Paramyxovírus ofídio isolado de Crotalus durissus terrificus: padronização do método de PCR randômica para sequenciamento genômico e sequenciamento genômico parcial

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(1)LIDIANY LINHARES. UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS DOUTORADO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS. PARAMYXOVÍRUS OFÍDIO ISOLADO DE Crotalus durissus terrificus: PADRONIZAÇÃO DO MÉTODO DE PCR RANDÔMICA PARA SEQUENCIAMENTO GENÔMICO E SEQUENCIAMENTO GENÔMICO PARCIAL. 2011. LIDIANY DE SOUZA ARAÚJO LINHARES. Dr. José Luiz de Lima Filho Orientador. Dr. João Pessoa Araújo Júnior Co-orientador.

(2) UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS DOUTORADO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS. PARAMYXOVÍRUS OFÍDIO ISOLADO DE Crotalus durissus terrificus: PADRONIZAÇÃO DO MÉTODO DE PCR RANDÔMICA PARA SEQUENCIAMENTO GENÔMICO E SEQUENCIAMENTO GENÔMICO PARCIAL. LIDIANY DE SOUZA ARAÚJO LINHARES. Dr. José Luiz de Lima Filho Orientador. Dr. João Pessoa Araújo Júnior Co-orientador.

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(4) UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS DOUTORADO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS Parecer da comissão examinadora da tese de Lidiany de Souza Araújo Linhares intitulada “Paramyxovírus ofídio isolado de Crotalus durissus terrificus: padronização do método de PCR randômica para sequenciamento genômico e sequenciamento genômico parcial.” A comissão examinadora considera o presente trabalho “Aprovado por Unanimidade” Portanto, cumpridas todas as exigências regimentares, Lidiany de Souza Araújo Linhares faz jus ao grau de doutora em Ciências Biológicas pela Universidade Federal de Pernambuco. Recife, 25/02/2011..

(5) “O rio pode mudar de rumo, mas as águas nunca param de fluir.”.

(6) AGRADECIMENTOS. Ao meu Maior Orientador e Dono da minha vida, ao Senhor Deus que em todas as coisas, me direcionou e supriu todas as minhas necessidades para concluir este curso. A Ele que por sua imensa bondade e carinho me deu coragem e perseverança para continuar.. A mim mesma por encarar os desafios e perseverar em aprender que um cientista faz descobertas resolvendo problemas através da pesquisa.. Ao professor Dr. José Luiz de Lima Filho por ter aceitado ser meu orientador e sem através do qual eu não teria condições de ingressar no curso.. Ao Dr. João Pessoa Araújo Júnior porque mesmo sem me conhecer aceitou ser meu coorientador e com tanto bom humor e dedicação tem me ensinado a crescer. Obrigada por sua confiança e por tudo que me ajudou a aprender.. Ao meu amado esposo Cristiano Linhares, sem o qual eu não teria conseguido concluir esta pesquisa, por toda sua compreensão, companheirismo e incentivo, por me fortalecer com seu carinho e amor, por tantas vezes ter carregado minhas cargas quando já não aguentava mais, por ser um oásis no meu deserto.. A minha querida amiga Miriam Camargo Guarnieri, meus eternos agradecimentos por todos os seus ensinamentos e por todo apoio.. Aos meus pais Sadrack e Lidinei Araújo e ao meu irmão Sadrack Júnior, por sempre terem estado presentes na minha vida me incentivando e me ajudando em tudo o que precisei.. Ao pastor Elecir Brito por sempre cuidar da minha família com seus preciosos conselhos.. A todos os componentes do Laboratório de Animais Peçonhentos e Toxinas (UFPE) e do Laboratório de Virologia Animal e Humana (UNESP) por sempre serem presentes. Sem vocês eu não teria conseguido.. À FAPESP, à FUNDIBIO e ao CNPq pelo apoio financeiro..

(7) RESUMO. O paramyxovírus ofídio (OPMV) Brasil foi isolado em cultivo de células Vero, a partir de amostras coletadas do fluido pulmonar de serpentes Crotalus durissus terrificus. Estas apresentavam sinais de pneumonia, enquanto eram mantidas no Centro de Estudos de Venenos e Animais Peçonhentos, Botucatu, São Paulo, Brasil. Amostras do OPMV Brasil purificado por ultracentrifugação em gradiente de sacarose foram inicialmente submetidas a alguns tratamentos no intuito de eliminar possíveis ácidos nucléicos contaminantes. Com o objetivo de realizar o sequenciamento do seu genoma, foi padronizada a técnica de PCR randômica. Através desta técnica foram obtidos seis fragmentos que representam proteínas de nucleocapsídeo, fosfoproteína, fusão e polimerase viral, variando entre 413 a 553 pb, exibindo identidade entre 82% a 89% com a espécie tipo dos paramyxovírus de répteis, o Fer-de-Lance vírus (FDLV - AY141760). Com base nestas informações outros primers foram desenhados e mais um fragmento com 670 pb foi sequenciado, o qual corresponde ao gene U com 85% de identidade com o FDLV. Juntamente com outras sequências obtidas por PCR para os genes HN, F e L, bem como uma sequência parcial para o gene F publicada por outros pesquisadores (AF251500) foram montadas sequências contíguas utilizando o software MEGA v4.0, as quais foram alinhadas e comparadas através do BLASTn contra os dados depositados no GenBank. Ao todo foram obtidos 10 fragmentos genômicos do OPMV Brasil, 3 fragmentos por PCR tradicional, 6 por PCR randômica e 1 por primer walking. Cerca de 5313 nucleotídeos foram sequenciados, ou seja, um terço do genoma se comparado com 15378 pb do FDLV. Não foram obtidas sequências apenas para o gene M (matrix). As sequências de aminoácidos apresentaram identidade entre 77% e 97% com o FDLV e as sequências de aminoácidos de 4 fragmentos foram homólogas aos domínios conservados das proteínas N, F, HN e L. Quando comparadas as sequências para o gene F obtidas durante esta pesquisa com a depositada no GenBank sob número de acesso AF251500, constatou-se 100% de similaridade entre 328 nucleotídeos comuns, cerca de 109 aminoácidos. Portanto sugere-se que, em 2001, o mesmo agente viral afetou, no mesmo período, as serpentes dos gêneros Bothrops e Crotalus em diferentes regiões do estado de São Paulo. Baseado nas comparações das sequências de aminoácidos com o FDLV, OPMV Brasil pode ser considerado uma espécie diferente. Contudo, é necessário identificar as relações filogenéticas do OPMV Brasil com outras espécies de paramyxovírus isoladas até o momento.. Palavras-chave: Paramyxovírus, PCR randômica, seqüenciamento..

