UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
Pamella Stivanelli
Avaliação das técnicas moleculares de DNA microarray e LAMP para a identificação das espécies Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii de
isolados crescidos em meio de cultura e de líquido cefalorraquidiano de pacientes com meningite
CAMPINAS 2019
Avaliação das técnicas moleculares de DNA microarray e LAMP para a identificação das espécies Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii de
isolados crescidos em meio de cultura e de líquido cefalorraquidiano de pacientes com meningite
Dissertação de mestrado apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestra em Ciências na área de concentração Clínica Médica.
ORIENTADORA: MARIA LUIZA MORETTI
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA ALUNA PAMELLA STIVANELLI, E ORIENTADA PELA PROF. DRA. MARIA LUIZA MORETTI
CAMPINAS
ORIENTADOR: MARIA LUIZA MORETTI
MEMBROS:
1. PROF. DRA. MARIA LUIZA MORETTI
2. PROF. DRA. CÉLIA REGINA GARLIPP
3. PROF. DRA. GILDA MARIA BARBARO DEL NEGRO
Programa de Pós-Graduação em Clínica Médica da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas.
A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros da banca examinadora encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.
concedida para que fosse possível chegar até aqui.
Aos meus pais Neusa e Reginaldo, meu irmão Matheus, por todo apoio, pelo amor e carinho.
À meu esposo Guilherme, por seu amor, carinho, dedicação, paciência e com certeza o seu apoio.
‘’ Tudo posso naquele que me fortalece’’ Filipenses 4:13 ‘’ Medo de nada, só amor’’ Padre Haroldo Rahm
erguer e me sustentar em todos meus problemas, por ter me sustentado durante esse trajeto de minha vida.
Aos meus pais Neusa e Reginaldo e meu irmão Matheus, por sempre estarem ao meu lado, me apoiando. Sempre me deram força, eles sabem os momentos difíceis que passei para chegar até onde cheguei, foram caminhadas duras, suadas, momentos de dor (eles sabem exatamente o que estou dizendo), muito obrigada do fundo do meu coração, aquela época sombria passou e com a força de Deus e de vocês me ajudaram a conquistar muitas coisas, o mestrado foi uma delas.
À minha orientadora Maria Luiza Moretti, que me acolheu em seu laboratório, obrigada pela confiança que depositou em mim, dês do início da iniciação cientifica e até agora no mestrado, obrigada pelos ensinamentos, paciência e por ter colaborado com a realização desse sonho. À profa. Angélica Zaninelli Schreiber e a Luzia Lyra, por toda a colaboração e disponibilidade do Laboratório de Investigação em Fungos da FCM- UNICAMP.
Ao prof. Plínio Trabasso, pelos ensinamentos, amizade, conselhos e também pela disponibilidade em auxiliar em alguns ocorridos no laboratório.
À profa. Marcia Melhem do Instituto Adolfo Lutz, que nos cederam as cepas de Cryptococcus gattii para que pudéssemos testar em nossos ensaios.
Às funcionárias Cibele Tararam, Larissa Levy e Érivan Ribeiro e ex funcionária Ariane B. Lopes do Laboratório de Epidemiologia Molecular e Doenças Infecciosas (LEMDI), pelos auxílios e ensinamentos teóricos e práticos, ombro amigo, amizade, paciência, risadas, companhia, cafés e gordices.
Aos alunos que compartilharam o mesmo ambiente de trabalho, Láis Sturaro, Láis Pontes, Franqueline, Caio, Deborah Mota.
À FAPESP, pelo auxílio financeiro e suporte, o qual foi fundamental para que esse trabalho fosse desenvolvido.
À JICA pela oportunidade de conhecer e participar dos conhecimentos dos professores Yuzuru Mikami, Tohru Gonoi, Teppei Arai, Tetsuhiro Matsuzawa e Akira Watanabe.
Aos meus amigos e familiares, que é muito difícil citar todos, mas por aqueles que sempre estiveram ao meu lado torcendo pelo meu melhor.
Ao meu esposo Guilherme, que sem dúvidas é um presente de Deus em minha vida, meu anjo aqui na terra, obrigada por absolutamente tudo, seu apoio, seu ombro, suas palavras, seu amor, carinho, foram fundamentais para que tudo o que citei nos agradecimentos de meus pais, me mantivessem de pé, por mais que por diversas vezes as lágrimas eram insistentes, sua voz e seu carinho eram ainda mais fortes.
gênero Cryptococcus que acomete principalmente, pacientes com HIV, imunodeprimidos e transplantados de órgãos. Espécies gattii e neoformans são responsáveis por causarem meningite em humanos. Objetivos. O objetivo desse trabalho foi avaliar o desempenho das técnicas moleculares de DNA microarray e Loop Mediated Isothermal amplification (LAMP) na identificação de Cryptococcus no líquido cefalorraquidiano de pacientes com meningite criptpcócica diferenciando as espécies gattii e neoformans. Metodologia. Estudo prospectivo desenvolvido no período de agosto de 2016 a outubro de 2018. Foram estudados amostras de líquido cefalorraquidiano positivas para Cryptococcus, positivos para bactérias e negativos para qualquer microrganismo, onde foram obtidas na enfermaria de moléstias infecciosas e do laboratório de microbiologia do Hospital de Clínicas da Unicamp. Trinta cepas de C. gattii foram cedidas pelo Instituto Adolfo Lutz para testar nas metodologias estudadas. O DNA extraído diretamente do líquor e de seu isolado em cultura, foi submetido a PCR utilizando a região ITS e o gene CAP59 e posteriormente ao DNA microarray, LAMP e sequenciamento. Resultados. Foram extraídos 133 LCR, sendo 11 positivos para Cryptococcus, 15 positivas para bactérias, 107 negativos e trinta cepas de C.gattii. Foram identificados 8 amostras como C. neoformans e 2 como C. gattii e as cepas foram identificadas como C. gattii. Para a plataforma de ITS do microarray, de 11 amostras de LCR que foram extraídos o DNA, 10 amplificaram por PCR. Cinco amostras de LCR foram identificados, e as outras 5 não foram possíveis obterem resultados. Para os isolados testados nessa plataforma, houveram três amostras com reações inespecíficas e 7 foram identificadas corretamente. Para a plataforma de CAP59, houve amplificação por PCR em todas as amostras de LCR. Não houve identificação em três amostras e oito foram corretamente identificadas. Já para os isolados de LCR foi possível identificar corretamente todas as amostras. Foram realizados testes com diferentes iniciadores na metodologia de LAMP (SetA, SetD, Set1, Set2, Set3_neoformans e Set4_neoformans para identificar C. neoformans e SetB/C e Set1_gattii para identificar C. gattii). Dois conjuntos de iniciadores se mostraram específicos para C. neoformans e C. gattii respectivamente: Se3_neoformans e Set1_gattii. De 11 amostras de LCR testadas por LAMP, 9 foram testadas pelos iniciadores
amplificação e nas duas amostras de C. gattii testadas no conjunto Set1_gattii, não foi possível obter amplificação. Todos os isolados testadas pelo Set3_neoformans amplificaram na metodologia de LAMP. O conjunto Set1_gattii, foi testado apenas um isolado (P285) que foi identificado como C. gattii, pois a outra a amostra não cresceu em cultura. As amostras de LCR negativas e positivas para bactérias foram usadas como controle de nossos testes, e todas resultaram negativas. Conclusão. As metodologias provaram ser testes rápidos e confiáveis na identificação de Cryptococcus, porém é preciso que haja mais testes em relação a detecção direto de amostra clínica.
Cryptococcus that mainly affects, patients with HIV, immunosuppressed and organ transplanted. Species gattii and neoformans are responsible for causing meningitis in humans. Objectives. The objective of this work was to evaluate the performance of molecular microarray and Loop Mediated Isothermal amplification (LAMP) techniques in the identification of Cryptococcus in the cerebrospinal fluid of patients with cryptococcal meningitis differentiating the gattii and neoformans species. Methods. A prospective study was carried out from August 2016 to October 2018. Cerebrospinal fluid samples were positive for Cryptococcus, positive for bacteria and negative for any microorganism, where they were obtained in the infectious diseases ward and the microbiology laboratory of the Hospital de Clínicas of Unicamp. Thirty strains of C. gattii were given by the Adolfo Lutz Institute to test the methodologies studied. The DNA extracted directly from the CSF and its culture isolate was submitted to PCR using the ITS region and the CAP59 gene and later to DNA microarray, LAMP and sequencing.
