MARTA DELFINA BAZZANO GONZALEZ
LISADO DE PLAQUETAS HUMANAS NA EXPANSÃO DE
CÉLULAS-TRONCO MESENQUIMAIS DE POLPA DENTÁRIA
Piracicaba 2016
Faculdade de Odontologia de Piracicaba
Universidade Estadual de Campinas CampinasESTADUAL DE CAMPINAS
MARTA DELFINA BAZZANO GONZALEZ
LISADO DE PLAQUETAS HUMANAS NA EXPANSÃO DE
CÉLULAS-TRONCO MESENQUIMAIS DE POLPA DENTÁRIA
Dissertação apresentada à Faculdade de Odontologia de Piracicaba da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestra em Biologia Buco Dental na Área de Histologia e Embriologia.
Orientador: Prof. Dr. Marcelo Rocha Marques
Piracicaba 2016
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA ALUNA
MARTA DELFINA BAZZANO GONZALEZ E
ORIENTADA PELO PROF.DR. MARCELO ROCHA MARQUES.
Agência(s) de fomento e nº(s) de processo(s): FAPESP, 2014/11872-1 Ficha catalográfica Universidade Estadual de Campinas
Biblioteca da Faculdade de Odontologia de Piracicaba Marilene Girello - CRB 8/6159
Bazzano Gonzalez, Marta Delfina, 1962-
B349L BazLisado de plaquetas humanas na expansão de células-tronco mesenquimais de polpa dentária / Marta Delfina Bazzano Gonzalez. – Piracicaba, SP : [s.n.], 2016.
BazOrientador: Marcelo Rocha Marques.
BazDissertação (mestrado) – Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba.
Baz1. Células-tronco. 2. Polpa dentária. 3. Terapia baseada em transplante de células e tecidos. 4. Células mesenquimais estromais. I. Marques, Marcelo Rocha,1976-. II. Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Odontologia de Piracicaba. III. Título.
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Platelet lisated for dental pulp mesenchymal stem cell expansion Palavras-chave em inglês:
Stem cells Dental pulp
Cell- and tissue-based therapy Mesenchymal stromal cells
Área de concentração: Histologia e Embriologia Titulação: Mestra em Biologia Buco-Dental Banca examinadora:
Marcelo Rocha Marques [Orientador] Rui Barbosa de Brito Júnior
Nilva de Karla Cervigne Data de defesa: 24-02-2016
AGRADECIMENTOS
A Deus, por tudo.
A minha família pelo incentivo e compreensão nas minhas inúmeras ausências.
Ao meu orientador Prof. Dr. Marcelo Rocha Marques pela oportunidade de trabalharmos juntos, pela capacidade de transmitir seus conhecimentos com uma simplicidade singular e principalmente, pela amizade.
A Regina Amélia Moraes do Hemocentro da UNICAMP.
Ao Dr. Walter Pinto Júnior da CULTILAB - Materiais para cultura de células Ltda.
A Felipe Franco da Rocha do Laboratório de Alta performance - LACTAD – Unicamp, pela ajuda nas análises de Citometria de Fluxo.
A Silvia Helena da Costa do Laboratório de Citogenética Médica de Campinas.
Ao Gustavo Narvaes pela força e ajuda na Cultura de células.
A Natássia Cristina Martins Oliveira pela ajuda na realização dos experimentos.
Aos queridos colegas do Dpto. que de alguma maneira me ajudaram, mais não foram citados pois são muitos, para que fosse possível a finalização deste trabalho.
Muito obrigado a todos!!!
“É preciso força para sonhar e perceber que a estrada vai além do que se vê... ”
Los Hermanos
RESUMO
As células-tronco mesenquimais (CTMs) tem se tornado um atrativo em terapia celular e medicina regenerativa, pela sua capacidade de imunomodulação e diferenciação em vários tecidos. Já foram isoladas de inúmeros tecidos do organismo, incluindo os tecidos dentários, como a polpa, onde encontram-se em pouquíssima quantidade, implicando na sua expansão in vitro para o seu uso em terapia. Suplementos padronizados, como o soro fetal bovino (SFB) trouxe questionamentos relativos à xeno-imunização; possibilidade de transmissão de patógenos, príons e micoplasmas, quando utilizados para a expansão de CTMs destinadas a ensaios clínicos. Além disso, fatores de ordem ética e a grande variabilidade na produção dos lotes, limitam o seu uso na cultura. Pesquisas foram direcionadas para a obtenção de um substituto apropriado na cultura, surgindo o interesse da comunidade científica pelos derivados plaquetários. As plaquetas sanguíneas possuem grânulos que contêm vários fatores de crescimento e citocinas que, quando liberados e adicionados ao meio de cultura, funcionam como um suplemento eficaz, em substituição ao SFB. Este estudo, desenvolveu um protocolo para o processamento de um lisado de plaquetas (LP) humanas provenientes de bolsas de concentrados de plaquetas com data de validade expirada, partindo de protocolos citados na literatura, como alternativa ao SFB no meio de cultura e avaliou o seu efeito em CTMs da polpa dentária de terceiros molares. Seis protocolos foram previamente elaborados e testados, até a obtenção de um lisado eficiente na cultura. Terceiros molares provenientes de 3 pacientes entre 17 e 19 anos tiveram suas polpas coletadas e processadas para o cultivo e expansão das CTMs. Para comparar os efeitos dos dois suplementos (LP e SFB), as células foram expandidas em densidade baixa até a quinta passagem, quando os ensaios foram realizados. Após a caracterização por meio de ensaios de imunofenotipagem e o potencial de diferenciação em tecidos de origem mesodérmica (osteogênica, adipogênica e condrogênica), foram avaliados o perfil citogenético, a morfologia e a cinética da população por Ensaio de Population doubling time (PDT). Um pool de seis lisados processados individualmente, foi utilizado como suplemento no meio de cultura na concentração de 10% para todos os ensaios, utilizando como controle meio suplementado com SFB a 10%. Foi observado que o meio suplementado com o pool de lisado de plaquetas sustentou
a expansão até a quinta passagem das CTMs, diminuindo o tempo de dobramento da população por passagem (Population doubling time), quando comparadas ao SFB. A capacidade de diferenciação destas células, não foram afetadas pelo LP, e os marcadores de membrana analisados para cada amostra apresentaram poucas diferenças na sua expressão quando comparadas as amostras do SFB. A técnica de bandeamento GTG, para a cariotipagem, após 20 metáfases analisadas por amostra, não evidenciou nenhuma anormalidade estrutural ou morfológica dos cromossomos. Concluímos que o lisado de plaquetas pode tornar-se um substituto eficiente para o SFB, quando se tem o objetivo de expandir in vitro CTMs da polpa dentária.
Palavras-chave: Células-tronco. Polpa dentária. Terapia baseada em transplante de células e tecidos. Células mesenquimais.
ABSTRACT
Mesenchymal stem cells (MSC) has become interesting in cell therapy and regenerative medicine, due to its immunomodulatory capacity and differentiation in many tissues. MSC´s have been isolated from many human body tissues, including dental region, such as pulp, where just few MSC´s can be found, so to be used in theraphy expansion in vitro has to be performed. Standard supplements such as fetal bovine serum (FBS) brought challenges related to the xeno-immunization; possibility of pathogens transmission, prions and mycoplasmas when MSC’s expansion are applied on clinical trials. Additionally ethical issues and production quality variation limit its use in cells culture. Researchs are running to obtain suitable substitute, so emerging interest of scientific community for platelet derivatives. Blood platelets have granules which contain various growth factors and cytokines that when released and added to the culture medium act as an effective supplement to replace FBS. Protocols are being developed to process a human platelet lysate (hPL) derived concentrates platelets bags of platelets with expired date, based protocols reported in the literature as an alternative to the FBS in the culture medium and to evaluate their effect on the dental pulp stem cells(DPSCs) of third molars. Previously six protocols were prepared and tested to obtain an efficient culture lysate. Third molars from three patients (17 to 19 years old) had their pulps collected and processed for cultivation and expansion of MSCs. To compare the effects of the two supplements (hPL and FBS), cells were expanded in low density to the fifth passage when the assays were performed. After characterization by immunophenotype tests and the potential to differentiate into mesodermal origin (osteogenic, adipogenic and chondrogenic), evaluated the cytogenetic profile, morphology and population’s kinetics by Population doubling time (PDT). A pool of six individually processed lysates, was used as a supplement in the culture medium at the concentration of 10% for all tests, using as a control medium supplemented with 10% FBS. It was observed that medium supplemented with hPL pool maintained by the expansion of the fifth passage MSC, reducing the PDT passage compared to FBS. The differentiation capacity of these cells were not affected by the hPL and the membrane markers analyzed for each sample showed few differences in expression when compared to the samples FBS. The GTG banding technique for karyotyping after 20 metaphases analyzed per sample did not show any structural or morphological abnormality of chromosomes. We conclude that the hPL can become
an effective substitute for FBS, as has been the objective of expanding in vitro DPSCs.
