UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
INSTITUTO DE BIOLOGIA
Jalile Garcia Schiavuzzo
EFEITO DO TRATAMENTO COM CÉLULAS TRONCO
MESENQUIMAIS NA HIPERALGESIA EM MODELO
EXPERIMENTAL DE NEUROPATIA DIABÉTICA
CAMPINAS (2019)
EFEITO DO TRATAMENTO COM CÉLULAS TRONCO
MESENQUIMAIS NA HIPERALGESIA EM MODELO
EXPERIMENTAL DE NEUROPATIA DIABÉTICA
Tese apresentada ao Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do Título de Doutora em Biologia Funcional e Molecular – área de Fisiologia. ].
Orientador: Professor Doutor Carlos Amilcar Parada
CAMPINAS (2019) ESTE ARQUIVO DIGITAL CORRESPONDE À
VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELA ALUNA JALILE GARCIA SCHIAVUZZO E ORIENTADA PELO PROFESSOR DOUTOR CARLOS ALMILCAR PARADA.
COMISSÃO EXAMINADORA
Prof.(a) Dr.Carlos Almilcar Parada
Prof.(a). Dr. Cesar Renato Sartori Prof.(a) Dra. Gisele Castro
Prof.(a) Dr(a) Luiz Alberto Ferreira Ramos Prof.(a) Dr(a). Rafael Vercelino
Os membros da Comissão Examinadora acima assinaram a Ata de Defesa, que se encontra no processo de vida acadêmica do aluno.
A Ata da defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no SIGA/Sistema de Fluxo de Dissertação/Tese e na Secretaria do Programa de Biologia Funcional e Molecular do Instituto de Biologia Da UNICAMP.
primeiros e mais importantes anos de sua vida. Espero que um dia você compreenda todos os momentos de ausência e se orgulhe da minha trajetória.
Agradeço o apoio e afeto incondicional do meu marido Ricardo, pelo companheirismo e dedicação à nossa família e por jamais medir
esforços para nossa evolução.
E ao meus pais, Roberto e Estér, que sempre nutriram o sonho de ver seus filhos doutores.
Aqui está!
Aos meus irmãos Jacqueline e Roberto Júnior, que pelo amor incondicional e respeito a cada passo que dei na vida.
Agradeço a Deus por todas as oportunidades que me dá em vida. Me permitir viver dias tão intensos, sentimentos tão profundos, perseguir o meu propósito e por me manter sã e serena nessa jornada. Agradeço à Universidade Estadual de Campinas, em especial ao Instituto de Biologia pela infraestrutura e apoio acadêmico prestados, assim como a todos os funcionários do programa de Biologia Funcional e Molecular especialmente ao Professor Dr. Leonardo Silveira, a todos os Professores do Curso de Pós Graduação da BFM agradeço pelo esforço em fazer e manter a qualidade desse programa como referência no país.
Agradeço à Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo e a CAPES pelo financiamento deste projeto (Projeto FAPESP 2014/21962-8 e também ao projeto BEPE 2017/26625-8
O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001
Agradeço meu orientador Carlos Amilcar Parada, por todos esforço e dedicação ao projeto.
Agradeço toda minha família, especialmente aos meus sogros Ricardo e Lygia, pelo apoio e extensa ajuda nos cuidados com minha filha, essenciais nos meus muitos momentos de ausência.
Aos meus amigos, colegas e técnicos de laboratório, pela extensa ajuda na realização de experimentos e análise dos dados, pela inspiração, por dividirem comigo esses anos tão difíceis, mas de imenso crescimento profissional e pessoal.
Agradecimentos Especiais
Ao professor Alexandre Oliveira, pelo apoio e suporte no cultivo de células tronco mesenquimais, peças chaves no desenvolvimento desse projeto. I professori Francesco Ferrini e Adalberto Merighi
(UNITO / ITALIA) per la loro accoglienza e generosità, per la loro pazienza e presenza costante in questo breve ma intenso periodo di lavoro.
Outros agradecimentos
Esse trabalho é um trabalho feito por muitas mãos. Algumas que aparecem claramente nos resultados dos dados, são as mãos de quem estiveram comigo na bancada fazendo experimentos ou usando suas mentes para sugestões intelectuais, e outras tantas mãos que estavam me amparando, me segurando, me empurrando sempre a frente, me ajudando também de forma oculta, porém, importantíssima para a conclusão desse projeto.
Ao Dr. Alexandre Schiavuzzo Gualazzi, ao diretor da ANPG Flavio Franco, a Dra. Alessandra Chohfi e ao
Dr. Mateo Panero Meus eternos agradecimentos!
Epígrafe
Para onde vão os trens, meu pai? Para Mahal, Tamí, para Camirí, espaços no mapa, e depois o pai ria: também para lugar algum meu filho, tu podes ir e ainda que se mova o trem, tu não te moves de ti.
RESUMO
A neuropatia diabética periférica manifesta-se em aproximadamente 50% dos pacientes diabéticos e está entre as maiores causas de amputação de membros periféricos. Entre os casos diagnosticados de dor neuropática, 30% deles são classificados como neuropatia diabética. Apesar dos aspectos eletrofisiológicos e morfológicos da dor neuropática diabética serem conhecidos, pouco se sabe sobre seu desenvolvimento e progressão, inviabilizando terapias eficazes. Mais recentemente, estudos têm demonstrado uma estreita correlação entre o desenvolvimento da neuropatia diabética e o aumento de citocinas no Gânglio da Raiz Dorsal (GRD). De um modo geral, tem-se observado um aumento de citocinas pró-inflamatórias, embora não haja evidências de um processo inflamatório no GRD evidenciado, por exemplo, por aumento de células polimorfonucleares. Nesse sentido, nosso grupo tem demonstrado que a hiperalgesia inflamatória do tecido periférico induz aumento de citocinas pró-inflamatórias do GRD, indicando que as citocinas no sistema nervoso podem ter uma função neuromodulatória e não necessariamente inflamatória como no tecido periférico. Embora seu aumento no processo inflamatório possa estar relacionado com a sensibilização da via nociceptiva,.
De fato, nosso trabalho observou por meio da técnica de Elisa um aumento de citocinas inflamatórias (TNF-α, IL-1β, IL-6 e CINC-1) no GRD de ratos com neuropatia diabética, e que o tratamento intratecal de CTMs reduziu o aumento procovado pela STZ. Alguns trabalhos utilizando células tronco mesenquimais como tratamento para a neuropatia diabética apontam aumento na expressão de citocinas anti-inflamatórias induzidos pela administração de CTM. Resultado semelhante foi observado em nosso trabalho ao quantificar a citocina anti-inflamatória (IL-10). Além disso, verificamos que as Células tronco reduzem a dor neuropática diabética, por um processo que independe da regeneração nervosa periférica. Observamos também, por meio da técnica de ensaio intracelular de cálcio, que o tratamento com CTM pode reduzir a dor neuropática diabética através de mecanismos homeostáticos os quais ativam os receptores P2X4 expressos nas próprias CTMs. Nossos resultados demostram ainda, que esses receptores presentes nas CTMs estão envolvidos na liberação de BDNF.
inflamatória e em mecanismos homeostáticos que envolvem receptores P2X4 expressos nas CTMs.
Palavras-chave: células tronco mesenquimais, neuropatia diabética, hiperalgesia, citocinas, receptores P2X4 e neurotrofinas BDNF.
Peripheral diabetic neuropathy manifests in approximately 50% of diabetic patients and is among the leading causes of peripheral limb amputation. Among the diagnosed cases of neuropathic pain, 30% of them are classified as diabetic neuropathy. Although the electrophysiological and morphological aspects of diabetic neuropathic pain are known, yet the mechanisms responsible for pain and progression in this disease are poorly understood , making effective therapies unfeasible. More recently, studies have shown a close correlation between the development of diabetic neuropathy and increased cytokines in the dorsal root ganglion (DRG). In general, an increase in proinflammatory cytokines has been observed, although there is no evidence of an inflammatory process in DRG evidenced, for example, by an increase in polymorphonuclear cells. This way, our group has shown that inflammatory hyperalgesia of peripheral tissue induces an increase in DRG proinflammatory cytokines, indicating that cytokines in the nervous system may have a neuromodulatory and not necessarily inflammatory function as in peripheral tissue. Although its increase in inflammatory process may be related to sensitization of the nociceptive pathway.
In fact, our work observed by the Elisa technique an increase in inflammatory cytokines (TNF-α, IL-1β, IL-6 and CINC-1) in the GRD of rats with diabetic neuropathy, and that intrathecal treatment of MSCs reduced the increase approved by STZ. Some studies using mesenchymal stem cells as a treatment for diabetic neuropathy indicate increased expression of anti-inflammatory cytokines induced by the administration of MSC. Similar result was observed in our work when quantifying anti-inflammatory cytokine (IL-10). In addition, the stem cells reduce diabetic neuropathic pain by a process that is independent of peripheral nerve regeneration. We also observed through the intracellular calcium assay technique that MSC treatment can reduce diabetic neuropathic pain through homeostatic mechanisms through the activation of P2X4 expressed in MSCs. We also observed that these receptors present in MSCs are involved in BDNF release.
