizante.

1.3 Justificativa

Em função da necessidade de estudos sobre agentes antimicrobianos que reduzam ao máximo as células multirresistentes de S. aureus em superfícies hospitalares, por estarem nas mãos dos profissionais da saúde, optou-se por estudar as propriedades dos componentes fenólicos da Oliveira, em particular a oleuropeína, extraída comercialmente das folhas de Oliveira, para verificar se suas propriedades

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antimicrobianas são eficazes na redução ou combate a essa espécie de bactéria, causadora de infecção hospitalar, além de verificar se o sanitizante hipoclorito de sódio 1% é eficaz na redução dessas bactérias.

2. MATERIAL E MÉTODOS

O conjunto de atividades globais a serem realizados no experimento encontra-se representado esquematicamente no fluxograma da Figura 2.

Figura 1. Fluxograma representando os diferentes métodos utilizados para avaliação da redução de S. aureus como células em suspensão ao ser testados com a oleuropeína isolada ou associada ao

sanitizante hipoclorito de sódio, em suas análises quantitativas.

2.1 Isolado bacteriano

Para este estudo foram utilizados isolados de Staphylococcus aureus (cepa ATCC 25923) Laborclin®, Brasil, obtidas comercialmente e mantidas sob -80ºC em caldo de infusão de cérebro e coração (BHI - Brain Heart Infusion) (Merck, Alemanha) com glicerol (Synth, Brasil) a 15% (v/v) para formar uma suspensão de estoque, armazenados no laboratório de Microbiologia da UNIP – Universidade Paulista, Campus São José do Rio Pardo/SP.

ENSAIOS EXPERIMENTAIS DESCRIÇÃO

CEPA: Staphylococcus aureus

X

BACTÉRIA EM SUSPENSÃO Perfil da resistência da Concentração Inibitória Mínima

SANITIZANTE COMERCIAL: Hipoclorito de Sódio (HS) 1%

OLEUROPEÍNA (OLE) isolada

OLE associada ao HS 1%

Teste de resistência através de Disco Difusão em Ágar

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2.2 Avaliação comparativa da atividade bactericida da oleuropeína com o sanitizante químico Hidróxido de Sódio

2.2.1 Perfil de resistência por determinação da Concentração Inibitória Mínima

A Oleuropeína utilizada neste experimento foi obtida da Empresa Folhas de Oliva, doação do proprietário Cosmo Pacetta, que forneceu a concentração para experimento, através da cromatografia líquida de alta eficiência (Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) ou High Performance Liquide Chromatography (HPLC), cujo método de análise foi em Cromatógrafo Shimadzu série 20ª. Coluna: Nucleodur C18 250 x 3.0 mm, 5µm (Macharey Nagel). Fase móvel: Metano/ácido trifluoroacético 0,1% em água (40:60), pH 2,0, fluxo 0,7 ml/min. Detector UV a 280. Volume de injeção: 20µl. Padrão de Oleuropeíma cat N0 008011 – 96,6% (Chengdu Biopurify Phytochemicals). Amostra OLIVEAGE lote 01/2013, líquido, teor de oleuropeína 29,3 mg/100 ml, 0,03% (p/v), 293 mg/L. Essa metodologia foi baseada nos estudos de Dominciano (2015).

Além da OLE, foi utilizado o princípio ativo do sanitizante químico Hipoclorito de Sódio 1%, para fins de comparação com a atividade bactericida da oleuropeína. A escolha da concentração química é a mesma utilizada na limpeza de superfícies das unidades de saúde como agente sanitizante e, portanto, autorizadas pelo Ministério da Saúde.

O perfil de resistência a sanitizantes foi avaliado através da Concentração Inibitória Mínima (CIM) para a bactéria testada, utilizando-se o método de diluição em caldo, que mede quantitativamente a atividade in vitro de um agente antimicrobiano contra um determinado isolado bacteriano. Para a realização do teste, foram preparados tubos de ensaio com meio de cultura BHI para a bactéria S.

aureus. A seguir, os tubos foram inoculados com uma suspensão padrão do

organismo (100 µL) testado contra diversas concentrações dos agentes antimicrobianos. O procedimento para determinação da CIM utilizou as séries de tubos de ensaio (1 a 12), como esquematizado na Figura 3. Após incubação a 37ºC/24 horas, foi feita a comparação visual dos tubos.

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A CIM, neste caso, foi definida como a menor concentração de um agente antimicrobiano que impede o crescimento visível de um microrganismo (NCCLS, 2003).