Results. 133 CSF were extracted, 11 positive for Cryptococcus, 15 positive for
bacteria and 107 negative and 30 C. gattii strains. Eight samples were identified as C. neoformans and 2 as C. gattii and the strains were identified as C. gattii. For the microarray ITS platform, from 11 CSF samples that were extracted DNA, 10 amplified by PCR. Five CSF samples were identified, and the other 5 were not possible to obtain results. For the isolates tested on this platform, there were three samples with non-specific reactions and 7 were identified correctly. For the CAP59 platform, PCR amplification was performed on all CSF samples. There was no identification in three samples and eight were correctly identified. For the isolates of CSF, it was possible to correctly identify all the samples. Tests with different LAMP (SetA, SetD, Set1, Set2, Set3_neoformans and Set4_neoformans methods were used to identify C. neoformans and SetB/C and Set1_gattii to identify C. gattii). Two sets of primers were specific for C. neoformans and C. gattii respectively: Se3_neoformans and Set1_gattii. Of 11 CSF samples tested by LAMP, 9 were tested by Set3_neoformans and two by Set1_gattii. For the Set3_neoformans set 55.5% were identified as C. neoformans and in four samples there was no amplification and in the two C. gattii samples tested in the Set1_gattii set, it was not possible to obtain amplification. All isolates tested by Set3_neoformans amplified the LAMP methodology. The set Set1_gattii, was tested
controls for our tests, and all tested negative. Conclusion. The methodologies have proven to be rapid and reliable tests in the identification of Cryptococcus, but more tests are necessary in relation to direct detection of clinical samples.
da inalação de partículas aerossolizadas do ambiente. Na figura há dois exemplos de possibilidades de infecção 1º: Presença de Cryptococcus em madeira em decomposição 2º Presença de Cryptococcus em fezes de aves. Em ambos exemplos estão associados com a presença de células fúngicas. ... 20 Figura 2. Esquema representativo da organização do DNA ribossomal fúngico. Os quadrados indicam as regiões selecionadas para sequenciamento ou amplificação do DNA por PCR (ITS e D1/D2). SSU: small ribosomal subunit; LSU: large ribosomal subunit. Imagens obtidas de Webgenack e Binnicker 2009 (40). ... 23 Figura 3. Representação da ligação dos iniciadores utilizados na metodologia de LAMP. A) Os iniciadores FIP, BIP, B3 e F3 se ligam as regiões complementares do DNA e dão início à amplificação. B) Quando a estrutura inicial cíclica do LAMP se forma, os outros dois iniciadores LF e LB se ligam nas regiões entre F2/F1 e B1/B2, respectivamente. ... 26 Figura 4. Fluxograma do trabalho realizado com as amostras de líquor positivas para Cryptococcus spp. ... 31 Figura 5. Esquema da impressão das lâminas de DNA microarray pelo equipamento KCS miniprinter. Primeiramente o equipamento imprime os óligos nas lâminas de policarbonato. Em seguida, as lâminas passam pelo um processo de hibidização, onde é possível visualizar o resultado. Esse processo consiste em adicionar o PCR de interesse, levar a uma camara úmida por duas horas. Em seguida essa lâmina é incubada por 5 min em uma solução de lavagem para que possa receber a solução conjugada que permanece por 30 minutos. Repete-se o processo utilizando-se coloring buffer. Ao adicionar a solução colorante, é possível a visualização do resultado a olho nú. ... 36 Figura 6. Representação esquemática da disposição dos oligonucleotídeos das espécies de fungos presentes na lâmina de Microarray da plataforma ITS. A) Mapa da ordem dos gêneros e espécies presente na plataforma de ITS. B) Representação do mapa ao ser impresso na lâmina de policarbonato. ... 37 Figura 7. Representação esquemática da disposição dos oligonucleotídeos das espécies de Cryptococcus spp. na plataforma de CAP59. A esquerda mapa da ordem dos gêneros e espécies presente na plataforma de CAP59 e a direita representação do mapa ao ser impresso na lâmina de policarbonato. ... 38 Figura 8. Géis de agarose mostrando os resultados de produtos de amplificação de PCR com diferentes protocolos de extração de DNA a partir de líquido cefalorraquidiano infectado artificialmente com diferentes concentrações de Cryptococcus neoformans ATCC e os respectivos limiares de detecção. No gel CTAB houve amplificação nas
Figura 9. Fluxograma representando os resultados das plataformas de DNA microarray. Resultados obtidos com extração de DNA a partir de amostras de LCR... 43 Figura 10. Fluxograma representando os resultados da plataforma ITS do DNA microarray. Resultados obtidos da extração de DNA de Cryptococcus spp a partir de isolados resultantes do crescimento da semeadura de líquor em meio de cultura ... 44 Figura 11. Identificação de Cryptococcus spp. em lâminas de DNA microarray a partir de LCR e de seus isolados em cultura. Identificação das amostras no microarray testada na plataforma ITS onde amostras foram submetidas a amplificação do DNA utilizando iniciadores ITS-1b/ITS-4R. De todas as amostras testadas, somente a P285 é positiva para C.gattii e na lamina resultou positiva somente para Cryptococcus spp. ... 45 Figura 12. Identificação de Cryptococcus spp. em lâminas de DNA microarray a partir de LCR e seus isolados em cultura. Identificação das amostras no DNA microarray testadas na plataforma CAP59. As amostras foram submetidas à amplificação do DNA utilizando iniciadores CAP59-1Fb/CAP59-2Rb.De todas as amostras testadas, somente a P272 e P285 são positivas para C.gattii. Cultura de P272 não apresentou crescimento. ... 46 Figura 13. Resultado da hibridação das cepas de C.gattii nas lâminas de DNA microarray pela plataforma de CAP59. ... 48 Figura 14. Gráficos de amplificação isotérmica de DNA por LAMP. Amostras de DNA dos genótipos VNI a VNIV de C. neoformans foram submetidos à amplificação isotérmica por LAMP, usando o conjunto de iniciadores SetA e SetD, específicos para C. neoformans. C. gattii e Candida albicans foram usados como controles negativos da reação. ... 50 Figura 15. Gráficos de amplificação isotérmica de DNA por LAMP. A) Amostras de DNA dos genótipos de C. gattii e amostras de DNA das cepas do IAL que foram submetidos à amplificação isotérmica por LAMP. B) Testes com outros microrganismos que foram submetidos a amplificação isotérmica por LAMP. Todos os testes foram fetios usando o conjunto de iniciadores SetB/C. ... 51 Figura 16. Gráficos de amplificação isotérmica de DNA por LAMP. Amostras de DNA dos genótipos de C. neoformans que foram submetidos à amplificação isotérmica por LAMP usando o conjunto de iniciadores Set1desenhados para C.neoformans. C-: Uso de controle negativo foi de Candida albicans. ... 52 Figura 17. Gráficos de amplificação isotérmica de DNA por LAMP. Amostras de DNA dos genótipos de C. neoformans que foram submetidos à amplificação isotérmica por LAMP usando o conjunto de iniciadores Set2 desenhados para C.neoformans. C-: Uso de controle negativo foi de Candida albicans. ... 53