These data indicate that intrathecal MSC treatment is a viable therapy for the control of diabetic neuropathic pain, acting on inflammatory modulation and homeostatic mechanisms involving P2X4 receptors expressed in MSCs.
Figura 1- Equipamento de Randal & Sellito
Figura 2- Equipamento VonFrey Eletrônico
Figura 3 - Hiperglicemia induzida por Streptozotocina
Figura 4 - Placa de cultura de CTM isoladas
Figura 5 – Imunofluorescência do DRG
Figura 6- Testes comportamentais iniciais de hiperalgesia
Figura 7 - Testes comportamentais finais de hiperalgesia
Figura 8 -Quantificação das citocinas inflamatórias
Figura 9 – Quantificação da enzima mieloperoxidase
Figura 10- Marcação Pgp 9.5 para análise da densidade das fibras nervosas
Figura 11- Ensaio intracelular de cálcio inicial
Figura 12- Ensaio intracelular de cálcio final
Figura 13- Resultados de Western Blot
Figura 14 – Imunofluorescência das células tronco mesenquimais Figura 15- Quantificação da liberação de BDNF
CTM-Células tronco mesenquimais. ATP – Adenosina trifosfato
DRG- Dorsal Root Ganglio – Gânglio da Raiz Dorsal BSA – Albumina sérica bovina
BzATP – 20,30-O-(4-benzoylbenzoyl)-ATP – Agonista de receptores P2X Ca2+ – Cálcio
DMEM – Dulbecco's Modified Eagle's Medium – meio de cultura DNA –Ácido desoxirribonucleico
GRD – Gânglio da raiz dorsal
EDTA –Ácido etilenodiamino tetra-acético ELISA – Ensaio de imunoenzimática
HEPES – Ácido 2-[4-(2-hidróxietil)-1-piperazinil]-etanosulfónico – Tampão IL-1β – Interleucina 1 beta
IL-6- Interleucina 1
CINC-1 – Cintokine-induced netrophil chenoattractannt IL-8–Interleucina-8
IL-10 Interleucina 10
P2X4– Receptores purinérgicos inotrópicos do tipo 4 PBS – Tampão Fosfato
TNF-α –Fator de necrose tumoral alfa CSG – Células Satélites Gliais
GRD – Gânglio da Raiz Dorsal PG- Prostaglandinas
AMPc- Adenosina Monosfosfato Cíclico PKA- Proteina Quinase A
NO- Oxido Nitrico
NGF- Fator de crescimento neural
BDNF- Fator neurotrófico derivado do cérebro GFAP- proteina glial acida
ADP-Difosfato de adenosina
NANC- sistema nervoso não-adrenérgico não-colinérgico
ADP-Adenosina Difosfato AS - Antisense
BK - Bradicinina
IL-1β – Interleucina-1 beta
B1- Receptores de Bradicinina tipo 1 B2 - Receptores de Bradicinina tipo 2. TNF-α – Fator de necrose tumoral alfa
Δ[Ca2+]i – Variação da concentração de cálcio intracelular ADP –Adenosina difosfato
ANOVA –Análise de Variância
Ap5A – P1,P5-Di(adenosine-5′) pentaphosphate BSA – Albumina sérica bovina
COX – Cicloxigenases DMSO –Dimetilsulfóxido
DNA –Ácido desoxirribonucleico
DNAc –Ácido desoxirribonucleico complementar dUTP –Deoxiuridina trifosfato
EDTA –Ácido etilenodiamino tetra-acético EP – Receptor de prostaglandina
GABA –Ácido gama-aminobutírico GFAP – Proteína glial fibrilar ácida GLU – Glutamato
GS – Glutamina sintetase
HEPES – Ácido 2-[4-(2-hidróxietil)-1-piperazinil]-etanosulfónico – Tampão i.p. – Intraperitoneal
i.pl. – Intraplantar
IL-1RI – Receptor de interleucina 1 do tipo 1
IL-1Ra – Antagonista de receptor para interleucina-1 beta IL-8 –Interleucina-8
LPS – Lipopolissacarídeo PGE – Prostaglandina E ODN – Oligonucleotídeo P2 – Receptores purinérgicos
P2X7 – Receptores purinérgicos inotrópicos do tipo 7 P2Y – Receptores purinérgicos acoplados a proteína G PBS – Tampão Fosfato
PCR – Ensaio de reação em cadeia da polimerase PFA –Paraformaldeído
RNA – Ácido ribonucleico RNAse – Ribonuclease SGC – Células satélites gliais SNC –Sistema nervoso central
TRPV1 – Receptores de potencial transiente vanilóide do tipo 1 UTP –Uridina trifosfato
1.0 INTRODUÇÃO ... 19
1.1TEORIA DA DOR:CONTEXTO HISTÓRICO ... 19
1.2VIAS SOMATOSSENSORIAIS. ... 21
1.3FIBRAS PERIFÉRICAS ... 22
1.4O GÂNGLIO DA RAIZ DORSAL (GRD) ... 23
1.5CÉLULAS SATÉLITES GLIAIS (CSG)... 24
1.6P2X4 ... 26
1.7MEDIADORES INFLAMATÓRIOS DA DOR. ... 28
1.8 NEUROPATIA DIABÉTICA ... 30
1.8.2MODELO QUÍMICO DE INDUÇÃO DE DIABETES ... 35
1.9.0– CELULAS TRONO MESENQUIMAIS (CTM) ... 36
1.9.1FATOR NEUROTRÓFICO DERIVADO DO CÉREBRO (BDNF) ... 37
2.0 JUSTIFICATIVA ... 38 3.0 OBJETIVOS ... 39 ELISA ... 40 3.0 METODOLOGIA ... 40 DRG ... 40 MPO ... 40 IMUNOFLUORESCÊNCIA ... 40 IN VITRO ... 41 CULTURA DE CSGS ... 41 ENSAIO DE CALCIO ... 41 WESTERN BLOT ... 41 IMUNOFLUORESCÊNCIA ... 41 ELISA ... 41 3.1ANIMAIS: ... 41 3.2INDUÇÃO DO DIABETES ... 41
3.2.1 AVALIAÇÃO DE GLICEMIA E PESO DOS ANIMAIS ... 42
3.3CULTURA CELULAR PRIMÁRIA CTMS ... 42
3.3.1EXTRAÇÃO DAS CÉLULAS TRONCO DERIVADAS DA MEDULA ÓSSEA ... 42
3.3.2ANÁLISE FENOTÍPICA DAS CTMS POR CITOMETRIA DE FLUXO ... 43
3.7-ENSAIO IMUNO-ENZIMÁTICO (ELISA) ... 47
3.8QUANTIFICAÇÃO DE MIELOPEROXIDASE ... 48
3.9.IMUNOFLUORESCENCIA DO GRD PARA O TRACEJAMENTO DE CTM MARCADAS COM GFP. ... 49
3.10IMUNOFLUORESCENCIA DA PELE DA PATA TRASEIRA ... 49
3.11CO-CULTURA CELULAR ... 50
3.12 AVALIAÇÃO DA DINÂMICA DE CÁLCIO INTRACELULAR ... 51
3.13WESTERN BLOT ... 52
4.0 ANÁLISES ESTATÍSTICAS ... 53
5.0 RESULTADOS ... 53
5.1HIPERGLICEMIA INDUZIDA POR STREPTOZOTOCINA ... 53
CARACTERIZAÇÃODASCTM ... 55
5.3PRESENÇA DE CÉLULAS TRONCO MESENQUIMAIS MARCADAS COM GFP NO GÂNGLIO DA RAIZ DORSAL (GRD) APÓS A ADMINISTRAÇÃO INTRATECAL ... 57
5.4RATOS HIPERGLICÊMICOS EXIBIRAM AUMENTO DA INTENSIDADE DE HIPERALGESIA ... 58
5.5 CELULAS TRONCO REDUZEM A HIPERALGESIA MECANICA INDUZIDA POR STZ ... 59
5.6 EFEITO DO TRATAMENTO COM CTM INTRATECAL NA LIBERAÇÃO DAS CITOCINAS IL-Β,TNF-Α,IL-6CINC-1 E IL-10 NO GÂNGLIO DA RAIZ DORSAL DE RATOS HIPERALGÉSICOS COM NEUROPATIA DIABÉTICA EXPERIMENTAL. ... 61
5.7.MIGRAÇÃO DE NEUTRÓFILOS EM ANIMAIS DIABÉTICOS TRATADOS COM CTMS ... 65
5.8MARCAÇÃOPGP9.5PARAANÁLISEDADENSIDADEDASFIBRASNERVOSAS ... 66
5.9EFEITO DA HIPERGLICEMIA NA DINÂMICA DE CÁLCIO INTRACELULAR DAS CSGS ATIVADAS POR BZATP E ANTAGONIZADA POR PSB. ... 68
5.10O EFEITO DA CO-CULTURA COM CÉLULAS TRONCO NAS CSGS TRATADAS COM AGONISTA E ANTAGONISTA DO RECEPTOR P2X4. ... 69
5.11ACO-CULTURADECSGSECTMSTÊMAUMENTODAEXPRESSÃODORECEPTORP2X4... 71
5.12CÉLULASTRONCOEXPRESSAMP2X4 ... 72
5.13CÉLULAS TRONCO MESENQUIMAIS CTMS LIBERAM BDNF QUANDO ATIVADAS POR BZATP ... 73
6- DISCUSSÃO ... 74
7.0 CONCLUSÃO ... 80
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 81
ANEXO I- RELATÓRIO DE ESTÁGIO NO EXTERIOR (BEPE) ... 103
ANEXO 2- DECLARAÇÃO DA COMISSÃO DE ÉTICA DO USO DE ANIMAIS ... 128
1.0 INTRODUÇÃO
1.1 TEORIA DA DOR: CONTEXTO HISTÓRICO
A Associação Internacional de Estudos da Dor (IASP) depois de séculos de estudos e descobertas define a dor como uma experiência sensorial e emocional desagradável que se relaciona com uma lesão real ou potencial dos tecidos. Umas das primeiras descrições do sistema somatossensorial foi feita por Renè Descartes no livro “Tratado do Homem” em 1664. O autor relatou a dor como uma percepção cerebral e distinguiu a transdução sensorial dolorosa da percepção da dor. Sua teoria também descreveu os nervos como túbulos vazios que transmitiam informações sensoriais e motoras. Esse entendimento da função neural foi baseado no postulado de Galeno, que estabelecia que a base da percepção da dor dependeria de três condições: 1) um órgão precisa estar apto a receber estímulos; 2) deve existir uma conexão entre o órgão e o cérebro; 3) a existência de um centro de integração que converta o estímulo em percepção consciente (REY et al., 1995).