Keywords: Stem cells. Dental Pulp. Cell - and tissue - based therapy. Mesenchymal stromal cells.
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO 12 2 REVISÃO DA LITERATURA 16 3 PROPOSIÇÃO 40 4 MATERIAL E MÉTODOS 41 5 RESULTADOS 59 6 DISCUSSÃO 87 7 CONCLUSÃO 93 REFERÊNCIAS 94ANEXO 1 – Comprovante de Comitê de Ética 109
1 INTRODUÇÃO
O potencial das células-tronco tem estimulado a aparecimento de novas áreas, como a medicina regenerativa e a bioengenharia de tecidos. Terapias baseadas em células para o tratamento de doenças humanas tornaram-se uma realidade clínica à luz dos avanços em pesquisa com células-tronco adultas, células estaminais embrionárias e células somáticas reprogramadas, conhecidas como células-tronco de pluripotência induzida iPSC (do inglês: Induced pluripotent stem cell) (Henon, 2003; Silva et al, (2012).
As células-tronco mesenquimais (CTMs) são uma população de células indiferenciadas dentro das células-tronco adultas, definidas parcialmente pelo seu potencial de diferenciação em várias linhagens celulares in vitro e in vivo, que incluem osso, cartilagem, e tecido adiposo (Pittenger et al,1999; Baksh et al, 2004), e atualmente, tem se demostrado com capacidades terapêuticas muito além da sua capacidade de diferenciação (D’ Souza, 2015). Os mecanismos através dos quais exercem estas ações incluem a liberação de biomoléculas com capacidade anti-inflamatória, imunomoduladora, anti-fibrogênica e funções tróficas (D’Souza, 2015).
Células-tronco mesenquimais (CTMs) humanas, vem sendo avaliadas quanto ao seu potencial terapêutico em pelo menos 543 estudos incluídos no Clinical Trials (www.clinicaltrials.gov) para várias doenças, distúrbios e lesões como: doença de Cronh, DECH (doença do enxerto contra o hospedeiro), esclerose múltipla, diabetes tipo I , colite ulcerativa, osteogênesis imperfecta, injúria da coluna espinhal, transplante renal, osteoartrite, distrofia muscular de Duchenne, esclerodermia, fraturas ósseas, lesões ulcerativas, falência renal crônica, síndrome do stress respiratório agudo, e várias cardiomiopatias com resultados promissores.
Células-tronco da polpa dentária originam-se de linhagens oriundas da crista neural ( Miura et al, 2003; Lu et al, 2005; d’Aquino et al, 2009; Janebodin et al, 2011) e podem ser obtidos sem invasão à tecidos, a partir de dentes descartados por motivos clínicos, como os terceiros molares, que geralmente seriam descartados como resíduos biológicos. (Gronthos et al, 2000; Jo et al, 2007; Collart Dutilleul et al, 2012). Células-tronco oriundas da polpa dental foram capazes de se diferenciar in vitro em tecidos hepáticos (Ishkitiew et al, 2010); células neuronais funcionais (Iohara et al 2006; Arthur et al ,2008; KÍrali et al, 2009); endotélio e odontoblastos (Sakai et al,
2010); células pancreáticas (Govindasamy et al, 2011) e utilizados em alguns ensaios promissores in vivo em cardiopatias (Gandia et al, 2008); desordens musculares (Kerkis et al, 2008), doenças das glândulas salivares (Yamamura et al, 2013) e em ensaios associados a biomateriais para a engenharia óssea tecidual (Niu et al, 2014). Estudos como o de Alge et al (2010) e Huang et al (2011), descrevem as células-tronco originárias da polpa dentária com potencial maior do que as que se originam da medula óssea, o que tornam esta população altamente atrativa para aplicações clínicas. Isto, têm estimulado a criação de Bio-bancos para a sua criopreservação, tanto as CTMs de polpa dentária alógenas como autógenas (Collart-Dutilleul et al, 2015).
Em geral, protocolos clínicos de cultura celular partem de uma pequena quantidade de CTMs primárias obtidas em seus respectivos nichos que, após isoladas a partir de uma determinada fonte de tecido, são expandidas por várias passagens in vitro a fim de gerar um número clinicamente relevante destas células (Horwitz et al, 2011; Díez et al, 2015). No entanto, a falta de uma padronização na cultura, envolvendo o meio utilizado constitui-se em umas das principais deficiências do uso de CTMs em terapias avançadas. (Díez et al, 2015). Meios clássicos utilizados para gerar as CTMs envolvem, normalmente suplementos como o soro fetal bovino (SFB) que proporcionam fatores de crescimento, de adesão e nutrientes vitais que são essenciais para a nutrição destas células na cultura (Honn et al, 1975; Sotiropoulou et al, 2006).
Jung et al (2012), consideram que métodos que envolvem o SFB não são adequados para garantir a qualidade das CTMs para uso terapêutico humano. Órgãos regulatórios tanto nos EUA (Food and Drug Administration-FDA) e Europa (European Medicines Agency-EMA) e diretrizes internacionais da Organização Mundial da Saúde para as Boas práticas de Manufatura (Good Manufacturing Practice-GMP), orientam para a miniminização no uso de produtos de origem animal, devido a riscos relacionados à xeno-imunização, transmissão de patógenos, vírus e micoplasmas na propagação de células com finalidades clínicas (Gstraunthaler, 2003; Schallmoser and Strunk, 2013). Recentemente, vários produtos vêm sendo testados como alternativa ao SFB, incluindo alguns suplementos de origem humana como o plasma rico em plaquetas, soro autólogo ou alógeno, lisado de plaquetas, ou mesmo formulações isentas de soro contendo apenas fatores de crescimento e de adesão. (Lucarelli et al,
2003; Anitua et al, 2007; Bernardo et al, 2007; Capelli et al, 2007; Bieback et al, 2009; Lohmann et al, 2012; Mojica-Henshaw et al, 2013; Schallmoser and Strunk, 2013).
As plaquetas humanas têm um papel fundamental na hemostasia corporal, regeneração tecidual e na cicatrização (Golebiewska et al, 2015). Oriundas dos megacariócitos liberam substâncias através dos seus grânulos internos que influenciam na reação vascular e atuam sobre outras células do sangue durante a angiogênese e a inflamação (Harrison,2005). Seus grânulos são ricos em citocinas e fatores de crescimento, como o fator de crescimento derivado de plaquetas (platelet-derived growth factor- (PDGF); fator de crescimento fibroblástico básico ( basic fibroblast growth factor (FGF-b ); fator de crescimento epidermal (epidermal growth fator-EGF); fator de crescimento transformante β (transforming growth factor-β - TGF-β); fator de crescimento de hepatócitos (hepatocyte growth factor - HGF); fator de crescimento endotelial vascular (endothelial growth fator - VEGF); (fator de crescimento semelhante a insulina 1 (insulin-like growth factor-1 - IGF-1) e de várias outras moléculas imunológicas e de adesão . (Ng et al, 2008; Schallmoser and Strunk, 2013; Burnouf et al, 2016). Estes fatores podem ser liberados artificialmente promovendo a sua lise por congelamento/descongelamento (Schallmoser et al, 2006, sonicação (Bernardi et al, 2013) ou tratamentos químicos(Copland et al, 2013), surgindo o lisado de plaquetas humanas (LP), como uma alternativa adequada ao SFB como suplemento no meio de cultura, permitindo a expansão eficaz de células humanas sob condições isentas de componentes xenógenos para uma multiplicidade de aplicações na terapia celular e na engenharia de tecidos (Bournof et al, 2015). Numerosos estudos que utilizam produtos derivados de plaquetas, para induzir a proliferação e diferenciação de células humanas, descreveram diferentes métodos de preparação o que limita a comparação dos resultados obtidos, abrindo um grande campo para a padronização da sua manufatura e assim, tornar-se um suplemento alternativo na cultura de células (Doucet et al 2005; Mannelo et al, 2007; Kazemnejad et al,2008; Bieback et al, 2009; Blande et al, 2009; Rauchet al 2011; Hemeda et al,2014; Plamberger et al, 2015).
