UNIVERSIDADE TECNOLÓGICA FEDERAL DO PARANÁ DEPARTAMENTO ACADÊMICO DE QUÍMICA E BIOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA
MICHELE DO ROCIO GONÇALVES DIAS
RESOLUÇÃO DE ÁLCOOIS ALÍLICOS CATALISADA POR
DIFERENTES LIPASES IMOBILIZADAS EM NANOTUBOS DE
CARBONO DE PAREDES MÚLTIPLAS
DISSERTAÇÃO
CURITIBA 2018
MICHELE DO ROCIO GONÇALVES DIAS
RESOLUÇÃO DE ÁLCOOIS ALÍLICOS CATALISADA POR
DIFERENTES LIPASES IMOBILIZADAS EM NANOTUBOS DE
CARBONO DE PAREDES MÚLTIPLAS
Dissertação apresentada como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre em Química, do Programa de Pós-Graduação em Química da Universidade Tecnológica Federal do Paraná – UTFPR – Campus Curitiba. Área de concentração: Química Orgânica.
Orientadora: Profa. Dra. Cristiane Pilissão.
Coorientadora: Profa. Dra Nadia Krieger.
CURITIBA 2018
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação
D541r Dias, Michele do Rocio Gonçalves
2018 Resolução de álcoois alílicos catalisada por diferentes lipases imobilizadas em nanotubos de carbono de paredes múltiplas / Dias, Michele do Rocio Gonçalves.-- 2018. 130 f.: il.; 30 cm.
Disponível também via World Wide Web. Texto em português, com resumo em inglês.
Dissertação (Mestrado) - Universidade Tecnológica Federal do Paraná. Programa de Pós-Graduação em Química, Curitiba, 2018.
Bibliografia: p. 95-104.
1. Lipase. 2. Enzimas. 3. Imobilização. 4. Nanotubos de carbono. 5. Química orgânica. 6. Química - Dissertações. I. Pilissão, Cristiane, orient. II. Krieger, Nadia, coorient. III. Universidade Tecnológica Federal do Paraná – Programa de Pós-Graduação em Química. IV. Título.
CDD: Ed. 22 -- 540
Biblioteca Central da UTFPR, Câmpus Curitiba Bibliotecária Lucia Ferreira Littiere - CRB 9/1271
Universidade Tecnológica Federal do Paraná Diretoria de Pesquisa e Pós-Graduação
TERMO DE APROVAÇÃO DE DISSERTAÇÃO Nº 014
A Dissertação de Mestrado intitulada RESOLUÇÃO DE ÁLCOOIS ALÍLICOS CATALISADA POR DIFERENTES LIPASES IMOBILIZADAS EM NANOTUBOS DE CARBONO DE PAREDES MÚLTIPLAS, defendida em sessão pública pelo(a) candidato(a) Michele do Rocio Gonçalves Dias, no dia 26 de abril de 2018, foi julgada para a obtenção do título de Mestre em Química, área de concentração QUÍMICA ORGÂNICA, e aprovada em sua forma final, pelo Programa de Pós-Graduação em Química.
BANCA EXAMINADORA:
Prof(a). Dr(a). Cristiane Pilissão - Presidente -UTFPR Prof(a). Dr(a). Eduard Westphal – UTFPR
Prof(a). Dr(a). Maria da Graça Nascimento – UFSC
A via original deste documento encontra-se arquivada na Secretaria do Programa, contendo a assinatura da Coordenação após a entrega da versão corrigida do trabalho.
Curitiba, 26 de abril de 2018.
Aos meus pais, Gerson e Maria, pela paciência e incentivo, com carinho.
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus por ter dado força e paciência para superar as dificuldades. A minha família por acreditar em mim, em especial aos meus pais, a minha irmã Bia, pelo carinho, incentivo e estrutura para que eu pudesse continuar estudando. Ao meu sobrinho Alan, pela sua alegria, afeto e por todos os momentos de descontração durante essa caminhada.
A Professora Cristiane Pilissão pela orientação, incentivo, ajuda e pelas nossas longas conversas cientificas, das quais aprendi muito. E principalmente pela sua amizade durante esses anos.
A Professora Nádia Krieger, da UFPR (Universidade Federal do Paraná), pela orientação e suporte, suas correções, incentivos e por disponibilizar o laboratório (LTEB – Laboratório de Tecnologia Enzimática e Biocatálise) para realização de alguns experimentos.
A Professora Maria da Graça Nascimento, da UFSC (Universidade Federal de Santa Catarina), pelas análises de polarimetria.
Ao Professor Hugo Gallardo, da UFSC, pelas análises de termogravimetria (TGA).
Aos professores Paula Cristina Rodrigues e Eduard Westphal, da UTFPR, pela participação na banca de qualificação, pelas correções e sugestões neste trabalho.
Ao LAMAQ (Laboratório Multiusuários de Análises Químicas) do Departamento Acadêmico de Química e Biologia da UTFPR (Universidade Tecnológica Federal do Paraná) por disponibilizar os equipamentos GC-FID, FT-IR e UV-Vis para realização das análises.
A Técnica Rúbia Camila R. Bottini da UTFPR pela ajuda na realização das análises de GC-FID e FT-IR, realizadas na UTFPR.
A UFPR por disponibilizar o equipamento de RMN para realização das análises.
Ao pessoal do LTEB pelos ensinamentos e ajuda na realização de alguns experimentos.
Aos meus colegas do Laboratório de Catálise Enzimática (LACEN), Maria Clara, Mariane, Tais, Juliane e em especial ao Alysson e a Gesieli pela ajuda na
realização dos experimentos durante todo o período de execução deste trabalho e prontidão para ajudar em todos os momentos.
Aos meus colegas, em especial Alysson, Lilian, Natalia, Lucas Karas e Francielli Santana pelo incentivo, força e pelos momentos de descontração.
A empresa Amano pela doação das enzimas.
A Capes (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior) pela bolsa.
Ao CNPQ (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico) por financiar o projeto.
Ao Programa de Pós-graduação em Química pelo suporte, em especial aos professores do programa, pelos seus ensinamentos.
Aos Professores da UTFPR pela contribuição na minha formação acadêmica. Agradeço a todas as pessoas que de alguma forma contribuíram para realização deste trabalho, bem como, para a minha formação.
RESUMO
DIAS, Michele R. G. Resolução de álcoois alílicos catalisada por diferentes
lipases imobilizadas em nanotubos de carbono. 2018, 129 f. Dissertação
(Mestrado em Química Orgânica) – Programa de Pós-Graduação em Química, Universidade Tecnológica Federal do Paraná. Curitiba, 2018.