Descartes considerava os nervos como “conexões” entre os órgãos e o cérebro e postulou que, em resposta ao estímulo sensorial periférico, ocorre a ativação de uma fibra que corre dentro dos nervos tocando um sino no cérebro, permitindo que o espírito animal flua através dos nervos e ative uma resposta motora (MOAYEDI, M., DAVIS, 201AD).
O atual conceito sobre as vias de dor foi desenvolvido por Chales Bell e descrito em “ A Ideia de uma Nova Anatomia do Cérebro" (1868). Ele provou que o cérebro é caracterizado por estruturas heterogêneas e sugeriu que os nervos eram grupos de neurônios especializados em estímulos sensoriais, funções motoras e de detecção. Franois Magendie, baseado na teoria de Bell, separou o sistema sensorial de nervos motores e construiu sua teoria de que nervo tem diferentes vias entrando e saindo da medula espinhal, ficando então conhecida a Lei Bell-Megandie das diferenciações de nervos espinhais (STAHNISCH FW, 2009). Outras informações provieram da
transdução sensorial específica na última parte do século XIX pelas descobertas de receptores cutâneos específicos sensíveis ao toque como os corpúsculos de Pacini (CAUNA, N., ROSS, 1958). Merkel´s (1875) e Ruffini (1893) apud (MOAYEDI, M., DAVIS, 201AD) deram suporte a teoria de que não havia uma única opinião sobre a natureza da dor.
Outra teoria bastante discutida foi a da Wilhelm Erb chamada de “Teoria da Intensidade” que definia que a intensidade do estímulo era responsável pela ocorrência da dor tanto quanto a origem e modalidade do estímulo (DALLENBACH, 1939). Esta teoria deu origem futuramente a descoberta de receptores específicos de dor chamados nociceptores (SHERRINGTON, 1952). Na tentativa de rever e reconciliar diferentes ideias somatossensoriais, Sinclair sugeriu o modelo de teoria patológica com a ideia de que qualquer sensação única induz um padrão específico de disparo neuronal, cujo perfil espacial e temporal codificava o tipo e a intensidade da estimulação ao invés de fibras específicas (SINCLAIR, 1958). No entanto, esta teoria foi incapaz de explicar a necessidade de diferentes receptores sensoriais cutâneos associados a fibras periféricas de tamanhos diferentes (HEINBECKER, P., ET AL., 1933).
Em 1965 Ronald Mezack e Chales Patrick Wall publicaram um artigo intitulado "A teoria do Portão da Dor” cuja proposta revolucionou as teorias existentes. Neste modelo juntou-se as teorias da dor ao padrão da especificidade, preenchendo a lacuna entre elas. Aceitaram a subdivisão efetiva dos nociceptores e do receptor sensível ao toque e sugeriram que o sinal induzido em fibras aferentes primárias atingia três regiões da medula espinhal: o corno dorsal, a substancia gelatinosa e um grupo de células chamadas de células “transmissoras”. Eles levantaram a hipótese de que a substância gelatinosa era a porta da transmissão do estímulo sensorial e que o mecanismo era induzido por fibras de tamanho pequeno e inibido por fibras de tamanho grande e quando os axônios eram estimulados ultrapassavam o portão, a via era ativada e a dor percebida. Além disso, as vias descendentes do tracto supraspinal poderiam modular este portão (Mezack e Wll, 1965; Moyaedi e Davis, 2013). Embora esta teoria tenha mostrado algumas imprecisões anatômicas e simplificações exageradas, sua estrutura geral avançou significativamente nosso conhecimento sobre dor.
A definição atual de dor pela IASP é baseada na teoria publicada em 1968 por Melzack e Casey que consideravam a dor como multidimensional e complexa. A definição de multidimensionalidade foi justificada pela possibilidade de discriminar características diferentes da dor, como intensidade, localização, qualidade e duração (sensitivo-discriminativa) para induzir respostas emocionais como desagrado e luta-ou-fuga (afeto-motivacional), e para estimular funções superiores (MELZACK; CASEY, 1968; MOAYEDI, M., DAVIS, 201AD).
O debate entre as teorias da especificidade e do padrão não está esgotado. Há alguns anos, Basbaum publicou um artigo sobre as diferenças entre a transdução periférica de estímulos dolorosos, processamento central e percepção da dor. Essa perspectiva contemporânea da especificidade versus padrão relaciona-se mais com a condução de mensagens nociceptivas e menos com a percepção sensorial da dor, que é claramente influenciada por fatores emocionais e cognitivos (BASBAUM et al., 2010).
Após detalhadas reflexões sobre todas as teorias somando-se aos achados científicos produzidos nos últimos anos, o nosso grupo de pesquisa prefere utilizar a definição de que Dor é uma percepção desagradável associada à estimulação da via nociceptiva. A percepção está relacionada com o componente afetivo emocional e ativação da via nociceptiva com o componente sensorial discriminativo (Laboratório De Estudos da Dor).
1.2 VIAS SOMATOSSENSORIAIS.
O sistema somatossensorial é parte de um sistema especializado e responsável pela percepção de sensações como o toque, pressão, dor, temperatura, posição, movimento e vibração, que são percebidos por pele, músculos, articulações fáscias e outros tecidos. Este sistema é organizado em vias neuronais. As informações periféricas sensoriais são convertidas em impulsos nervosos por neurônios sensoriais primários (M, 2003) até a medula espinal, onde fazem sinapse com neurônios secundários, e estes conduzem as informações até os núcleos talâmicos no cérebro através de tractos neuronais específicos (espinotalâmico, espinoreticular, espinomesencefálico, espinocervicotalâmico, espinoparabraquial, espinoparabraquio (trigêmio) hipotalâmico, via pós-sináptica da coluna dorsal
(BESSON, 1999; MILLAN, 1999) e eventualmente, continua no córtex sensorial , no lobo parietal, através de neurônios de terceira ordem (BRODAL, 1969; M, 2003; VALBO, [s.d.]).
1.3 FIBRAS PERIFÉRICAS
Os Neurônios periféricos sensoriais primários são neurônios pseudounipolares que tem ramificações centrais ligados ao soma pelo axônio único através do qual transmitem estímulos (VOL et al., 1987). Seu corpo celular está localizado no Gânglio da Raiz Dorsal (GRD) ou no Gânglio Trigeminal. A sensibilidade somática do sistema de retransmissão é uma das mais heterogêneas do sistema sensorial, permitindo uma ampla gama de estímulos como toque, pressão, vibração, posição, temperatura, alongamento e nocicepção. Em termos simplistas, o sistema somatossensorial periférico pode ser organizado em fibras sensoriais especializadas na codificação de estímulos inócuos de baixo limiar (vias não-nociceptivas) ou estímulos nocivos de alta resistência. A nocicepção é definida como um processo neural de codificação de estímulos nocivos (IASP, 1994).