Os objetivos deste trabalho foram desenvolver um protocolo para o processamento de um lisado de plaquetas humanas provenientes de bolsas de concentrados plaquetários com data de validade expirada, partindo de protocolos
citados na literatura, como alternativa ao SFB no meio de cultura durante a expansão in vitro de CTMs de polpa dentária de terceiros molares.
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 Células-tronco
As células-tronco são células com capacidade de diferenciação em diferentes linhagens, auto renovação e proliferação. Podem ser classificadas, de acordo com a sua origem ou a sua capacidade de diferenciação, em dois tipos principais: embrionárias e não embrionárias. (Ding et al, 2011; Young et al, 2013).
As células-tronco embrionárias são pluripotentes, podendo diferenciar-se nas três camadas germinativas embrionárias (endoderme, mesoderme e ectoderme) e dar origem a todos os tipos de células. As células-tronco não embrionárias, também conhecidas como células-tronco adultas, encontram-se em muitos tecidos do organismo adulto e são ditas de multipotentes. (Hynes et al, 2012; Young et al, 2013).
Mais recentemente, por manipulação genética, surgiram as células-tronco de pluripotência induzida (IPS), que são pluripotentes e comparáveis às celulas-tronco embrionárias em termos de morfologia, capacidade proliferativa, perfil de expressão gênica e capacidade de diferenciação (Hynes et al, 2012; Silva et al 2012).
2.1.1 Células-tronco mesenquimais
A presença de células não-hematopoiéticas estaminais na medula óssea foi sugerida pela primeira vez há 149 anos atrás, por observações do patologista alemão Julius Cohnheim (Prockop,1997). A sua pesquisa levantou a possibilidade de que a medula óssea poderia ser a fonte de células semelhantes a fibroblastos que podiam ser vistas durante o processo normal na reparação de feridas. Trabalhos posteriores que se iniciaram na década de 70, como o de Friedenstein et al, (1970); Friedenstein et al (1974); Friedenstein et al (1976) e Owen e Friedenstein (1988), durante cultura de células de medula óssea, relatam uma pequena população de aparência fusiforme e fortemente aderentes ao plástico, que se mantiveram inativas por 4 dias e após este período começaram a se multiplicar rapidamente. Após algumas passagens esta cultura foi adquirindo uma aparência mais homogênea e fibroblastóide, formando colônias que foram denominadas de Unidades Formadoras de Colônias semelhantes a Fibroblastos (UFC-F). Owen e Friedenstein (1988), nomearam estas células de
células-tronco estromais (do inglês: stromal stem cells). Outros grupos, como o de Castro-Malaspina et al (1980), confirmaram que as células isoladas pelo método de Friedenstein et al (1976), tinham propriedades multipotenciais e poderiam diferenciar-se em osteoblastos, condrócitos, adipócitos e mioblastos. Posteriormente referidas por Caplan (1991) como células-tronco mesenquimais (CTMs) (do inglês: mesenchymal stem cells–MSCs) devido à sua capacidade de diferenciação em células do tipo mesenquimais; ou de células estromais, porque são oriundas do complexo conjunto de estruturas de suporte (estroma) encontrados na medula óssea (Caplan et al 2005).
Após o seu isolamento da medula óssea, já foram obtidas de uma variedade de tecidos, tais como o cordão umbilical (Kern et al, 2006; Kouroupis et al, 2013), tecido adiposo (James et al, 2012), tecidos dentais, como a polpa (Gronthos et al, 2000; 2002), gengiva (Tomar et al, 2010) e outros tecidos como a pele, músculo esquelético, fluído aminiótico, placenta e endométrio (Nardi et al, 2006). Devido a facilidade na coleta das CTMs destes tecidos e a variabilidade de fontes disponíveis, tornaram-se alvo em pesquisas para aplicações clínicas e experimentais.
2.1.2 Definição das células-tronco mesenquimais
As células-tronco mesenquimais (CTMs) multipotentes humanas, despertaram um grande interesse da área biomédica, devido ao seu grande potencial terapéutico. No entanto, variados métodos de isolamento, expansão e abordagens para caracterizar estas células, foram relatados pelos pesquisadores, tornando cada vez mais difícil a comparação entre resultados. Três critérios foram definidos pelo Comité de células-tronco mesenquimais da Sociedade Internacional de Terapia Celular (International Society for Cellular Therapy-ISCT) para definir as CTMs: a aderência ao plástico, quando cultivadas sobre condições padronizadas na cultura; pelo menos 95% da população destas células devem expressar os marcadores de membrana CD105, CD73 e CD90. Além disso, menos do que 2% da população deveriam expressam os marcadores CD45, CD34, CD14 ou CD11b, CD79a ou CD19 e HLA-DR. Finalmente, devem ser capazes de sofrer diferenciação em pelo menos três linhagens diferentes (Osteoblastos, condroblastos e adipócitos) quando submetidos a meios específicos in vitro. Embora estes critérios, provavelmente,
sofram modificações a medida que novos conhecimentos vão sendo adicionados, estes critérios mínimos são necessários para uma caracterização mais uniforme das CTMs facilitando o intercâmbio de dados entre os pesquisadores. (Dominici,2006).
2.1.3 Biologia das células-tronco mesenquimais
As células-tronco mesenquimais são células indiferenciadas, com capacidade de auto-renovação. Devido ao seu estado indiferenciado, é capaz de proporcionar uma reposição ativa da sua população de maneira constante aos tecidos (Lemischka, 2005).
As primeiras células-tronco descritas na literatura foram isoladas da medula óssea estromal, que tem por finalidade promover um microambiente que forneça um suporte para a hematopoese. Na medula óssea fresca adulta, constituem apenas 0,01% a 0,0001% das células nucleadas. As CTMs são uma população heterogênea de células capazes de proliferar in vitro, como células aderentes ao plástico, tendo morfologia semelhante aos fibroblastos e são capazes de diferenciação em vários tecidos. (Ponticoglou et al, 2011).
Um fenômeno comum a todas as células diplóides, incluindo as CTMs, quando expandidas in vitro, denominado de “limite de Hayflick”, refere-se ao número de divisões celulares que ocorrem durante um determinado período de tempo através de passagens consecutivas em condições padronizadas de cultura, e logo após, as células param de proliferar entrando em senescência (Hayflick, 1965; Estrada et al, 2013). Relaciona-se ao número de PD (Population doubling), ou seja, ao número de vezes que a população dobrou na cultura. Para as CTMs, semelhante às células diploides humanas, o número máximo de PDs está em torno de 50 (+/-) (Hayflick, 1965).
Outra característica das CTMs na cultura, refere-se à confluência em que as células deverão ser repicadas, ou seja, o momento para que seja realizado a subcultura. Ho et al ( 2012), demostrou que se a cultura for repicada quando a confluência já atinguiú 100%, as células tornam-se mais envelhecidas e apresentam um prolongado tempo de duplicação, ocorre uma maior expressão da senescência asociada à β-Galactosidase, observa-se um aumento da parada do ciclo celular e
também, o aumento intracelular de ROS (espécies reativas de oxigênio). Os autores, concluem que a densidade ideal para repicagem seria em torno de 60 a 70%.
2.1.4 Células-tronco mesenquimais da polpa dentária
A polpa dentária se origina de células que migraram da crista neural, durante o desenvolvimento e são conhecidas por abrigar várias populações de células com capacidade multipotencial ( Miura et al., 2003; Lu et al 2005; Janebodin et al, 2011). Evidências demostram que as células-tronco são encontradas em “nichos” e, alguns tecidos, como a polpa dentária, são ricas fontes destas células. Apresentam um grande potencial proliferativo in vitro, facilitando a sua expansão ex vivo aumentando o potencial de translação destas células. Indiscutivelmente, a polpa dentária é a fonte mais acessível de células-tronco pós-natais, pois podem ser obtidos sem invasão à tecidos, a partir de dentes descartados por motivos clínicos, como os terceiros molares e que geralmente seriam descartados como resíduos biológicos. (Gronthos et al, 2000; Jo et al, 2007; Casagrande et al 2010; Collart Dutilleul et al, 2012). .