Este trabalho teve como objetivo avaliar a eficiência catalítica de diferentes lipases, na sua forma livre e imobilizada em nanotubos de carbono de paredes múltiplas (MWCNTs), na resolução cinética enzimática de álcoois alílicos com acetato de vinila. Inicialmente, foi realizada uma triagem com três lipases comerciais para a resolução do (RS)-1-octen-3-ol, lipase de pâncreas de porco (PPL), de Candida rugosa AY “Amano” 30 (AY30) e de Burkholderia cepacia “Amano” (PS). A enzima que apresentou o maior desempenho em termos de conversão e excesso enantiomérico de produto (eep) foi a lipase PS. Portanto, a lipase PS foi selecionada para dar
continuidade aos estudos de imobilização em MWCNTS, bem como, avaliar diferentes condições reacionais na resolução dos álcoois alilicos. Os rendimentos de imobilização obtidos para a lipase PS em MWCNTs sem funcionalização (MWCNTs-SF) foram maiores que 91 % em 24 horas. A melhor proporção de enzima:suporte na resolução do (RS)-octen-3-ol foi 5:1, sendo que o respectivo éster, (S)-acetato de 1-octen-3-ila foi obtido com conversão de 22%, eep de 51%, resultando em valores de E
de 4. Este resultado representa um aumento de 2,5 vezes na conversão ao utilizar a lipase imobilizada em comparação a sua forma livre. A influência do pH de imobilização (pHI) utilizando o sistema PS/MWCNTs-SF (5:1) foi aplicado na resolução dos substratos (RS)-1-hexen-3-ol, (RS)-1-octen-3-ol e (RS)-(E)-4-fenil-3-buten-2-ol com acetato de vinila, sendo que os melhores resultados obtidos foram em pH ácidos a neutro (5,0 – 7,0). Em pH básico (8,0) ocorreu uma redução da eficiência catalítica para todos os substratos avaliados. Além disso, observou-se que os grupos substituintes ligados ao carbono assimétrico influenciaram significativamente nos valores de razões enantioméricas (E), onde o valor de E foi cerca de 25 vezes maior com o substrato aromático [(RS)-(E)-4-fenil-3-buten-2-ol] em comparação aos alifáticos [hexen-3-ol, octen-3-ol]. Quando utilizou os álcoois (RS)-1-hexen-3-ol e (RS)-(E)-4-fenil-3-buten-2-ol as conversões ao respectivo produto foram de 52 e 51%, respectivamente em 6 horas de reação. Já com o álcool (RS)-1-octen-3-ol foi de 35% em 24 horas de reação. Os melhores suportes para a imobilização da lipase PS foram os MWCNTs-SF e MWCNTs-N (funcionalizados com APTES), pois apresentaram maior eficiência catalítica na resolução dos três substratos em comparação aos MWCNTs-A (funcionalizado com ácidos). O aumento da massa de imobilizado de 5 mg para 15 mg aumentou a conversão em 1,8 vezes para a resolução dos álcoois alílicos alifáticos e de 1,4 vezes para o substrato alílico aromático. Ao avaliar a influência da temperatura reacional de 35 a 70ºC na resolução dos álcoois alilicos, observou que os melhores resultados foram obtidos a 55ºC. O solvente orgânico influenciou significativamente a seletividade da enzima, sendo que o sistema livre de solvente apresentou os melhores resultados. Os resultados obtidos mostram que a lipase comercial PS imobilizada em MWCNTs apresentou potencial catalítico para aplicação na resolução cinética de álcoois alílicos secundários, sendo que, os valores de conversão, eep e E foram superiores ao comparar com sua forma livre. Palavras-chave: Lipase, resolução enzimática, imobilização, nanotubos de carbonos
ABSTRACT
DIAS, Michele R. G. Resolution of allylic alcohols catalyzed by different lipases
immobilized in multi walled carbon nanotubes. 2018, 129 f. Dissertação (Mestrado
em Química Orgânica) – Programa de Pós-Graduação em Química, Universidade Tecnológica Federal do Paraná. Curitiba, 2018
The aim of this work was to evaluate the catalytic efficiency of lipases, free and immobilized in multi walled carbon nanotubes (MWCNTs), for the enzymatic kinetic resolution of allylic alcohols with vinyl acetate. Firstly, three commercial lipases were screened such as porcine pancreas (PPL), Candida rugosa AY "Amano" 30 (AY30) and Burkholderia cepacia "Amano" (PS) in the resolution of (RS) -1- octen-3-ol. The enzyme that presented the highest performance was PS. Therefore, PS was selected to continue the immobilization studies in MWCNTS, as well as to evaluate the different reaction conditions in the resolution of allylic alcohols. The immobilization yields obtained for lipase PS in MWCNTs without functionalization (MWCNTs-SF) were more than 91% in 24 h. The best enzyme:support ratio in (RS)-1-octen-3-ol resolution was 5: 1 (w/w), forming the corresponding ester (S)-1-octen-3-yl acetate in conversion of 22%, eep of 51%, thus resulting in E value of 4. Moreover, a 2.5-fold increase in the
conversion was observed when the immobilized lipase was used. The studies related to pH effects on PS immobilization applied in the resolution of 1-hexen-3-ol, (RS)-1-octen-3-ol and (RS)-(E)-4-phenyl-3-buten-2-ol with vinyl acetate presented better results in acid or neutral pH values (5.0 – 7.0). When the pH was basic (8.0), the catalytic efficiency declined for all substrates. Furthermore, the substituent groups attached to the asymmetric carbon were found to have significantly influenced on the values of enantiomeric ratio (E), being approximately 25 higher for the aromatic [(E)-4-phenyl-3-buten-2-ol] substrate than the aliphatics [1-hexen-3-ol and (RS)-1-octen-3-ol]. When (RS)-1-hexen-3-ol and (RS)-(E)-4-phenyl-3-buten-2-ol were used, the conversions to the respective product were of 52 and 51%, respectively, in 6 h of reaction. Using (RS)-1-octen-3-ol, the degree of conversion was 35% in 24 h of reaction. The best catalytic efficiency obtained for the resolution of the three substrates was using PS immobilized in MWCNTs-SF and MWCNTs-N (treated with APTES). Increasing the amount of immobilized enzyme, from 5 to 15 mg, the conversion degrees increased about 1.8 and 1.4 times for the aliphatic and aromatic alcohols, respectively. In the study of the reaction temperature effect, the best results for resolution the 3 substrates were obtained at 55 ° C. The organic solvent influenced the selectivity of the enzyme, and it was observed that the solvent-free system presented higher potential for the studied reactions. The results showed that the commercial PS lipase immobilized in MWCNTS had catalytic potential for the application in the kinetic resolution of secondary allylic alcohols, being the values of conversion, eep and E
higher than those obtained using the free form.
Keywords: Lipases, kinetic resolution, immobilization, multi walled carbon nanotubes
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 - REPRESENTAÇÃO DA FORMAÇÃO DE UMA LIGAÇÃO PEPTÍDICA
...20
FIGURA 2 - REPRESENTAÇÃO DA ESTRUTURA DE UMA PROTEÍNA. ...21 FIGURA 3 - DIAGRAMA DE ENERGIA PARA UMA REAÇÃO NÃO CATALISADA
E UMA REAÇÃO CATALISADA POR ENZIMA. ...22
FIGURA 4 - REAÇÕES CATALISADAS POR LIPASES. ...24 FIGURA 5 - CONFORMAÇÃO INATIVA E ATIVA DA LIPK107 SOBREPOSTAS 25
FIGURA 6 - REPRESENTAÇÃO ESQUEMÁTICA DA ESTRUTURA
