Efeito do pH de imobilização e da estrutura do substrato

As enzimas podem ser altamente afetadas pelo pH, tanto durante a imobilização quanto ao longo dos processos de biocatálise. Assim, o efeito do pH de imobilização da PS em MWCNTs-SF (5:1) foi avaliado na resolução dos álcoois alilicos [(RS)-OC, (RS)-HX e (RS)- 4F3B] com acetato de vinila na faixa de pH entre 4,0 a 8,0.

Os resultados obtidos estão apresentados na TABELA 8.

A enantiopreferência da lipase PS foi para formação dos produtos (S)-AHX, (S)- AOC e (R)-A4F3B (conforme estão destacados na TABELA 8).

Como pode ser observado (TABELA 8), a variação do pH de imobilização (pHI) do sistema PS/MWCNTs-SF alterou significativamente a porcentagem de conversão ao utilizar os substratos alílicos alifáticos, (RS)-OC e (RS)-HX. Sendo que os melhores resultados foram obtidos em pH ácido 4,0 a 6,0, em comparação aos pHs neutro e básico (7,0 – 8,0). As porcentagens de conversões variaram de 31 a 39% para o álcool (RS)-OC e 42 a 73% para o álcool (RS)-HX. No entanto, a

enantiosseletividade manteve-se constante em toda faixa de pH estudada (E entre 3 e 4).

TABELA 8 - EFEITO DO PH NA IMOBILIZAÇÃO DA LIPASE PS EM MWCNTS-SF APLICADO A

RESOLUÇÃO DOS ÁLCOOIS (RS)-1-HEXEN-3-OL, (RS)-1-OCTEN-3-OL E (RS)-(E)-4- FENIL-3-BUTEN-2-OL COM ACETATO DE VINILA.

pHI

Substrato

(RS)-1-hexen-3-ol (RS)-1-octen-3-ol (RS)-(E)-4-fenil-3-buten-2-ol

c (%) eep (%) ees (%) E c (%) eep (%) ees (%) E c (%) eep (%) ees (%) E

4,0 42±4 16±1 (S) 11 (R) 3 31±1 44±1 (S) 19 (R) 4 52±1 98±0 (R) -- 118 5,0 62±10 14±1 (S) 23 (R) 3 39±4 46±1 (S) 29 (R) 4 52±1 98±0 (R) -- 118 6,0 73±11 18±1 (S) 47 (R) 3 37±4 47±1 (S) 27 (R) 4 50±2 98±1 (R) 96 (S) 94 7,0 39±1 24±2 (S) 15 (R) 3 22±4 51±0 (S) 15 (R) 4 51±4 98±1 (R) -- 157 8,0 44±6 26±2 (S) 20 (R) 3 19±0 51±0 (S) 12 (R) 4 21±6 > 99 (R) 26 (S) > 200 FONTE: O autor (2018).

NOTAS: Condições de imobilização: 150 mg do pó da lipase PS, 30 mg MWCNTs- SF, solução tampão citrato pH = 4,0 e 5,0 e fosfato pH = 6,0, 7,0 e 8,0 (50 mmol·L-1_{), 50 °C, 180 rpm, 24 horas.} Condições reacionais: 15 mg de lipase imobilizada, 0,5 mmol do álcool racêmico, 0,5 mmol de acetato de vinila, 5 mL de hexano, 35°C, 180 rpm, 72 horas.

Ao utilizar o álcool alilico aromático (RS)-4-F3B, melhores resultados foram obtidos, sendo que o respectivo éster foi formado com conversões de aproximadamente 50% na faixa de pH 4,0 a 7,0, resultando em valores de eep > 98%

e E de 94 - 157. Ao aumentar o pHI para um meio básico, observou uma diminuição na porcentagem de conversão cerca de 2,4 vezes menor em comparação aos demais valores de pHI (4,0 - 7,0).

Em muitos casos o pH ótimo das enzimas na sua forma livre pode ser diferente da sua forma imobilizada. Assim, o valor do pH utilizado na etapa de imobilização de enzimas é parâmetro que deve ser observado com cautela, pois as mudanças do pH podem alterar as cargas superficiais das enzimas e dos MWCNTs, afetando as interações entre a enzima e o suporte, levando a um aumento ou redução da atividade catalítica. 78, 84, 85

Alguns trabalhos descritos na literatura relatam que maiores eficiências catalíticas são obtidas quando as enzimas são imobilizadas em pH ácidos em comparação aos pH básicos. Como no trabalho de Yildirim e col. que descreve a acilação assimétrica de aminoálcoois utilizando a lipase de Pseudomonas sp. imobilizada em glutaraldeído, onde foi observado uma redução da atividade de hidrólise frente ao substrato p-NPP (palmitato de p-nitrofenila) quando a imobilização

foi realizada em pH = 8,0 (880±42 U/mg P) em comparação ao pH = 6,0 (1250±40 U/mg P).84

Ke e col., também observaram um decréscimo na atividade catalítica da lipase Burkholderia cepacia na acilação do feniletanol quando a lipase foi imobilizada em MWCNTS em pH básico entre 8,0 e 11,0, sendo que neste caso os melhores resultados foram obtidos em pH = 7,0. 78

O pH ótimo da lipase PS na sua forma livre é 7,0 (baseado na ficha técnica da enzima). No entanto, a partir dos resultados apresentados na TABELA 8, o pH de imobilização 6,0 foi selecionado para os demais estudos.