As células-tronco da polpa dental foram primeiramente identificados por Gronthos et al (2000), e já foram isoladas de vários tecidos dentais, caracterizados e classificados num grande grupo denominado de DPSCs (do inglês: dental pulp stem cell), ou células-tronco da polpa dental que incluem outros tipos de células como as SHEDs (exfoliated deciduous teeth) células-tronco de dentes decíduos, PDLSc (periodontal ligament stem cell) células-tronco do ligamento periodontal, DFPCs (dental follicle progenitor cells) células-tronco do folículo dental e as SCAPs (stem cells from apical papila) células tronco da papila dental. (Cheng et al, 2008; Cordeiro et al, 2008; Honda et al, 2008; Huo et al, 2010; Casagrande et al, 2011).
Estudos demonstram que as CTMs de polpa dental, tem capacidade de auto renovação e um grande potencial de diferenciação em diversos tecidos, osteoblastos, condrócitos, adipócitos células de músculo liso e esquelético, (Gronthos et al, 2002; Laino et al, 2005; d'Aquino et al, 2007; Otaki et al, 2007; Yu et al, 2007; Gandia et al, 2008; Huang et al, 2008; Karaoz et al, 2010). Também já foram diferenciados in vitro em tecidos hepáticos (Ishkitiew et al, 2010); células neuronais funcionais (Iohara et al 2006; Arthur et al ,2008; KÍrali et al, 2009); endotélio e
odontoblastos (Sakai et al, 2010); células pancreáticas (Govindasamy et al, 2011) e utilizados em alguns ensaios promissores in vivo em cardiopatias (Gandia et al, 2008); desordens musculares (Kerkis et al, 2008), doenças das glândulas salivares (Yamamura et al, 2013) e em ensaios associados a biomateriais para a engenharia óssea tecidual (Niu et al, 2014) .
As CTMs de polpa dentária expressam vários marcadores como o CD73, CD90, CD105, CD13, CD29, CD44, CD146 (Yamada et al, 2006; 2010; Pivoriuunas et al, 2010; Hilkens et al, 2013) e são caracterizadas por não expressarem marcadores hematopoiéticos como CD34, CD45, CD11b, CD19, e o HLA-DR (human leukocyte
antigen), receptor de monócitos e macrófagos do compiexo de histocompatibilidade
tipo II (MHC II) (Gioventù et al, 2012). Também expressam vários marcadores específicos de células-tronco embrionárias como Oct4 e Nanog (Ferro et al., 2012).
Atari et al (2012), descreveu um perfil imunofenotípico para CTMs de polpa dentária de terceiros molares mostrando a positividade para os seguintes marcadores: SSEA4+, OCT4+, NANOG+, SOX2+, LIN28+, CD13+, CD105+, CD342, CD452, CD90+, CD29+, CD732, STRO1+ and CD146-.
Tendências atuais visando a criopreservação das CTMs de polpa dentária, ou mesmo de dentes inteiros congelados, para uso futuro em terapias, tem incentivado trabalhos como o Perry et al (2008) e Gioventù et al, (2012) explorando condições de isolamento, processamento e criopreservação, seguindo as boas práticas de preservação de tecidos.
Oda et al, (2010) descreveu um trabalho em que células de pluripontência induzida (IPS) foram geradas a partir de CTMs de polpa dentária de terceiros molares por transdução retroviral de OCT3/4, SOX2, and KLF4 sem MYC.
Estudos como o de Alge et al (2010) e Huang et al (2011), descrevem as células-tronco originárias da polpa dental com potencial maior do que as que se originam da medula óssea, o que tornam esta população altamente atrativa para aplicações clínicas.
2.1.5 Perfil citogenético das células-tronco mesenquimais
O uso de CTMs em terapia celular implica na extensiva expansão in vitro
para o seu uso clínico aumentando o risco de que células geneticamente anormais
possam surgir e propagar-se na cultura. Anormalidades genéticas e epigenéticas podem levar à transformação e fraco desempenho no seu uso clínico, constituindo-se num ponto crítico para a segurança em terapia celular ( Bochkov et al, 2007; Sensebè et al, 2009; Casiraghi et al, 2013; Stultz et al, 2016). Deve ser considerada, a variabilidade doador-doador na estabilidade gênica destas células destinadas à terapia (Wang et al, 2013).
A técnica de bandeamento GTG, permite a visualização de blocos diferenciados (bandas), melhorando significativamente a caracterização cromossômica. (Casperson et al, 1970). Experiências com culturas de células-tronco mostraram que os procedimentos durante as preparações citogenéticas (colheita, hipotonização, fixação) devem ser executadas sob condições suaves, já que o aparecimento de células rompidas com cromossomos dispersos eram mais incidentes em culturas de células-tronco do que em culturas de linfócitos (Bochkov et al, 2007).
Aneuploidias foram estudadas com CTMs de tecido adiposo entre as passagens 0 a 16 e em culturas senescentes por Roemeling –van Rhijn et al (2013). Para avaliar a plasticidade da ploidia, as CTMs foram clonadas e a variação da ploidia, foram examinadas. A tumorigenicidade, foi estudada pela injeção de células aneuploides em ratos imunodeficientes NOD / SCID. Os resultados demostraram que não houve aneuploidias nas células que acabaram de ser isoladas. Em passagens baixas (de 0 a 4) foram detectadas aneuploidias em 3,4% das células e em passagens mais tardias (de 5 a 16) houve um aumento significativo de aneuploidias em 7,1%. Nas células senescentes, as aneuploidias aumentaram para 19,8%. Nos clones, a aneuploidia foi observada nas CTMs diplóides, demostrando o aparecimento de nova aneuploidia. E finalmente, as CTMs aneuploides de tecido adiposo foram incapazes de formar tumores nos ratos imunodeficientes.
Bochkov et al, (2007), apresentaram resultados de um trabalho que demonstra o aparecimento espontâneo de aberrações cromossómicas em 7 culturas de células-tronco mesenquimais de tecido adiposo, com incidência média de 2,95%. A porcentagem de células com alguma aberração em culturas variou de 1,50 a 5,95%.
Um total de 3,33 aberrações foram detectadas para cada 100 células analisadas, sendo a maioria de fragmentos individuais, significando que as células com aberrações cromatídicas acabavam morrendo mais voltavam a aparecer durante a mitose subsequente. A incidência de aberrações cromossómicas nas culturas analisadas durante as primeiras passagens em comparação com uma cultura de linfócitos de sangue periférico, estavam no limite superior ao normal. No entanto, neste estudo os autores demostraram o aparecimento de alterações cariotípicas consideráveis depois de várias passagens. Este fato é muito importante do ponto de vista da segurança em terapia celular e portanto, é de extrema relevância a investigação citogenética de culturas destinadas a terapia.
Um estudo para avaliar a estabilidade genética de CTMs oriundas de 10 doadores de medula óssea, durante a cultura através das passagens, Stultz et al (2015), indicaram que ocorrem anormalidades em CTMs em passagens mais precoces que poderiam ser propagdas clonalmente. Nos resultados, este autor, relata que essas anormalidades diminuíram através das passagens. Observou-se uma maior variabilidade na quantidade de cariótipos anormais na passagem 3, do que as observadas na passagem 5 ou 7, podendo refletir, um ajuste das CTMs às condições da cultura visto que, mudanças genéticas e epigenéticas aparecem na cultura de células como uma maneira de adaptação (Nestor et al, 2015). Estes resultados sugerem uma tendência para a perda do cariótipo anormal com o aumento do número de passagens. Outro estudos, também relatam a diminuição de anomalias detectadas com o aumento no número de passagens, que estão relacionados à apoptose, parada do ciclo celular ou envelhecimento replicativo na cultura. (Binato et al, 2013).
A Sociedade Internacional para Terapia Celular (International Society for
Cellular Therapy-ISCT) sugeriu a presença de 2 metáfases anormais idênticas de 20
examinadas, como um limite para exclusão do uso clínico de CTMs (Barkholt et al, 2013).
2. 2 Terapia celular
Terapias regenerativas com células, baseadas na propagação in vitro de células-tronco, oferecem uma enorme esperança para pacientes que sofrem de doenças degenerativas que anteriormente, eram consideradas incuráveis. As CTMs, albergam uma vasta gama de propriedades, como a capacidade de auto-renovação,
potencial de diferenciação em multilinhagens e propriedades imunossupressoras, tornando-as fonte atraente para terapias regenerativas (Sensebé et al ,2009; Haque et al, 2013).