TRIDIMENSIONAL DA LIPASE DE CANDIDA ANTARCTICA OBTIDA POR RAIOS X. ...26
FIGURA 7 - REPRESENTAÇÃO SIMPLIFICADA DA REAÇÃO DE HIDRÓLISE A
PARTIR DA SERINA HIDROLASE. ...26
FIGURA 8 - REPRESENTAÇÃO ESQUEMÁTICA DOS MÉTODOS DE
IMOBILIZAÇÃO DE ENZIMAS. ...28
FIGURA 9 - REPRESENTAÇÃO ESQUEMÁTICA DA ESTRUTURA DOS
NANOTUBOS DE CARBONO. ...30
FIGURA 10 - REPRESENTAÇÃO ESQUEMÁTICA DA ADSORÇÃO FÍSICA DE
UMA ENZIMA EM TORNO DOS CNTS. ...31
FIGURA 11 - EXEMPLOS DE EFEITOS BIOLÓGICOS DE ALGUNS
ENANTIÔMEROS. ...32
FIGURA 12 - REPRESENTAÇÃO ESQUEMÁTICA DA PREFERÊNCIA DA ENZIMA
ENTRE OS ENANTIÔMEROS A E B. ...34
FIGURA 13 - MODELO DO SITIO ATIVO PARA AS LIPASES – SEGUNDO A
REGRA DE KAZLAUSKAS. ...35
FIGURA 14 - DIAGRAMA DE ENERGIA PARA UMA REAÇÃO
ENANTIOSSELETIVA CATALISADA POR ENZIMA. ...36
FIGURA 15 - REAÇÕES DIVERSAS COM ÁLCOOIS ALÍLICOS. ...38
FIGURA 16 - ESTRATÉGIA PARA A SÍNTESE DE -LACTONAS ENRIQUECIDAS
ENANTIOMERICAMENTE. ...39
FIGURA 17 - FLUXOGRAMA DAS ETAPAS QUE FORAM REALIZADAS NESTE
TRABALHO VISANDO O ESTUDO DAS REAÇÕES DE RESOLUÇÃO ENZIMÁTICA DE ÁLCOOIS ALÍLICOS...42
FIGURA 18 - REPRESENTAÇÃO ESQUEMÁTICA PARA FUNCIONALIZAÇÃO
DOS MWCNTS PELA ROTA A. ...43
FIGURA 19 - REPRESENTAÇÃO ESQUEMÁTICA PARA FUNCIONALIZAÇÃO DOS MWCNTS PELA ROTA N. ...43
FIGURA 20 - REPRESENTAÇÃO DA REAÇÃO DE HIDRÓLISE DE UM TRIACILGLICERÍDEO CATALISADA POR LIPASE. ...46
FIGURA 21 - PREPARAÇÃO DO ÁLCOOL ALÍLICO (RS)-3-BUTEN-2-OL [(RS)-4F3B] A PARTIR DA REDUÇÃO DA CETONA (E)-4-FENIL-3-BUTEN-2-ONA COM BOROHIDRETO DE SÓDIO. ...49
FIGURA 22 - PREPARAÇÃO DOS ÉSTERES RACÊMICOS A PARTIR DOS SEUS RESPECTIVOS ÁLCOOIS E CLORETO DE ACILA. ...50
FIGURA 23 - PREPARAÇÃO DO ÉSTER (RS)-(E)-ACETATO DE 4-FENIL-3-BUTEN-2-ILA [(RS)-A4F3B] A PARTIR DO ÁLCOOL E ANIDRIDO ACÉTICO. ...50
FIGURA 24 - PREPARAÇÃO DOS ÉSTERES ENRIQUECIDOS ENANTIOMERICAMENTE ACETATO DE 1-HEXEN-3-ILA, (S)-ACETATO DE 1-OCTEN-3-ILA E (R)-(S)-ACETATO DE 4-FENIL-3-BUTEN-2-ILA A PARTIR DOS ÁLCOOIS E ACETATO DE VINILA. ..51
FIGURA 25 - METODOLOGIAS DE 1 A 6 TESTADAS PARA DERIVATIZAÇÃO DO 1-OCTEN-3-OL E 1-HEXEN-3-OL. ...54
FIGURA 26 - REPRESENTAÇÃO ESQUEMÁTICA DOS NANOTUBOS DE CARBONO. ...55
FIGURA 27 - ESPECTROS DE FT-IR PARA AS AMOSTRAS DE NANOTUBOS DE CARBONO. ...56
FIGURA 28 - CURVAS TGA/DTG DOS MWCNTs-SF. ...59
FIGURA 29 - CURVAS TGA/DTG DOS MWCNTs-A...59
FIGURA 30 - CURVAS TGA/DTG DOS MWCNTs-N. ...60
FIGURA 31 - ANÁLISE POR ELETROFORESE-SDS 12 % DAS AMOSTRAS DE LIPASES. ...62
FIGURA 32 - CINÉTICA E RENDIMENTO DE IMOBILIZAÇÃO DA LIPASE PS EM MWCNTS-SF BASEADOS NA QUANTIDADE DE PROTEÍNA RESIDUAL DO SOBRENADANTE PARA OS IMOBILIZADOS PREPARADOS NAS PROPORÇÕES ENZIMA : SUPORTE (M/M) DE 0,5:1, 1:1, 3:1, 5:1 E 10:1. ...65
FIGURA 33 - REPRESENTAÇÃO ESQUEMÁTICA DOS ENANTIÔMEROS DOS
SUBSTRATOS DE REAÇÃO RÁPIDA NO SITIO ATIVO DA ENZIMA, UTILIZANDO A REGRA DE KAZLAUKAS. ...74
FIGURA 34 - EFEITO DO TEMPO REACIONAL NA CONVERSÃO DOS
SUBSTRATOS (RS)-1-HEXEN-3-OL, (RS)-1-OCTEN-3-OL E (RS)-(E)-4-FENIL-3-BUTEN-2-OL COM ACETATO DE VINILA A PARTIR DA RESOLUÇÃO CINÉTICA ENZIMÁTICA UTILIZANDO O SISTEMA PS/MWCNTS-SF (5:1). ...76
FIGURA 35 - INFLUÊNCIA DA MASSA DO IMOBILIZADO PS/MWCNTS-SF (5:1)
NA RESOLUÇÃO CINÉTICA DO (RS)-1-HEXEN-3-OL, (RS)-1-OCTEN-3-OL E (RS)-(E)-4-FENIL-3-BUTEN-2-OL COM ACETATO DE VINILA. ...77
FIGURA 36 - ESPECTROS DE FT-IR PARA CARACTERIZAÇÃO DA LIPASE
IMOBILIZADA EM MWCNTS. ...88
FIGURA 37 - CURVAS TGA/DTG DAS AMOSTRAS PS/MWCNTS- SF (5:1), PS
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 - CLASSIFICAÇÃO DAS ENZIMAS SEGUNDO A UIBBM. ...23 TABELA 2 – NOMENCLATURA UTILIZADA PARA OS SUBSTRATOS E
PRODUTOS APRESENTADOS NESTE TRABALHO E TEMPO DE RETENÇÃO OBTIDOS POR CGQ-FID. ...53
TABELA 3 – COMPOSIÇÃO ELEMENTAR DOS MWCNTS-SF, MWCNTS-A E
MWCNTS-N OBTIDOS POR EDS. ...58
TABELA 4 – ATIVIDADE DE HIDRÓLISE E CARGA DE PROTEÍNAS NAS
LIPASES PPL, PS E AY30...61
TABELA 5 - RESOLUÇÃO DO (RS)-1-OCTEN-3-OL COM ACETATO DE VINILA
UTILIZANDO AS LIPASES COMERCIAIS PPL, PS E AY30. ...63
TABELA 6 – QUANTIDADE DE PROTEÍNAS PRESENTES NOS DIFERENTES
IMOBILIZADOS PS/MWCNTS-SF. ...66
TABELA 7 – ESTUDO DA EFICIÊNCIA CATALÍTICA DA PS IMOBILIZADA EM
MWCNTS-SF EM COMPARAÇÃO A SUA FORMA LIVRE E DA INFLUÊNCIA DA RAZÃO ENTRE MASSA DE PS E SUPORTE (M/M) NA RESOLUÇÃO DO (RS)-1-OCTEN-3-OL COM ACETATO DE VINILA. ...69
TABELA 8 - EFEITO DO PH NA IMOBILIZAÇÃO DA LIPASE PS EM MWCNTS-SF
APLICADO A RESOLUÇÃO DOS ÁLCOOIS (RS)-1-HEXEN-3-OL, (RS)-1-OCTEN-3-OL E (RS)-(E)-4-FENIL-3-BUTEN-2-OL COM ACETATO DE VINILA. ...72
TABELA 9 - INFLUÊNCIA DA FUNCIONALIZAÇÃO DOS MWCNTS NA
IMOBILIZAÇÃO DA LIPASE PS E APLICAÇÃO DESSE SISTEMA NA RESOLUÇÃO DOS ÁLCOOIS ALÍLICOS. ...78
TABELA 10 - INFLUÊNCIA DA TEMPERATURA NA RESOLUÇÃO CINÉTICA DO
(RS)-1-HEXEN-3-OL, (RS)-1-OCTEN-3-OL E (RS)-(E)-4-FENIL-3-BUTEN-2-OL COM ACETATO DE VINILA UTILIZANDO A LIPASE PS IMOBILIZADA EM MWCNTS-SF [PS/MWCNTS-SF (5:1)]. ...81
TABELA 11 - AVALIAÇÃO DA EFICIÊNCIA CATALÍTICA ENTRE A LIPASE PS
LIVRE E IMOBILIZADA EM MWCNTS-SF NA RESOLUÇÃO DOS ÁLCOOIS ALÍLICOS. ...82
TABELA 12 - INFLUÊNCIA DOS SOLVENTES ORGÂNICOS NA RESOLUÇÃO
DOS ÁLCOOIS ALÍLICOS CATALISADA PELA LIPASE PS IMOBILIZADA EM MWCNTS. ...84
LISTA DE ABREVIATURAS
% PI Porcentagem de proteína no imobilizado (RS)-4F3B (RS)-4-fenil-3-buten-2-ol
(RS)-A4F3B (RS)-acetato de 4-fenil-3-buten-2-ila (RS)-AHX (RS)-acetato de 1-hexen-3-ila
(RS)-AOC (RS)-acetato de 1-octen-3-ila
(RS)-HX (RS)-1-hexen-3-ol
(RS)-OC (RS)-1-octen-3-ol
APTES (3-aminopropil)trietoxisilano
AY30 Lipase comercial de Candida rugosa BCL Lipase comercial de Burkholderia cepacia
c Conversão
d Dupleto
dd Duplo dupleto
dq Duplo quinteto
ddd Duplo duplo dupleto
eep Excesso enantiomérico de produto
ees Excesso enantiomérico de substrato
E Enantiosseletividade ou razão enantiomérica
EC Comissão de Enzimas (do inglês, Enzyme Commission) FID Detector de ionização em chama (do inglês, Flame ionization
detector)
FT-IR Espectroscopia de Infravermelho com transformada de Fourier (do inglês, Fourier - Transform infrared spectroscopy) CGQ-FID Cromatografia gasosa, utilizando uma coluna de fase
estacionária quiral com detector de ionização em chama
m Multipleto
MEV/EDS Microscopia eletrônica de varredura acoplada a espectroscopia de raios X por dispersão de energia
MWCNTs Nanotubos de carbono de paredes múltiplas (do inglês, Multi-walled carbon nanotubes)
MWCNTs-A Nanotubos de carbono de paredes múltiplas submetidos a funcionalização pela rota A
MWCNTs-N Nanotubos de carbono de paredes múltiplas submetidos a funcionalização pela rota N
MWCNTs-SF Nanotubos de carbono de paredes múltiplas sem funcionalização
CNTs Nanotubos de carbono (do inglês, Carbon nanotubes) PPL Lipase comercial de pâncreas de porco
PS Lipase comercial de Burkholderia cepacia “amano”
PS/MWCNTs-X (A:B) PS imobilizada em nanotubos de carbono de paredes múltiplas. O X indica o tipo de funcionalização (A, N ou SF) e o (A:B) indica a proporção de enzima e suporte (m/m).