No que se refere às fibras aferentes primárias nociceptivas, elas são de pequeno diâmetro e estão ligadas a terminações livres, ou seja, não estão associadas a receptores sensoriais especializados. Possuem alto limiar de ativação e são diretamente relacionadas às vias nociceptivas (AGUGGIA et al.,2003). Por isso, genericamente são denominadas nociceptores, podendo ser encontradas em dois tipos: fibras A-delta (Aδ), de médio diâmetro, finamente mielinizadas, com velocidade de condução média, entre 12 e 30 m/s (correspondentes a 20% das fibras de dor e responsáveis pela dor rápida, aguda e lancinante que sentimos após estimulação nociva), e fibras C não mielinizadas, de pequeno diâmetro, com velocidade de condução menor (0,5 a 2 m/s) (correspondentes a 80% das fibras condutoras da informação dolorosa e responsáveis pela dor com característica lenta e difusa) (MILAN, 1999; JULIUS e BAUSMAN, 2001). Levando-se em conta o critério funcional, as fibras Aδ respondem à estimulação mecânica, porém podem ser sensibilizadas pelo calor, enquanto as fibras do tipo C respondem tanto a estímulos térmicos quanto mecânicos e químicos, sendo classificadas, por isso, como nociceptores polimodais.
As fibras aferentes são sensibilizadas pela ação de algumas substâncias químicas presentes no tecido e conhecidas como algiogênicas (WEBSTER, 1977), tais como: histamina, acetilcolina, eucotrieno, bradicinina, serotonina l, substância P, fator de ativação plaquetário, radicais ácidos, íons potássio, prostaglandinas, tromboxana, interleucinas, fator de necrose tumoral (TNFα), fator de crescimento nervoso (NGF) e monofosfato cíclico de adenosina (AMPc) (RAJA; MEYER; CAMPBELL, 1988).
Resumidamente, pode-se dizer que a dor é uma espécie de alarme fisiológico que alerta o organismo sobre uma ameaça à sua integridade. Assim, a nocicepção é a ativação das vias sensoriais responsáveis por detectar a presença de estímulos nocivos ou potencialmente nocivos. Envolve fenômenos iônicos, ou seja, necessita da indução de respostas elétricas nestas fibras sensoriais responsáveis pela detecção de estímulos de alta intensidade, com entrada de íons sódio (Na+) por canais
específicos, que conduziram a informação ao longo das vias nociceptivas, desencadeando a reação (ou a percepção) (KLAUMANN; WOUK; SILLAS, 2008).
Em determinadas situações a dor é acompanhada por fenômenos paralelos, como a hiperalgesia, que é um fenômeno resultante da sensibilização das fibras neuronais sensoriais responsáveis pela detecção dos estímulos nociceptivos, essa sensibilização é caracterizada eletrofisiologicamente pela redução do limiar de excitabilidade neuronal (RIEDEL; NEECK, 2001) ocorre por ação de mediadores produzidos pelo processo inflamatório (HUANG; MASSA; KARLE, 2006; VERRI et al., 2006). Estes mediadores atuarão em seus respectivos receptores, induzindo como resultado final, alterações metabólicas que facilitarão a produção de potenciais de ação pelos neurônios nociceptores. Em outras palavras quando há inflamação, as fibras são ativadas mais facilmente ao receber um estímulo (dor aumentada em resposta a um estímulo que já era doloroso).
1.4 O GÂNGLIO DA RAIZ DORSAL (GRD)
Os Gânglios da Raiz dorsal (GRD) são localizados lateralmente à medula espinhal, (31 pares em humanos e 34 em roedores) (HOFSTETTER, J., SUCKOW, MA., AND HICKMAN, 2006; POWIS; GILLINGWATER, 2016; SENGUL; PUCHALSKI; WATSON, 2012) e são em sua maior parte constituídos de corpos celulares de
neurônios aferentes primários, os quais são individualmente envolvidos por células satélites gliais cujo papel estrutural é formar uma capsula conectiva firme de tecido colágeno margeada internamente por lâminas de células perineurais (WAGGENER; BEGGS, 1967). No interior de um GRD há neurônios sensoriais, heterogênios com diferentes características que incluem a espessura das fibras, o tamanho dos corpos celulares e quantidade de mielina que envolvem as fibras (JANKOWSKI; KOERBER, 2010).
Embora alguns estudos tenham descrito histologicamente a cápsula que envolve o GRD (SEITZ; LÖHLER; SCHWENDEMANN, 1981) a literatura descreve que substâncias administradas no espaço subaracnóideo via intratecal penetram essa bainha e agem diretamente nos corpos celulares neuronais, ou seja, a administração de drogas diretamente no espaço subaracnóideo pode ser usadas para induzir ou inibir a expressão de moléculas no GRD (LAI et al., 2002; PARADA et al., 2003). Autores já observaram a presença de receptores para mediadores inflamatórios na soma celular, no interior dos GRD (SHINDER; DEVOR, 1994). Demonstrando um alto número de diversas moléculas quimioreceptoras na membrana dos corpos celulares presentes no GRD, levantaram a hipótese de que ele teria uma função na transmissão do impulso neuronal e não apenas papel de manutenção metabólica dos neurônios. A estrutura dos neurônios do GRD são células de tamanho grandes, cilíndricas, variando entre 20-150μm de diâmetro, podem ser classificados como “pseudounipolares”, ou seja, a partir de seu corpo celular, há um prolongamento que se divide adiante em dois, formando um “T” ou “Y”. Um deles se dirige para os tecidos periféricos e o outro ramo entra na medula espinal, fazendo conexões com os neurônios chamados de segunda ordem.
Uma lesão no tecido periférico produz estímulos nas terminações do neurônio aferente primário produzindo impulsos que serão conduzidos através do axônio desde a periferia até o sistema nervoso central, através de mecanismos conhecidos como condução do impulso nervoso, na maioria destes neurônios o impulso conduzido ao longo do axônio invade o soma celular, mostrando o caráter relevante do GRD na propagação do estímulo aferente (DEVOR; OBERMAYER, 1984).
As células satélites gliais (CSG) são células especializadas que envolvem todo o corpo dos neurônios aferentes primários (SHINDER; DEVOR, 1994) no gânglio da raiz dorsal. O envoltório glial forma uma unidade discreta que isola eletricamente (com algumas exceções) os corpos neuronais de seus neurônios vizinhos (PANNESE, 2018). A organização das SCG pode ser distinguida em padrão de monocamada e aplanado ou padrão de sobreposição multicamadas e esse arranjo pode ser mudado com uma discreta unidade, passando de 4-6 µm para 40-50 µm.(LEDDA; DE PALO; PANNESE, 2004). As CSG exibem uma estrutura laminar, embalando o longo processo de ramificação, produzindo expansões lamelares e microvilosidades principalmente na parte interna do neurônio. Esta organização aumenta significativamente a superfície dos CSG aumentando consequentemente a relação entre superfície e volume. Estas microvilosidades também invaginam os neurônios, aumentando a superfície de troca química (HANANI, 2005). Diferentes estudos mostram que existe uma relação direta entre o número de CSG e o envelope dos neurônios formando um grande envoltório, pois é preciso mais CSG para sustentar corpos neuronais de grande calibre, isso corrobora a hipótese de que as CSG desempenham um papel no suporte estrutural e metabólico dos neurônios sensoriais (LEDDA, 2004; LEDDA; DE PALO; PANNESE, 2004). As CSG não formam uma barreira que impede a passagem de íons, micro e macromoléculas. Também macrófagos passam por ela, de forma mais lenta e com baixa difusão. (PANNESE, 1981, 2018).
As CSG estão em importante comunicação umas com as outras através de “ Gap Junctions” Conhecidas também por nexos ou junção em hiato, esses canais permitem o movimento de moléculas e íons, diretamente do citosol de uma célula para outra realizando a troca de íons como K+ e Ca2+, segundos mensageiros (cAMP,
cGMP e inositol 1,4,5-trifosfato (IP3) e pequenos metabólitos (glicose), permitindo o acoplamento elétrico e bioquímico entre as células (KANNO; LOEWENSTEIN, 1964).
Estudos realizados em humanos demonstram que os receptores P2X tem sua expressão aumentada em CSG de pacientes portadores de dor neuropática (CHEN et al., 2008). Outros estudos realizados pelo nosso grupo de trabalho demonstraram que em CSG de ratos com neuropatia diabética, a expressão de P2X4 está aumentada (TEIXEIRA et al., 2019).
Esses achados evidenciam que os principais papéis das CSG sejam realizar suporte mecânico e metabólico para os neurônios. (DUBLIN; HANANI, 2007).