O primeiro ensaio clínico utilizando CTMs expandidas em cultura foi relatada por Lazarus et al (1995). Neste estudo, 15 pacientes onco-hematológicos em remissão completa, receberam infusões de células autólogas expandidas in vitro em meio suplementado com SFB por via intravenosa, sem reações adversas após a infusão.
Desde então, CTMs humanas, vem sendo avaliadas quanto ao seu potencial terapêutico e atualmente existem pelo menos 543 estudos em andamento, incluídos no Clinical Trials (www.clinicaltrials.gov) para tratamento de várias doenças, distúrbios e lesões como: doença de Cronh, DECH (doença do enxerto contra o hospedeiro), esclerose múltipla, diabetes tipo I , colite ulcerativa, osteogênesis imperfecta, injúria da coluna espinhal, transplante renal, osteoartrite, distrofia muscular de Duchenne, esclerodermia, fraturas ósseas, lesões ulcerativas, falência renal crônica, síndrome do stress respiratório agudo, e várias cardiomiopatias com resultados promissores.
Segundo Binato et al (2013), aproximadamente de 2 x 10⁶ células/kg de peso corporal, são necessárias para aplicações clínicas de CTMs humanas. Outros protocolos de terapia celular segundo pesquisa no Clinical trials (www.clinicaltrials.gov) por Estrada et al ( 2013) envolvem de 1x 107 a 4x 10 8 de
CTMs por tratamento, e consequentemente, necessitam de expansão in vitro em torno de 8 a 12 semanas para que seja possível a sua implantação. Recentemente, Sharma et al ( 2015), revisou uma média de 0,5 a 8 x 10⁶ Células /kg de peso corporal de CTMs utilizados em vários ensaios, já citados anteriormente no Clinical trails.
2.2.1 Terapia celular com células-tronco mesenquimais
As CTMs exercem seus efeitos terapêuticos por vários mecanismos: a capacidade de migração para regiões de inflamação após injúria tecidual; capacidade de diferenciação em vários tipos celulares; secreção de inúmeras moléculas bioativas capazes de estimular a recuperação de células injuriadas e inibir a inflamação;
apresentar baixa imunogenicidade e capacidade de executar funções imunomoduladoras. A eficácia destes efeitos, já foi demostrado por inúmeros
trabalhos pré-clínicos usando modelo animal. (Wang et al, 2012; Sharma et al, 2014; Gao et al, 2016).
Murphy et al (2013), num artigo de revisão, sobre as propriedades das CTMs, destaca que as mesmas são parcialmente definidas pela sua capacidade de se diferenciar em tecidos como o osso, cartilagem e tecido adiposo in vitro, mas é a seu efeito trófico, parácrino e funções imunomoduladoras que se atribui o maior impacto terapêutico in vivo. Além da sua alta plasticidade, são capazes de migrar para áreas lesadas, inflamadas ou mesmo para áreas tumorais. (Satija et al, 2007).
Diferentemente aos tratamentos farmacêuticos que proporcionam um único agente na dose específica, as CTMs são reguladas localmente e secretam fatores bioativos em concentrações variáveis em resposta aos sinais do microambiente. Além disso, a capacidade anti-inflamatória e imunomoduladora das CTMs, pode ser fundamental no restabelecimento de condições localizadas ou sistêmicas para a cura e a regeneração tecidual (Murphy et al, 2013).
O principal efeito trófico destas células deve-se à secreção de fatores de crescimento e citocinas que lhes conferem propriedades imunossupressoras, anti-apoptóticas, pró-angiogénicas e anti-fibróticas. Através de mecanismos parácrinos modulam o ambiente a ser regenerado por mecanismos imunomoduladores em resposta a moléculas inflamatórias como a interleucina-1 (IL-1), IL-2, IL-12, factor de necrose tumoral α (TNF-α) e o interferon-gama (INF-γ), secretando fatores de crescimento, proteínas anti-inflamatórias e proteínas mitogénicas e angiogênicas, tais como: TGF-α, TGF-β, HGF, EGF, FGF-2, IGF-1 (Caplan e Bruder, 2001; Ryan et al, 2007) e VEGF, IGF-1, EGF e angiopoietina-1 (Chen et al, 2008).
As CTMs eram identificadas por expressar HLA-I e exibir baixa imunogenicidade. Mais tarde, confirmou-se a sua capacidade de influenciar as funções do sistema imune nato e adaptativo incluindo células natural killer, monócitos, macrófagos, células dendríticas e linfócitos B e T. (Hao et al,2012).
Recentemente o perfil terapêutico das CTMs, se expandiu beneficiando-se das suas propriedades de entrega de biomoléculas, como veículos para genes em terapia gênica com grande capacidade para secretar naturalmente fatores que podem
ser usados no tratamento de rim, pulmão, coração, fígado, pâncreas, sistema nervoso, e doenças ósseas (D’Souza et al, 2015 ).
A alta plasticidade e capacidade de diferenciação, em adição à capacidade para migrar para os locais de lesão, inflamação ou para áreas tumorais, destacam o potencial destas células para uso em medicina regenerativa e engenharia de tecidos (Satija et al., 2007; chen et al, 2008).
2.2.2 Expansão in vitro de células-tronco mesenquimais destinadas à terapia
A maioria das aplicações clínicas das CTMs humanas para uso em terapias, engenharia de tecidos, medicina regenerativa e tratamento de doenças imunológicas e inflamatórias requerem uma fase de amplificação in vitro permitindo que um número clinicamente significativo destas células, sejam alcançados. Portanto inúmeros parâmetros devem ser avaliados, incluindo a densidade de plaqueamento das células, o número de passagens e o meio de cultura, seguindo normas para as boas práticas de manufatura (do inglês: Good manufacturing practice – GMP) (Sensebé et al, 2009; Shib e Burnouf, 2015).
As falhas no enxerto e a sobrevivência a curto prazo, são reconhecidos como as principais limitações relacionadas ao envelhecimento precoce, ao encurtamento dos telômeros, a perda de marcadores para citocinas durante a expansão ex vivo e a hiper-imunogenicidade das células contaminadas por componentes xenôgenos na cultura. Para minimizar estes problemas, a expansão ex vivo pode ser realizada em condições hipóxicas visto que as condições na cultura apresentam uma concentração maior de oxigênio do que o nicho natural destas células ( Shahdadfar et al, 2005) .Uma condição de cultura ideal envolve um ambiente hipóxico na cultura associado a meios livres de suplementos xenôgenos como o soro humano, fatores de crescimento ou o lisado de plaquetas.(Estrada et al, 2012; Haque et al, 2013).
2.3 Suplementos utilizados na cultura celular
2.3.1 Soro fetal Bovino (SFB)
Os meios basais utilizados para expansão são suplementados com vários nutrientes e fatores de crescimento. O padrão-ouro em escala laboratorial tem sido o soro fetal bovino (SFB), no entanto, a sua composição apresenta fatores de risco, uma vez que pode ser fonte de antígenos xenogênicos e infecções zoonóticas.
O SFB apresenta em sua composição mais de mil componentes diferentes, entre os quais hormônios, vitaminas, nucleosídeos, aminoácidos, lipídios, proteínas de transporte (albumina, globina, transferrina), fatores de ligação (fibronectina e laminina), fatores de estabilização, desintoxicantes, fatores de proliferação e fatores de crescimento. Além disso apresentam baixa quantidade de imunoglogulinas comparado a outros soros animais, o que contribuíram para a adoção do SBF como suplemento padrão na cultura celular (Valk et al, 2004).
Hofbauer et al (2014), descreve alguns aspectos críticos do uso do SFB, como a possível internalização de proteínas e príons xenogênicos. Algumas formas de terapia celular podem envolver múltiplas doses, o que gera uma preocupação com possíveis reações imunológicas causadas por proteínas derivada do soro. Em um ensaio realizado por Spees et al ( 2004), demonstrou-se que de 7 a 30 mg de proteínas do soro estão associadas com a preparação de 108 milhões de células, que
é a dosagem aproximada para uma aplicação clínica.