(8) ABSTRACT. The ophidian paramyxovirus (OPMV) Brazil was isolated in Vero cell culture, from lung fluid of Crotalus durissus terrificus snakes, which showed pneumonia’s signs, at the Center for the Study of Venoms and Venomous Animals, Botucatu, São Paulo, Brazil. OPMV Brazil samples used in this study were previously purified by sucrose density ultracentrifugation were initially subjected to several treatments in order to eliminate possible contaminant nucleic acids. Aiming to sequence its genome, the the randon PCR technique was standardized. Using this technique, six fragments were obtained, representing coding genes for nucleocapside protein, phosphoprotein, fusion and polymerase protein. The fragments ranged from 413 to 553 bp, showed 82 to 89% of identity with Fer-de-Lance virus (FDLV - AY141760). Based on this information, other primers were designed and an additional fragment of 670 bp was sequenced. This fragment corresponds to the gene U, with 85% of identity with FDLV. A contigous sequence was constructed, in MEGA v4.0 software, taking together the sequenced fragments from rPCR, other sequences obtained by specific PCR for HN, F and L genes, as well as a parcial sequence for the F gene previously published by other authors (AF251500). The sequences for each fragment were submitted to BLASTn and their amino acid sequences were translated in BLASTp. In all were obtained 10 fragments genomic from OPMV Brazil, three fragments by PCR traditional, six random PCR and one for primer walking. Approximately 5313 nucleotides were sequenced, one third of the genome compared with 15378 bp of FDLV. Not only were obtained sequences for the gene M (matrix). The aa sequences presented 77-97% of identity with FDLV and the aa sequences for four fragments were homologous to the conserved domain of the proteins N, F, HN and L. The partial gene F sequence herein obtained (328 nucleotides / 109 aa) presented a similarity of 100% with the sequence previously deposited in GenBank with accession number AF251500. Taking all these data together, we suggested that, in 2001, there was one type of paramyxovirus infecting, at the same time, the snakes from Bothrops and Crotalus genera, in different regions from São Paulo State. Based on the aa sequences comparisons with FDLV, the OPMV Brasil can be considered a different species. However, is necessary known its phylogenetic relation with other paramyxovirus isolated so far.. Key-words: Paramyxovirus, random PCR, sequencing..

(9) LISTA DE FIGURAS DA REVISÃO BIBLIOGRÁFICA. Figura 1 – Cascavel com sinais clínicos de distúrbio no sistema nervosos central................. pág. 17 Figura 2 – Crotalus unicolor com pneumonia hemorrágica................................................... pág. 18 Figura 3 – Fotomicrografia eletrônica de FDLV marcado por contrastação negativa exibindo pleomorfismo (A) Nucleocapsídeo com 321 nm de diâmetro (Fonte: Lunger e Clark, 1978); (B) Nucleocapsídeo com 143 nm de diâmetro (Fonte: Clark et al., 1979); (C) Nucleocapsídeo com 150 nm (Fonte: Ahne et al., 1999); (D) Nucleocapsídeo com 400 nm de diâmetro (Fonte: Mayr et al., 2000); (E) Nucleocapsídeo com 300 nm de diâmetro (Fonte: Franke et al., 2001) ................................................................................................................................................... pág. 19 Figura 4 – Crotalus durissus terrificus com pneumonia supostamente causada por paramyxovírus (A) Formação de “papo” e (B) Respiração de boca aberta. (Fonte: Silva, R.J., 2000 in Nogueira, 2004) ......................................................................................................................................... pág. 20 Figura 5 – Fotomicrografia eletrônica do OPMV Brasil isolado em células Vero.................. pág. 21 Figura 6 – Organização do genoma do FDLV (Fonte: Kurath et al., 2004)..............................pág. 21. 3.

(10) LISTA DE FIGURAS DOS ARTIGOS ARTIGO 1 Figure 1 – Viral particles were successfully purified from the aliquots of ultracentrifugation using a combination of differential centrifugation, filtration, and vertrel treatment. Effectiveness of the viral purification was confirmed for PCR. Viral particles are treated with nucleases to remove contaminated nucleic acids. Construction of double-stranded cDNA the OPMV. Fractions were directly amplified by rPCR and other was purified in MicroSpin S-400 HR column to eliminate the excess of FR26RVN primer. Random priming is used to generate 300–1000 bp amplicons which are size-selected and cloned. Colonies are picked up and sequenced. Sequence is trimmed and assembled. Contigs are closed using sequence-specific primers.………………..................... pág. 34 Figure 2 – Effectiveness of vertrel treatment in virus purification procedure as determined by PCR assays. Products were separed on 1.5% agarose gel. Lane 1, GeneRuler 100 bp DNA Ladder (Fermentas); Lane 2, positive PCR control for mitochondrial DNA with approximately 374 bp; Lane 3, positive PCR control for eukaryotic rRNA gene, >1000 bp; Lane 4, pellet, after centrifugation, result positive for mitochondrial DNA; Lane 5, pellet, after centrifugation, result negative for eukaryotic rRNA gene; Lane 6, Filtered supernatant fraction without Vertrel treatment, result positive PCR for mitochondrial DNA; Lane 7, Filtered supernatant fraction without Vertrel treatment, result negative PCR for eukaryotic rRNA gene; Lane 8, Filtered supernatant fraction with Vertrel treatment showing significant reduction of mitochondrial DNA contamination; Lane 9, Filtered supernatant fraction with Vertrel treatment with result negative PCR for eukaryotic rRNA gene. .………….................................................................................................................. pág. 35 Figure 3 – Effectiveness of nucleases treatment with sepharose columns for detection of OPMV particles by rPCR. Products were separed on 1.5% agarose gel. Lane 1 and 2, aliquots B2 (treated with DNAse and RNAse and purified in sepharose column); Lane 3 and 4, aliquots A2 (treated with DNAse and purified in sepharose column); Lane 5 and 10: HighRanger 1 Kb DNA Ladder (Norgen); Lane 6 and 7: aliquots B1 (treated with DNAse and RNAse); Lane 8 and 9: aliquots A1 (treated with DNAse only). .………………............................................................................ pág. 36 Figure 4 – Amplification by rPCR of viral cDNA after definition the best treatment, represented by B2 aliquot on 1.5% agarose gel. Lane 1, HighRanger 1 Kb DNA Ladder (Norgen); Lanes 2, 3 and 4, Random priming used to generate 300 –1000 bp amplicons, which are size-selected and cloned. .………………......................................................................................................................... pág. 36 4.

(11) ARTIGO 2 Figura 1 – Mapa esquemático da distribuição dos fragmentos genômicos do OPMV Brasil. F: fragmento e *: fragmento CrotBoth;...........................................................................................pág.46 Figura 2 – Coluna 1, HighRanger 1 Kb DNA Ladder (Norgen); Coluna 2, Produto obtido através de primers “walking” com aproximadamente 790 pb visualizado em gel de agarose 1,5%..... pág. 47. Figura 3 - Sequência parcial de nucleotídeos do OPMV Brasil (fragmento 1) alinhada com o genoma do FDLV sob número de acesso AY141760............................................................... pág. 49. Figura 4 - Sequência parcial da proteína N do OPMV Brasil (fragmento 1) com a proteína N do FDLV sob número de acesso NP_899654.1............................................................................. pág. 50. Figura 5 - Sequência parcial da proteína N do OPMV Brasil (fragmento 1) alinhada com sequências protêicas de outras espécies virais (gi 548001- Measles virus strain AIK-C; gi 82010533 - Dolphin morbillivirus; gi 127900 - Measles virus strain Edmonston; gi 548004 - Rinderpest virus (strain RBOK); gi 585547 - Rinderpest virus (strain L); gi 730123 - Rinderpest virus (strain kuwait 82/1); gi 585545 - Peste-des-petits-ruminants virus; gi 33302610 - Canine distemper virus strain Onderstepoort; gi 585544 - Phocine distemper virus) indica possíveis domínios conservados da proteína de nucleocapsídeo. Em vermelho, resíduos altamente conservados e em azul resíduos com menor grau de conservação....................................................................................................... pág. 50. Figura 6 - Sequência parcial de nucleotídeos do OPMV Brasil (fragmento 2) alinhada com o genoma do FDLV sob número de acesso AY141760. Em negrito as bases que indicam o sinal de poliadenilação, a caixa cinza indica o sítio de poliadenilação com 4 bases, em vermelho as bases que correspondem a região intergênica, em negrito e sublinhado o códon que sinaliza o local para a incorporação do CAP 5’ no RNAm e em amarelo o local de inserção de 11 bases no OPMV Brasil na região UTR 5’do gene U....................................................................................................... pág. 52. Figura 7 - Sequência parcial de aminoácidos do OPMV Brasil (ORF 1 do fragmento 2) com a ORF-1 OPMV sob número de acesso ACT63861.1.................................................................. pág. 52. Figura 8 - Sequência parcial da proteína U do OPMV Brasil (ORF 2 do fragmento 2) com a proteína U do paramyxovírus de réptil sob número de acesso AAS45836.1........................... pág. 53 5.