1.6 P2X4
Trabalhos demonstram que a adenosina trifosfato (ATP) está presente em concentrações milimolares em todas as células do corpo (MCCLESKEY; GOLD, 1999) pois é a principal fonte de energia das células e que fibras nervosas sensoriais liberavam ATP (HOLTON, 1959). Esses achados fizeram com que em 1972 Burnstock e associados propusessem o termo receptores purinérgicos (BURNSTOCK, 1972). Ficou evidenciado o papel extracelular do ATP, somente conhecido pela sua função intracelular, até aquele momento. Atualmente, há muitas evidências da ação do ATP extracelular atuando de maneira bastante diversa, agindo como molécula sinalizadora em processos fisiológicos e patológicos (KHAKH; ALAN NORTH, 2006). No meio extracelular o ATP exerce suas funções por meio da ativação de receptores conhecidos como purinérgicos. Em 1998, Burnstock propôs a distinção de dois tipos de receptores purinérgicos, nomeados de P1 e P2, os quais medeiam as funções fisiológicas da adenosina e do ATP, respectivamente (ABBRACCHIO; BURNSTOCK, 1998). Os receptores purinérgicos são proteínas de superfície celular que possuem uma grande afinidade com purinas e a partir daí uma série de alterações intracelulares que alteram o comportamento celular acontecem. As classes conhecidas de receptores purinérgicos em mamíferos são os da família P1, que tem preferência pela Adenosina e os P2 tem preferência pelo ATP ou ADP.
Os receptores purinérgicos são ativados pelo trifosfato (ATP) e seu conceito como neurotransmissor, sendo liberado por terminais sinápticos através da exocitose vesicular, está bem estabelecido (BURNSTOCK, 2006). O ATP é considerado o principal neurotransmissor liberado por nervos não adrenérgicos e não colinérgicos (NANC), que inervam diversas vísceras e leitos vasculares. Por outro lado, o ATP também pode ser liberado por diversos outros tipos celulares além dos neurônios. Uma forma de liberação de ATP ocorre através do extravasamento do ATP intracelular decorrente da lise da membrana celular. Esta liberação ocorre devido a traumas físicos, químicos ou biológicos que levam à morte celular resultando em um grande aumento nos níveis de ATP no meio extracelular.
Sob situações de inflamação, o ATP pode deixar o meio intracelular e contribuir com o desenvolvimento da hiperalgesia inflamatória via ativação dos receptores P2X.
Este mecanismo também acontece com o aumento da glicemia sanguínea presente nos diabéticos, aumentando o ATP disponível no meio extracelular, sensibilizando assim receptores purinérgicos como o P2X4. (ANDÓ et al., 2010). Trabalhos demonstram que P2X4 são super-expressos em micróglia do corno da raiz dorsal na medula, após lesão nervosa periférica, e que a alodinia tátil induzida nesse modelo, foi revertida pelo bloqueio farmacológico de P2X4 na medula espinhal. Esses trabalhos demonstraram que a hipersensibilidade à dor induzida por lesão nervosa periférica depende da sinalização purinérgica em curso através de P2X4 nas microglias. A diminuição da dor neuropática em camundongos nocautes para P2X4 demonstrou a sua ativa participação no processo da dor neuropática diabética (TSUDA et al., 2009). Este fato foi apoiado pelos achados em estudos utilizando minociclina, um antibiótico derivado da tetraciclina que tem um efeito inibitório na ativação da microglia. Outros estudos demonstraram consistentemente que a minociclina atenua tanto a ativação microglia quanto a alodinia mecânica em modelos de dor neuropática causada por lesão nervosa periférica quanto no diabetes. (MORGADO et al., 2011; PABREJA et al., 2011; RAGHAVENDRA; TANGA; DELEO, 2003). Como já acima citado, estudos do nosso grupo de pesquisa demostraram uma maior expressão de P2X4 no GRD de ratos diabéticos quando comparados com animais controles (TEIXEIRA et al., 2019), adicionalmente há estudos que demonstram que o P2X4 é uma molécula-chave na dor neuropática, através da via P2X4-BDNF-KCC2 prevenindo a hiperalgesia sem afetar a analgesia provocada pela morfina e que a inativação dos receptores P2X4 expressos na micróglia de neurônios da medula dependem da liberação de BDNF. (FERRINI et al., 2013).
A hipótese do papel essencial do receptor P2X4 na dor neuropática ganhou maior peso após estudos que demostraram que o tratamento espinhal com ODN-antisense contra P2X4 atenuou a alodinía tátil após a lesão do nervo (TSUDA; INOUE; SALTER, 2005) e que em animais knockout para o receptor P2X4 houve a ausência de hiperalgesia mecânica induzida pela injúria periférica do nervo e uma diminuição da liberação de BDNF pela micróglia (GEVER et al., 2006).
Com a demonstração da participação do papel fundamental do receptor P2X4 em modelos de dor neuropática, nos interessou testar se o tratamento com células tronco intratecal, estaria reduzindo a dor neuropática diabética, através da regulação
da atividade desses receptores pela atividade parácrina das CTMs (Células tronco mesenquimais).
1.7 MEDIADORES INFLAMATÓRIOS DA DOR.
A inflamação é definida como um processo bioquímico e celular que acontece no tecido vascularizado, envolvendo o plasma, as células circulantes, os vasos e os constituintes celulares e extracelulares (ABBAS, ABUL K.; LICHTMAN, ANDREW H.; PILLAI, 2015). Em resumo, a função da inflamação é reparar o tecido lesado ou combater o patógeno invasor que gera uma resposta inespecífica utilizando elementos do sistema imune inato. Precocemente é estimulada por células residentes, como os macrófagos, células dendriticas e mastócitos, provocando manifestações dos sinais clássicos da inflamação, que são calor, rubor, tumor, dor e a perda de função (APPLETON; TOMLINSON; WILLOUGHBY, 1996). As principais substâncias liberadas no sítio da lesão são produzidas pelo macrófago ao reconhecer os mediadores químicos dos patógenos ou substâncias lesivas, e então a cascata de eventos é produzida em resposta ao trauma que podem ser: mecânico, por hipóxia, alteração imunológicas ou genéticas, invasão de agentes químicos ou micro-organismos, exposição à temperaturas externas ou radiação (SHERWOOD; TOLIVER-KINSKY, 2004). As outras principais células importantes no início da inflamação são os mastócitos, que contém grânulos no seu interior, como a histamina, que podem ser liberadas no local e têm um importante papel no processo inflamatório. Para que a inflamação aconteça é preciso que haja 4 grandes mudanças vasculares: a vasodilatação, o aumento da permeabilidade do vaso, a liberação de fatores de coagulação e ativação endotelial. Esses eventos são responsáveis por gerar 4 dos 5 eventos dos clássicos sinais da inflamação: calor, rubor, tumor e dor, sucessivamente. (ABBAS, ABUL K.; LICHTMAN, ANDREW H.; PILLAI, 2015).
A ativação endotelial faz com que o vaso passe a expressar as moléculas de adesão, que atraem ainda mais células para o local das inflamação, como os monócitos circulantes que ao chegarem ao local da lesão se transformam em macrófagos, e principalmente os neutrófilos que serão os principais responsáveis pelo combate aos microrganismos ou reparação dos tecidos e assim, como também já houve o aumento da permeabilidade vascular, as células atravessam a parede do
vaso para enfim chegar ao sítio da lesão e iniciar seu trabalho. Os neutrófilos passam a liberar mediadores inflamatórios, como a Bradicinina (BK), Fator Neutrofilico Neural alfa (TNF-α), Interleucina 1- beta (IL-1β), Interleucina 6- (IL-6) e Interleucina 8 (IL-8) que estimulam a síntese das prostaglandinas e liberação das aminas simpatomiméticas, as quais sensibilizam diretamente os nociceptores aferentes primários. As prostaglandilas (PGs) são formadas pela ação da enzima ciclooxigenase (COX) (FERREIRA; VANE, 1967). Elas possuem duas isoformas chamadas COX1- que geralmente são expressas nas células e são responsáveis pela produção de PGs, participando de muitos processos fisiológicos, fazendo a proteção da parede do estômago pela redução da secreção gástrica pelo aumento da produção de muco (O´Neill, 1993) e há também a isoforma COX-2 que é expressa especialmente no encéfalo. As PGs também são responsáveis por sensibilizar receptores periféricos e induzir a hiperalgesia (Ferreira et al., 1972), que acontece por meio de vias paralelas de ativação dos eicosanoides que podem depender do aumento de aminas simpatomiméticas, após um estímulo danoso. Cunha et. al (1991) demonstraram através de mecanismos farmacológicos que o tratamento com guanetidina (induzindo a depleção de aminas endógenas periféricas), utilizando antagonistas β-adrenérgicos ou com antagonistas de receptores dopaminérgicos é capaz de inibir a hipernocicepção induzida por IL-8. O mesmo ocorreu com relação a CINC-1 (do inglês citokine-induced netrophil chemoattractant-) (LORENZETTI et al., [s.d.]). Outros mediadores que também são liberados durante a inflamação contribuem para indução da hiperalgesia. Estudos demonstram que as citocinas IL-1, IL-6, IL-8 e TNF-α induzem a sensibilização dos nociceptores em vários modelos experimentais (JANKOWSKI; KOERBER, 2010). Outros estudos mostram a participação destas citocinas na gênese da hiperalgesia mecânica quando um estímulo inflamatório é administrado por via intraplantar (VERRI et al., 2006). Em relação a Bradicinina (BK) uma cinina de origem plasmáticas, estudos demonstram sua participação em processos fisiológicos em que há lesão tissular e inflamação. (FERREIRA; LORENZETTI; POOLE, 1993) e após um estímulo inflamatório a BK antecede a produção de TNF-α, IL-1β, IL-6 e IL-8. Outros estudos demonstram que em doses elevadas de LPS (5µg/pata) induzem hiperalgesia que não é bloqueada pelo pré-tratamento com antagonistas de receptores de BK, sugerindo que a liberação de TNF-α é direta. Entretanto estudos posteriores demonstram a participação da BK na
hiperalgesia via ativação dos receptores da BK (B1 e B2) e posterior a liberação de TNF-α.