RMN 1H Espectroscopia de Ressonância magnética nuclear de
hidrogênio
RI Rendimento de Imobilização
s Simpleto
Ser-His-Asp/Glu Serina, histidina e aspartato ou glutamato
t Tripleto
TGA Análise termogravimétrica (do inglês, Thermogravimetric analysis)
SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ...18 2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA ...20 2.1 ENZIMAS ...20 2.1.1 Lipases ...23 2.1.1.1 Mecanismo de catálise ...25 2.2 IMOBILIZAÇÃO DE ENZIMAS ...27
2.2.1 Suportes para imobilização de enzimas ...29
2.3 RESOLUÇÃO CINÉTICA ENZIMÁTICA ...31
2.3.1 Resolução cinética de álcoois alílicos ...37
3 OBJETIVOS ...40
3.1 OBJETIVO GERAL ...40
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS...40
4 METODOLOGIA ...42
4.1 FUNCIONALIZAÇÃO DOS NANOTUBOS DE CARBONO ...43
4.2 ESTUDO COM AS LIPASES COMERCIAIS ...45
4.2.1 Determinação de proteínas...45
4.2.2 Determinação da atividade enzimática ...45
4.2.3 Determinação da pureza das lipases ...47
4.2.4 Eficiência catalítica das lipases PPL, AY30 e PS na resolução do (RS)-1-octen-3-ol ...47
4.3 IMOBILIZAÇÃO DA LIPASE EM MWCNTs ...47
4.3.1 Cinética de Imobilização ...47
4.3.2 Procedimento geral de imobilização e determinação da carga de proteínas nos imobilizados ...48
4.4 SÍNTESE DO SUBSTRATO E PADRÕES ...49
4.4.1 Preparação do substrato (RS)-(E)-4-fenil-3-buten-2-ol ...49
4.4.2 Preparação dos padrões racêmicos acetato de 1-hexen-3-ila, (RS)-acetato de 1-octen-3-ila e (RS)-(E)-(RS)-acetato de 4-fenil-3-buten-2-ila ...50
4.4.3 Preparação dos padrões quirais via catálise enzimática ...51
4.5 RESOLUÇÃO ENZIMÁTICA DOS ÁLCOOIS ALÍLICOS ...51
4.6 DERIVATIZAÇÃO DOS SUBSTRATOS HEXEN-3-OL E (RS)-1-OCTEN-3-OL ...53
5 RESULTADOS E DISCUSSÕES ...55
5.1 FUNCIONALIZAÇÃO DOS MWCNTs ...55
5.2 CARACTERIZAÇÃO E EFICIÊNCIA CATALITICA DAS LIPASES AY30, PPL e PS ...61
5.3 IMOBILIZAÇÃO DA LIPASE EM MWCNTS ...64
5.3.1 Cinética de imobilização ...64
5.3.2 Determinação da carga de proteínas nos imobilizados ...66
5.4 RESOLUÇÃO DOS ALCOOIS ALILICOS...67
5.4.1 Derivatização dos substratos 1-hexen-3-ol e 1-octen-3-ol ...67
5.4.2 Parâmetros de imobilização e reacionais que influenciam a eficiência catalítica das lipases...69
5.4.2.1 Influência da imobilização e da razão entre a massa da lipase PS e o suporte (MWCNTS-SF) na resolução do (RS)-1-octen-3-ol ...69
5.4.2.2 Efeito do pH de imobilização e da estrutura do substrato ...71
5.4.2.3 Efeito do tempo reacional ...75
5.4.2.4 Influência da massa do imobilizado ...76
5.4.2.5 Influência da temperatura reacional ...80
5.4.2.6 Comparação da eficiência catalítica entre a lipase PS livre e imobilizada....82
5.4.2.7 Influência do solvente ...83
5.5 CARACTERIZAÇÃO DA LIPASE IMOBILIZADA EM MWCNTS ...83
6 CONCLUSÕES ...92
7 PERSPECTIVAS FUTURAS ...94
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...95
APÊNDICE ... 105
APÊNDICE A - Preparação e caracterização do substrato (RS)-(E)- 4-fenil-3-buten-2-ol... 105
APÊNDICE B - Preparação e caracterização dos padrões (RS)-acetato de 1-hexen-3-ila e (RS)-acetato de 1-octen-3-ila ... 109
APÊNDICE C - Preparação e caracterização do padrão racêmico (RS)-(E)-acetato de 4-fenil-3-buten-2-ila ... 114
APÊNDICE D - Preparação dos compostos enquirecidos enantiomericamente ... 117
APÊNDICE E - Cromatogramas da separação dos substratos (RS)-1-hexen-3ol e (RS)-1-octen-3-ol ... 120
APÊNDICE F - Caracterização do produto (RS)-propionato de 1- hexen- 3- ila
... 121
APÊNDICE G - Caracterização do produto (RS)-propionato de 1- octen-3- ila ... 123
APÊNDICE H - Resultados obtidos para resolução dos álcoois alílicos ... 125
ANEXO...126
1 INTRODUÇÃO
A utilização de enzimas como catalisadores na síntese orgânica tem recebido atenção especial nos últimos anos, devido às suas propriedades que as diferem dos catalisadores não-enzimáticos, pois as enzimas são altamente especificas e realizam as reações em condições brandas de pressão e temperatura, bem como, reduzem a formação de subprodutos indesejáveis. 1
Existem diferentes classes de enzimas, dentre elas, destaca-se as hidrolases, em especial as lipases, pois estão entre as classes mais estudadas atualmente. Estas enzimas são capazes de catalisar diversas reações tanto em meio aquoso, como em meio orgânico. Além disso, são quimio, regio e enantiosseletivas, e, portanto, possuem grande aplicabilidade na obtenção de compostos enantiomericamente puros, os quais são usados como intermediários na indústria farmacêutica, agroquímica e química fina. 2 - 4
Existem vários métodos para obtenção de compostos opticamente ativos, sendo que alguns processos envolvem reações químicas adicionais, gerando grande quantidade de resíduos, tornando o processo oneroso e ambientalmente inadequado. 3, 5, 6 Contudo, a resolução enzimática é uma ótima estratégia para
obtenção destes compostos a partir dos seus racematos. Por exemplo, a resolução de álcoois tem sido de grande interesse, pois estes compostos podem atuar como intermediários em várias rotas sintéticas. 7 - 9
As lipases utilizadas na sua forma livre apresentam algumas desvantagens, tais como, são sensíveis à alteração brusca nos parâmetros operacionais (temperatura, pH) e podem apresentar baixa estabilidade em solventes orgânicos, levando à desnaturação e inativação da enzima, diminuindo a sua atividade catalítica. Além disso, existe a impossibilidade de sua reutilização em um novo ciclo. Para minimizar essas desvantagens, tem-se utilizado o processo de imobilização. Esta técnica pode melhorar a estabilidade das enzimas no meio reacional, e assim facilitar a sua recuperação e reutilização.10, 11
Vários materiais podem ser usados como suportes para imobilização, sendo que o uso de materiais nanoestruturados, como nanotubos de carbono, têm sido foco de muitas pesquisas. Estes materiais oferecem as características ideais para equilibrar os principais fatores que determinam a eficiência dos biocatalisadores, incluindo a elevada área superficial e menor resistência à transferência de massa.12 - 14
Muitos trabalhos relatam a importância da utilização de enzimas na obtenção de compostos enantiomericamente puros, visando o desenvolvimento da biocatálise em escala industrial. A partir dessas considerações, este trabalho tem como objetivo a resolução enzimática de álcoois alílicos, na presença de ésteres vinílicos, como doadores acila, utilizando as lipases comerciais de pâncreas de porco (PPL), Candida rugosa AY “Amano” 30 (AY30) e Burkholderia cepacia “Amano” (PS) na sua forma livre e/ou imobilizada em nanotubos de carbono de paredes múltiplas (MWCNTs).
2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
2.1 ENZIMAS
Enzimas são catalisadores biológicos, em geral de natureza proteica sendo formadas por longas cadeias de aminoácidos ligados através de ligações peptídicas (FIGURA 1). A sequência exata de aminoácidos é denominada de estrutura primária [FIGURA 2 (a)], a estrutura secundária é a conformação tridimensional da cadeia de aminoácidos [FIGURA 2 (b)], e a disposição espacial da sequência de aminoácidos é denominada de estrutura terciária [FIGURA 2 (c)]. Algumas enzimas podem ser constituídas de múltiplas cadeias polipeptídicas, chamadas de subunidades e a união dessas subunidades é denominada de estrutura quaternária [FIGURA 2 (d)]. 15, 16
FIGURA 1- REPRESENTAÇÃO DA FORMAÇÃO DE UMA LIGAÇÃO PEPTÍDICA.
FIGURA 2 - REPRESENTAÇÃO DA ESTRUTURA DE UMA PROTEÍNA.
FONTE: O autor (2018).
LEGENDA: (a) Estrutura primária. (b) Estrutura secundária. (c) Estrutura terciária. (d) Estrutura quaternária.
O uso de enzimas em vários processos tem sido muito explorado devido as suas propriedades catalíticas, podendo destacar:
• Aumento da velocidade de reação – nesses processos a velocidade de uma
reação pode aumentar em até 1020 vezes em relação aos não catalisados; 17, 18
• Atuam em condições brandas – em geral abaixo de 100ºC, pressão 1 atm e
pH neutro, o que minimiza problemas com reações secundárias indesejáveis;
• Apresentam alta especificidade – possuem propriedades quimiosseletivas,
regiosseletivas, diastereosseletivas e enantiosseletivas, raramente formam produtos secundários e são capazes de catalisar um grande número de reações.1
A utilização de enzimas como biocatalisadores tem fortes atrativos, porém ainda existem algumas desvantagens que tornam seu uso limitado, como por exemplo:
• São propensas a sofrer inativação ou inibição – mudanças bruscas nos
parâmetros operacionais (pH, temperatura e pressão), agentes químicos ou físicos podem inibir ou inativar as enzimas;
• Necessitam de cofatores – algumas enzimas precisam de cofatores
(substâncias orgânicas ou inorgânicas) para realizar a catálise;
• Apresentam atividade reduzida – na maioria das vezes a atividade em
solventes orgânicos é menor quando comparada aos sistemas aquosos, além disso, apresentam alto custo. 1, 11
A utilização de técnicas de imobilização tem minimizado algumas destas desvantagens, pois a imobilização pode aumentar a estabilidade das enzimas e facilitar a sua recuperação e reutilização. 10, 13, 19
Como qualquer catalisador, as enzimas aumentam a velocidade das reações através da diminuição da barreira de energia existente entre reagentes (substratos) e produtos sem sofrer alterações permanentes em sua estrutura. Na literatura existem algumas propostas de como ocorre a interação da enzima com o substrato (S), sendo, que uma reação catalisada por enzima sempre é iniciada pela formação de um complexo enzima-substrato (EnzS), dentro de uma cavidade denominada sítio ativo, onde ocorre a catálise. A formação deste complexo conduz a uma diminuição da energia de ativação, aumentando a velocidade da reação, conforme apresentado na
FIGURA 3. 15, 20, 21
FIGURA 3 – DIAGRAMA DE ENERGIA PARA UMA REAÇÃO NÃO CATALISADA E UMA REAÇÃO
CATALISADA POR ENZIMA.