(12) Figura 9 - Sequência parcial de nucleotídeos do OPMV Brasil (fragmento 3) alinhada com o genoma do FDLV sob número de acesso AY141760. ............................................................. pág. 54. Figura 10 - Sequência parcial da proteína P/V do OPMV Brasil (fragmento 3) com proteínas do FDLV: proteína P sob número de acesso NP_899656.1 e proteína V sob número de acesso NP_899657.1. ........................................................................................................................... pág. 54. Figura 11 - Sequência parcial de nucleotídeos do OPMV Brasil (fragmento 4) alinhada com o genoma do FDLV sob número de acesso AY141760. ............................................................. pág. 55. Figura 12 - Sequência parcial da proteína P do OPMV Brasil (fragmento 4) com a proteína P do FDLV sob número de acesso NP_899656.1.............................................................................. pág. 55. Figura 13 - Sequência parcial de nucleotídeos do OPMV Brasil (fragmentos 5 e 6) alinhada com o genoma do FDLV sob número de acesso AY141760. Em negrito as 309 bases idênticas entre as sequências dos fragmentos 5 e 6 e em sublinhado as bases de códons incompletos. ............... pág. 57. Figura 14 - Sequência parcial da proteína F do OPMV Brasil (fragmento 5 e 6) com proteína F do FDLV sob número de acesso 2732801 F................................................................................... pág. 58. Figura 15 - Sequência do contig CrotBoth (fragmentos 5 e 6 com sequência parcial do gene F sob número de acesso AF251500) alinhada com o genoma do FDLV sob número de acesso AY141760. Em negrito as 328 bases idênticas entre as sequências dos fragmentos CrotBoth e a sequência parcial do gene F sob número de acesso AF251500. A caixa cinza refere-se a 100% de identidade com a sequência do RNAm da subunidade F-1 da proteína F do FDLV sob número de acesso AF251500 ............................................................................................................................ pág. 60/61. Figura 16 - Sequência do contig CrotBoth (fragmentos 5 e 6 com sequência parcial do gene F sob número de acesso AF251500) alinhada com a proteína F de um OPMV GonoGER85 sob número de acesso AAV54052.1.................................................................................................................. pág. 62. 6.

(13) Figura 17 - Sequência do contig CrotBoth (fragmentos 5 e 6 com sequência parcial do gene F sob número de acesso AF251500) alinhada com sequências parciais da proteína F de outras espécies virais (2B9B_A: Parainfluenza virus 5; gi 138283: Turkey rhinotracheitis virus; gi 1353202: Bovine parainfluenza virus 3; gi 62512131: Sendai virus; gi 138268: Human parainfluenza virus 1; gi 549307: Measles virus strain AIK-C; gi 138249: Canine distemper virus strain Onderstepoort; gi 465403: Newcastle disease virus (STRAIN AUSTRALIA-VICTORIA/32); gi 138282: simian virus 5) revelando uma região de domínio conservado do precursor inativo (F0) da proteína de fusão dos paramyxovírus. Em vermelho, resíduos altamente conservados e em azul resíduos com menor grau de conservação. ......................................................................................................................... pág. 63. Figura 18 - Sequência parcial de nucleotídeos do OPMV Brasil (fragmento 7) alinhada com o genoma do FDLV sob número de acesso AY141760............................................................... pág. 65. Figura 19 - Sequência parcial da proteína HN do OPMV Brasil (fragmento 7) com proteína HN do FDLV sob número de acesso NP_899660.1............................................................................. pág. 65. Figura 20 - Sequência parcial da pronteína HN do OPMV Brasil (fragmento 7) com com sequências parciais da proteína HN de outras espécies virais (gi 82024394: Mossman virus; gi 82037869: Tupaia paramyxovirus; gi 123852758: J-virus; gi 123828331: Beilong virus; gi 75551748: Fer-de-lance virus; gi 82018030: Human parainfluenza virus 3; gi 82037801: Bovine parainfluenza virus 3; gi 82026851: Recombinant PIV3/PIV1 virus; gi 82034258: Menangle virus) revelando uma região de domínio da proteína HN dos paramyxovírus. Em vermelho, resíduos altamente conservados e em azul resíduos com menor grau de conservação........................... pág. 66. Figura 21 - Sequência parcial de nucleotídeos do OPMV Brasil (fragmento 8) alinhada com o genoma do FDLV sob número de acesso AY141760. Em sublinhado as bases de um códon incompleto................................................................................................................................. pág. 68. Figura 22 - Sequência parcial da proteína L do OPMV Brasil (fragmento 8) com proteína L do FDLV sob número de acesso NP_899661.1. ............................................................................ pág. 68. 7.

(14) Figura 23 - Sequência parcial da proteína L do OPMV Brasil (fragmento 8) com sequências protêicas de outras espécies virais (gi 81974830: Tupaia paramyxovirus; gi 123828330: Beilong virus; gi 123852757: J-virus; gi 82010656: Dolphin morbillivirus; gi 548836: Measles virus strain AIK-C; gi 81962405: Avian paramyxovirus 6; gi 75551747: Fer-de-lance virus; gi 75566871: Human parainfluenza virus 3; gi 133613: Sendai virus) revelando possíveis domínios conservados da proteína de L. Em vermelho, resíduos altamente conservados e em azul resíduos com menor grau de conservação. ......................................................................................................................... pág. 69. Figura 24 - Sequência parcial de nucleotídeos do OPMV Brasil (fragmento 9) alinhada com o genoma do FDLV sob número de acesso AY141760. Em sublinhado a base de um códon incompleto. ............................................................................................................................... pág. 70. Figura 25 - Sequência parcial da proteína L do OPMV Brasil (fragmento 9) com proteína L do FDLV sob número de acesso NP_899661.1. ............................................................................ pág. 71. Figura 26 - Sequência parcial de aminoácidos do OPMV Brasil (fragmento 9) com sequências protêicas de outras espécies virais (gi 81974830: Tupaia paramyxovirus; gi 123828330: Beilong virus; gi 123852757: J-virus; gi 82010656: Dolphin morbillivirus; gi 548836: Measles virus strain AIK-C; gi 82022301: Peste-des-petits-ruminants virus; gi 81962405: Avian paramyxovirus 6 (APMV-6); gi 75551747: Fer-de-lance virus; gi 75566871: Human parainfluenza virus 3;) revelando possíveis domínios conservados da proteína de L. Em vermelho, resíduos altamente conservados e em azul resíduos com menor grau de conservação. .......................................... pág. 71. Figura 27 - Sequência parcial de nucleotídeos do OPMV Brasil (fragmento 10) alinhada com o genoma do FDLV sob número de acesso AY141760. Em sublinhado a base de um códon incompleto. ............................................................................................................................... pág. 72. Figura 28 - Sequência parcial da proteína L do OPMV Brasil (fragmento 10) com proteína L do FDLV sob número de acesso NP_899661.1. ............................................................................ pág. 72. 8.