usando o conjunto de iniciadores Set3_neoformans e Set4_neoformans desenhados para C.neoformans. Uso de controle negativo foi de Candida albicans. Os genótipos de C.gattii foram utilizados para a observação de amplificação inespecífica. ... 54 Figura 19. Gráficos de amplificação isotérmica de DNA por LAMP. Amostras de DNA de outros microrganismos que foram submetidos à amplificação isotérmica por LAMP usando o conjunto de iniciadores Set3_neoformans desenhados para C.neoformans. ... 55 Figura 20. Gráficos de amplificação isotérmica de DNA por LAMP. DNA dos isolados em cultura de LCR positivos para C. neoformans que foram submetidos à amplificação isotérmica por LAMP com o conjunto Set3_neoformans ... 56 Figura 21. Gráficos de amplificação isotérmica de DNA por LAMP. DNA das amostras de LCR positivos para C. neoformans que foram submetidos à amplificação isotérmica por LAMP com o conjunto Set3_neoformans. Nas amostras LCR276, LCR275, LCR274, LCR232 não houve amplificação. ... 57 Figura 22. Gráficos de amplificação de DNA por LAMP. Amostras de DNA das 30 cepas de C.gattii que foram submetidos à amplificação isotérmica por LAMP com o conjunto Set1_gattii. As amostras 08, 09, 25 e 32 estão com gráficos individuais, pois precisaram ser repetidas em reações diferentes. ... 58 Figura 23. Gráficos de amplificação de DNA por LAMP. Amostras de DNA de outros microrganismos que foram submetidos à amplificação isotérmica por LAMP com o conjunto Set1_gattii. A amostra 09 foi usada como controle positivo da reação. ... 59 Figura 24. Gráficos de amplificação de DNA por LAMP. Amostras de líquor C.gattii testadas com o conjunto Set1_gattii. * amostras que não tiveram amplificação. As curvas de amplificações positivas da cultura de P285 estão sobrepostas. ... 59 Figura 25. Gráficos de amplificação de DNA por LAMP. Teste com amostras nas concentrações 101 cel/ml a 107cel/ ml que foram submetidas à amplificação isotérmica por
LAMP utilizando o conjunto de iniciadores Set3_neoformans. ... 60 Figura 26. Fluxograma representando os resultados dos conjuntos de iniciadores de LAMP. Os quadros em vermelho mostram os conjuntos de iniciadores que foram escolhidos para utilizar na metodologia de LAMP. ... 61 Figura 27. Fluxograma representando os resultados de LAMP. Resultados obtidos com extração de DNA a partir de amostras de LCR ... 61 Figura 28. Fluxograma representando os resultados de LAMP. Resultados obtidos com extração de DNA de Cryptococcus spp a partir de isolados resultantes do crescimento da semeadura de líquor em meio de cultura. * O LCR P272 não apresentou crescimento em cultura. ... 62
Aids Síndrome da Imunodeficiência adquirida DNA Ácido desoxirribonucleico
PCR Reação em cadeia da polimerase
ITS Internal Transcribed Spacer
CAP59 Capsular Associated Proteins 59
NCBI National Center for Biothecnology Information LAMP Loop mediated Isothermal Amplification RT-PCR Reação de transcriptase reversa
RNA Ácido ribonucleico
qPCR PCR em tempo real
UV Radiação ultravioleta
M Molar
g Constante gravitacional
mM Milimolar
EDTA Ácido Etilenodiamino tetra-ácetico
bio Biotinilado V Volts h Horas min Minutos LCR Liquido Cefalorraquidiano MI Moléstias Infecciosas
Laboratório de Epidemiologia Molecular e Doenças LEMDI Infecciosas
pMOL Picomol
uM Micromolar
1.2.1 Histórico ... 17
1.2.2 Características ... 17
1.2.3 Epidemiologia ... 18
1.3 Cryptococcus como causador de doenças ... 19
1.3.1 Diagnóstico Clínico e Laboratorial ... 21
2.0 Objetivos ... 27
3.0 Metodologia ... 28
3.1 Local do Estudo ... 28
3.2 Amostras ... 28
3.3 Técnicas Moleculares ... 31
3.3.1 Fluxograma do processamento das amostras clínicas ... 31
3.3.2 Infecção de Cryptococcus em LCR com identificação microbiológica negativa para fungos e bactérias ... 31
3.3.3 Extração de DNA ... 32
3.3.4 Sequenciamento de DNA ... 33
3.3.5 DNA microarray ... 34
3.3.6 Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) ... 38
4.0 Resultados ... 40
4.1 Padronização de extração de LCR infectado ... 40
4.2 Sequenciamento ... 41
4.2.1 Cepas de Cryptococcus gattii ... 41
4.3 DNA microarray ... 43
4.3.1 Microarray das cepas de C.gattii ... 47
4.4 Loop mediated Isothermal Amplification (LAMP) ... 49
5.0 Discussão ... 63
6.0 Conclusão ... 69
7. Referências Bibliográficas ... 70
1.0 Introdução
1.2 Ecologia do Cryptococcus 1.2.1 Histórico
A criptococose foi descrita, pela primeira vez, por Zenker em 1861, mas como não houve evidência da cultura do microrganismo, o caso não foi validado. No entanto, o crédito da primeira descrição foi para Zenker e para o pesquisador alemão, Otto Busse em 1894, patologista do Institute of Pathology at Greifswald University, na Alemanha, onde isolou o fungo de uma lesão de sarcoma na tíbia. O fungo foi isolado em cultura e feito teste de patogenicidade confirmado por reinoculação na pele da própria paciente que veio a falecer pela infecção. Busse chamou a doença de saccharomycopsis hominis e o fungo de Saccharomyces. Em 1894, o pesquisador italiano, Francesco Sanfelice, na Itália, isolou de suco de pêssego, uma levedura encapsulada que era semelhante ao microrganismo que Busse e Zenker haviam descrito, e denominou-a de Saccharomyces neoformans. Em meados de 1901, Jean-Paul Vuillemin, através das descobertas de Sanfelice e Busse, renomeou as leveduras como Cryptococcus e as espécies como C. neoformans e C. homini, respectivamente (1). Essa classificação se deu pelo fato dos microrganismos isolados não fermentarem carbono, e da não formação de ascóporos, que caracterizam as espécies do gênero Saccharomyces (2).
Em 1934 e 1935, Rhoda Benham e Jacomina Lodder apontaram que, muitas das leveduras descritas, pertenciam a uma mesma espécie. Benham, na época, nomeou os fungos como Cryptococcus neoformans e Lodder denominou-os Torulopsis neoformans. Posteriomente, em 1950, Benham recomendou o nome de C. neoformans, para esta espécie, após estudos que mostraram diferenças sorológicas entre isolados de amostras clínica (3). Porém, foi somente em 1952 que a recomendação Benham foi adotada, após um estudo taxonômico realizado por Kreger-van Rij (2).
1.2.2 Características
Cryptococcus spp. pertencem ao domínio Eukaryota dentro do reino Fungi. Apresentam-se como leveduras não fermentadoras de formas ovaladas, medindo aproximadamente de 5 µm a 20 µm de diâmetro, com brotamento único ou múltiplo, e
envolvido por uma cápsula mucopolissacáride. As colônias cultivadas em meio de cultura, após três dias à temperatura de 25 a 37ºC, apresentam-se de cor branca à creme, brilhante e de textura mucoide (4).
A classificação sorológica A, B, C, D e AD, destaca as diferenças antigênicas do principal polissacarídeo capsular do fungo, a glucuronoxilomanana (GXM). A capacidade de produção de melanina, é um importante fator de virulência do fungo. Formação de colônias marrons em meios com extrato de sementes de niger, é uma característica de C. neoformans e C. gattii, o que não ocorre em outras espécies do gênero Cryptococcus ou até mesmo em outras leveduras (5,6). Os cinco sorotipos de Cryptococcus são distribuídos em C. neoformans sorotipos A (C. neoformans var. grubii), D (C. neoformans var. neoformans) e o híbrido AD, e C. gatti sorotipo B e C (7,8,13). As duas espécies de Cryptococcus compreendem quatro genótipos moleculares diferentes para cada espécie: C. neoformans VNI a VNIV e C. gattii VGI a VGIV. O ciclo de vida de Cryptococcus spp. é composto por dois estágios, sexual e assexual. C. neoformans (var. grubii e var. neoformans) e C. gattii são ditas variedades anamórficas (assexuadas) (9). Mais recentemente foi proposta uma nova classificação de espécies de Cryptococcus. Para C. neoformans var. grubii com genótipos AFLP1/VNI, AFLP1A/VNB/VNII e AFLP1B/VNII tem sido simplificado para C. neoformans var. neoformans; o genótipo AFLP2/VNIV tem sido renomeado para C. deneoformans. C. gattii foi dividido em cinco espécies: C. gattii (AFLP4/VGI); C. bacillisporus (AFLP5/VGIII); C. deuterogattii (AFLP6/VGII); C. tetragattii (AFLP7/VGIV) e C. decagattii (AFLP10) (10,11).
1.2.3 Epidemiologia
Cryptococcus. neoformans é ubíquo e cosmopolita, estando presente em múltiplas regiões do mundo. É isolado em substratos orgânicos associados à habitat de aves, mais comumente em pombos, contaminados com excretas secas e ricas em fontes de nitrogênio, como ureia e creatinina (5,10).
Cryptococcus gattii tem sido isolado do ambiente principalmente em regiões tropicais e subtropicais, mas também podem ser incluídas em sua distribuição, as áreas de clima temperado. Seu habitat natural foi descrito inicialmente na Austrália, associado a restos vegetais de Eucalyptus camaldulensis, estando relacionado a madeira em decomposição (11,12). Essa espécie também causa doença em vários
animais incluindo cães, gatos, cavalos, coalas, golfinhos, marsupiais, aves entre outros (14).