Riscos de infecção através de derivados de origem bovina, incluem a transmissão de viroses, como o vírus da diarréia bovina e o parvovírus, príons responsáveis pela encefalopatia espongiforme (que provoca a doença da vaca louca) em bovinos e a doença de Creutzfeldt-Jakob , em humanos (Hill et al, 1997).
O SFB pode apresentar uma grande variabilidade de lote para lote, durante o seu processamento, mesmo provindo de um único fabricante, o que altera substancialmente a qualidade e a concentração dos fatores que o compõem, influenciando diretamente na sua performance durante a cultura celular (Zheng et ai, 2006;Tonti, 2007).
Outra grande desvantagem do uso do SFB na cultura, refere-se ao método desumano de coleta do sangue do feto da vaca prenha. Em média, cerca de um milhão
de bezerros são mortos a cada ano para a colheita de 500.000 litros de SFB (Jockems et al, 2002; Van der Valk et al, 2004). Isto contradiz os principais objetivos da investigação in vitro da biomedicina, ou seja seria o oposto do conceito 3R: reduzir, repor e refinar (do inglês: reducing, replacing, and refining) o uso de animais para pesquisa e testes científicos. (Russel e Burch, 1959).
2.3.2 Alternativas ao soro fetal bovino na cultura
Meios isentos de soro não são capazes de promover o crescimento de CTMs na cultura, pela falta de fatores de crescimento e citocinas que induz a oscilações de cálcio intracelular e que são vitais para a proliferação e diferenciação das mesmas ( Foreman et al, 2006).
A expansão de CTMs in vitro é atualmente realizada com meios comercialmente disponíveis como o SFB ou mesmo fatores de crescimento processados por tecnologia recombinante (Sharma et al, 2014).
Diversos trabalhos, vem tentando otimizar meios de cultura derivados de sangue humano, como o soro autógeno e alógeno, plasma rico em plaquetas (PRP) e particularmente, lisados e produtos liberados de plaquetas, como suplemento no meio de cultura para o isolamento e expansão de CTMs a partir de várias origens de tecidos. (Gstraunthaler, 2003; Doucet et al, 2005; Schallmoser et al, 2007; Fekete et al, 2012; Chen et al, 2012; Jonsdottir-bush et al, 2013; Bernardi et al, 2013; Ludicone et al, 2014; Bieback et al, 2013; Sharma et al, 2014; Shib e Bournouf, 2015).
Várias alternativas de origem humana têm sido testadas na sua capacidade de sustentar a proliferação e diferenciação das células em cultura. O soro humano (Human serum-HS), é uma delas. Alguns estudos demonstraram que o uso de soro humano autólogo para a expansão de CTMs é viável, sem comprometer a capacidade de diferenciação ou alterar o imunofenótipo da sua superfície (Stute et al, 2004). Outros trabalhos demostraram que o soro autólogo humano, tem resultados semelhantes ao SFB (Spees et al, 2004). Em contrapartida, alguns autores concluíram que o SFB é superior na cultura quando comparado ao soro autólogo (Yamagushi et al, 2002).
Um estudo desenvolvido por Shahdadfar et al (2005), investigou se o soro humano autólogo ou alógeno poderia substituir o SFB na expansão in vitro de CTMs e constataram que a escolha do soro afeta diferentes parâmetros das células em cultura. Primeiramente, as CTMs proliferaram significativamente mais rápido com o soro autólogo do que com o SFB, mais em contrapartida, com o soro alógeno as CTMs pararam de crescer, entrando em morte celular. Em segundo lugar, as CTMs se diferenciaram mais rapidamente em SFB nas linhagens mesenquimais, em comparação ao soro autólogo. Curiosamente, a análise de microarray de todo o genoma, identificou várias transcrições envolvidas no ciclo e diferenciação celular que foram reguladas nas CTMs em SFB e no soro autólogo de maneira diferente. Por exempo, várias transcrições, incluindo alguns envolvidos na inibição do ciclo celular, foram reguladas positivamente em SFB em passagens tardias, mais para o soro autólogo, foi notadamente estável. Estes pesquisadores, concluíram que o soro autólogo , mesmo na ausência de fatores de crescimento, ajudariam na expansão de CTMs pela expressão de genes e perfil transcricional mais estáveis.
Um outro experimento, conduzido por Kurita et al (2008), avaliou três tipos de soro humano preparados a partir de sangue total (ST), plasma rico em plaquetas (PRP) e plasma pobre em plaquetas (PPP) a partir de amostras de sangue de 4 voluntários. Os autores investigaram os perfis bioquímicos do soro das 3 preparações bem como, o seu potencial como suplemento na cultura de 3 tipos de células humanas: fibroblastos de pele, CTMs de tecido adiposo e células tronco hematopoiéticas (CTHs) de cordão umbilical. Nos resultados, as contagens de plaquetas diferiram entre o soro de ST (100 %), PRP (75,1 %) e do PPP (12,6%), resultando em concentrações diferentes com relação ao fatores de crescimento, mais a contagem de proteína total e albumina foram semelhantes. O soro de ST e PRP aumentou a proliferação de fibroblastos em comparação ao PPP. Com relação às CTMs de tecido adiposo e CTHs do cordão umbilical não houve diferenças significativas na proliferação, nos 3 suplementos. Os autores concluíram que a origem da preparação do soro e o tipo de célula alvo do suplemento podem apresentar variações na cultura.
Ferro et al (2012), avaliou a proliferação, morfologia, expressão de marcadores relacionados com a pluripotência e a capacidade de diferenciação osteoblástica de CTMs de polpa dentária, utilizando como suplemento soro humano
autólogo numa concentração baixa de 1,25% em comparação ao SFB a 10%. Os resultados demostraram que as CTMs cultivadas no soro a 1,25% apresentaram alta uniformidade na expressão de marcadores de células-tronco, a proliferação foi estimulada e o potencial de diferenciação osteogênico foi semelhante ao do SFB a 10%.
Recentemente, tem sido proposto o Plasma rico em plaquetas (PRP) humanas, como um substituto ao SFB na expansão de CTMs. Os efeitos do PRP na reparação tecidual já vem sendo descritos por longas décadas na odontologia e na medicina regenerativa. Na cultura celular, comprovadamente o PRP promove a expansão de CTMs, aumentando a proliferação e a capacidade de formação de unidades formadoras de colônias (UFCs), além disso, resulta na manutenção do seu potencial de diferenciação osteogênico, condrogênico e adipogênico, sem compromentimento da sua capacidade imunossupressora. (Doucet et al, 2005). Nas dificuldades que envolvem o seu processamento, são citados dois aspectos: a dificuldade de remoção da membrana das plaquetas após as centrifugações que formam agregados que se aderem à superfície das CTMs e, à quantidade de leucócitos que estão presentes no PRP e que não são possíveis de remoção por centrifugação. (Chieregatto et al, 2001; Kocaoemer et al, 2007).
.D’Esposito et al (2015), utilizou o PRP para a expansão de CTMs de tecido adiposo humano, in vitro, e seus resultados demostraram que a viabilidade foi fortemente aumentada na presença de 5% até 20 % de PRP, e os níveis de IL-6, IL- IL-10, o VEGFe interferon-γ estavam significativamente aumentados nas CTMs.
Kocaoemer et al (2007), investigaram os efeitos de um pool de soro humano do tipo AB juntamente com PRP ativado por trombina para a expansão de CTMs de tecido adiposo em comparação ao SFB em uma cultura de longo prazo e, teve como resultados uma taxa de proliferação mais acentuada quando comparada à cultura expandida em SFB; a capacidade de diferenciação foi preservada durante toda a cultura e a imunofenotipagem foi característica para CTMs, com excessão de uma população que não evoluiú adequadamente e apresentou marcação positiva para CD14 e CD45 (marcadores de linhagem hematopoiética).
Finalmente, surgem alguns trabalhos que visam a lise das plaquetas tendo como alvo os fatores de crescimento presente nos seus grânulos. Doucet et al (2005),
foi o primeiro a descrever o uso de lisado de plaquetas humanas na expansão de CTMs e desde então, uma série de trabalhos tem sido descritos com lisados plaquetários autógenos e alógenos mostrando a sua eficiência na proliferação de vários tipos celulares (Doucet et al, 2005; Schallmoser et al, 2007; Fekete et al, 2012; Chen et al, 2012; Jonsdottir-bush et al, 2013; Bernardi et al, 2013).