FONTE: O autor (2018).
As enzimas são classificadas de acordo com a União Internacional de Bioquímica e Biologia molecular (UIBBM - International Union of Biochemistry and Molecular Biology) conforme as reações que catalisam, existindo seis classes principais (TABELA 1). Para a identificação individual, as enzimas possuem um código de 4 dígitos na Comissão de Enzimas (EC – Enzyme Commission), EC A.B.C.D, onde, A representa a classe principal, B a classe, C indica a sub-subclasse (grupos químicos específicos que participam da reação) e D é o número individual da enzima em sua sub-subclasse.1, 15, 16
TABELA 1 - CLASSIFICAÇÃO DAS ENZIMAS SEGUNDO A UIBBM.
Classificação Tipo de reação catalisada
1. Oxidorredutases Transferência de elétrons, reações de oxidorredução 2. Transferases Transferência de grupos funcionais
3. Hidrolases Reações de hidrólise
4. Liases Adição de grupos as duplas ligações ou eliminação de grupos para formação de duplas ligações
5. Isomerases Isomerização
6. Ligases Formação de ligações pelo acoplamento com hidrólise de ATP FONTE: Adaptado de NELSON (2002).16
As enzimas que pertencem a classe das hidrolases são as mais comumente utilizadas na síntese orgânica e representam grande parte das enzimas utilizadas na indústria. Como exemplos de enzimas da classe das hidrolases estão as proteases, as esterases, as amilases, as celulases, e de grande destaque as lipases.1, 2, 22, 23
2.1.1 Lipases
As lipases (triacilglicerol acil hidrolases EC 3.1.1.3) são enzimas hidrolíticas e podem ser encontradas em diversos organismos, incluindo animais, plantas, fungos e bactérias. Os micro-organismos são a fonte preferencial de produção de enzimas, em especial os fungos, pois as enzimas produzidas por eles normalmente são extracelulares, favorecendo sua extração, isolamento e purificação. Em seu ambiente natural elas catalisam as reações de hidrólise de triacilgliceróis aos correspondentes ácidos graxos e glicerol. 1, 22, 24, 25
A capacidade das lipases em aceitar diferentes substratos não-naturais faz com que essas enzimas, em solventes orgânicos, catalisem várias reações, dentre elas estão a esterificação, a transesterificação, a aminólise, entre outras (FIGURA 4).1, 2, 23, 26 Além disso, as lipases apresentam algumas vantagens quando comparada as
demais classes de enzimas, como por exemplo: não necessitam de cofatores; e em geral são capazes de atuar em uma ampla faixa de temperatura e pH sem sofrer inativação. 3, 27
FIGURA 4 - REAÇÕES CATALISADAS POR LIPASES.
FONTE: O autor (2018).
Algumas lipases exibem um aumento na atividade enzimática quando estão na presença de uma interface orgânico/aquosa, pois possuem uma cadeia polipeptídica que cobre o sitio ativo da enzima em solução (forma fechada), denominada tampa hidrofóbica ou “lid”. A presença de uma interface orgânico/aquosa provoca um rearranjo estrutural da “lid”, tornando acessível o sitio ativo e permitindo a catálise (forma aberta), conforme apresentado na FIGURA 5. Esse fenômeno ficou conhecido como ativação interfacial. Entretanto algumas lipases não possuem a tampa ou não necessitam da interface para desempenhar sua atividade hidrolítica. 1, 11, 28, 29
FIGURA 5 - CONFORMAÇÃO INATIVA E ATIVA DA LIPK107 SOBREPOSTAS.
FONTE: Reimpresso de Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Proteins and Proteomics, Vol. 1804, Xu et al., Template-based modeling of a psychrophilic lipase: Conformational changes, novel structural features and its application in predicting the enantioselectivity of lipase catalyzed transesterification of secondary alcohols, Pág. 2186, Direitos autorais (2010)29, com permissão da Elsevier (ANEXO A, pág. 126).
LEGENDA: A presença da Ser79 no sitio catalítico mostra a tampa ou lid na conformação inativa (em azul – forma fechada) e na conformação ativa (em vermelho – forma aberta), a seta tracejada (em azul claro) mostra a ação de abertura da tampa.
2.1.1.1 Mecanismo de catálise
A partir de estudos estruturais entende-se que as lipases realizam a catálise através de um sitio ativo composto por três resíduos de aminoácidos que são serina, histidina e aspartato ou glutamato (Ser-His-Asp/Glu).1, 2, 30 A FIGURA 6, mostra a
representação gráfica da estrutura tridimensional da lipase de Candida antarctica (CAL-B) com a ampliação do seu sitio ativo formado pelos resíduos Ser-His-Asp.
FIGURA 6 - REPRESENTAÇÃO ESQUEMÁTICA DA ESTRUTURA TRIDIMENSIONAL DA LIPASE
DE CANDIDA ANTARCTICA OBTIDA POR RAIOS X.
FONTE: Disponível em www.rcsb.org/pdb/ (PDB – PROTEIN DATA BANK).26, 31
O mecanismo que tem sido elucidado em maiores detalhes é o da serina hidrolase, onde a hidrólise do substrato ocorre em duas etapas, conforme apresentando na FIGURA 7.
FIGURA 7 – REPRESENTAÇÃO SIMPLIFICADA DA REAÇÃO DE HIDRÓLISE A PARTIR DA
SERINA HIDROLASE.
Na primeira etapa os dois grupos aspartato (Asp) e histidina (His) que estão localizados próximos ao resíduo da serina (Ser) formam a tríade catalítica. O arranjo destes grupos leva a um aumento da nucleofilicidade do oxigênio da hidroxila da serina, permitindo o ataque ao carbono da carbonila do substrato, que se torna covalentemente ligado a enzima, levando a formação do complexo acil-enzima e liberação do grupo de saída. Na segunda etapa um nucleófilo ataca o carbono da carbonila do intermediário acil-enzima, liberando o produto acilado e regenerando a enzima.1, 32
Nos últimos anos o uso das lipases vem crescendo em diversos segmentos industriais, pois elas podem ser utilizadas em diferentes aplicações. Como por exemplo, elas podem ser empregadas no processamento de alimentos, detergentes e formulações desengordurantes, indústria de polpa e papel, no tratamento de efluentes ricos em óleos e gorduras e em síntese orgânica, destacando-se na obtenção de compostos opticamente ativos. 3, 5, 7, 23
A utilização dessas enzimas na síntese orgânica ainda é limitada, devido algumas desvantagens já mencionadas anteriormente. Entretanto tem-se buscado metodologias que minimizem tais problemas, como por exemplo, técnicas de imobilização que vêm sendo empregadas com a finalidade de melhorar a estabilidade, aumentar a atividade catalítica e facilitar o manuseio e recuperação da enzima do meio reacional. 10, 11, 33
2.2 IMOBILIZAÇÃO DE ENZIMAS
A imobilização de enzimas tem sido utilizada com o objetivo de aumentar o desempenho desses biocatalisadores, pois em muitos casos a atividade catalítica observada nas enzimas em solventes orgânicos é mais baixa do que em água, tornando as aplicações práticas pouco atraentes.2, 11, 33
De modo geral, uma enzima imobilizada pode ter sua atividade catalítica aumentada em comparação com a enzima não imobilizada. Além disso, podem se tornar insolúveis em qualquer meio, o que facilita a sua reutilização e purificação do produto. 10, 11, 34, 35
Existem vários métodos de imobilização, os mais frequentemente utilizados são:
• Ligações covalentes – neste método ocorre a formação de uma ou várias ligações covalentes entre a enzima e o suporte;
• Ligações cruzadas - a própria enzima atua como suporte formando ligações covalentes entre si;
• Imobilização por inclusão ou confinamento – a enzima permanece em espaços confinados, ficando aprisionada, mas continua cataliticamente ativa;
• Imobilização por adsorção - neste caso a ligação entre a enzima e o suporte pode ocorrer através de diferentes tipos de interações não-covalentes. Tais como, interações hidrofóbicas, forças de Van der Waals, ligações iônicas e ligações de hidrogênio.1, 10, 11, 36
A FIGURA 8 ilustra alguns métodos utilizados para a imobilização de enzimas.
FIGURA 8- REPRESENTAÇÃO ESQUEMÁTICA DOS MÉTODOS DE IMOBILIZAÇÃO DE ENZIMAS.
FONTE: O autor (2018).