(15) LISTA DE TABELAS DOS ARTIGOS. ARTIGO 1. Table 1: List of fragments the OPMV obtained by random PCR. ........................................... pág. 37. Table 2: List of colonies sequenced with pGEM-T Easy and pJET vectors. ........................... pág. 38. ARTIGO 2. Tabela 1: Estrutura dos fragmentos genômicos do OPMV Brasil. .......................................... pág. 48. 9.

(16) LISTA DE ABREVIAÇÕES. 1. µl - microlitro; 2. µm – micrômetro; 3. µM – micromolar; 4. AMV - avian myeloblastosis virus; 5. BLAST - Basic Local Alignment Search Tool; 6. bp – base pair; 7. CAP 5’- 7-metil-guanosina na extremidade 5’ 8. cDNA - DNA complementar; 9. CEVAP - Centro de Estudos de Venenos e Animais Peçonhentos; 10. CrotBoth – Crotalus Bothrops; 11. DNA - deoxyribonucleic acid; 12. DNAses – enzimas que degradam o DNA; 13. dNTP - desorribonuleotídeo trifosfatado; 14. ECP - efeitos citopáticos; 15. ELISA - Enzyme-linked immunosorbent assay; 16. F – fusão; 17. F0 - precursor inativo da proteína de fusão; 18. FDLV- Fer de Lance vírus; 19. g – gravidade; 20. h – hora; 21. HI - inibição da hemaglutinação; 22. HN - hemaglutinina-neuraminidase; 23. IGR - intergenic regian; 24. Kb – kilobases; 25. L – polimerase; 26. LB - Luria Bertani; 27. M – matrix; 28. MEGA - Molecular Evolutionary Genetics Analysis; 29. min – minuto; 30. ml – mililitro; 31. mM – milimolar; 32. N – nucleocapsídeo; 33. NCBI - National Certer for Biotechnology Information; 10.

(17) 34. nm – nanômetro; 35. nt – nucleotídeo; 36. OPMV - Ophidian Paramyxovirus; 37. ORF - Open Region Frame; 38. P – fosfoproteína; 39. pb - pares de bases; 40. PCR - polymerase chain reaction; 41. RNA - ribonucleic acid; 42. RNAm – RNA mensageiro; 43. rPCR - PCR randômica; 44. rRNA – RNA ribossômico; 45. sec – segundos (inglês); 46. seg – segundos; 47. SISPA - Sequence-Independent Single Primer Amplification; 48. SPF - Specified Pathogen Free; 49. U – unique; 50. UTR: unstranlated region; 51. V - proteína rica em cisteína; 52. x – vezes; 53. μg – micrograma;. 11.

(18) SUMÁRIO Resumo .......................................................................................................................................pág. 1 Abstract ......................................................................................................................................pág. 2 Lista de figuras da revisão bibliográfica ...................................................................................pág. 3 Lista de figuras dos artigos ........................................................................................................pág. 4 Lista de tabelas dos artigos ........................................................................................................pág. 9 Lista de abreviações .................................................................................................................. pág. 10 Sumário ..................................................................................................................................... pág. 12 Introdução.................................................................................................................................. pág. 13 Revisão Bibliográfica I. Cativeiro e Enfermidades ...............................................................................................pág. 14 II. Paramyxovírus Ofídio ................................................................................................... pág. 15 III. Sequenciamento de Genomas Virais ............................................................................ pág. 23 Referências Bibliográficas ....................................................................................................... pág. 24 Artigo 1 - Standardization of Random Priming Method for Genome Sequencing of the Ophidian Paramyxovirus. ……………………………………………………………....pág. 29 Artigo 2 - Sequenciamento parcial do genoma do Paramyxovírus Ofídio Brasil isolado de Crotalus durissus terrificus ..................................................................................... pág. 42 Conclusões ................................................................................................................................ pág. 77 Normas da Revista ................................................................................................................... pág. 79 Comprovante de submissão do artigo ....................................................................................... pág. 92. 12.

(19) INTRODUÇÃO. As serpentes peçonhentas são animais fascinantes e são fundamentais para o equilíbrio dos ecossistemas nos quais estão naturalmente inseridos, hora atuando como presas, hora como predadoras. Embora estes ofídios causem medo, milhares de pessoas são beneficiadas com os produtos desenvolvidos a partir de suas peçonhas, soros antiofídicos e fármacos. No Brasil, poucos estudos são desenvolvidos com o objetivo de preservar a saúde destes animais e mesmo com os cuidados em cativeiro (quarentena), algumas enfermidades atingem plantéis particulares e zoológicos causando óbitos com causa desconhecida. Após uma suspeita de infecção por paramyxovírus que matou mais de 400 espécimes em um serpentário no interior de São Paulo no ano de 1997, em 2004 foi realizado o isolamento do paramyxovírus ofídio Brasil em cultivo de células Vero durante um surto no mesmo serpentário, que novamente causou diversos óbitos. Deste então, nenhum estudo foi realizado com este agente viral. Através das informações obtidas com o sequenciamento genômico do paramyxovírus é possível desenvolver um método de detecção de serpentes que previamente entraram em contato com este agente viral e realizar uma triagem das serpentes antes de serem introduzidas nos serpentários. Assim, o ingresso de um paramyxovírus nas coleções poderia ser evitado, bem como as altas taxas de morbidade e mortalidade normalmente decorrentes de paramyxoviroses. Com um método de detecção também seria possível auxiliar o monitoramento e o controle das doenças no trato respiratório causadas pelo paramyxovírus em serpentes. Cientes das ferramentas que possibilitam o sequenciamento de genomas virais e com o objetivo de fornecer informações que possam ser usadas para manter serpentes saudáveis, neste trabalho nos propomos a realizar a padronização da técnica de PCR randômica, que juntamente, com as técnicas de PCR tradicional e primers walking serão aplicadas para sequenciar parcialmente o genoma do paramyxovírus ofídico Brasil previamente isolado de serpentes Crotalus durissus terrificus.. 13.