Alguns protocolos recentes para expansão de CTMs tem evitado completamente o uso do SFB focando alternativas mais humanizadas, como as descritas com suplementos de origem humana. Quando vistos no contexto da pesquisa clínica, estes suplementos podem servir como alternativas mais baratas para expansão em larga escala de CTMs direcionados à terapias. (Tekkete et al, 2011).
2.3.3 Plaquetas humanas
As plaquetas são elementos sanguíneos anucleados provenientes de megacariócitos da medula óssea e medem aproximadamente de 2 a 4 µm de diâmetro, com uma média de vida útil de aproximandamente 7 dias no sangue circulante. (Harrison, 2005; Everts et al, 2006; Eyre e Gamli, 2010). O seu número varia normalmente entre 1,5 e 3 x 10⁵ plaquetas por milímetro cúbico de sangue (Everts et al, 2006). Segundo Batty e Smith (2010), as plaquetas possuem internamente, uma variedade de grânulos de armazenamento (grânulos alfa, grânulos densos e lisossomas), um anel de citoesqueleto rígido e contrátil, formado de actina e miosina, em torno de sua periferia; possuem mitocôndrias e um sistema tubular denso que serve para o armazenamento de cálcio, formado por membranas invaginadas que ficam em contato com os fluídos extracelulares. Em estado de repouso possuem formato discóide. Sua forma e tamanho pequeno permite que permaneçam deslocadas para a periferia dos vasos, estrategicamente colocadas para a manutenção da integridade vascular (Harrison,2005; Everts et al, 2006).
Após a sua ativação as plaquetas secretam mais de 300 substâncias ativas a partir de seus grânulos intracelulares. Os grânulos densos secretam substâncias que contribuem para a homeostase e a coagulação, mais também desempenham importante papel na metástase do câncer. Os α-grânulos contêm vários mitógenos, citocinas, fatores pro e antiinflamatórios e outras moléculas bioativas que são reguladoras essenciais do microambiente complexo do trombo durante a reparação
tecidual (Golebiewska et al, 2015). Seus grânulos são ricos em citocinas e fatores de crescimento, como o fator de crescimento derivado de plaquetas (platelet-derived growth factor- (PDGF); fator de crescimento fibroblástico básico ( basic fibroblast growth factor (FGF-b ); fator de crescimento epidermal (epidermal growth fator-EGF); fator de crescimento transformante β (transforming growth factor-β - TGF-β); fator de crescimento de hepatócitos (hepatocyte growth factor - HGF); fator de crescimento endotelial vascular (endothelial growth fator - VEGF); (fator de crescimento semelhante a insulina 1 (insulin-like growth factor-1 - IGF-1) e de várias outras moléculas imunológicas e de adesão . (Ng et al, 2008; Schallmoser and Strunk, 2013; Burnouf et al, 2016). Estes fatores podem ser liberados artificialmente promovendo a sua lise por congelamento/descongelamento (Schallmoser et al, 2006, sonicação Bernardi et al, (2013) ou tratamentos químicos (Copland et al, 2013), surgindo o lisado de plaquetas humanas (LP), como uma alternativa adequada ao SFB como suplemento no meio de cultura. (Bournouf et al, 2016)
As funções dos fatores de crescimento liberados pelos grânulos plaquetários, foram descritos por Everts et al, (2006), e estão relacionados a seguir:
TGFβ -Transforming Growth Factor-β ou fator de transformação do crescimento-β : estimula a proliferação de células-tronco mesenquimais indiferenciadas, regulam a mitogênesis de células endotelias, fibroblásticas e osteoblásticas, regula a síntese de colágeno e a síntese de colagenase, regula os efeitos mitogênicos de outros fatores de crescimento, estimula a quimiotaxia de células endoteliais e a angiogênese, inibe a proliferação de linfócitos e macrófagos.
bFGF - Basic Fibroblast Growth Factor ou fator de crescimento básico de fibroblastos: promove o crescimento e a diferenciação de condrócitos e osteoblastos; são mitogênicos para células mesenquimais, condrócitos e osteoblastos
PDGFa-b Platelet Derived Growth Factor ou fator de crescimento derivado de plaquetas a – b: são motogênicos para células mesenquimais e osteoblastos; estimula a quimiotaxia e motogênese de fibroblastos, células gliais e células musculares lisas, regula a secreção de colagenase e a síntese de colâgeno, estimula a quimiotaxia de macrôfagos
EGF - Epidermal Growth Factor ou fator de crescimento epidermal: estimula a quimiotaxia de células endoteliais e a angiogênese, regula a secreção de colágeno, estimula a mitogênese de células epiteliais e mesenquimais
VEGF Vascular Endothelial Growth Factor- VEGF ou fator de crescimento endothelial vascular : aumenta a angiogênese e a permeabilidade dos vasos, estimula a mitogênese de células endoteliais.
Figura 1 - Componentes contidos nos grânulos plaquetários.
Fonte: Burnouf et al ,20161
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1 Burnouf T, Strunk D, Koc MBC, Schallmoser K. Human platelet lysate: Replacing fetal bovine
2.3.4 Lisado de plaquetas humanas
Inúmeros trabalhos já demostraram a eficiência do lisado de plaquetas humanas na cultura celular, como um substituto ao SFB. Vários deles, foram realizados tentando desenvolver e padronizar protocolos de acordo com as Boas Práticas de Manufatura (Good Manufacturing Practice –GMP) para a expansão de CTMs sem alterações em suas características fenotípicas e funcionais (Doucet et al 2005; Bernardo et al 2007; Schallmoser et al 2007; Bieback et al 2009; Fekete et al 2012;. Hemeda et al 2014; Warnke et al. 2013).
O lisado de plaquetas geralmente é preparado a partir de concentrados plaquetários, e a sua preparação envolve a ruptura mecânica ou química para a remoção da membrana das plaquetas. O fibrinogênio é coagulado e separado por centrifugação e microfiltração da suspensão líquida que contém o lisado. O método mais comunmente utilizado para a ruptura envolve ciclos repetidos de congelamento/resfriamento.(Tekkette et al, 2011).
Várias populações de células humanas, incluindo as células epiteliais e tronco-mesenquimais (a partir de sangue do cordão umbilical, tecido adiposo, medula óssea e sangue periférico), monócitos, células endoteliais, queratinócitos, células tumorais, condrócitos, fibroblastos e hepatócitos foram usadas para testar o efeito estimulante sobre o crescimento de derivados de plaquetas in vitro. (Baik et al, 2014;. Barsotti et al, 2013; Bernardi et al, 2013; Hofbauer et al, 2014).
Outros trabalhos, demonstraram que o lisado de plaquetas, pode substituir totalmente o SFB na cultura, tanto para células em suspensão, como para células que se aderem ao plástico. (Johansson et al., 2003). Recentemente, alguns resultados de Schallmoser e Strunk (2013), demostraram que o lisado de plaquetas humanas é altamente eficiente para a cultura de células progenitoras mesenquimais humanas e células progenitoras endoteliais, mesmo quando utilizado na concentração de 5%.
Jonsdottir-Buch et al (2013), realizou um estudo comparativo para avaliar o efeito do lisado de plaquetas processados a partir de concentrados plaquetários (CP) expirados, plaquetas frescas e o tradicional SFB na cultura de CTMs e demostrou que as características básicas destas células não foram afetadas com relação à expressão de antígenos de superfície, potencial de diferenciação em trilinhagens e a capacidade imunomodulatória, no entanto, o lisado promoveu
mudanças na sua morfologia, um significativo aumento da proliferação e elevados níveis na expressão de RUNX-2 na diferenciação osteogênica. Portanto, concluiú que o uso de plaquetas expiradas para fins transfusionais representam um substituto para o SFB para a diminuição de riscos de contaminação por agentes patogênicos e reações imunológicas a proteínas xenogênicas. Além disso, a utilização de concentrados plaquetários expirados é livre de implicações éticas, não competindo com pacientes que necessitam de transfusões. Um outro fator destacado pelo autor é a diminuição dos custos na cultura, á que as plaquetas normalmente seriam descartadas como resíduos nos departamentos de processamentos de sangue.