Por muito tempo o foco da atenção dos pesquisadores, ficou restrito em um pequeno número de moléculas como as prostaglandinas (PGs) e a Bradicinina. Eles trouxeram grande contribuições para a compreensão da base da transmissão e manutenção da dor periférica desencadeada por mecanismos inflamatórios agudos ou persistentes. Entretanto, tornaram-se conhecidas novas variedades de mediadores inflamatórios, mecanismos de produção e liberação desses mediadores por células não neuronais, tais como células imunes e células gliais. Essas evidencias rapidamente se difundiram como uma importante base para estados de dor pois os mediadores inflamatórios podem atuar no receptor in loco. Autores concluem que mediadores e moduladores de dor periférica tais como as citocinas pró-inflamatórias, algumas quimiocinas e alguns fatores neurotróficos além de seus papéis tradicionalmente reconhecidos são capazes de alterar as propriedades de resposta de neurônios sinalizadores de dor. De forma geral as ações dos mediadores inflamatórios acontecem através de um grande número de fatores endógenos que produzem dor quando injetados no tecido periférico. Muitas dessas substâncias também podem sensibilizar os nociceptores reduzindo o seu limiar de ativação através de uma ou mais modalidades de estímulos e aumentam a responsividade dos nociceptores ao estímulo. Este processo de sensibilização é reconhecido como sendo de importância crítica em muitos estados de dor crônica. É precisamente essa excitabilidade aberrante do nociceptor que causa grande parte da anormalidade sensorial (STEPHEN B. MCMAHON, MARTIN KOLTZENBURG, IRENE TRACEY, 2013).
1.8 NEUROPATIA DIABÉTICA
A prevalência de diabetes em adultos de 20 a 79 anos foi estimada em 8,8% em 2015 e deverá subir para 10,4% em 2040 segundo as projeções da Associação Internacional de Diabetes (AID) (OGURTSOVA et al., 2017). Nos Estados Unidos, as dores neuropáticas geram gastos anuais de mais de 100 bilhões de dólares e a neuropatia diabética (NPD) é o causa mais comum delas (MCCARBERG; BILLINGTON, 2006). No Brasil, os gastos com diabetes no Sistema Público de Saúde superam os 67 milhões de reais por ano, segundo dados do Ministério da Saúde.
A neuropatia diabética é definida como a presença de sinais e sintomas de disfunção neural periférica, em portadores de diabetes, quando outras causas foram excluídas (American Diabetes Association). A neuropatia de origem diabética acomete cerca de 50% dos diabéticos (TAPP; SHAW, 2009). A alta prevalência de diabetes em adultos tem importante implicações sociais, financeiras e de desenvolvimento, dados que nos mostram a necessidade cada vez mais urgente de que os governos implementarem políticas para diminuir os fatores de risco para diabetes tipo 2 e diabetes gestacional, garantindo o acesso adequado ao tratamento para todas as pessoas que vivem com diabetes. Lidar com o impacto global do diabetes é uma tarefa monumental que inclui o desenvolvimento de pesquisas, políticas de atendimento especializado e também educando tanto indivíduos como governos sobre os passos que podem serem tomados para prevenção e manejo da doença e de suas sequelas.
Embora não existam dados muito concisos na literatura a respeito da prevalência da diabetes tipo 1, em estudo feito nos Estados Unidos, autores apontam para uma prevalência de 3,6% da população infantil (MENKE; ORCHARD, 2015), outros autores comparam a incidência na população adulta diabética e reportam que 5% de todos os casos são do tipo 1.(O’BRIEN; SAKOWSKI; FELDMAN, 2014). Ela é caracterizada como uma doença auto-imune, provocado por um dano na produção de insulina pelas células β pancreáticas, que causa insulinopenia e hiperglicemia sistêmica. É comum a ocorrência de microangiopatias, que consequentemente levam a degeneração nervosa periférica. Apesar desse tipo de diabetes ser de menor prevalência na população mundial, o desenvolvimento da dor neuropática diabética, aparentemente acontece por mecanismos muito parecidos com o da diabetes tipo 2, além disso, a doença tem início na infância, não apresenta cura ou qualquer tratamento alternativo à insulina, deixando o sistema nervoso periférico exposto aos efeitos deletérios da hiperglicemia por um período maior, quando comparado ao do diabetes tipo 2 (O’BRIEN; SAKOWSKI; FELDMAN, 2014).
Os altos níveis de glicose sanguínea, que caracterizam a diabetes também levam a complicações macrovasculares e microvasculares que resultam em desregulação e danos. As alterações macrovasculares levam a condições de micropatias e aterosclerose, enquanto as alterações microvasculares estão envolvidas com o desenvolvimento das nefropatias, retinopatias e também da neuropatia (SULLIVAN et al., 2007).
A gênesis da Dor Neuropática Diabética ainda não está esclarecida, porém tem sido demonstrado que neurônios periféricos apresentam características morfofuncionais específicas como a perda axonal afetando as porções distais das fibras neuronais. Porém não está claro se este sinal está relacionado com a hiperalgesia neuropática diabética. Embora alguns estudos sugiram que sim por detectarem esta perda na fase inicial da doença (DE PREUX CHARLES et al., 2010; YAGIHASHI, 1997). Entretanto, outros sugerem que tais alterações ocorram na fase tardia e irreversível da doença tornando mais inconsistente uma correlação deste sinal com a hiperalgesia (CHOWDHURY et al., 1999).
Independente das alterações morfofuncionais dos neurônios periféricos observadas na neuropatia diabética, a hipótese atualmente mais aceita sobre a gênese desta patologia está relacionada com o estrese oxidativo nos neurônios periféricos devido à alta concentração de glicose no meio extracelular e consequentemente dentro da célula neuronal já que esta não depende de insulina para a captação de glicose (FERNYHOUGH; CALCUTT, 2010; POP-BUSUI; SIMA; STEVENS, 2006; SUGIMOTO; MURAKAWA; SIMA, 2000; ZOCHODNE, 2007).
A Neuropatia Diabética inclui um número distinto de síndromes: neuropatia periférica, que é a mais comum causa de dor ou perda da sensibilidade nas extremidade dos membros, neuropatia autonômica que causa alterações em funções de órgãos como intestino, bexiga, pulmões e coração; neuropatia proximal, que afeta a parte superior de membros inferiores, como coxas, quadris e nádegas; neuropatia focal, cujo efeito pode ser um único grupo de nervos do corpo, causando dor ou fraqueza muscular (COSTIGAN; SCHOLZ; WOOLF, 2009).
Os Sintomas da polineuropatia diabética são considerados manifestações de disfunção do sistema somatossensorial, assim suas características clínicas variam de acordo com o tipo e o comprimento das fibras nervosas envolvidas. Complicações das fibras diâmetro pequeno chamadas de fibras Aδ e fibras desmielinizadas chamadas fibras Cs, que são responsáveis pela condução do estímulos dolorosos relacionados a temperatura, podem causar hiperalgesia e alodinia (aumento da sensibilidade, que causa dor após um estímulo tipicamente não doloroso). Disfunções das fibras não mielinizadas chamadas Aβ, que normalmente transmitem informações mecânicas podem resultar em ataxia e reduzir a propriocepção (O’BRIEN; SAKOWSKI; FELDMAN, 2014).