Figura 2. Esquema do método de diluição em caldo em série composta por doze tubos, onde do 1º tubo será retirado 5mL de sanitizante e inserido no 2º tubo e assim sucessivamente até o tubo 11. Os controles serão os tubos 11(C-), contendo BHI com sanitizante e o tubo 12(C+), que contém apenas BHI com o inóculo.

Fonte: CARANDINA (2013)

Foram distribuídos 5 mL de meio de cultura BHI para cada tubo, exceto para o primeiro. Todos os tubos foram autoclavados com o meio de cultura a 121ºC por 15 minutos. Os experimentos foram realizados com sanitizante puro e com o sanitizante acrescido de oleuropeína (para cada 10 mL de sanitizante foi acrescido 5 mg de oleuropeína).

Em uma série de 12 tubos de ensaio com meio de cultura BHI foram acrescentadas diversas concentrações dos agentes antimicrobianos, onde no primeiro tubo foi adicionado 10 mL de sanitizante (diluição 100%), sendo 5 mL transferidos para o segundo tubo (diluição 50%) e assim sucessivamente até o tubo 11. O tubo de número 11 foi considerado o controle negativo (BHI+ antimicrobiano) e o tubo de número 12 o controle positivo (BHI+ CEPA). Todos os tubos foram homogeneizados com agitador de tubos e, em seguida, incubados em estufa a 37ºC/24h, para comparação visual. A CIM do antimicrobiano testado foi considerada como a concentração do tubo de maior diluição onde foi verificada a ausência de crescimento bacteriano (PACHECO, 2006). Todos os ensaios foram realizados em duplicata.

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A Tabela 1 demonstra as concentrações de solução de sanitizantes nos tubos e os controles.

Tabela 1. Diluição e conteúdo dos tubos de ensaio para determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM)

TUBO DILUIÇÃO CONTEÚDO

1 1:1 ou 100% 10 mL de sanitizante

2 1:2 ou 50% 5 mL de BHI e 5 mL de sanitizante do tubo 1

3 1:4 ou 25% 5 mL de BHI e 5 mL do tubo 2 4 1:8 ou 12,5% 5 mL de BHI e 5 mL do tubo 3 5 1:16 ou 6,25% 5 mL de BHI e 5 mL do tubo 4 6 1:32 ou 3,12% 5 mL de BHI e 5 mL do tubo 5 7 1:64 ou 1,56% 5 mL de BHI e 5 mL do tubo 6 8 1:128 ou 0,78% 5 mL de BHI e 5 mL do tubo 7 9 1:256 ou 0,39% 5 mL de BHI e 5 mL do tubo 8 10 1:512 ou 0,19% 5 mL de BHI e 5 mL do tubo 9

11 - 5 mL de BHI e 5 mL do tubo 10 (Controle -)

12 - 5 mL de BHI + CEPA (Controle +)

Fonte: DOMINCIANO (2015)

2.2.2 Teste de Resistência através de Disco Difusão em Ágar

A resistência dos isolados de S. aureus à oleuropeína e ao sanitizantes comercial hipoclorito de sódio 1% foram testadas pelo método DDA, o qual foi adaptado da metodologia preconizada pelo National Committee for Clinical

Laboratory Standards (NCCLS, 2003). A cultura de bactérias foi corrigida em 108

UFC (escala 0,5 de McFarland) e logo após foram plaqueadas empregando-se a técnica de swab de algodão padronizado, previamente esterilizado, para espalhamento da suspensão na placa de Petri contendo TSA (Ágar Tríptico de Soja, Sigma-Aldrich).

Em seguida foram colocados discos de 6mm de papel filtro, previamente esterilizados, embebidos nos sanitizantes testados. As placas de S. aureus foram incubadas em estufa a 37ºC durante 24 horas. A interpretação dos resultados foi um seguimento dos padrões do NCCLS (2003).

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2.3 Períodos do Estudo

O estudo ocorreu no período de julho de 2017 a junho de 2018.

2.4 Aspectos Éticos

O projeto não foi submetido ao Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) da Universidade Paulista porque não se trata de experimento com seres humanos ou animais.

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3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

3.1 Concentração Inibitória Mínima

Os resultados da pesquisa foram baseados em experimentos realizados no laboratório da universidade para comprovar tal eficácia do sanitizante e a oleuropeína em conjunto ou isolados.

Para que um dos experimentos acontecesse, colocou-se 100 mg/mL da bactéria estudada (S. aureus), em tubos com a solução de BHI, sendo 12 tubos para cada um (com diluição 1:1, 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64, 1:128, 1:256, 1:512, C- e C+). Foram utilizadas duplicatas de 12 tubos para cada experimento, conforme Tabela 2 e a leitura dos tubos armazenados em estufa 37ºC foi feita após 24h.