(20) REVISÃO BIBLIOGRÁFICA. I. CATIVEIRO E ENFERMIDADES. A criação de serpentes peçonhentas em cativeiro é uma importante atividade, pois é a partir da peçonha que os soros antiofídicos são produzidos com o objetivo de realizar o tratamento de vítimas de envenenamento ofídico e desenvolver estudos com propriedades farmacológicas (Nogueira, 2004). Porém, nesta modalidade zootécnica, as serpentes mantidas em cativeiro, tornamse mais vulneráveis a ação de patógenos do que se estivessem em seu habitat natural visto que as diferentes condições ambientais podem ocasionar depressão de seu sistema imune (Barnard, 1996; Ackerman, 2003; Jacobson, 2004). Dentre todas as patologias que acometem a criação de serpentes em cativeiro, as doenças que atingem o sistema respiratório assumem uma posição de destaque, pois em alguns casos podem causar 100% de mortalidade do plantel (Nogueira, 2004). As características morfológicas e fisiológicas do trato respiratório tendem a favorecer a retenção de secreções respiratórias e exsudados nos tecidos do trato respiratório inferior provocando abertura da boca e emissão de ruídos durante a respiração, além do acúmulo de secreções purulentas nas narinas e na glote (Jacobson, 1992; Schumacher, 1997). Dentre os grupos virais já registrados em serpentes estão os calici-, adeno-, herpes-, reo-, picorna-, flavi-, retro-, parvo-, irido- e paramyxovírus responsáveis por causar dificuldade respiratória, letargia, pneumonia, hemorragias, necrose pancreática e gastrointestinal, perda de apetite, emagrecimento rápido, redução da temperatura corpórea, ingestão excessiva de líquido, ecdises constantes, convulsões, tumores, distúrbios nervosos como desorientação ou regurgitações crônicas (Essbauer e Ahne, 2001; Ackerman, 2003; Hoser, 2003; Jacobson, 2004; James e April, 2005).. 14.

(21) II. PARAMYXOVÍRUS OFÍDIO. B A. A. B Em 1972, em um serpentário na Suíça, uma epizootia matou 30% do plantel de Bothrops A. atrox e um agente viral capaz de eliminar por completo plantéis de coleções particulares e zoológicas foi isolado das suspensões pulmonares do trato respiratório das serpentes com doença respiratória (Foelsch e Leloup, 1976; Clark et al., 1979, Jacobson et al., 1980). Ainda em 1978 o papel dos vírus como agentes etiológicos primários de doença em répteis era desconhecido (Burke, 1978). Porém, desde o primeiro isolamento, diversos óbitos foram registrados entre serpentes nos EUA, México, Argentina, Alemanha e Espanha (Ahne et al., 1987; Foelsch e Leloup, 1976; Jacobson, 1980; Jacobson et al., 1981, 1992; Orós et al., 2001). Posteriormente, este vírus foi chamado de Fer de Lance vírus (FDLV) e por apresentar propriedades ultraestruturais semelhantes às myxoviruses foi identificado como um provável paramyxovírus (Clark et al., 1979; Clark e Lunger, 1981). Jacobson et al. (1980) descreveram o caso de uma Crotalus lepidus com história de doença progressiva do sistema nervoso central que havia sido submetida à necropsia. Os achados histopatológicos evidenciavam pneumonia intersticial e alterações de órgãos do sistema nervoso, desmielinização e degeneração axonal foram observadas no tronco cerebral e medula espinhal superior. Através de microscopia eletrônica, constataram-se inúmeras partículas virais no espaço extracelular do tecido do tronco cerebral. Amostras do tecido pulmonar foram inoculadas em cultura de células cardíacas de serpente e, finalmente, um vírus similar a um paramyxovírus foi isolado. Por comparações a partícula isolada era semelhante em tamanho e formato àquelas partículas vistas no tecido nervoso. Os efeitos citopáticos, a sensibilidade ao éter, a capacidade hemaglutinante e a aparência ultraestrutural reforçaram a suposição de que o agente era um paramyxovírus. Clark e Lunger (1981) afirmaram que o FDLV é um paramyxovírus por possuir um genoma com RNA de cadeia simples com um coeficiente de sedimentação de 50S, embora comparações sorológicas com outros paramyxovírus de mamíferos e aves indicassem diferenças antigênicas. Porém ainda era necessário verificar se este vírus era altamente patogênico, sendo sozinho capaz de causar severas epizootias, ou era um agente de infecções latentes ordinárias levando à doença aguda animais sujeitos a outros fatores de estresse. Jacobson et al. (1981) relataram que nos meses de fevereiro e março de 1980, 35 serpentes de uma coleção de 438 animais foram a óbito no Zoológico de Louisiana. Os óbitos ocorreram apenas entre os gêneros da família Viperidae, sendo o gênero Crotalus um dos mais atingidos. Vírus com as características de paramyxovírus foram isolados de tecidos dos animais atingidos e realizaram-se provas sorológicas de inibição da hemaglutinação em 22 serpentes que sobreviveram. Os títulos positivos variaram de 20 a 2560, com apenas dois animais com títulos negativos. 15.

(22) Nos anos seguintes, vírus relacionados aos paramyxovírus foram isolados de outras espécies de serpentes. Ahne et al. (1987) obtiveram o isolamento de um tipo de vírus semelhante a um myxovírus a partir de órgãos da serpente Elaphe oxycephala e Potgieter et al. (1987) descreveram uma doença respiratória fatal em Vipera xanthina xanthina associada com a infecção por um paramyxovírus relacionado ao vírus Parainfluenza-2. Ahne e Scheinert (1989) relataram o isolamento de partículas semelhantes ao parvovírus a partir de órgãos de uma serpente Elaphe guttata mostrando sinais de pneumonia. Jacobson et al. (1991) tentando encontrar uma vacina que protegesse as serpentes contra a doença causada pelo paramyxovírus, inativaram uma estirpe isolada de uma Dendroaspis polylepis e utilizaram-na para preparar vacinas com e sem adjuvantes. Um grupo de Crotalus atrox foi então vacinado e, embora diversas serpentes tenham desenvolvido títulos, a resposta entre os indivíduos foi considerada variável e transitória para ser considerada eficaz. Atualmente pesquisadores da Universidade da Flórida estão avaliando a aplicação de uma vacina atenuada (Jacobson, 2010). Em outra epizootia ocorrida no zoológico de Nova Orleans (Jacobson et al., 1992) realizaram-se provas sorológicas consecutivas em 26 serpentes do gênero Crotalus antes que fossem a óbito. Inicialmente altos títulos de anticorpos foram identificados em todas as serpentes porém, durante o período avaliado o valor dos títulos diminiu. Em muitos casos, os títulos declinaram em três a sete meses após a colheita das primeiras amostras de sangue. Não foi concluído se isto era uma indicação de imunidade por curto período e suscetibilidade à reinfecção com a doença ou se talvez o título de anticorpos não fosse o melhor indicativo de imunidade em serpentes após infecção pelo OPMV, pois o caso foi confirmado com isolamento viral. Durante os surtos causados por OPMV as serpentes das espécies C. durissus e C. basiliscus são particularmente suscetíveis e são as primeiras a morrerem enquanto outras espécies da família Viperidae são mais resistentes (Jacobson, 1993). Blahak (1995) efetuou a caracterização de estirpes de vírus isolados de serpentes que vieram a óbito em um zoológico da Alemanha, e Richter et al. (1996) a de estirpes isoladas nos Estados Unidos, ambos concluíram que estes vírus possuíam características de paramyxovírus. Quanto à relação com paramyxovírus aviários ou de mamíferos, o primeiro observou reações cruzadas em testes sorológicos com paramyxovírus aviário tipo 1 e 7, concluindo porém, através de eletroforese, que suas proteínas HN (hemaglutinina-neuraminidase), N (nucleoproteína) e M (matrix) apresentavam diferentes pesos moleculares. Até então, não haviam sido satisfeitos os postulados de Koch que implicariam definitivamente o OPMV como agente de doença em serpentes. Jacobson et al. (1997), após inoculação experimental intratraqueal em uma espécie de Crotalus com uma estirpe de OPMV,. 16.