O método escolhido para a imobilização irá depender de vários fatores, como o tipo de enzima, o suporte e sua aplicação. Dependendo da técnica de imobilização, algumas propriedades do biocatalisador (atividade, estabilidade e seletividade) podem ser alteradas significativamente, e em alguns casos obtendo-se um maior desempenho do biocatalisador. Entretanto, a imobilização também pode causar um efeito contrário, como a diminuição da atividade especifica da enzima (µmols de substrato convertido por enzima unitária por unidade de tempo), devido a limitações de transferência de massa ou em casos mais extremos a sua desativação. 10, 11, 37
A escolha do suporte é uma etapa importante na imobilização de enzimas, assim algumas características são desejáveis, tais como: ser insolúvel no meio reacional; possuir uma boa área superficial; apresentar resistência ao ataque
microbiológico e estabilidade química, mecânica e térmica; possuir grupos químicos que possam ser ativados ou modificados. Uma característica extremamente necessária é que o suporte não deve interferir na estrutura nativa da enzima. 10, 36, 38
2.2.1 Suportes para imobilização de enzimas
Atualmente diferentes tipos de suportes podem ser encontrados para imobilização de enzimas, como os polímeros naturais e sintéticos, sílica, entre outros. Entretanto estudos recentes mostram que a utilização de materiais nanoestruturados como suportes podem levar a um aumento da estabilidade e da atividade das enzimas em várias reações. 37- 39
Nanomateriais são materiais que possuem tamanho em escala nanométrica e apresentam propriedades únicas que os distinguem do sólido estendido (materiais de origem). As propriedades desses compostos são totalmente dependentes do tamanho e da forma dessas partículas. Atualmente, os avanços na fabricação desses materiais levaram aos pesquisadores explorar as propriedades especiais que eles possuem, tais como, eletrônicas, magnéticas, mecânicas, químicas e ópticas.37, 39 - 41
Algumas características encontradas nos nanomateriais, incluindo a elevada área superficial e menor resistência à transferência de massa, podem ser exploradas para a imobilização de enzimas, pois tais propriedades são fatores essenciais que determinam a eficiência dos biocatalisadores. Vários nanomateriais têm sido relatados como potenciais suportes para a preparação de biocatalisadores, dentre eles estão: os nanotubos de carbono (CNTs – carbon nanotubes); as nanopartículas; as matrizes nanoporosas e as nanofibras.12, 14, 37
Os CNTs consistem em estruturas tubulares, formados por uma ou várias folhas de grafeno enroladas de forma concêntrica, sendo divididos em dois grupos, os de parede simples (SWCNTs – single-walled carbon nanotubes) e de paredes múltiplas (MWCNTs – multi-walled carbon nanotubes), como representados na
FIGURA 9. Esses materiais possuem a cavidade interna oca e podem apresentar suas
extremidades abertas ou fechadas. 40 - 42
Os nanotubos de carbono (CNTs), entre vários tipos de nanomateriais, podem ter suas propriedades alteradas pela funcionalização adicional no material. Essa funcionalização ocorre nas imperfeições dos CNTs, que podem ser tanto em suas paredes (superfície) ou pontas. Como resultado a funcionalização pode originar
propriedades diferentes em comparação com os nanotubos não funcionalizados. Assim, sua estrutura quimicamente modificada pode ser utilizada para facilitar a interação dos nanotubos com moléculas orgânicas, como as enzimas. 13, 43, 44
FIGURA 9 - REPRESENTAÇÃO ESQUEMÁTICA DA ESTRUTURA DOS NANOTUBOS DE
CARBONO.
FONTE: O autor (2018). LEGENDA: (A) SWCNTs. (B) MWCNTs.
A funcionalização é um método covalente, com o ataque direto dos grupos funcionais sobre os CNTs. Assim, quando esses materiais possuem defeitos, estes locais podem ser atacados por oxidantes fortes formando grupos carboxílicos (- COOH) ou hidroxílicos (-OH). Os grupamentos inseridos podem ainda ser usados como precursores para o ataque de outros grupos funcionais, levando a formação de grupamentos amino (NH2) na superfície do CNTs. 43, 44
As propriedades encontradas nos CNTs, tais como, estabilidade química, mecânica e térmica, bem como, resistência à oxidação e elevada área superficial, fazem com que esses materiais possam ser utilizados em diferentes aplicações, incluindo a biocatálise.13, 40, 45 Estudos recentes, mostram os nanotubos de carbono
como um suporte promissor para a imobilização de enzimas e a aplicação na resolução de compostos racêmicos.46, 47
Na literatura são descritos diferentes métodos de imobilização, sendo que o mais utilizado é a adsorção. Em comparação aos outros métodos, este é um processo mais simples, barato e além disso, na maioria dos casos a estrutura da enzima não é afetada.
Neste método a enzima é atraída pelo suporte e adsorvida sobre a sua superfície (FIGURA 10), através de diferentes tipos de interações não covalentes.36, 48, 49
A ligação não covalente da enzima na superfície dos CNTs pode ocorrer por diferentes mecanismos, como por exemplo: adsorção por interações de van der Waals e a formação de interação - stacks entre os resíduos aromáticos das enzimas e a superfície dos CNTs; interações hidrofóbicas entre as cadeias laterais hidrofóbicas de aminoácidos e a superfície desses materiais; através das ligações de hidrogênio entre grupos terminais da enzima e grupos contendo oxigênio ou nitrogênio presente nos CNTs funcionalizados.13
FIGURA 10 – REPRESENTAÇÃO ESQUEMÁTICA DA ADSORÇÃO FÍSICA DE UMA ENZIMA EM
TORNO DOS CNTS.
FONTE: O autor (2018).
A utilização de biocatalisadores, em especial as lipases imobilizadas, tem atraído grande atenção nos últimos anos na obtenção de compostos enantiomericamente puros, a partir da resolução cinética enzimática de racematos. A busca por compostos opticamente ativos é de extrema importância no desenvolvimento de novos fármacos, onde geralmente apenas um dos enantiômeros é responsável pela ação terapêutica, enquanto o segundo pode ser inativo ou até mesmo tóxico. 50
2.3 RESOLUÇÃO CINÉTICA ENZIMÁTICA
A síntese de moléculas enantiomericamente puras ainda é um desafio na química orgânica moderna devido à importância desses compostos nos processos biológicos, pois a maioria das moléculas presentes nos organismos vivos são quirais, sendo assim formadas por apenas uma das formas enantioméricas. 1, 50
A quiralidade pode ser definida como a condição necessária e suficiente para existência de enantiômeros. Estes possuem propriedades químicas e físicas (ponto de ebulição, fusão, solubilidade) semelhantes. Porém se diferem no sentido da rotação do plano da luz polarizada. 51
A mistura formada por quantidades equimolares dos enantiômeros é chamada racêmica ou racemato. Os enantiômeros podem apresentar atividades biológicas completamente diferentes, pois interagem de maneira distinta com outros sistemas quirais ou aquirais.1, 50
Na FIGURA 11 são mostrados os efeitos biológicos para a penicilina e a asparagina ao interagir com moléculas biológicas. Por exemplo o isômero (S) da penicilina é um agente terapêutico altamente potente para artrite crônica primária, enquanto o isômero (R) não tem ação terapêutica, e é altamente tóxico. Já o isômero (R) da asparagina tem um sabor doce, enquanto o isômero (S) apresenta sabor amargo.1, 50
FIGURA 11 – EXEMPLOS DE EFEITOS BIOLÓGICOS DE ALGUNS ENANTIÔMEROS.
FONTE: Adaptado de FABER (2011).1
A preparação de compostos enantiomericamente puros é um fator que torna a síntese enantiosseletiva e a resolução de misturas racêmicas uma área de grande interesse para as indústrias farmacêuticas, agroquímicas e de alimentos ao processar seus produtos (drogas, aditivos alimentícios, vitaminas) com apenas uma das formas enantioméricas
A resolução de racematos ainda é uma das metodologias mais importantes para a síntese de produtos enantiopuros. Esta pode ser dividida em várias categorias, dentre elas está a resolução cinética. 4
A resolução cinética (kinetic resolution- KR) é um processo no qual um dos enantiômeros de um racemato é convertido em produto mais rapidamente que o outro, utilizando um catalisador quiral. Isso ocorre devido as diferentes velocidades de reação para cada um dos enantiômeros. Assim quanto mais rapidamente um dos enantiômeros for transformado em produto, maior será a eficiência do método. Em uma situação ideal podemos esperar que apenas um dos enantiômeros será transformado no produto desejado enquanto o outro é recuperado sem reagir. 4, 5
A KR se limita a um rendimento máximo de 50%, visto que um racemato é formado por uma mistura de 50% de cada enantiômero. Para contornar essa limitação a resolução cinética dinâmica (dynamic kinetic resolution- DKR) vem sendo empregada. Nela o substrato sofre continuamente uma racemização in situ. Assim todo substrato pode ser convertido em produto com rendimento de 100%. 4, 5
Quando se utiliza uma enzima ou micro-organismo como catalisador quiral este processo é chamado de resolução cinética enzimática. Uma das enzimas empregadas neste processo são as lipases, onde a enzima é capaz de diferenciar os dois enantiômeros da mistura racêmica. Assim um dos enantiômeros é convertido em produto mais rápido que o outro. Existem alguns modelos que tentam explicar a preferência das enzimas para um determinado enantiômero em relação ao outro. 5, 32
Um dos modelos foi proposto por Ogston52. Ele desenvolveu a regra do ataque
de três pontos do substrato ao sitio ativo da enzima. Segundo este modelo, um substrato deve ser posicionado dentro do sitio ativo da enzima de tal maneira que garanta a melhor interação dos grupos substituintes do substrato com o sitio ativo da enzima. Como consequência, pelo menos 3 pontos diferentes de ligação do substrato no sitio ativo são necessários.