Tabela 2: Resultado da CIM contra OLE e HS, isolados e misturados contra S. aureus

Sanitizantes Concentração Diluição/Tubo

OLE 5 ml 1:4

HS (1% v/v) 5 ml 1:2

OLE+HS (1% v/v) 10 ml 1:2

Nos tubos em que havia HS 1% isolado e HS+OLE misturado, a turvação iniciou a partir do 3º tubo, demonstrando que quanto mais diluído o HS for, menor a eficácia do sanitizante contra microrganismos em suspensão no experimento in vitro. Pereira et al. (2015) mostrou que o HS perdeu sua eficácia perante um aumento de matéria orgânica, ou seja, pode-se apontar que o HS usado em dissolução aumentada, permite aos microrganismos a capacidade de se tornarem resistentes, corroborando os resultados deste estudo.

Já os tubos com OLE isolados, a turvação ocorreu a partir do 4º tubo (diluição 1:4). Os estudos de Dominciano et al. (2016a e 2016b) resultaram numa potencialização dos sanitizantes químicos quando misturados a OLE, o que não ocorreu neste estudo. Segundo a autora, OLE tem potencial antibactericida, o que pode facilitar sua atuação contra a membrana celular dos microrganismos de S

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Vice-Reitoria de Pós-Graduação e Pesquisa da Universidade Paulista - UNIP Figura 3: Imagem dos tubos contendo Oleuropeína e a turvação negativa.

3.2 Disco Difusão

Os experimentos de disco difusão nas placas de Petri em meio de cultura TSA, foram feitos em duplicata para verificar se formaria halo de inibição em torno dos discos contendo os sanitizantes sem diluição de HS e OLE isolados e HS + OLE misturados contra 100 mg/mL de bactéria S. aureus espalhadas por toda a placa, conforme amostrado na Tabela 3.

Tabela 3: Suscetibilidade de S. aureus contra *OLE e HS isolados e em combinação no método de disco difusão.

Solução/sanitizante Diâmetro do Halo1 Classificação2

OLE (0,03% p/v) 8.7 ± 0.8 Intermediário

HS (1%, v/v) 7.1 ± 1.7 Intermediário

OLE+HS (1%, v/v) 7.5 ± 1.2 Intermediário

*OLIVEAGE lote 01/2013 – HPLC = 29,3 mg/100ml (0,03% p/v). 1

Os resultados são apresentados como média ± desvio padrão de ensaios em duplicata. 2Resistente: zona de inibição (ZI) = 6mm;

Intermediário: ZI = 7 a 10mm; Sensível: ZI = > 10 mm.

Embora os mecanismos de atividade antimicrobiana de OLE não sejam ainda completamente compreendidos, estudos anteriores (TATARIDOU; KOTZEKIDOU, 2015) mostraram que OLE e outros compostos em azeite interagem com fosfatidilglicerol na superfície da parede celular bacteriana, e causam alterações na membrana citoplasmática, o que poderia levar ao rompimento do envelope celular (CASAS-SANCHEZ, 2007). Os estudos de Dominciano (2016a) defende que os

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resultados indicam que OLE apresenta potencial para incrementar o efeito bactericida de sanitizantes comerciais para eliminação de S. aureus em superfícies inertes.

Figura 4: Imagem da placa de Petri com halos de inibição ao redor dos discos contendo a mistura de OLE+HS.

Estudos apontam que podem ocorrer variações em um experimento com a mesma função, porém feitos em meios diferentes. Sanitizantes químicos misturados a OLE demonstram que novas pesquisas com compostos naturais devem ser estimuladas em busca de novos produtos que reduzam os microrganismos a níveis consideráveis, garantindo a higienização e evitando as contaminações e patologias.

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4. CONSIDERAÇÕES FINAIS

Conclui-se que OLE tem efeito sanitizante contra microrganismos em suspensão estudados in vitro de S. aureus, porém são necessários incentivos a novos estudos para um melhor entendimento do seu mecanismo de ação. Também é importante testar novos sanitizantes orgânicos com potencial antimicrobiano e antibactericida a fim de buscar novos produtos comerciais na limpeza e higienização de superfícies hospitalares para redução das infecções e contaminações.

O sanitizante químico HS não deve sofrer diluições para a limpeza das superfícies hospitalares para não perder seu efeito.

Adicionalmente, os resultados do presente trabalho poderão contribuir para estimular o aproveitamento de folhas e ramos da Oliveira, cujo acúmulo impacta negativamente na microbiota do solo e dos lençóis freáticos por sua elevada fitotoxicidade, trazendo uma possível solução aos cultivadores, além de obterem uma fonte de rendimentos com esses resíduos.

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FONTES CONSULTADAS

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