Cerca de 10-20% dos pacientes portadores de neuropatia diabética apresentam sintomas de dor, cuja maior prevalência é em pacientes com diabetes tipo 2 (35% contra 22%) em mulheres (38%) e com variabilidade entre grupos étnicos. (LAWSON; BACKONJA, 2013). Na verdade, a perda de função associadas com lesões periféricas podem resultar em dor espontânea devido a atividades ectópicas. (MAIER et al., 2010). A neuropatia diabética é caracterizada por uma progressiva degeneração nervosa, de área distal para proximal e o mecanismo foi considerado responsável por gerar uma dor neuropática e pelo seu desaparecimento depois de um certo tempo. Os mecanismos que geram a dor e a redução da dor na neuropatia diabética são ainda pouco conhecidos, mas artigos têm demonstrado relação entre a reinervação cutânea pelas pequenas fibras de terminações epidérmicas e a redução da PDN (BEISWENGER; CALCUTT; MIZISIN, 2008). Esses achados que focam na região distal de axônios sensoriais confirmou as teorias de que as alterações nervosas periféricas têm um papel importante no aumento da dor. Curiosamente, o modelo de ratos com diabetes tipo 1 e tipo 2 pode apresentar em uma fase estável uma hiperalgesia térmica precoce que pode progredir para a hipoalgesia (CALCUTT; FRESHWATER; MIZISIN, 2004).
Esses achados sugerem que a principal causador da hiperalgesia seja a hiperglicemia, enquanto a hipoalgesia depende tanto da hiperglicemia quanto da acentuada deficiência de insulina (LAWSON; BACKONJA, 2013). Por outro lado diferentes estudos em modelos de diabetes tipo 1 em ratos forneceu evidências contrastantes sobre o papel da hiperglicemia na alteração do comportamento da hiperalgesia, apoiando um papel principal da insulinopenia (ROMANOVSKY et al., 2010).
A hiperglicemia crônica é responsável por aberrações metabólicas que contribuem para o dano nervoso por mecanismos bioquímicos severos. Mesmo que nenhum deles tenha sido considerado crítico, eles fornecem um raciocínio lógico para o desenvolvimento de diferentes tipos de abordagens terapêuticas. Diferentes hipóteses foram formuladas para explicar o surgimento da dor neuropática (DESEURE; HANS, 2017).
✓ Disfunção espontânea de neurônios aferentes lesados (YOON; NA; CHUNG, 1996).
✓ Liberação de fatores pro-nociceptivos durante a degeneração walleriana de nervos lesados dia após dia (DESEURE; HANS, 2017).
✓ Sensibilização espinal: hiperatividade de neurônios primários aumenta a liberação de aminoácidos nos neurônios secundários, causando uma resposta aumentada aos estímulos nocivos (WOOLF, 1993).
Ao nível celular, a diabetes induz uma quebra severa e importante nas vias de metabolismo intracelular, como por exemplo a via de polióis, em condições normais a via de contribuição para o metabolismo da glicose é baixa, devido à baixa afinidade de glicose à enzima Aldose Redutase, que é uma enzima oxiredutora dependente de NADPH, catalizadora da redução de alguns compostos carbonílicos. Que neste exemplo da glicose, tal redução leva à formação do poliálcool sorbitol, que é oxidado em frutose (utilizando uma molécula de NADH, transformando-a em NAD+) pela via da enzima Sorbitol Desidrogenase. A enzima Hexoquinase fosforila a frutose, voltado-a voltado-a vivoltado-a dvoltado-a glicólise. Entretvoltado-anto, o excesso de glicose no svoltado-angue voltado-aumentvoltado-a voltado-a tvoltado-axvoltado-a de conversão enzimática da glicose para o sorbitol, para quantidades maiores que a necessidade de frutose pela via da glicólise, favorecendo a produção de sorbitol, concomitante, leva à redução da disponibilidade de NADPH. O resultado desse mecanismo de é indução do estresse oxidativo, secreção de citocinas, degradação da matriz extracelular e ativação de vias inflamatórias (NASCIMENTO; PUPE; CAVALCANTI, 2016).
Tem sido observado em modelos de hiperalgesia neuropática diabética um aumento considerável de citocinas "pro-inflamatórias" no Gânglio da Raiz Dorsal, tais como interleucina-1beta (IL-1β), interleucina-6 (IL-6) e Fator de Necrose Tumoral Alfa (TNF-α) correlacionado com o desenvolvimento de hiperalgesia (DAULHAC et al., 2006; TSUDA et al., 2008; WODARSKI et al., 2009b). Existem também evidências de que em processos inflamatórios do tecido periférico o desenvolvimento de hiperalgesia depende de um desequilíbrio em prol das citocinas pro- inflamatórias comparadas com as citocinas anti-inflamatórias, como a interleucina-10 (IL-10) (HONDA et al., 2006). A inibição da produção e da citocinas anti-inflamatórias e a ação de citocinas pró-inflamatórias, modulam eventos imunes e inflamatórios aumentando a hipersensibilidade (MOALEM; TRACEY, 2006) e a dor.
A inflamação tem um papel central na resposta a lesão do sistema nervoso provocado pela vasodilatação, aumentando a permeabilidade, a migração celular e a dor. Níveis aumentados de citocinas pro-inflamatórias no GRD foram observados em animais que apresentavam dor neuropática diabética, quando comparados a animais diabéticos sem dor neuropática (GALLOWAY; CHATTOPADHYAY, 2013).
Como desordens endócrinas, a Diabetes tipo 1 e Diabetes tipo 2 são delineadas como doenças bastante complexas, envolvendo vários sistemas do corpo. Com essa consideração os modelos animais precisam ser escolhidos cuidadosamente, dependendo de qual aspecto da doença é objetivado investigar. A maior parte dos experimentos são feitos em roedores, embora haja estudos feitos em outros animais. Geralmente o modelo diabético é feito quimicamente ou através da indução por dieta que tenta reproduzir em laboratório as mesmas condições do fenótipo diabético inequívoco (KING, 2012).
1.8.2 MODELO QUÍMICO DE INDUÇÃO DE DIABETES
A Streptozotocina (STZ) é um antibiótico de amplo espectro produzido a partir da bactéria Achromogenes de Streptomyces, A STZ possui uma semelhança estrutural com a glicose e é absorvida pelas células β pancreáticas através do transportador de glicose 2 (GLUT2), causando a morte das células por fragmentação do DNA e comprometimento do transporte de glicose (VENTURA-SOBREVILLA et al., 2011). A DiaComp recomenda a indução de hiperglicemia com uma única e alta dose de STZ (150mg/kg) ou em baixas e múltiplas doses (50mg/kg/5 dias consecutivos). Ambos os protocolos induzem a diabetes e desenvolvem o fenótipo diabético, mas existem algumas diferenças cruciais.
O modelo de alta dose de STZ induz neuropatia grave com duração de até 12 semanas após a injeção e é caracterizada por alterações variáveis nos perfis sensoriais, incluindo aumento da latência térmica, hiperalgesia mecânica, redução da velocidade de condução do nervo e redução da densidade de fibras nervosas periféricas, entretanto a alta toxicidade da droga, leva a altos índices de mortalidade.
O modelo de baixas doses de STZ é menos toxico, com uma morte gradual de células β, promovendo o aumento da glicemia e infiltração de linfócitos pancreáticos, que mimetizam a patologia humana, embora esse modelo apresente menor número
de animais que desenvolvem a neuropatia, ele é menos tóxico e com mais baixos índices de mortalidade animal.
Poucos estudos avaliam os efeitos sistêmicos causados pela Streptozotocina em outros tecidos como no Sistema Nervoso Central, mas sim os efeitos que a hiperglicemia induzida pela STZ promovem (NIKOLAKOPOULOU et al., 2018) especialmente pela depleção da insulina, que junto ao IGF-1 (fator de crescimento semelhante a insulina 1) têm múltiplas funções no cérebro apoiando a sobrevivência de neurônios e oligodendrócitos (FOTUHI et al., 2012) promovendo integridade sináptica e a plasticidade (CHIU; CHEN; CLINE, 2008), também auxiliando na memória e cognição (DE LA MONTE, 2013). Outros trabalhos apontam uma relação entre o desajuste da insulina com a doença de Alzheimer (RIVERA et al., 2005; TALBOT et al., 2012). No tecido periférico a STZ parece ser neurotóxica, produzindo hiperalgesia independentemente dos efeitos deletérios provocados pela hiperglicemia (CUNHA et al., 2009).
1.9.0 – CELULAS TRONO MESENQUIMAIS (CTM)
As CTMs (células tronco mesenquimais) são células-tronco adultas encontradas na medula óssea, não hematopoiéticas, progenitoras multipotentes que podem se diferenciar em células de mesma origem mesodérmica, tais como: osteoblastos, adipócitos, condrócitos (CAPLAN, 2007; PITTENGER et al., 1999). Elas são de fácil obtenção e grande capacidade de proliferação (LE BLANC et al., 2008). A primeira e principal fonte de obtenção das CTM é a medula óssea, no entanto também é possível obter as CTM de várias outras fontes tais como: sangue de cordão umbilical, fígado fetal, líquido amniótico, polpa dentária e tecido adiposo (CAMPAGNOLI et al., 2001; ERICES; CONGET; MINGUELL, 2000) .