(23) puderam acompanhar o desenvolvimento das lesões compatíveis através de exames histológicos e obtiveram também o reisolamento do agente a partir dos animais inoculados. Embora as infecções de OPMV possam ocorrer durante todo o ano, em vários casos, as epizootias têm comumente ocorrido entre os meses de janeiro e maio, no hemisfério norte. Replicações do vírus “in vitro” têm demonstrado que o OPMV é dependente de temperatura, sendo a média de temperatura para crescimento entre 23°C a 32°C e a temperatura ótima é 30°C. É possível que infecções latentes possam ser ativadas quando as serpentes são mantidas em temperaturas ambientais subótimas o que justificaria a ocorrência das várias infecções durante os períodos frios do ano e após hipernação (Lunger e Clark, 1979; Jacobson, 2010). Uma paramyxovirose pode ser similar à pneumonia causada pelo vírus Sendai em camundongos, na qual vários fatores estressantes como o transporte e flutuações da temperatura ambiental podem resultar na ativação da infecção latente. Qualquer serpente eliminando o OPMV poderia servir como o foco de uma epizootia (Jacobson, 2004). A via de infecção é principalmente pelo ar embora outras vias não possam ser excluídas. Serpentes Naja naja kaouthia que conviviam no mesmo recinto com animais infectados com OPMV tiveram aumento na atividade de excreção de urina, seguido de óbito e em todas as serpentes mortas isolou-se paramyxovírus (Jacobson, 2010). Em uma epizootia envolvendo Crotalus lepidus, um animal infectado foi introduzido em uma coleção com 8 animais saudáveis e após 3 dias sinais clínicos puderam ser observados em outros espécimes, tremores na cabeça e perda de equilíbrio (Figura 1) e após 14 dias da introdução do animal infectado, 7 cascavéis morreram (Jacobson, 2010).. Figura 1 – Cascavel com sinais clínicos de distúrbio no sistema nervoso central. (Fonte: http://www.vetmed.ufl.edu/college/departments/sacs/research/OphidianParamyxovirus.html).. 17.

(24) Não há sinais patognomônicos na paramixovirose dos ofídios, a doença apresenta grande variação de sinais clínicos, os quais tornam o diagnóstico difícil (Cranfield e Bronson, 1996). Frequentemente serpentes que aparentam bom estado de saúde e comportamento normal são encontradas mortas dentro de seus recintos pela manhã (Jacobson, 2010). Contudo, a infecção pode ser dividida em três categorias: aguda e superaguda, quando os animais exibem sinais respiratórios e/ou neurológicos por curto período antes de virem a óbito ou, frequentemente são apenas encontrados mortos; crônica, quando se observam sinais inespecíficos de doença ao longo de meses, emagrecimento e pneumonias por infecção bacteriana secundária; e a do portador, quando os animais são portadores do vírus disseminam o agente, mas não demonstram sinais de doença (Cranfield e Bronson, 1996). Os sinais clínicos são mais direcionados para o sistema respiratório, levam de 5 a 12 dias para aparecer e podem ser classificados em 4 estágios: durante o primeiro estágio ocorre a perda do tônus muscular, com as serpentes afetadas exibindo uma postura linear com a cabeça levemente elevada; durante o segundo estágio, no final de 2 dias, as serpentes mostram atividade anormal de rastejamento inquieto e mantêm as bocas parcialmente abertas. Suas línguas não são completamente estendidas para fora da boca e suas pupilas são extremamente dilatadas; o terceiro estágio ocorre durante várias horas um dia antes da morte. A boca é mantida completamente aberta e as serpentes expelem um material purulento da glote, que pode preencher as passagens nasais, cobrir a mucosa oral, e pode ser parcialmente engolido no terço superior do esôfago; o quarto estágio pode ser visto por vários minutos durante a hora que antecede a morte. Os animais estão excessivamente ativos e, imediatamente antes de morrer, manifestam comportamentos convulsivos. Algumas serpentes morrem expelindo sangue pela glote dentro da cavidade oral (Figura 2) (Jacobson, 2010).. Figura 2 – Crotalus unicolor com pneumonia hemorrágica. (Fonte: http://www.vetmed.ufl.edu/college/departments/sacs/research/OphidianParamyxovirus.html).. 18.

(25) Quanto ao diagnóstico "in vivo", o teste de inibição da hemaglutinação (HI) foi desenvolvido para determinar a presença de anticorpos específicos contra a OPMV em amostras de soro e plasma das serpentes expostas (Jacobson et al., 1981). Outra forma clássica para a confirmação de uma infecção viral é a realização do isolamento do agente através de inoculação em ovos livres de patógenos específicos (Specified Pathogen Free - SPF) e através do cultivo celular. Vários paramyxovírus têm sido isolados em diferentes tipos celulares, porém os tipos de ampla utilização são células cardíacas de serpentes do gênero Vipera e as células Vero, nas quais podem ser observados os efeitos citopáticos (ECP) com a formação de sincícios (Mayr et al., 2000). Kania et al. (2000) padronizaram um ELISA indireto para a quantificação de anticorpos contra o OPMV. Entretanto, por utilizarem conjugados anti-imunoglobulina de jibóia (Boa constrictor), a reação só apresentou boa reatividade para membros da família Boidae, que são mais resistentes à infecção pelo OPMV que os membros da família Viperidae (Jacobson et al. 1981). Técnicas de imunohistoquímica (Homer et al., 1995; Orós et al., 2001) e imunofluorescência (Jacobson, 2010) foram utilizadas para detectar a presença de partículas do OPMV em tecidos do pulmão de serpentes afetadas, enquanto que por contrastação negativa foi possível identificar pleomorfismo com variação de tamanho entre as partículas de OPMV até então isoladas (Figura 3) (Lunger e Clark, 1978; Clark et al., 1979; Ahne et al., 1999; Mayr et al., 2000; Franke et al., 2001).. A. B. C. A. A. A. D. E. A. A. Figura 3 – Fotomicrografia eletrônica de FDLV marcado por contrastação negativa exibindo pleomorfismo. (A) Nucleocapsídeo com 321 nm de diâmetro (Fonte: Lunger e Clark, 1978); (B) Nucleocapsídeo com 143 nm de diâmetro (Fonte: Clark et al., 1979); (C) Nucleocapsídeo com 150 nm (Fonte: Ahne et al., 1999); (D) Nucleocapsídeo com 400 nm de diâmetro (Fonte: Mayr et al., 2000); (E) Nucleocapsídeo com 300 nm de diâmetro (Fonte: Franke et al., 2001). 19.