Dumont e Vanderbroeke (2003), em um trabalho para avaliar alguns parâmetros relativos à estocagem de bolsas de plaquetaféreses por até 7 dias visando ampliar o seu uso para efeitos transfusionais, 24 bolsas com número variado de plaquetas foram mantidas à temperatura ambiente e sob agitação constante. Observou-se um declínio gradual nos constituintes plaquetários através dos 7 dias semelhante às de 5 dias, embora as funções metabólicas das plaquetas foram mantidas e a média do pH em torno de 6,2 a 22⁰C. Os pesquisadores concluíram que a lenta redução na sobrevivência das plaquetas com 7 dias de estocagem foi relativa às de 5 dias, mantendo-se funcionalmente adequadas para efeitos transfusionais.
Figura 2 – Processamento do soro fetal bovino e do lisado de plaquetas
Fonte: Hemeda et al, 20142
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2Hemeda H, Giebel B, Wagner W.Evaluation of human platelet lysate versus fetal bovine
2.3.5 Efeito do Lisado de plaquetas nas células-tronco mesenquimais Alguns estudos, confirmam que o LP na concentração de 5% é suficiente para o aumento da taxa de proliferação e o potencial de diferenciação multilinhagem de CTMs de polpa dentária (Chen et al, 2012) e o aumento da diferenciação osteogênica in vitro e in vivo ( Govindasamy et al, 2011). No entanto, Categnaro et al, (2011) estabelece a concentração de 10% como a ideal para a proliferação, capacidade de diferenciação e expressão de marcadores de membrana em CTMs derivadas de tecido adiposo. Outros autores, também utilizaram o lisado para a expansão de CTMs na concentração de 10% (Copland et al, 2013).
Para avaliar o efeito do LP provindo de plaquetas de doadores em várias faixas etárias, Lohmamm et al (2012), relataram que a idade do doador não afetava a capacidade de formação de unidades formadoras de colônias (UFCs) nem a diferenciação adipogênica in vitro de CTMs de medula óssea, mais a diferenciação osteogênica foi diminuída quando os doadores tinham idade mais avançada.
Capland et al (2013), levantaram a hipótese de que o LP poderia afetar as propriedades imunossupressoras das CTMs, devido ao fibrinogênio contido no plasma sanguíneo afetando negativamente a função imunosupressora destas células. Para testar esta hipótese pools de plaquetas oriundas de plaquetaféreses vencidas, foram submetidas a um processo de coagulação controlada por temperatura para a obtenção de um lisado emprobrecido de fibrinogênio. Esta depleção, não afetou as propriedades mitogênicas do LP, nem o conteúdo dos fatores de crescimento e foi menos propenso à formação de precipitados ao longo do tempo, na cultura. Para o lisado do controle (sem a depleção de fibrinogênio), destacou que esta proteína do plasma interagiú diretamente com as CTMs, com aumento da dose-dependente na produção de IL-6, IL-8 e MCP-1, no comprometimento da capacidade de regulação da indoleamina 2,3 dioxigenase (IDO) e a supressão na proliferação de células T.
Horn et al (2010), comparou a atividade de vários lisados individuais, visto que a maioria dos trabalhos que envolvem este suplemento, são provenientes de pools previamente processados. O estudo envolveu a comparação entre os lisados com relação a sua eficiência na formação de unidades formadoras de colônias (UFCs), proliferação e diferenciação in vitro em cultura de longo prazo. Os dados foram correlacionados com perfis das citocinas dos lisados. Em seus resultados
descreveram que a frequência de UFCs, morfologia das colônias, imunofenotipagem e potencial de diferenciação adipogênica foram semelhantes quando comparadas às CTMs expandidas em SFB. No entanto, a diferenciação osteogênica foi mais acentuada nos LPs. Havia significativas diferenças na proliferação de CTMs expandidas em LPs diferentes, mais em todas as amostras foi sempre maior em comparação ao FBS. O crescimento celular foi correlacionado com a concentração do PDGF- e uma associação mais moderada com a contagem das plaquetas. Todos os LPs suportaram a expansão por até 20 PDs (Population doublings). O autor conclui que, apesar dessas variações na eficiência dos LPs individuais, a utilização de lisados autólogos para expansão de CTMs destinadas à terapias, é viável.
O LP tem sido considerado uma alternativa muito eficaz na cultura de CTMs para uso em terapia, sem o risco de infecções ou derivados xenogênicos. No entanto, em contraste ao SFB, o LP contém plasma e anticoagulantes como a heparina, para prevenir a coagulação do meio ou formação de gel. Hemeda et al, (2013), avaliou culturas de CTMs em meios suplementados com várias concentrações de HNF (heparina não fracionada) e a heparina de baixo peso molecular - HBPM (enoxaparina). As culturas foram comparadas quanto ao potencial de diferenciação, frequência de unidade formadora de colônias (CFUs), imunofenotipagem e diferenciação in vitro. Os resultados demonstraram que somente 0,61 UI / ml de HNF ou 0,024 mg / mL de HBPM era necessária para a prevenção da coagulação dos meios suplementados com LP, neste estudo. Concentrações mais elevadas prejudicaram a proliferação celular de um modo dependente da dose, mesmo sem a adição do álcool benzílico, o qual é geralmente adicionado à heparina como agente bacteriostático. A frequência de CFUs também foi dimimuindo conforme o aumento das concentrações de heparina, especialmente com HBPM, enquanto que nenhum efeito significativo foi observado na morfologia celular ou imunofenotipagem. Altas concentrações de heparina reduziram a diferenciação in vitro para a adipogênica e osteogênica.
As propriedades imunomoduladoras e regenerativas das CTMs são limitadas pela perda da auto renovação e plasticidade celular associados à expansão ex vivo e a exposição de fatores xenôgenos, quando expandidas em SFB, aumentando a sua imunogenicidade. Griffiths et al (2013) comparou por até 16 passagens CTMs cultivadas em meios suplementados com LP e SFB, com relação
ao tamanho das células, PDT (Population doubling time) e imunofenotipagem, um ensaio de senescência pela expressão endôgena da β galactosidase. Os meios suplementados com o SFB foram gradualmente sendo trocados pelos meios contendo LP. Como resultados, os pesquisadores observaram que as culturas que tiveram seu resgate mais cedo (até a 5ª passagem) do SFB para o LP, tiveram uma proliferação maior com a diminuição do PDT (population doubling time) quando comparadas com as células que permaneceram no SFB,tamanho de células menores sem alterações na imunofenotipagem. E um número menor de células coradas pela β galactosidase.
2.3.6 Efeito do lisado de plaquetas na morfologia das células-tronco- mesenquimais
O acompanhamento da morfologia celular permite avaliar a ausência de contaminação cruzada, detecção de sinais de deteriorização como granulação acentuada ao redor do núcleo, aumento de vacuolos citoplasmáticos, perda da morfologia típica fibroblastóide, com arredondamento das células e descolamento do subtrato. Esses sinais implicam que a cultura pode estar sofrendo de inadequação ao meio de cultura, ao suplemento utilizado, contaminação microbiana, senescência ou inicio de apoptose.( Freshney, 2006).
Jonsdottir-bush et al, (2010) quando comparou o efeito do LP oriundas de plaquetas expiradas e plaquetas frescas em relação ao SFB, em CTMs de medula óssea, avaliou regularmente a morfologia destas células. As suas observações, revelaram que a morfologia era dependente do suplemento utilizado na cultura de células. A característica típica fibroblastóide de CTM quando cultivadas em meio suplementado com LP, foram ainda mais fusiformes e alongadas com corpos celulares densos, quando comparadas às cultivadas em SFB. Além disso, houve diferenças no comportamento de crescimento das mesmas. As CTMs cultivadas em LP cresciam de uma maneira que deixava áreas circulares livre de células ao contrário do SFB. O autor sugere que este fato pode estar relacionado à serotonina armazenada nas plaquetas, que é sabidamente conhecida por afetar a morfologia celular de células neurais e causar vasoconstrição em células endoteliais. Uma explicação para isto seria que existem indicações de que CTMs residem como pericitos no interior da vasculatura e podem ser afetados pelos níveis de serotonina presente no LP,
provocando mudanças na sua morfologia que resulta na contração das células (Daubert e Condron, 2010).
Govindasamy et al (2011), durante a expansão in vitro de CTMs de polpa dentária em LP em comparação ao SFB, observou que as células em contato com o lisado apresentavam-se pequenas e fusiformes e ocorriam várias regiões em sobreposição com células altamente densas (overlaping), quando comparadas às células expandidas no SFB que pareciam mais esparçadas.