Segundo Ellis e Pfeiffer (11,12), C. gattii tem como reservatório natural flores de eucalipto. Essa planta é nativa da Austrália, porém foi exportada para diversos países, como por exemplo, Brasil, África, Ásia, Havaí, México (11). A criptococose por C. gattii ocorre em diversos países, como por exemplo no Peru, Colômbia, Argentina, Venezuela, Austrália, África Central, sudeste da Ásia, México, algumas regiões dos Estados Unidos (15,16,17). No Brasil, alguns estudos sobre criptococose de sistema nervoso central (SNC) causada por C. gattii, apresentaram letalidade de até 40% em crianças e adultos jovens, nas regiões norte e nordeste (18).
Na África, o número de casos de criptococose supera os casos de tuberculose e a mortalidade está há cima de 50 a 70% dos casos. Nos países desenvolvidos, a mortalidade é cerca de 22% enquanto que nos países subdesenvolvidos varia de 40 a 50% (19). Nos países, com epidemia pela infecção pelo HIV, houve um decréscimo do número de casos de criptococose após a introdução terapêutica anti-retroviral, em especial, nos países desenvolvidos (19,20). Prado et al (21), por um estudo realizado a partir de dados do Sistema de Informações de Mortalidade (SIM) do Ministério da Saúde, de 1996 a 2006, demonstraram que micoses sistêmicas foram responsáveis por 3.583 mortes sendo que a criptococose representou 25% das mortes.
Um estudo recente de Norida Velez et al (25), utilizou larvas de Galleria mellonella como modelo invertebrado, os autores observaram que não houve diferenças na patogenicidade entre cepas clínicas e ambientais de C. neoformans e C. gattii, independente do genótipo molecular. Este estudo difere de anteriores que mencionaram que as características morfológicas das colônias apresentadas em meio de cultura foram associadas com a presença de fatores de virulência (22, 23, 24).
1.3 Cryptococcus como causador de doenças
Acredita-se que a criptococose é adquirida por meio da inalação de fungos, que ao serem inalados formam um complexo primário no pulmão. A infecção ocorre por inalação de basidiósporos ou leveduras desidratadas (5, 26). O diâmetro dos propágulos fúngicos de 1,2 a 1,8 μm depositam-se nos alvéolos, e na temperatura corporal de 37ºC transformam-se em leveduras capsuladas. O hospedeiro desenvolve um complexo linfonodal pulmonar primário. A inalação de Cryptococcus spp., na
maioria dos casos, produz infecção pulmonar assintomática, podendo ser autolimitada e, dentro deste complexo, as leveduras podem permanecem latentes, ou morrer (27).
Frente a um posterior evento de imunossupressão, as leveduras de Cryptococcus podem ser reativadas e causar doença. Essa infecção primária pode também levar a sintomas pulmonares no hospedeiro, em caso de imunossupressão ou de um grande inóculo da levedura. A disseminação pulmonar para outros órgãos pode potencialmente ocorrer como resultado da infecção primária ou secundária (27). Prioritariamente, as espécies C. neoformans e C. gattii são responsáveis por causar doença em seres humanos e podem se manifestar de duas formas diferentes, caracterizando-se pela criptococose oportunista, associada a condições de imunodepressão, sendo causada predominantemente por C. neoformans, e a criptococose, do hospedeiro imunocompetente, podendo ser causada por C. gattii. As duas espécies podem causar doença pulmonar, meningoencefalite, ou outras formas da doença, porém a meningite é considerada de evolução mais grave e com alta letalidade, podendo ou não ser acompanhada de lesão pulmonar, fungemia e de focos secundários em outros órgãos, tais como trato urinário, pele e ossos (20).
Figura 1. Exemplo da via de transmissão de Cryptococcus. A infecção é adquirida através da inalação de partículas aerossolizadas do ambiente. Na figura há dois exemplos de possibilidades de infecção 1º: Presença de
Cryptococcus em madeira em decomposição 2º Presença de Cryptococcus em fezes de aves. Em ambos
exemplos estão associados com a presença de células fúngicas.
Um estudo da década de 60 sobre terapia antifúngica reportou mortalidade de até 80% em até dois anos após o diagnóstico (10). Os sintomas podem ser agudos ou crônicos e sua gravidade varia de acordo com as condições clínicas do paciente, que pode apresentar outras doenças, como diabetes, infecção pelo HIV, o uso de
drogas imunossupressoras e também pós-transplante de órgãos. Os sinais e sintomas mais comuns da meningite criptocócica são a dor de cabeça intensa e contínua, alteração do status mental variando de alterações leves da personalidade ou mesmo confusão mental, letargia e coma (28,29,5). Sintomas como náuseas e vômitos também são comuns e estão associados com o aumento da pressão intracraniana, podendo estar presente na maioria dos pacientes. Aumento da temperatura corporal e sinais meníngeos estão associados com a inflamação das meninges (5) e, dependendo do grau de acometimento, o paciente pode apresentar visão borrada, diminuição da acuidade visual, cegueira, diplopia e fotofobia, papiledema, neurite óptica e corioretinite (30).
1.3.1 Diagnóstico Clínico e Laboratorial
A alta mortalidade da doença criptocócica está diretamente relacionada ao retardo do diagnóstico e consequentemente, à demora na instituição da terapia antifúngica (5). O histórico prévio do paciente e o quadro clínico são pontos iniciais para o possível diagnóstico da doença, onde o estado imunológico do indivíduo pode estar relacionado com as apresentações clínicas do paciente.
O diagnóstico, de forma geral, pode ser feito através de cultura e microscopia direta de materiais clínicos, através da coloração pela tinta da china sendo possível a visualização do fungo (31,32). No líquido cefalorraquidiano (LCR), as células fúngicas, quando coradas com tinta da China, são visualizadas à microscopia óptica comum quando há 103 ou 104 UFC/mL de elementos fúngicos, com sensibilidade em torno de
80%, não sendo preditora de evolução (5,32). A centrifugação do LCR por 10 minutos aumenta a sensibilidade. A cultura é o exame comprobatório da doença. Cryptococcus spp. apresenta bom crescimento em vários meios de cultivos, que não contenham ciclo-heximida, como: Agar-sangue, Agar-Sabouraud e Agar infusão de cérebro-coração. As espécies neoformans e gattii, podem ser determinadas baseando-se nas características das cores no meio de L-canavanina-glicina-azul de bromotimol (7). Pode crescer em temperaturas entre 25°C e 37°C, a termotolerância máxima é de 40°C. A cultura de LCR é positiva em 89% dos pacientes sem infecção por HIV e em 95-100% dos pacientes com aids. A hemocultura pode revelar a presença do fungo no sangue na doença disseminada (5,27).
O exame histopatológico de tecidos também pode ser utilizado para diagnosticar condições patológicas em tecidos e órgãos, no caso dos pulmões, por
exemplo, órgão acometido pela criptococose (5). Há também a detecção do antígeno capsular do Cryptococcus (CrAg), que é um teste imunocromatográfico para a detecção qualitativa ou semi-quantitativa dos antígenos de polissacarídeos capsulares (31,33). Essa técnica foi introduzida na prática clínica, podendo ser realizado diretamente do LCR, soro ou mesmo do sangue. Este ensaio foi recomendado pela Organização Mundial da Saúde tanto como teste de triagem como para diagnóstico de meningite criptocócica (35, 36) com sensibilidade entre 94% a 100% (36). Outro método é a detecção de antígeno capsular polissacarídeo de Cryptococcus pela aglutinação do látex, que pode ser realizada no sangue, urina, lavado brônquio alveolar e no LCR (34). No entanto, na prática, a detecção de antígeno é feita no LCR e no soro. LCR e soro são positivos em mais de 90% nos pacientes com meningite criptocócica; em infecções fora do SNC, estes espécimes fornecem menor positividade do teste. A sensibilidade é de 95% e especificidade de 98% (5).