Este pH foi selecionado com base no trabalho previamente publicado por Dias e col., que relataram como pH ótimo de imobilização da lipase PS em MWCNTs o pH 6,0, quando este sistema foi aplicado na resolução do (RS)-feniletanol com acetato de vinila. 86

Como busca-se aplicar o mesmo sistema de imobilização para a lipase PS em MWCNTs para a resolução do maior número de substratos (álcoois secundários), nosso intuito foi buscar condições similares para todas as classes de álcoois já estudadas.

A TABELA 8 fornece outro resultado importante com relação a seletividade da PS baseada na estrutura do substrato. Os resultados mostram que os grupos substituintes ligados ao carbono assimétrico dos álcoois alílicos estudados influenciaram significativamente os valores de eep, e consequentemente os valores

de E.

Analisando os dados no mesmo ponto (pHI = 6,0), observa-se que o valor de E foi cerca de 25 vezes maior na resolução do álcool alílico aromático [(RS)-4F3B] em comparação aos álcoois alílicos alifáticos [(RS)-HX e (RS)-OC].

A diferença de enantiosseletividade para esses substratos pode ser explicada segundo o modelo de Kazlauskas, ou seja, baseado no tamanho dos grupos substituintes ligados ao carbono assimétrico. 53, 54

Neste caso, os enantiômeros dos substratos (R ou S dos álcoois alílicos) que apresentam um melhor encaixe nas duas porções hidrofóbicas presentes no sitio ativo da enzima, serão convertidos mais rapidamente em produto, conforme apresentado na FIGURA 33.

FIGURA 33 – REPRESENTAÇÃO ESQUEMÁTICA DOS ENANTIÔMEROS DOS SUBSTRATOS DE

REAÇÃO RÁPIDA NO SITIO ATIVO DA ENZIMA, UTILIZANDO A REGRA DE KAZLAUKAS.

FONTE: O autor (2018).

NOTAS: M e G representam as duas cavidades hidrofóbicas da enzima, média e grande, respectivamente.

LEGENDA: (a) (S)-1-hexen-3-ol. (b) (S)-1-octen-3-ol.

(c) (R)-(E)-4-fenil-3-buten-2-ol.

De acordo com o modelo, a melhor seletividade foi observada para o substrato (RS)-4F3B em que os substituintes do carbono assimétrico se diferem significativamente em tamanho [FIGURA 33 (c)].

No caso dos álcoois alílicos alifáticos a diferença entre os tamanhos dos substituintes são menos relevantes, assim ocorre uma diminuição da enantiosseletividade à medida que os grupos substituintes ligados ao carbono da hidroxila se aproximam em tamanho. Como é o caso do (RS)-HX [FIGURA 33 (a)], onde foram observados os menores valores de eep e valores de E (eep = 18 % e E = 3)

em comparação ao (RS)-OC [FIGURA 33 (b)] que possui uma cadeia carbônica maior, consequentemente ocorre um aumento da seletividade (eep = 47 % e E = 4).

Em vários trabalhos da literatura também foi observado baixos valores de E para álcoois alifáticos em comparação aos aromáticos. Como no trabalho de Chojnacka e col. utilizando a lipase Amano PS, observou menores valores de E para os álcoois alifáticos (RS)-1-hepten-3-ol (E = 6,8) em comparação ao aromático (RS)- 1-fenil-3-buten-2-ol (E > 150).8 _{Os autores justificam essa diferença pelo melhor ajuste}

ao sitio ativo da enzima, quando substratos aromáticos são utilizados.

Moure e col. também observaram um aumento nos valores da razão enantiomérica de aproximadamente 12 vezes quando a lipase de Burkolderia cepacia LTB11 imobilizada em Accurel MP1000 foi utilizada na resolução do álcool aromático (RS)-1-fenil-2-propen-1-ol (E = 64) em comparação ao alifático (RS)-5-Metil-1-hexen- 3-ol (E = 5) .83

Os dados apresentados mostram que a escolha da enzima, do substrato, do suporte, do método de imobilização e a relação substrato-enzima-suporte são fatores primordiais para a eficiência do processo biocatalítico e determinantes para a obtenção do produto com alta pureza enantiomérica.

A partir desses resultados, outro parâmetro importante a ser avaliado foi a otimização do tempo reacional nas reações de resolução dos álcoois alílicos