Além da sua capacidade de auto regeneração e diferenciação em tecidos como neurônios de origem ectodérmica, miócitos, osteócitos, adipócitos, condrócitos e hepatócitos endodérmicos, as CTMs têm função parácrina e podem secretar ampla gama de substâncias, incluindo fatores de crescimento, citocinas e prostaglandinas. Fatores de crescimento são importantes sinalizadores de angiogênese, citoproteção e sobrevida. As CTMs também possuem várias propriedades imunomoduladoras, como a inibição da ativação e proliferação de células imunes, a produção de citocinas pró-inflamatórias por linfócitos e maturação de células dendríticas. O efeito
imunossupressor das CTM é dependente da dose e parece ser independente do complexo principal de histocompatibilidade. (ASANUMA; MELDRUM; MELDRUM, 2010a)
As CTMs afetam as células imunes através da liberação de fatores de crescimento, como HGF (fator de crescimento de hepatócito), TGF-β1 (Fator de Crescimento Transformante- beta1) prostaglandina-E2, HLA-G (Antígeno Leucocitário Humano) e IL-6 e IL-10, e da inibição da proliferação de células T, regulando positivamente a expressão de óxido nítrico e indoleamina 2,3-dioxigenase em resposta à estimulação com interferon-.1(LI et al., 2014; SATO et al., 2007). Os mecanismos de imunossupressão induzida por CTM não estão completamente claros, mas esta propriedade é inestimável no uso potencial de CTMs para medicina imunossupressora e regenerativa (ASANUMA; MELDRUM; MELDRUM, 2010a).
Trabalhos utilizando CTM isoladas e implantadas no músculo esquelético de ratos com dor neuropática diabética revelaram um aumento na expressão de fator de crescimento vascular (VEGF), fator de crescimento de fibroblastos (bFGF) e aumento da condução de atividade elétrica no nervo ciático dos animais (SHIBATA et al., 2008a). Outros estudos utilizando BM-MNCs (células mononucleares derivadas da medula) injetadas no tecido intramuscular próximo ao nervo ciático mostraram pela primeira vez a redução da resposta hiperalgésica e alodinia fria, aumento da vascularização do nervo e a expressão de canais de Sódio, quando comparada com o grupo controle, em ratos com neuropatia diabética, induzida pela Streptozotocina (NARUSE et al., 2011). Recentes estudos têm demonstrado a participação das CTMs na modulação de citocinas inflamatórias no GRD, medula e em nervos de ratos com neuropatia, na regeneração nervosa periférica (EVANGELISTA et al., 2018) entretanto, nenhum trabalho descreve o mecanismo pelo qual as CTMs fazem a modulação da dor neuropatia diabética.
1.9.1 FATOR NEUROTRÓFICO DERIVADO DO CÉREBRO (BDNF)
O BDNF (Fator Neurotrófico Derivado do cérebro) faz parte de uma família de proteínas solúveis endógenas que regulam a sobrevivência, a plasticidade, além do crescimento e a síntese de novos neurônios com funções especiais. Estas proteínas são conhecidas como neurotrofinas (DAVIES, 1994). O BDNF interage com
receptores de trkB.(KAPLAN; STEPHENS, 1994). Baixas doses de BDNF injetadas no nucleo rostromedial podem induzir hiperalgesia, enquanto altas doses podem causar analgesia (FRANK et al., 1997; GROTH; AANONSEN, 2002). A correlação entre BDNF e dor neuropática também é ainda não é clara devido à multiplicidade de abordagens experimentais, tornando a interpretação correta dos resultados obtidos difícil, pois há muitas alterações nos padrões da expressão do BDNF (MERIGHI et al., 2008).
Estes dados nos levaram a sugerir que o BDNF apresenta importante função na regulação da hiperalgesia e da analgesia periférica e portanto achamos relevante avaliar se as células tronco interfeririam na liberação de BDNF.
2.0 JUSTIFICATIVA
Existem muitas lacunas no conhecimento da patogênese da Dor neuropática diabética, no que envolve a atuação do aumento da glicemia e a da insulina na raiz nervosa ou ao longo do nervo periférico, pouco se sabe sobre como o tratamento com células tronco mesenquimais promovem a redução da dor neuropática diabética, sabe-se que há um aumento da expressão de os fatores de crescimento VEGF , bFGF e IGF -1 e redução NT3, que estão associados com uma melhora na vascularização, crescimento e regeneração nervosa (SHIBATA et al., 2008b).
Trabalhos recentes apontaram um aumento de citocinas, do fator de necrose tumoral (TNF-α), citocinas pró-inflamatórias (IL1-β, IL-6), e redução das citocinas anti-inflamatórias (IL-10) no GRD de animais com DPN (GALLOWAY; CHATTOPADHYAY, 2013). Sabe-se também que as células da glia e seus receptores P2X4 estão associados a dor neuropática diabética. Otratamento com células tronco mesenquimais tem se mostrado uma terapia promissora no tratamento diversas patologias, em especial na DPN, especialmente pelo seus efeitos parácrinos como a modulação dos níveis de citocinas pro e anti-inflamatórias aumentando os níveis de fatores de crescimento neurais, promovendo uma reparação no nervo, cuja lesão é causada, pelo menos em parte, pela condição neuro-inflamatória que a diabetes promove. Acreditamos ser relevante, portanto, investigar se a redução ou até o bloqueio da dor neuropática diabética através do tratamento com CTMs, que está correlacionada com redução da condição inflamatória, em ratos com neuropatia diabética experimental, estaria sendo modulada, pelo menos em parte, pela atuação
em receptores purinérgicos P2X4, expressos nas CSGs dos neuronônios do GRD e também pela liberação do BDNF pelas células tronco. Este estudo contribui para o melhor entendimento da patogênese da doença, seu resultado poderia beneficiar milhares de pessoas em todo o mundo, se for replicada em humanos. Além do interesse científico, o desenvolvimento desse projeto permitiu a continuação da linha de pesquisa, já desenvolvida por nosso grupo, envolvendo a Neuropatia Diabética e implementando uma nova linha com uso de células tronco em processos de hiperalgesia.
O tratamento intratecal oferece uma terapêutica eficiente, pois os modelos propostos anteriormente, via intramuscular ou intravenoso requerem uma quantidade demasiada de células tronco para o tratamento de um adulto. Enquanto o tratamento administrado via intratecal pode resultar em uma atuação direta, e assim, reduzir significativamente a quantidade de células e consequentemente o custo do tratamento.
3.0 OBJETIVOS
O objetivo geral do projeto foi compreender de que forma a terapia com células tronco mesenquimais derivadas da medula óssea, atuam na redução da dor neuropática diabética experimental, elucidando os possíveis mecanismos relacionados a alteração dos níveis de citocinas, tais como a (TNF)-α, IL1-ß, 6, IL-10 e modulam a atividade funcional receptores purinérgicos P2X4.
Objetivos específicos:
✓ Avaliar através de testes comportamentais o efeito do tratamento intratecal de células tronco mesenquimais na hiperalgesia no modelo de neuropática diabética.
✓ Avaliar os níveis de citocinas pró e anti-inflamatórias no GRD em animais diabéticos e controles, submetidos ao tratamento com CTMs.
✓ Avaliar a expressão de receptores P2X4 no GRD e em cultura primária do GRD e co-cultura com CTMs, através de qPCR e Western Blot.
✓ Avaliar a participação funcional dos P2X4 expressos nas CSGs, em modelo in vitro, utilizando Indicador Fluorescente de Cálcio – Fluo4AM.
✓ Avaliar a expressão de P2X4 nas CTMs por imunomarcação.
✓ Avaliar a participação dos P2X4 expressos nas CTMs na liberação do BDNF.
3.0 METODOLOGIA
DRG
3.1 ANIMAIS:
Foram utilizados aproximadamente 8 animais por grupo para cada ensaio experimental, contabilizando 156 animais Utilizamos ratos Lewis machos com idade de 6 a 10 semanas (200-250g) provenientes do Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica na Área da Ciência em Animais de Laboratório (CEMIB) foram utilizados de acordo com as diretrizes aprovadas pelo Comitê de Ética para Pesquisas com Animais da Universidade Estadual de Campinas (CEUA-3702-1, anexo 2). Foram tomados todos os cuidados e esforços a fim de utilizarmos o mínimo número de animais possível para a condução dos experimentos e evitar o sofrimento animal. Os animais foram acondicionados em gaiolas apropriadas para a acomodação de cinco animais cada, acomodadas em estantes ventiladas (Alesco, Brasil) com temperatura (22±2°C) e umidade (55%±5%) constantes e fotoperíodo determinado de 12 horas de luz/escuro. Os animais receberam água e ração ad libitum ao decorrer de todo experimento, seguindo as diretrizes da IASP (Internation Association for the study of Pain).
3.2 INDUÇÃO DO DIABETES
Realizamos o protocolo de indução de diabetes tipo 1 por múltiplas doses de Streptozotocina de acordo com o protocolo descrito no artigo de Mori e calaboradores,
In vitro cultura de CSGs
Ensaio de calcio Western Blot Imunofluorescência