Dentro do diagnóstico laboratorial, as técnicas moleculares estão sendo cada vez mais estudadas para serem usadas como auxiliares no diagnóstico. São técnicas com sensibilidade superior em relação ao método utilizado na microbiologia convencional, pois identificam em nível de espécie. Existem algumas regiões que são utilizadas mais amplamente para identificação de gêneros, como por exemplo, regiões conservadas denominadas 18S e 28S localizada no ribossomo fúngico (Figura 2). Através do estudo de regiões alvos, como regiões ITS do DNA ribossomal (rDNA) da região 28S (37,44), que se mostraram regiões conservadas capazes de serem utilizadas para a distinguir fungos. Para o estudo de Cryptococcus spp., as regiões relacionadas com a formação da cápsula do fungo, como CAP10, CAP59, URA5, são muito utilizadas para estudos específicos da espécie fúngica (33,38,39), principalmente para genotipagem.
Figura 2. Esquema representativo da organização do DNA ribossomal fúngico. Os quadrados indicam as regiões
selecionadas para sequenciamento ou amplificação do DNA por PCR (ITS e D1/D2). SSU: small ribosomal subunit; LSU: large ribosomal subunit. Imagens obtidas de Webgenack e Binnicker 2009 (40).
1.3.1.1 Reação em Cadeia de Polimerase (PCR)
Uma técnica molecular muito utilizada nos laboratórios de pesquisas e em alguns laboratórios de análises clínicas é a reação em cadeia da polimerase (PCR). Esta técnica possibilitou, nos últimos anos, a melhora do diagnóstico molecular, e baseia-se na rápida replicação in vitro e identificação de sequências específicas de ácido nucléico (41) permitindo à amplificação de uma região de interesse do DNA, tornando a sequência mais sensível e específica. Para que a reação aconteça é necessária a utilização de reagentes, como Taq polimerase, DNA molde, iniciadores, água, magnésio e nucleotídeos. Realizando a mistura de reagentes, esta segue para o termociclador automático, onde ocorrerão três processos. O primeiro recebe o nome de desnaturação, onde as fitas de DNA se separam em uma temperatura que pode variar de 90ºC a 96ºC. Na segunda parte ocorre o anelamento dos iniciadores, eles se ligam com suas sequências complementares do DNA a uma temperatura 50/60ºC. Por último, à 72ºC, ocorre o processo chamado de extensão, onde acontece a síntese pela polimerase. Esse ciclo repete-se aproximadamente entre 25 a 40 vezes (42).
Existem outros métodos de PCR que são utilizados na biologia molecular, como por exemplo, (a) Reverse Transcriptase Chain Reaction (RT-PCR), em estudos de expressão gênica, onde não parte de um DNA molde diretamente extraído da amostra, mas a amostra fornece o RNA e é convertido em DNA complementar; (b) Nested PCR,
melhora a especificidade e eficiência de uma reação; (c) Multiplex PCR, uma técnica baseada na amplificação de diversos segmentos genômicos em uma única reação; (d) PCR em tempo real (Real Time-PCR / qPCR), basicamente um PCR mais rápido, sensível e quantitativo em comparação ao convencional, onde é possível a visualização dos resultados no momento da amplificação das amostras (33, 42,43).
1.3.1.2 Sequenciamento de DNA
O sequenciamento genético tornou-se um instrumento de identificação dos seres vivos, abordando a possibilidade de diferenciar espécies de fungos, bactérias, vírus, plantas, animais, e de diversas doenças, com maior especificidade e sensibilidade quando comparado a outras técnicas convencionais (44,45).
Sempre é importante a escolha certa da região gênica a ser estudada, pois o sucesso da identificação do fungo depende da região alvo escolhida. Além desse ponto importante, vale lembrar que a disponibilidade de um banco de dados para a comparação das sequências obtidas (44) é de extrema importância, pois aumenta o nível de confiabilidade da região sequenciada, sendo possível observar a porcentagem de identificação e cobertura dessas sequências analisadas, onde geralmente considera-se a partir de 98%. Essa é uma metodologia baseada na amplificação do sítio alvo do DNA pela reação da PCR, seguido pelo sequenciamento do fragmento específico. Quando as sequências são geradas, elas são comparadas e a seguir, depositadas em bancos de dados, como por exemplo, o do National Center for Biotechnology Information (NCBI) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) que são atualizados constantemente, sendo online e gratuito. (46).
1.3.1.3 DNA microarray
Um dos fatores que auxiliam o diagnóstico de infecção fúngica, é a rapidez da identificação do agente etiológico, para a instituição da terapêutica correta. O DNA microarray é uma técnica molecular capaz de identificar mais de um microrganismo simultaneamente em uma mesma reação, quando se testa um espécime clínico ou isolados fúngicos.
Trata-se de uma metodologia muito promissora quando se trata de diagnóstico clínico pela sua rápida identificação. Essa técnica foi estudada em diversos estudos, tais como regulação do ciclo celular, respostas ao estresse, diagnóstico de câncer,
descoberta funcional de genes, terapia específica, identificação de microrganismos patogênicos entre outros (47-54).
O DNA microarray baseia-se em métodos basicamente ópticos, como: detecção visível, fluorescência, luminescência e ressonância plasmática superficial. É considerada uma técnica colorimétrica, e para algumas das metodologias existentes, não há a necessidade de equipamentos especiais para a leitura (55,56).
Um arranjo de microarray pode ser definido como um conjunto ordenado de sondas, em que cada sonda representa uma única espécie de microrganismo correspondente ao gene em estudo, fixado em uma matriz sólida (lâminas de vidro e/ou plásticos) (57-59). A metodologia é realizada a partir de uma amostra de DNA que é amplificada por PCR e quando aplicada na plataforma de interesse, permite à hibridação nas sondas espécies-específicas da lâmina em caso de complementaridade de bases (57-59).
1.3.1.4 Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP)
LAMP é uma metodologia simples de diagnóstico molecular baseado no princípio da amplificação isotérmica de ácido nucleico simples, rápida, específica e econômica fornecendo resultados em aproximadamente 60 minutos de reação. Diferentes estudos clínicos validaram este teste molecular rápido com um desempenho similar à PCR convencional (60,61). Utilizam-se 6 iniciadores (FIP, BIP, F3, B3, LF e LB) especificamente projetados para reconhecer exatamente 6 regiões diferentes no gene alvo (Figura 3). O processo de reação prossegue a uma temperatura constante a 63ºC. Os produtos gerados são detectados por equipamentos especializados ou pela observação visual da turbidez ou fluorescência, o que reduz o custo do uso da técnica. Essa metodologia já foi aplicada para a detecção de diversos microrganismos patogênicos, incluindo vírus (61,62), bactérias (72), protozoários (63) e fungos, tais como Paracoccidioides brasiliensis (64), Pneumocystis jirovecii (69), Histoplasma capsulatum (65), Candida spp. (66,67), Fusarium spp. (68), entre outros. A amplificação e a detecção do gene podem ser completadas em um único passo, incubando a mistura de amostras, iniciadores, DNA polimerase com atividade de deslocamento de cadeia e substratos a uma temperatura constante. A reação apresenta amplificação do DNA de 101-1010 vezes em 15-60 minutos (70).
Figura 3. Representação da ligação dos iniciadores utilizados na metodologia de LAMP. A) Os iniciadores FIP, BIP, B3 e F3 se ligam as regiões complementares do DNA e dão início à amplificação. B) Quando a estrutura inicial cíclica do LAMP se forma, os outros dois iniciadores LF e LB se ligam nas regiões entre F2/F1 e B1/B2, respectivamente. Imagem adaptada de: Eiken Genome Site
De acordo com Yongkiettrakul et al, o LAMP se tornou uma técnica muito promissora pela rapidez do diagnóstico. Os autores observaram que uma das vantagens do LAMP em experimentos com extração diretamente de sangue, por exemplo, foi a tolerância à substâncias inibitórias presentes em amostras desse tipo de espécime clínico, como hemoglobina e imunoglobulina (71).
Pelo exposto, salienta-se a necessidade de estudo de novos testes diagnósticos que apresentem potencial aplicabilidade na prática clínica. Neste contexto, as técnicas moleculares, DNA microarray e LAMP, foram testadas para a identificação de leveduras do gênero Cryptococcus e das espécies neoformans e gattii, em isolados crescidos em meios de cultura, e diretamente do LCR de pacientes com meningite, hospitalizados no Hospital de Clínicas da UNICAMP.
2.0 Objetivos
Geral
Avaliar as técnicas moleculares de DNA microarray e Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) para identificar leveduras do gênero Cryptococcus e diferenciar as espécies neoformans e gattii.