A FIGURA 12 mostra uma representação esquemática da preferência da enzima entre os enantiômeros A e B. No caso I o enantiômero A é um bom substrato porque garante uma ótima interação dos grupos substituintes (A, B e C) por complementariedade com o sitio ativo da enzima (A’, B’ e C’). Nos demais casos II-IV, o enantiômero B é um substrato pobre, pois independentemente da orientação no sitio ativo, não é possível obter uma complementariedade de ligação entre o substrato e o sitio ativo da enzima.1
FIGURA 12 - REPRESENTAÇÃO ESQUEMÁTICA DA PREFERÊNCIA DA ENZIMA ENTRE OS
ENANTIÔMEROS A E B.
FONTE: Adaptado de FABER (2011).1
Um modelo mais recente para explicar a enatiopreferência das enzimas, especificamente para as lipases, é conhecida como a regra de Kazlauskas. 53 Seus
estudos demonstraram a enantiosseletividade das lipases de Pseudomonas cepacia e Candida rugosa frente a álcoois secundários de acordo com o tamanho e forma dessas moléculas quando estão no sitio ativo da enzima.
Segundo este modelo o sitio ativo da enzima é constituído de duas cavidades, uma grande e outra média, conforme apresentado na FIGURA 13. A enantiosseletividade para um substrato que possua um substituinte grande e um médio, como por exemplo um álcool secundário, pode ser explicada admitindo que ao submeter este substrato a resolução por uma lipase, um dos enantiômero liga-se ao sitio ativo da enzima com maior facilidade do que o outro [FIGURA 13 (a)]. Assim o outro enantiômero fica obrigado a encaixar seu substituinte de maior volume na cavidade pequena [FIGURA 13 (a)]. Dessa forma ocorrem repulsões estéricas, diminuindo a velocidade de reação para este enantiômero. Vale ressaltar que esta regra não está associada a configuração R ou S, mas ela prevê o enantiômero de reação rápida baseado no tamanho dos seus substituintes.32, 54
FIGURA 13 – MODELO DO SITIO ATIVO PARA AS LIPASES – SEGUNDO A REGRA DE
KAZLAUSKAS.
FONTE: O autor (2018).
LEGENDA: (a) Enantiômero de reação rápida. (b) Enantiômero de reação lenta.
M = substituinte médio e L = substituinte grande.
A enantiosseletividade das enzimas também pode ser explicada cineticamente, através da razão entre as velocidades de reação de cada enantiômero com a enzima, como mostra a Equação 1, onde vR é a velocidade de reação com o
enantiômero R e vS é a velocidade de reação com o enantiômero S.
𝐸 =𝑣𝑅
𝑣𝑆 𝑝𝑎𝑟𝑎 𝑣𝑅 > 𝑣𝑆 (1)
Quando uma mistura racêmica é submetida a resolução cinética enzimática ambos os enantiômeros A e B irão competir pelo sitio ativo da enzima. Devido ao ambiente quiral do sitio ativo da enzima dois complexos diastereoisoméricos da enzima com o substrato são formados no estado de transição ([EnzA]≠ e [EnzB]≠),
resultando em diferentes valores de energia de Gibbs (ΔG), para os respectivos estados de transição. Como consequência um enantiômero é transformado em produto mais rápido que o outro. A variação da energia de Gibbs entre os dois estados de transição (ΔΔG≠) está relacionada diretamente com a enantiosseletividade da
FIGURA 14 – DIAGRAMA DE ENERGIA PARA UMA REAÇÃO ENANTIOSSELETIVA CATALISADA
POR ENZIMA.
FONTE: O autor (2018).
LEGENDA: A e B representam os enantiômeros e P e Q representam os produtos da reação.
A pureza enantiomérica de um composto quiral é expressa em termos do excesso enantiomérico (ee), como mostra a Equação 2, onde R é a concentração do (R)-enantiômero e S é a concentração do (S)-enantiômero, assim para uma mistura racêmica o ee tem um valor igual a 0 (ou 0%) e para um composto enantiomericamente puro esse valor é 1 (ou 100%).32
% 𝑒𝑒𝑅 =𝑅−𝑆
𝑅+𝑆 𝑥 100 𝑝𝑎𝑟𝑎 𝑅 > 𝑆 (2)
A enantiosseletividade (E) ou também chamada de razão enantiomérica é um parâmetro utilizado para avaliar a seletividade de uma reação catalisada por lipase e pode ser descrita numericamente (Equação 3), sendo o valor de E definido como uma razão entre constantes de velocidade para os dois enantiômeros, descrito pelos valores de kcat (número de moléculas do substrato convertidas por unidade de tempo
por enzima) e KM (constante de saturação do substrato). 32
𝐸 =
𝑣𝑅 𝑣𝑆=
(𝑘𝑐𝑎𝑡 𝐾𝑀 ⁄ ) 𝑅 (𝑘𝑐𝑎𝑡 𝐾𝑀 ⁄ ) 𝑆 (3) [EnzA]≠ [EnzB]≠ ΔG Enz + P Enz + Q ΔΔG≠ Enz + A ou B Coordenada da reaçãoEm 1982 Chen e col. 55 desenvolveram uma equação muito útil para a
resolução cinética enzimática, que pode ser utilizada para calcular o valor de E, utilizando os dados experimentais. Essa equação é dependente da conversão (c), dos excessos enantioméricos de substrato (ees) e de produto (eep), conforme apresentado
na Equação 4.
𝐸 =
𝑙𝑛 [(1−𝑐)(1−𝑒𝑒𝑠)] 𝑙𝑛 [(1−𝑐)(1+𝑒𝑒𝑠)]=
𝑙𝑛 [(1−𝑐)(1+𝑒𝑒𝑝)]
𝑙𝑛 [(1−𝑐)(1−𝑒𝑒𝑝)] (4)
A conversão é expressa pela Equação 5.32
𝑐 =
𝑒𝑒𝑠𝑒𝑒𝑠+𝑒𝑒𝑝 (5)
Em 1993, Rakels e col.56 simplificaram a Equação 4 , para obter a Equação
6, em termos de ees e eep.
𝐸 =
𝑙𝑛[ 1−𝑒𝑒𝑠 1+(𝑒𝑒𝑠/𝑒𝑒𝑝)] 𝑙𝑛[ 1+𝑒𝑒𝑠 1+(𝑒𝑒𝑠/𝑒𝑒𝑝)] (6)Com base nas equações acima, para valores de E < 15 as reações são consideradas como reações não-seletivas. Para uma resolução cinética ser considerada aceitável esses valores devem estar na faixa de 15-30, e acima desses valores são excelentes. Entretanto valores de E > 200 não podem ser determinados com precisão, pois nesta faixa uma pequena variação ees ou eep. causa uma mudança
significativa no valor numérico de E.1
2.3.1 Resolução cinética de álcoois alílicos
As reações catalisadas por lipases têm sido utilizadas para síntese de vários compostos, como na obtenção de compostos opticamente ativos, através da resolução cinética de misturas racêmicas de álcoois primários (que possuam centros quirais na molécula), secundários e terciários. 2, 32
Álcoois alílicos e seus derivados quirais ou enriquecidos enantiomericamente podem ser utilizados como blocos de construção em síntese orgânica, permitindo um
grande número de transformações, incluindo a formação de ligações carbono-carbono e a possibilidade de introdução de vários grupos funcionais a dupla ligação. Em algumas reações o álcool pode ser utilizado como um grupo de direção permitindo um alto grau de seletividade. Além disso esses álcoois podem ser utilizados para obtenção de compostos com 3 estereocentros contínuos, alguns exemplos incluem: hidrogenação, ciclopropanação (Reação de Simmons-Smith), dihidroxilação, epoxidação e hidroboração (FIGURA 15).57
FIGURA 15 – REAÇÕES DIVERSAS COM ÁLCOOIS ALÍLICOS.
FONTE: Adaptado de LUMBROSO (2013). 57 LEGENDA: MT = metal de transição.
Alguns álcoois alílicos possuem propriedades odoríferas que podem ser exploradas, quanto aromatizantes ou flavorizantes. Como por exemplo, o (R)-1-octen-3-ol que é conhecido como o principal aroma do cogumelo e o (S)-1-octen-(R)-1-octen-3-ol
apresenta um odor de grama mofada.8, 58Além disso, esses compostos podem servir
como uma primeira etapa para a síntese de lactonas enantiomericamente puras, conforme apresentado na FIGURA 16. Como muitas moléculas de lactonas quirais apresentam atividade biológica, elas podem ser exploradas para tratamentos medicinais, como por exemplo, as 4-hidróxi-5,6-dihidropironas (4-Hydroxy-5,6-dihydropyrones) que possuem propriedades de inibição contra a HIV protease. 59, 60
FIGURA 16 - ESTRATÉGIA PARA A SÍNTESE DE -LACTONAS ENRIQUECIDAS ENANTIOMERICAMENTE.