(26) Após o isolamento de diferentes estirpes de OPMVs se verificou que estes vírus eram antigenicamente distintos de qualquer outro paramyxovírus, mas similares entre si e com o objetivo de obter informações moleculares para definir a posição taxonômica do OPMV foram desenhados primers para, através da técnica de PCR, obter sequências de fragmentos dos genes L (polimerase longa) e HN de 16 estirpes virais isoladas nos Estados Unidos, Alemanha e Suíça, as quais foram objetos de estudos filogenéticos (Ahne et al.; 1999; Kindermann et al., 2001). A partir de sequências de fragmentos dos genes L e F (fusão), obtidos por Franke et al. (2001), também realizaram-se análises filogenéticas em 18 estirpes de paramyxovírus isoladas de serpentes, propondo um novo gênero dentro da família Paramyxoviridae para os paramyxovírus de répteis. No Brasil, suspeita-se que em 1997 tenha ocorrido um surto de paramyxovirose entre serpentes da subespécie Crotalus durissus terrificus enquanto eram mantidas em cativeiro nas instalações do Centro de Estudos de Venenos e Animais Peçonhentos (CEVAP), pois diariamente passaram a ocorrer diversos óbitos de serpentes que exibiam aspecto saudável e, após necrópsia constatava-se a presença de material caseoso no pulmão e tubo digestivo. Alguns animais apresentaram um quadro de letargia e a formação de um “papo” (Figura 4A), também passaram a respirar de boca aberta com sangue na cavidade oral, provavelmente devido à hemorragia pulmonar (Figura 4B). Após estes óbitos, em 1998, cerca de 400 serpentes morreram (Comunicação pessoal feita por Silva, R.J. em 1998. Departamento de Parasitologia, Instituto de Biociências, Universidade Estadual Paulista (UNESP), Campus de Botucatu in Nogueira, 2004).. A. B. A. A. Figura 4 – Crotalus durissus terrificus com pneumonia supostamente causada por paramyxovírus. (A) Formação de “papo” e (B) Respiração de boca aberta. (Fonte: Silva, R.J., 2000 in Nogueira, 2004).. Casos comprovados foram relatados por Kolesnikovas et al. (2000, 2001) quando descreveram um surto ocorrido em Bothrops alternatus jovens mantidos no Laboratório de Herpetologia do Instituto Butantan, o qual foi investigado através de exames histopatológicos, imunohistoquímicos e microbiológicos, bem como por Nogueira et al. (2001, 2002) quando, por nested PCR, confirmaram o isolamento do OPMV Brasil em cultura de células Vero a partir da 20.

(27) inoculação de amostras provenientes das secreções pulmonares de C. d. terrificus que mostravam sinais de pneumonia e eram mantidas em cativeiro no CEVAP. A partícula isolada revelou ser envelopada, esférica e com diâmetro aproximado de 120 nm (Figura 5) (Nogueira, 2004).. Figura 5 – Fotomicrografia eletrônica do OPMV Brasil isolado em células Vero. (Fonte: Nogueira, 2004).. Em 2001, durante o sequenciamento de uma biblioteca de cDNA obtida da glândula de peçonha de Bothrops jararaca mantida em cativeiro no Instituto Butantan, foi caracterizada uma sequência parcial com 929 nucleotídeos que codificava 279 aminoácidos da proteína F dos paramyxovírus e por apresentar a cauda poliA pode-se atestar que o RNAm da proteína F estava sendo transcrito nas glândulas salivares da serpente (Junqueira de Azevedo et al., 2001). Em 2004 foi realizado o sequenciamento do genoma completo do Fer de Lance vírus, o qual consiste de RNA linear fita simples negativa, não segmentado com 15.378 nucleotídeos e apresenta sete genes na ordem 3’-N-U-P/V-M-F-HN-L-5’ indicando proteínas de nucleocapsídeo (N), unique (U), fosfoproteína (P), proteína rica em cisteína (V), matrix (M), fusão (F), hemaglutininaneuraminidase (HN), e a polimerase longa (L), respectivamente (Figura 6). Devido à presença de um gene adicional entre os genes N e P/V este genoma apresenta características únicas que não foram vistas em nenhum outro paramyxovírus. Portanto, foi sugerido para a família Paramyxoviridae, subfamília Paramyxovirinae, o gênero Ferlavirus tendo o FDVL como espécie tipo (Kurath et al., 2004).. Figura 6 – Organização do genoma do FDLV. (Fonte: Kurath, 2004). 21.

(28) Novamente sequências parciais dos genes HN, L e U de paramyxovírus isolados de serpentes, lagartos e tartarugas foram objetos de estudos filogenéticos e a nova classificação taxonômica proposta por Kurath et al., (2004) foi apoiada com base nos resultados obtidos por Marschang et al. (2009). Embora a caracterização molecular das estirpes isoladas de paramyxovírus tenha revelado, até então, a presença de apenas um tipo viral circulante nas coleções afetadas (Ahne et al., 1999; Franke et al., 2001), diferentes sequências para o gene L foram obtidas de amostras coletadas em diferentes órgãos do mesmo animal, bem como de diferentes animais na mesma coleção, portanto, mais de uma espécie de paramyxovírus pode infectar serpentes durante um surto (Papp et al., 2010). A infecção provocada pelo paramyxovírus tem início quando suas proteínas HN adsorvem receptores virais com receptores da célula hospedeira, sendo capazes de clivar o ácido siálico deste receptor prevenindo que outras partículas virais se liguem a células já infectadas. Em seguida, proteínas F fusionam o envelope viral com a membrana celular. No citoplasma, o nucleocapsídeo, RNA e proteínas N (RNA:N), é transcrito a partir da extremidade 3’ por um complexo polimerase viral, formado pelas proteínas L que se ligam ao RNA:N na presença das proteínas P. Para bloquear a ação do interferon do hospedeiro, a proteína V é expressa a partir de uma fase de leitura alternativa do gene P. Proteínas virais se acumulam e o complexo polimerase pára a produção de RNAm e transcreve o genoma por inteiro, RNA antigenômico. Este serve de molde para a produção de novos RNA genômicos, assim novos nucleocapsídeos com seus complexos de polimerase viral são formados. São inseridas na membrana plasmática as proteínas HN e F, cuja forma ativa é dada pela clivagem do precursor inativo F0 por proteases celulares, originando fragmentos F1 e F2. Possivelmente, as proteínas M, HN e F se associam resultando na protusão, brotamento e egresso viral. A função da proteína U não é conhecida, porém acredita-se que ela pode ser uma pequena proteína transmembrana (Kurath et al., 2004; Flores, 2007). Diferentes espécies de paramyxovírus causam infecção simultaneamente no mesmo animal (Papp et al., 2010), porém, recentemente, registrou-se duplas infecções envolvendo paramyxovírus e reovírus e, triplas infecções envolvendo paramyxovírus, reovírus e adenovírus nos mesmos animais. Sendo assim, paramyxovírus (envelopados) conseguem replicar normalmente enquanto diferentes tipos virais (não envelopados) infectam a mesma célula (Abbas et al., 2011).. 22.