Específicos
a. Padronizar um protocolo de extração diretamente de LCR para seguir com as metodologias moleculares propostas no estudo
b. Padronizar as metodologias de DNA microarray e LAMP, para a identificação de Cryptococcus spp. diretamente de amostras de LCR, de pacientes com meningite criptocócica. Testar estas metodologias para os isolados de Cryptococcus, crescidos em meio de cultura, em que foram semeados LCR de pacientes com meningite criptocócica.
c. Comparar os resultados obtidos de identificação das espécies de Cryptococcus por DNA microarray e LAMP com o sequenciamento de DNA obtido a partir do LCR dos pacientes com meningite criptocócica e dos isolados de Cryptococcus, crescidos em meio de cultura, em que foram semeados LCR de pacientes com meningite criptocócica.
d. Testar os ensaios de LAMP para determinar o limiar de detecção a partir de ensaios de inoculação de concentrações previamente conhecidas de Cryptococcus spp. em LCR.
3.0 Metodologia 3.1 Local do Estudo
O estudo foi realizado no Laboratório de Epidemiologia Molecular e Doenças Infecciosas (LEMDI) da UNICAMP. O Hospital de Clínicas da UNICAMP é um hospital universitário e de referência terciária localizado na região de Campinas, São Paulo. O hospital conta com 403 leitos, onde os pacientes são atendidos em diferentes especialidades médicas.
Esse estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética da Faculdade de Ciências Médicas/ Universidade Estadual de Campinas com o número CAAE: 54943116000005404.
3.2 Amostras
Trata-se de um estudo prospectivo realizado no período de Agosto de 2016 a Outubro de 2018. As amostras clínicas de LCR coletadas dos pacientes hospitalizados foram encaminhadas ao Laboratório de Patologia Clínica para realização dos exames de rotina, incluindo a microscopia direta do LCR e culturas para bactérias, micobactérias e fungos. A identificação microbiológica foi realizada pelos sistemas automatizados Vitek®2 (Lab Equipment bioMérieux Inc., Durham, NC, USA) ou BD Phoenix (Becton Dickinson, Flanklin Lakes, NJ, USA). Os resultados da identificação fúngica, pelos sistemas automatizados, foram comparados com os dos testes moleculares, DNA microarray, LAMP e sequenciamento do DNA. O Laboratório de Micologia armazenou alíquota dos LCRs que foram enviados para microscopia direta e cultura para fungos, incluindo os que resultaram negativos. Todos os pacientes, cujo LCR foi testado neste estudo, assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido para participação no estudo.
As amostras de LCR foram separadas em grupos conforme o resultado de identificação microbiológica: grupo A, as amostras positivas para Cryptococcus spp., o grupo B, as amostras positivas para bactérias e negativas para fungos e o grupo C composto por amostras negativas para bactérias e fungos (Tabela 1). O grupo controle desse estudo foi constituído por amostras negativas para fungos, bactérias e micobactérias, e as amostras positivas para bactérias. Todos os isolados de Cryptococcus foram armazenados em água segundo o método de Castellani (73).
Foram incluídas amostras clínicas de LCR da primeira ou segunda punção de 9 pacientes, e duas alíquotas de LCR provenientes de punção de alívio, de dois pacientes com meningite criptocócica, totalizando 11 amostras positivas de meningite criptocócica.
Para a padronização dos ensaios laboratoriais foram incluídas e testadas 30 cepas de C. gattii gentilmente cedidas pela Profa. Márcia S.C. Melhem, pesquisadora do Instituto Adolfo Lutz.
Foram incluídas oito amostras de DNAs correspondente aos 4 genótipos de C. neoformans (VNI a VNIV) e aos 4 genótipos de C. gattii (VGI a VGIV) e duas cepas identificadas como LIF 708 e ATCC 90113, gentilmente cedidos pela Profa. Angélica Z. Schreiber do Departamento de Patologia Clínica da FCM UNICAMP. Estes DNAs foram utilizados para avaliar os ensaios de LAMP.
Tabela 1. Relação das amostras de líquido cefalorraquidiano de acordo com o resultado do Laboratório
de Microbiologia do Hospital de Clínicas da UNICAMP
Total de Amostras
Identificação das amostras
Identificação pelo Laboratório de Microbiologia
Grupo A N = 11 P232 Cryptococcus spp. P260 Cryptococcus neoformans P261 C. neoformans *P272 Negativo P273 C. neoformans P274 C. neoformans #P275 Não realizada P276 Cryptococcus spp. P283 C. neoformans P284 C. neoformans P285 Cryptococcus gattii Grupo B N = 15
P63 Staphylococcus haemolyticus e Staphylococcus
epidermidis P113 Pseudomonas aeruginosa P228 Enterobacter cloacae P240 Staphylococcus aureus P257 P. aeruginosa P259 P. aeruginosa P262 P. aeruginosa P263 Streptococcus pneumoniae P264 E. cloacae P265 Staphylococcus caprae P266 S. caprae P267 Haemophilus influenzae P268 S. pneumoniae P269 Pantoea aerogenes P270 S. pneumoniae Grupo C N = 107 Negativos
Obs: A amostra *P272 resultou negativa na identificação microbiológica. A amostra #P275
foi obtida de punção de alívio de paciente com meningite criptocócica internado na enfermaria de Moléstias Infecciosas do Hospital de Clínicas da UNICAMP
3.3 Técnicas Moleculares
3.3.1 Fluxograma do processamento das amostras clínicas
No momento da inclusão, todas amostras de LCR foram identificadas com as iniciais do paciente, número de registro de entrada do hospital e data da coleta do material clínico. Posteriormente, uma pequena alíquota de cada amostra de LCR foi dispensada em meio de cultura ágar Sabouraud. Para as amostras em que foi obtido o crescimento fúngico, procedeu-se a extração do DNA do isolado crescido em cultura (Figura 4). Foi realizada a extração de DNA fúngico para 107 amostras de LCR, que resultaram negativas pela identificação microbiológica, e para as 15 amostras de LCR com crescimento bacteriano.
Figura 4. Fluxograma do trabalho realizado com as amostras de líquor positivas para Cryptococcus spp.
3.3.2 Infecção de Cryptococcus em LCR com identificação microbiológica negativa para fungos e bactérias
Para a padronização de testes de extração de DNA fúngico a partir de líquido cefalorraquidiano, foram realizadas infecções em amostras negativas de LCR com C. gattii LIF 708 e C. neoformans ATCC 90113. Inicialmente, foram retirados 500 µL da água contendo C. neoformans e transferido para um tubo de ensaio com 5 mL de meio líquido YEPD e incubado a 37ºC por 48h, sob agitação. Realizou-se o mesmo procedimento para C. gattii. Após 48h, foram retirados 500 µL do tubo de ensaio e transferidos para um tubo de 1,5 mL com 500 µL de PBS. Dessa mistura foram retirados 10 µL para contagem de células fúngicas em 16 quadrantes na câmara de Thoma de ep 0,1mm. Após a contagem, foi obtida uma concentração de 107cels/mL,
e assim foram realizadas diluições seriadas utilizando 900 µL de líquor e 100 µL da concentração anterior até chegar a uma concentração de 101 cels/mL.
3.3.3 Extração de DNA
Foram testados três protocolos de extração de DNA para as amostras de LCR infectadas com cepas C. neoformans ATCC e C. gattii LIF de 107cels/mL a 101cels/mL.
No primeiro teste realizado utilizou o reagente Brometo de Cetil trimetil amônio (CTAB). A amostra infectada foi centrifugada a 8.000g por10min e 100µL do precipitado foram transferidos para um tubo de 1,5 mL. Em seguida foram adicionados 500 µL de CTAB e o volume total transferido para um tubo MagNALyser Green Beads (Roche Applied Sciences, CA, EUA) para lise mecânica no equipamento MagNALyser (Roche). Esse lisado foi transferido para um novo tubo de 1,5 mL e submetido à extração de DNA utilizando QiaAmp DNA mini kit (Qiagen Inc., MD, USA) de acordo com as especificações do fabricante. O segundo teste realizado foi utilizando a solução alcalina de lavagem, onde uma alíquota de 200 µL de LCR foi adicionada a 500 µL da solução alcalina (NaOH 0,5 M, citrato de trisódio desidratado 0,05 M) para remoção de possíveis inibidores de PCR. As amostras foram agitadas por 15 seg, incubadas à temperatura ambiente por 5 min e centrifugadas a 16.000 g por 5 min. Após remoção do sobrenadante, o precipitado foi resuspendido em 300 µL de PBS 1X, agitado por 15 seg e em seguida transferido para um tubo MagNALyser Green Beads. O precipitado foi transferido para um novo tubo de 1,5 mL e submetido à extração de DNA com o QiaAmp DNA mini kit (Qiagen). No terceiro teste foi usado somente PBS 1X, sendo 500 µL do tampão com 200 µL da amostra, incubado à temperatura ambiente por 5 min e centrifugado a 16.000 g por5 min. Esse processo foi repetido com 300 µL de PBS, e posteriormente o conteúdo foi transferido para um tubo MagNALyser Green Beads (Roche) para lise mecânica no equipamento MagNALyser (Roche). Esse lisado foi transferido para um novo tubo de 1,5 mL e submetido à extração de DNA com o QiaAmp DNA mini kit (Qiagen) de acordo com as especificações do fabricante. Após a extração as amostras foram quantificadas no NanoDrop™ 2000 Spectrophotometers da Thermo Fisher Scientific™ (Waltham, MA, EUA) (Anexo 7).