FONTE: Adaptado de WARNER (2013). 59
LEGENDA: RCM = Ring-closing metathesis (Metátese de fechamento de anel).
A partir destas considerações, este trabalho, propõe estudar as reações de resolução de álcoois alílicos na presença de doadores acila utilizando diferentes lipases imobilizadas em nanotubos de carbono de paredes múltiplas.
3 OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL
Este trabalho tem como objetivo avaliar a eficiência catalítica de diferentes lipases na sua forma livre e/ou imobilizada em nanotubos de carbono de paredes múltiplas (MWCNTs) na resolução de álcoois alílicos.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1. Determinar a concentração de proteínas presentes nas lipases comerciais de pâncreas de porco (PPL), de Candida rugosa AY “Amano” 30 (AY30) e de Burkholderia cepacia “amano” (PS) através do método de Bradford;
2. Determinar a atividade de hidrólise das lipases PPL, AY30, PS utilizando o método pHstat na reação de hidrólise do azeite de oliva;
3. Determinar a pureza das lipases PPL, AY30, PS através do método de eletroforese SDS-PAGE;
4. Sintetizar via química o álcool buten-2-ol a partir da redução da 4-fenil-3-buten-2-ona;
5. Sintetizar via química os padrões racêmicos a partir da reação entre os álcoois alílicos (1-hexen-3-ol, 1-octen-3-ol e 4-fenil-3-buten-2-ol) e o cloreto de acila ou anidrido acético;
6. Sintetizar via enzimática os padrões enriquecidos enantiomericamente utilizando a lipase comercial imobilizada de Candida antarctica (lipozyme 435) a partir da reação de transesterificação dos álcoois alílicos (1-hexen-3-ol, 1-octen-3-ol e 4-fenil-3-buten-2-ol) e o acetato de vinila;
7. Caracterizar os compostos obtidos nos itens 4, 5 e 6 através de técnicas espectroscópicas de infravermelho com transformada de Fourier (FT-IR), ressonância magnética nuclear de próton (RMN 1H) e cromatografia gasosa,
utilizando uma coluna de fase estacionária quiral com detector de ionização em chama (CGQ-FID);
8. Funcionalizar os nanotubos de carbono de paredes múltiplas (MWCNTs) utilizando diferentes métodos (H2SO4/HNO3 e APTES) e caracterizá-los através das técnicas
de FT-IR, análise termogravimétrica (TGA) e microscopia eletrônica de varredura acoplado a espectroscopia de raios X por dispersão de energia (MEV/EDS);
9. Avaliar o comportamento das lipases comerciais (PPL, AY30 e PS) em sua forma livre na resolução enzimática do 1-octen-3-ol utilizando o acetato de vinila como doador acila;
10. Determinar as condições de imobilização da lipase comercial que apresentou maior eficiência catalítica no item 9, utilizando o suporte nanotubos de carbono de paredes múltiplas sem funcionalização (MWCNTs-SF), avaliando o tempo necessário de contato entre a enzima e o suporte, através de uma cinética de imobilização;
11. Definir a melhor relação entre as massas de lipase e suporte dos imobilizados preparados no item 10 na resolução enzimática do 1-octen-3-ol com acetato de vinila;
12. Estudar a influência de alguns parâmetros, tais como: pH de imobilização, massa de enzima imobilizada, tipo de suporte (baseado nas diferentes funcionalizações), tempo, temperatura e solvente na resolução enzimática dos álcoois 1-octen-3-ol, 1-hexen-3-ol, 4-fenil-3-buten-2-ol com acetato de vinila.
4 METODOLOGIA
A metodologia utilizada no decorrer do trabalho foi adaptada com base em referências da literatura. Os reagentes foram utilizados como recebidos. Nanotubos de carbono de paredes múltiplas (MWCNTs - teor de carbono superior a 98%, diâmetro externo 10±0,1 nm, diâmetro interno 4,5±0,5 nm e comprimento 3-6 µm), 3 - aminopropiletoxisilano (APTES - 99 %), (E)-4-fenil-3-buten-2-ona (99 %), cloreto de propanoila (98 %), (RS)-1-hexen-3-ol (≥ 98%) e (RS)-1-octen-3-ol (98 %) foram adquiridos da empresa Sigma-Aldrich. Borohidreto de sódio (> 99%), cloreto de acila (> 99 %), foram adquiridos da empresa Vetec. Acetato de vinila (> 99%) foi adquirido da empresa Neon. Lipases comerciais de pâncreas de porco (PPL), de Candida rugosa AY “Amano” 30 (AY30) e lipozyme 435 foram recebidas como doação da Amano e Novozymes em colaboração com a profa. Maria da Graça Nascimento da
UFSC. Lipase comercial de Burkholderia cepacia “amano” (PS - 30.000 U•g-1)
adquirida da empresa Sigma Aldrich ou recebida de doação da empresa Amano Enzyme USA. Os demais reagentes utilizados foram de grau analítico .
A FIGURA 17 mostra de forma resumida um fluxograma das etapas desenvolvidas neste trabalho. O procedimento que foi utilizado em cada etapa está descrito nas próximas subseções.
FIGURA 17 - FLUXOGRAMA DAS ETAPAS QUE FORAM REALIZADAS NESTE TRABALHO VISANDO O ESTUDO DAS REAÇÕES DE RESOLUÇÃO ENZIMÁTICA DE ÁLCOOIS ALÍLICOS.
4.1 FUNCIONALIZAÇÃO DOS NANOTUBOS DE CARBONO
A funcionalização dos nanotubos de carbono de paredes múltiplas (MWCNTs) foi realizada empregando duas rotas distintas (A e N). A FIGURA 18 e a FIGURA 19 apresentam uma representação esquemática do processo de funcionalização pelas rotas A e N.
FIGURA 18 – REPRESENTAÇÃO ESQUEMÁTICA PARA FUNCIONALIZAÇÃO DOS MWCNTS PELA
ROTA A.
FONTE: O autor (2018).
FIGURA 19 – REPRESENTAÇÃO ESQUEMÁTICA PARA FUNCIONALIZAÇÃO DOS MWCNTS PELA
ROTA N.
FONTE: Adaptado de YU (2015). 61
Rota A (FIGURA 18) - Em um balão de fundo redondo foram adicionados 20 mg de MWCNTs-SF, 10 mL de solução de ácido nítrico (HNO3 - 3,0 mol•L-1) e 10
agitação em refluxo durante 6 horas.62 Posteriormente os MWCNTs funcionalizados
foram separados da solução por centrifugação (3500 rpm) e lavados com uma solução água/etanol (1:1, v/v) até pH 7. Após a lavagem os MWCNTs funcionalizados foram secos em estufa a 50ºC por 24 horas.
Rota N (FIGURA 19) - Em um balão de fundo redondo foram adicionados 100 mg de MWCNTs-SF, 5 g de hidróxido de potássio (KOH) e 100 mL de etanol. A mistura permaneceu sob agitação em refluxo durante 8 horas.61 Em seguida os
MWCNTs funcionalizados foram separados da solução por centrifugação (3500 rpm), lavados com uma solução água/etanol (1:1, v/v) até pH 7 e secos em estufa a 50 °C. Na etapa seguinte 50 mg dos MWCNTs funcionalizados submetidos ao tratamento com KOH foram dispersos em 50 mL de tolueno por 30 minutos. Após a dispersão a mistura foi mantida sob agitação e adicionado 5 mmol de 3-aminopropriltrietoxisilano (APTES) gota a gota. Em seguida, a mistura permaneceu sob agitação em refluxo a temperatura de 80 °C por 8 horas. Então os MWCNTs funcionalizados foram lavados com 50 mL de solução de tolueno/etanol (1:1, v/v) e 25 mL de etanol (2 vezes). Posteriormente, foram secos em estufa a 80 °C por 24 horas.
A caracterização dos MWCNTs funcionalizados e sem funcionalização foi realizada pelas técnicas de FT-IR, TGA e MEV/EDS, conforme descrito abaixo.
Os espectros de infravermelho para caracterização desses materiais foram obtidos no Laboratório Multiusuário de Análises Químicas (LAMAQ), da UTFPR, em um equipamento da marca Varian-640-IR, no intervalo entre 400 e 4000 cm-1,
empregando pastilhas de KBr, em modo transmissão, 64 scans com resolução de 4 cm -1 para cada espectro. As amostras foram preparadas macerando as mesmas
juntamente com KBr na concentração de 0,1% (m/m).
As análises termogravimétricas dos MWCNTs funcionalizados e sem funcionalização, foram realizadas pelo Laboratório do grupo de Cristais Líquidos (LabCristais), do departamento de química da UFSC sob supervisão do prof. Hugo Gallardo, utilizando um equipamento da marca Shimadzu modelo TGA-50, sob atmosfera de nitrogênio com taxa de aquecimento 10°C.min-1, na faixa de 50 - 900°C.
A análise química elementar das amostras de MWCNTs foi realizada pelo Centro Multiusuário de Caracterização de Materiais (CMCM) da UTFPR, utilizando a espectroscopia de raios X por dispersão de energia (EDS), no microscópio eletrônico de varredura (MEV) da marca ZEISS modelo EVO MA15. Os materiais foram dispostos, na forma de pó, sobre uma fita adesiva dupla face de carbono previamente