(29) III. SEQUENCIAMENTO DE GENOMAS VIRAIS A. B Desde a década de 1980, com o advento das técnicas A de biologia molecular, os genomas. virais vêm sendo reconstruídos a partir de amostras clínicas e seus genomas têm sido sequenciados e depositados em bancos de dados (Ambrose, 2006). Através do sequenciamento dos genomas virais é possível identificar novos espécimes, verificar a presença de mutações e avaliar a evolução viral, além de investigar os padrões da transmissão entre os vírus e seus hospedeiros, realizar estudos taxonômicos e filogenéticos, traçar perfis epidemiológicos e fornecer informações que podem ser utilizadas para a produção de vacinas (Holmes, 2007). Através do sequenciamento dos diferentes genes do paramyxovírus isolados de répteis, atualmente sabe-se que seu genoma apresenta características únicas que motivaram a criação do gênero Ferlavirus (Kurath et al., 2004), e que paramyxovírus isolados de serpentes e lagartos estão no mesmo clado enquanto que os isolados de tartarugas formam um clado diferente (Marschang et al., 2009). Além disso, novas espécies de paramyxovírus têm sido descobertas através da comparação entre sequências obtidas para o gene L, frequentemente conservado, responsável pela função da polimerase viral (Papp et al., 2010). A estratégia desenvolvida para realizar o sequenciamento dos viromas tem sido a construção de primers a partir de sequências conservadas do próprio genoma viral. A técnica de SISPA (Reyes et al., 1991) destacou-se entre as muitas técnicas desenvolvidas para a identificação de vírus desconhecidos e presentes em baixas concentrações na amostra estudada. O princípio aplicado consiste na ligação direcional de um primer assimétrico em ambas as extremidades não coesivas (“blunt-ended”) do fragmento de DNA para posterior clonagem, sequenciamento e análise (Ambrose, 2006). Outras modificações foram feitas e com a técnica DNAse-SISPA as amostras passaram a ser filtradas em 0,22 µm e tratadas com DNAses (Allander et al., 2001; 2005). Algumas variações da SISPA foram desenvolvidas, entre elas a PCR randômica (Froussard, 1992), que utiliza como primeiro primer uma sequência universal na extremidade 5’, contendo sítios para enzimas de restrição, possibilitando assim sua clonagem, enquanto que a extremidade 3’ possui 6 ou 7 bases degeneradas. Na segunda etapa da PCR, um primer complementar a região universal do primeiro primer é utilizado, removendo assim a necessidade de adaptadores, isso permitiu a amplificação de genomas, independente de serem vírus DNA ou RNA bem como o sequenciamento completo de genomas virais que variam de 3000 a 15000 bases. (Ambrose, 2006; Djikeng et al., 2008). Pesquisas atuais com genomas virais têm dado destaque ao sequenciamento dos genes conservados e as relações filogenéticas entre as várias espécies isoladas (Abbas et al., 2011).. 23.

(30) REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS. 1. ABBAS, M.D.; MARSCHANG R.E.; SCHMIDT V., KASPER, A., PAPP, T. A unique novel paramyxovirus, four atadenovirus types and a reavirus identified in a concurrent of a corn snake (Pantherophis guttatus) collection in Germany. Veterinary Microbiology, doi:10.1016/j.vetmic.2011.01.010. 2. ACKERMAN, L. The Biology, Husbandry and Health Care of Reptiles. Neptune CityUSA: Editora T.F.H. Publications, Inc. III. 2003. 3. AHNE, W.; BATTS, W. N.; KURATH, G.; WINTON, J. R. Comparative sequence analyses of sixteen reptilian paramyxoviruses. Virus Research, v. 63, p.65-74, 1999. 4. AHNE, W.; NEUBERT, W. J.; THOMSEN, I. Reptilian viruses: isolation of myxovirus-like particles from the snake Elaphe oxycephala. Journal of Veterinary Medicine B, v. 34, p.60712, 1987. 5. AHNE, W.; SCHEINERT, P. Reptilian viruses: isolation of parvovirus-like particles from corn snake Elapha guttata (Colubridae). Journal of Veterinary Medicine B, v. 36, p.409-12, 1989. 6. ALLANDER, T.; TAMMI, M.T.; ERIKSSON, M.; BJERKNER, A.; TIVELJUNGLINDELL, A.; ANDERSSON, B. Cloning of a human parvovirus by molecular screening of respiratory tract samples. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, v. 102, n. 36, p. 12891-12896, 2005. 7. ALLANDER, T.; EMERSON, S.U.; ENGLE, R.E.; PURCELL, R.H.; BUKH, J. A virus discovery method incorporating DNase treatment and its application to the identification of two bovine parvovirus species. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, v. 98, n. 20, p. 11609-11614, 2001. 8. AMBROSE, H.E; CLEWLEY, J.P. Virus Discovery by Sequence-Independent Genome Amplification. Reviews in Medical Virology, v. 16, p.365-383, 2006. 9. BARNARD, S. M. Reptile Keeper’s Handbook. Malabar, FL, Kreiger. 1996. 10. BLAHAK, S. Isolation and characterization of Paramyxovirus from snakes and their relationship to avian Paramyxoviruses. Journal of Veterinary Medical B, v. 43, p.216-224, 1995. 11. BURKE, T.J. Infection Diseases of Reptiles apud NOGUEIRA, M. F. Estudo de Paramyxovirus Mycoplasma e de bacilos gram-negativos no trato respiratrio de serpentes Crotalus durissus terrificus. 2004. Tese de Doutorado apresentada a Faculdade de Medicina Veterinria e Zootecnia, Botucatu, Universidade Estadual Paulista. 12. CLARK, H. F.; LUNGER, P. D. Viruses. in COOPER, J. E.; JACKSON, O. F. (Ed.) Diseases of Reptilia. v.1, London: Academic Press, p.135-64, 1981. 13. CLARK, H.; LIEF, F.; LUNGER, P.; WATER, D.; LELOUP, P.; FOELSCH, D.; WYLER, R. Fer-de-lance virus (FDLV): a probable paramyxovirus isolated from a reptile. Journal of General Virology, v. 44, p. 405-418, 1979. 24.

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(35) Standardization of Random Priming Method for Genome Sequencing of the Ophidian Paramyxovirus.. BMC Genomics. 29.

(36) Manuscripts 1 Methodology article Standardization of Random Priming Method for Genome Sequencing of the Ophidian Paramyxovirus Araújo Linhares *1, Taniwaki 1, Alves Rosa1, Lima-Filho 2, Araújo Júnior1 Address: 1 Departamento de Microbiologia e Imunologia, Instituto de Biociências, UNESP, Botucatu; SP, Brazil. 2 Departamento de Bioquímica and Laboratório de Imunopatologia Keizo Asami (LIKA), Universidade Federal de Pernambuco, Cidade Universitária, Recife, Pernambuco, Brazil. Email: Lidiany de Souza Araújo Linhares* – lidianyaraujo@yahoo.com.br; Sueli Akemi Taniwaki – staniwaki@bol.com.br; Cristiane de Santis Alves Rosa– cris_desantis@yahoo.com.br; José Luiz de Lima Filho – zeluiz@lika.ufpe.br; João Pessoa Araújo Júnior – jpessoa@ibb.unesp.br; * Corresponding authors. Abstract. Background: Whole viral genome sequencing methods have been widely used for molecular epidemiology and virus discovery. Sequence Independent Single Primer Amplification and variants of this technique, such as random PCR (rPCR), showed to be rapid and effective for this purpose. In this study, rPCR method was standardized in order to sequence the ophidian Paramyxovirus genome. Results: Six fragments from 413 to 553 bp, obtained from thirty-two random clones, showed 82 to 89% of identity with Fer-de-Lance virus (AY141760). About one-fifth of complete ophidian Paramyxovirus genome was obtained and these sequences represent fragments from nucleocapside protein, phosphoprotein, fusion and polymerase protein genes. Conclusions: These results demonstrate the effectiveness of rPCR method for genome sequencing of paramyxovirus.. 30.