3.3.4 Sequenciamento de DNA
3.3.4.1 Reação em cadeia de Polimerase (PCR)
A identificação molecular de Cryptococcus spp. foi realizada pelo sequenciamento da região ITS do DNA ribossomal, utilizando os seguintes
iniciadores: ITS1 (5´-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3´) e ITS4
(5´-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3´), e para o gene CAP59, Cap59-1F
(5´CKTGGTCCAACKCYGGCT-3’) e Cap59-2R (5’-CRTTCATGAARACGACCG-3’). A amplificação pela PCR foi realizada, para o DNA extraído diretamente de líquor e para os isolados crescidos em cultura, no termociclador Veriti (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) utilizando 12,5 µL de PCR Master Mix (Promega, Fitchburg, WI, EUA), 1,25 µL dos iniciadores na concentração de 10 pmol, 2 µL da amostra de DNA e água para um volume final de 25 µL. A desnaturação ocorreu à 95ºC por 2 min, seguida de 40 ciclos à 95ºC por 30 seg, 55ºC por 30 seg para anelamento (para CAP59 foi utilizado 52ºC para temperatura de anelamento) e 72ºC por 1 min para extensão, além de extensão final a 72ºC por 5min. Após a reação de amplificação, a presença e integridade do material foram verificadas pela eletroforese em gel de agarose 2%. A eletroforese foi realizada em cuba contendo tampão TBE 1%, por 30 minutos. Após a corrida, os géis foram corados em brometo de etídio por 10 minutos e visualizados sob luz ultravioleta (UV).
3.3.4.2 Reação de Sequenciamento do DNA
Os produtos da PCR foram submetidos à purificação utilizando 2 µL de Exosap (USB Corporation, Cleveland, Ohio, EUA) para cada 5 µL do produto da PCR. As reações foram incubadas no termociclador Veriti (Applied Biosystems) à 37ºC por 30 min seguida de 80ºC por 15 min, totalizando 45 minutos. A reação de sequenciamento foi realizada utilizando-se 1µL BigDye Terminator v.3.1 (Life Technologies, Foster City, Califórnia, EUA), 1 µL de tampão, 1 µL de cada iniciador na concentração de 1,6 pmol, 2 µL do produto de PCR tratado com Exosap e 5 µLde água milli-Q. A amplificação ocorreu em termociclador Veriti (Applied Biosystems) à 95°C por 3 min, 35 ciclos à 95°C por 5 seg, 55°C por 10 seg e 60°C por 4min.
3.3.4.3 Lavagem e Purificação
Após a reação de sequenciamento, as amostras foram purificadas utilizando-se etanol e precipitação com EDTA. Foram adicionados, a cada amostra, 5 µL de EDTA e 60 µL de etanol 100%. As reações foram agitadas e incubadas durante 15 min a temperatura ambiente. Após esse período, as amostras foram centrifugadas por 30 min em rotação de 13.000 rpm à 4ºC. O sobrenadante foi descartado e adicionou-se a cada reação, 60 µL de etanol 70%. Foi realizada nova centrifugação por 10 min a 13.000 rpm à 4ºC. Novamente, o sobrenadante foi descartado e foi realizada a secagem a vácuo (Tomy Seiko CO, LTD, Tóquio, Japão). As amostras foram tratadas com 10 µL de Formamida (Applied Biosystems) e o sequenciamento ocorreu no equipamento ABI Prism 3500 Genetic Analyser (Applied Biosystems).
Os fragmentos de DNA, forward e reverse, obtidos para as regiões ITS e do gene CAP59 foram editadas e alinhados pelo programa Sequencher 5.2.4 (Gene Codes Corp., Ann Harbor, MI, USA). A partir das sequências consenso de cada isolado de Cryptococcus spp., foi realizada a identificação com base na homologia com sequências depositadas no banco de dados disponível online: NCBI (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov). A identificação quanto à espécie foi considerada quando os valores de homologia com outras sequências depositadas nos bancos foram maiores ou igual a 98%. Para tal análise considerou-se apenas as sequencias de cepas padrão: American Type Culture Collection (ATCC), Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS) e ARS Culture Collection (NRRL).
3.3.5 DNA microarray
O LEMDI conta com uma plataforma de DNA microarray, para a região ITS, desenvolvida em colaboração com pesquisadores do Medical Mycology Research Center, da Universidade de Chiba, Japão. A plataforma contém 13 gêneros e 31 espécies fúngicas (Figura 6). A amplificação do DNA fúngico foi realizada utilizando os pares de iniciadores universais marcados com biotina ITS1 – bio (5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’) e ITS4- bio (5’TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’). A técnica de DNA microarray foi baseada em Sakai et al, e Ferrari et al., e composta por quatro etapas: a) Elaboração da plataforma de DNA microarray, b) amplificação do DNA alvo por PCR, c) desnaturação e hibridização e d) interpretação dos resultados.
Para a desnaturação foram utilizados 8 μL da PCR em um tubo de 0,2 μL seguido de aquecimento a 9ºC por 2 min, e em seguida o resfriamento imediato em gelo por 2 min. Foram adicionados ao DNA desnaturado, 32 μL do tampão de hibridação (Tetramethyllammoniumchroride 2M, Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) 10%), EDTA 5mM, Saline Sodium Citrate 6X). Quarenta microlitros da solução foram aplicados à lâmina de microarray, e a mesma foi coberta com uma lamínula, para permitir a hibridização. As lâminas foram acomodadas em uma câmara umedecida com água destilada e incubada à 37ºC por 2 h. Após esse período, foi preparada a solução conjugada para cada amostra, composta pelos seguintes reagentes: 1,5 mL de coloring buffer (tampão Fosfato salino (PBS) 0,01M, Tween-20 0,05%), 24 μL do reagente denominado Solução A (tampão PBS e Biotina HRP 0,02 mg/mL) e 24 μL do reagente denominado Solução B (tampão PBS e estreptavidina 0,04 mg/mL). Completado o tempo de incubação, as lamínulas foram removidas da plataforma e as lâminas submersas em tampão de lavagem (Tampão PBS), por 5 min à 37˚C, em estufa incubadora. Em seguida, as lâminas foram deitadas em papel toalha e adicionado 1,5 mL da solução conjugada e a seguir incubadas em temperatura ambiente por 30 min. Após esse processo, a solução conjugada foi vertida e as lâminas acomodadas em uma cuba contendo coloring buffer durante 10 min em temperatura ambiente. Novamente, as lâminas foram vertidas removendo o coloring buffer e repousadas em papel toalha.
Foram aplicados 1,5 mL de solução reveladora (1,5 mL de H2O Milli-Q, 24 μL da Solução 1: H2O e CH3COONa 0,2M, pH3,3 ajustado com HCl; 24 μL da Solução 2: TMB (3,3’,5,5’- tetramethyl benzidina); 24 μL da Solução 3: H2O e Dextran sulfate sodium salt from Leuconostoc spp. 3%) e 24 μL da Solução 4: H2O e H2O2 1,5%), cobrindo cada lâmina, e a seguir incubadas novamente à temperatura ambiente por 30 min. A lâmina foi secada à temperatura ambiente.
A identificação dos resultados foi realizada a olho nú, onde ocorreu a revelação de pontos de coloração azul em posições específicas na lâmina, que continham diferentes sondas para fungos de interesse clínico, de acordo com o mapa de construção do array (Figura 5,6).
Figura 5. Esquema da impressão das lâminas de DNA microarray pelo equipamento KCS miniprinter. Primeiramente o equipamento imprime os óligos nas lâminas de policarbonato. Em seguida, as lâminas passam pelo um processo de hibidização, onde é possível visualizar o resultado. Esse processo consiste em adicionar o PCR de interesse, levar a uma camara úmida por duas horas. Em seguida essa lâmina é incubada por 5 min em uma solução de lavagem para que possa receber a solução conjugada que permanece por 30 minutos. Repete-se o processo utilizando-se coloring buffer. Ao adicionar a solução colorante, é possível a visualização do resultado a olho nú.
Figura 6. Representação esquemática da disposição dos oligonucleotídeos das espécies de fungos presentes na lâmina de Microarray da plataforma ITS. A) Mapa da ordem dos gêneros e espécies presente na plataforma de ITS. B) Representação do mapa ao ser impresso na lâmina de policarbonato.
Para a identificação de Cryptococcus e as espécies neoformans e gattii (Figura 7) foi desenvolvida uma nova plataforma, usando-se sondas da região do gene CAP59, um dos genes responsáveis pela produção da cápsula polissacarídea de Cryptococcus spp. Os iniciadores usados para a reação de PCR foram: Cap59-1F: 5´
Biotina- CKTGGTCCAACKCYGGCT e Cap59-2Rbio:
Biotina-CRTTCATGAARACGACCG, e seguiram o mesmo programa de amplificação, com exceção da temperatura de anelamento de 52ºC.
Figura 7. Representação esquemática da disposição dos oligonucleotídeos das espécies de Cryptococcus spp. na plataforma de CAP59. A esquerda mapa da ordem dos gêneros e espécies presente na plataforma de
CAP59 e a direita representação do mapa ao ser impresso na lâmina de policarbonato.
3.3.6 Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP)
A reação de amplificação do ensaio foi composta por: 10μL de cada iniciador FIP e BIP em concentração de 40pmol; 10 μL de cada iniciador F3 e B3 em concentração de 5pmol; 10 μL de LF e LB em concentração de 20pmol; 2 μL de DNA, 100 μL de reaction mix (1 mL betaína 8M, 500 μL MgCl2 165mM, 500 μL Tris-HCL, 500 μL KCL, 500 μL de NHSO4, 500 μL de Tween 20 2%, 350 μL de dNTP 10mM e 150 μL água miliQ filtrada), 10 μL DNA polimerase Bst (marca) e 30 μL de água miliQ filtrada. Essa mistura foi incubada no turbidímetro em tempo real LoopAmp EXIA (Eiken Chemical Co., Tokyo, Japan) à 63ºC. A reação foi considerada positiva sempre que a amplificação ocorria em até 60 minutos.
Foram realizados três testes com conjuntos de iniciadores desenhados, em diferentes softwares, com base no gene CAP59. Primeiramente, foram realizados testes com os ensaios de LAMP descritos na literatura (79), onde foram utilizados três
conjuntos de iniciadores: SetA – para identificação do sorotipo A de C. neoformans; SetD – para identificação do sorotipo D de C. neoformans e SetB/C - para identificação do sorotipo B/C de C. gattii. Para o segundo teste utilizou-se outros conjuntos de iniciadores para C. neoformans, ao qual foram desenhados no programa LAMP designer 1.14, disponível em http://www.premierbiosoft.com/isothermal/lamp.html; nomeados como: Set1 e Set2. O último teste foi realizado com iniciadores desenhados no Primer Explorer V5 (https://primerexplorer.jp/e/), nomeados: Set3_neoformans e Set4_neoformans para C. neoformans e Set1_gattii para C. gattii. Todas as sequências dos conjuntos de iniciadores, estão presentes no Anexo 4.
4.0 Resultados
Foram incluídas para este estudo: 11 amostras de LCR provenientes de 9 pacientes com meningite criptocócica, 15 amostras de LCR provenientes de pacientes com meningite bacteriana e 107 amostras de LCR cuja identificação microbiológica resultou negativa. Trinta isolados de C. gattii e 10 isolados de Cryptococcus spp, foram obtidos a partir da semeadura de LCR em meio de cultura. As amostras de LCRs negativas para quaisquer microrganismo e positivas para bactérias, foram extraídas e submetidas a PCR, cujo resultados foram negativos.
4.1 Padronização de extração de LCR infectado
Para as amostras de LCR infectadas com diferentes concentrações de C. gatti LIF 708 e C. neoformans ATCC 90113 (107 a 101céls/mL) foram testados três
protocolos de extração do DNA fúngico. Dos três protocolos testados, o que utilizou solução alcalina de lavagem apresentou melhores resultados. De todas as concentrações testadas, naquelas tratadas com solução alcalina de lavagem, foi possível identificar banda de amplificação do gene ITS em até 102 céls/mL. Já aquelas
tratadas com CTAB foram possível apenas até 106céls/mL e com PBS não foi possível
ver banda de amplificação, indicando a necessidade de um tratamento prévio da amostra clínica antes da extração de DNA propriamente dito. Os ensaios realizados com C. gattii e C. neoformans apresentaram os mesmos resultados para o limiar de detecção. A figura 8 mostra os limiares de detecção para os três protocolos de extração de ensaios realizados com C. neoformans ATCC.
Figura 8. Géis de agarose mostrando os resultados de produtos de amplificação de PCR com diferentes protocolos de extração de DNA a partir de líquido cefalorraquidiano infectado artificialmente com diferentes concentrações de Cryptococcus neoformans ATCC e os respectivos limiares de detecção. No gel CTAB houve amplificação nas concentrações de 107 de 106. No gel Solução Alcalina houve amplificação de 107 a 102. No gel PBS não houve amplificação de produtos de PCR
4.2 Sequenciamento
Foram sequenciados todos os produtos de amplificação obtidos de 11 amostras de LCR provenientes de 9 pacientes com meningite criptocócica (Tabela 2). Todas as amostras de LCR (P232, P260, P261, P272, P273, P274, P275, P276, P283, P284 e P285) foram extraídas de acordo com o protocolo de extração padronizado com solução alcalina de lavagem, tanto o LCR quanto os isolados crescidos em meio de cultura, onde foram semeadas alíquotas de LCR. Uma observação a ser feita, é que a amostra P272 não cresceu em cultura, impossibilitando a extração de DNA de seu isolado; além disso, não foi possível amplificar seu DNA através da região ITS, consequentemente a plataforma de microarray que utiliza o DNA amplificado pela região ITS, não foi possível ser realizado (Tabela 2).
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Tabela 2. Resultados do sequenciamento do DNA, de produtos da amplificação da região ITS e do
gene CAP59, obtidos diretamente da extração de DNA a partir de amostras de líquor e de isolados resultantes do crescimento da semeadura de líquor em meio de cultura, de Cryptococcus spp.
#NR- Não realizado, punção de alívio adquirida pela enfermaria. *P272 não apresentou crescimento em meio de cultura
4.2.1 Cepas de Cryptococcus gattii
Foram extraídos o DNA dos 30 isolados enviados pelo Instituto Adolfo Lutz e realizado o sequenciamento da região ITS e do gene CAP59. Os resultados estão descritos na Amostra Microbiologia Sequenciamento CAP59 ITS Espécie LCR Espécie Cultura Identida de LCR Identidade Cultura Espécie LCR Espécie Cultura Identid ade LCR Identidade Cultura P232 Cryptococcus
spp. C.neoformans C.neoformans 98% 98% C.neoformans C.neoformans 98% 98%
P260 C.neoformans C.neoformans C.neoformans 98% 98% C.neoformans C.neoformans 98% 98%
P261 C.neoformans C.neoformans C.neoformans 98% 98% C.neoformans C.neoformans 99% 99%
*P272 Negativo C.gattii Não cresceu 99% - NR NR NR NR P273 C.neoformans C.neoformans C.neoformans 100% 100% C.neoformans C.neoformans 99% 99%
P274 C.neoformans C.neoformans C.neoformans 100% 100% C.neoformans C.neoformans 100% 100%
#P275 NR C.neoformans C.neoformans 100% 100% C.neoformans C.neoformans 100% 100%
P276 C.neoformans C.neoformans C.neoformans 99% 99% C.neoformans C.neoformans 99% 99%
P283
Cryptococcus
spp C.neoformans C.neoformans 99% 99% C.neoformans C.neoformans 99% 99%
P284 C.neoformans C.neoformans C.neoformans 98% 98% C.neoformans C.neoformans 98% 98%
