(b) 1A SFB 1A LP
Population Doubling
*
*
*
*
50 40 30 20 10 0 2A SFB 2B LP SFB passagens 5 4 3 2 1 0 (c)
Gráfico 8 –
Population Doubling Time
50 40 30 20 10 0 Tempo (h) passagens 2A SFB 2B LP SFB (d)
*
*
*
*
Na sequência, estão relacionados o (e) PD e o (f) PDT das amostras 3B LP em relação à amostra 3A SFB ( *p< 0,05 na comparação dos dois suplementos, por passagem).
Population Doubling
5 4 3 2 1 0 n⁰ de PDs*
*
(e)
5. 5 Análise do cariótipo das células-tronco de polpa dentária expandidas em LP e SFB
A análise citogenética das CTMs de polpa dentária foram realizadas para todas as amostras: 1A SFB, 1B LP, 2A SFB, 2B LP, 3A SFB e 3B LP ,na quinta passagem, pela técnica de bandeamento GTG, e revelou que houve a manutenção do cariótipo diplóide 46 XX ou 46 XY ,após 20 metáfases avaliadas. Os resultados não evidenciaram nenhuma anormalidade no padrão cromossômico das células expandidas no lisado de plaquetas (LP) e nem no soro fetal bovino (SFB). A amostra 3B LP, durante a análise, apresentou um marcador em 1 metáfase, por isso, extendeu- se as análises para 32 metáfases que se apresentaram normais, descartando o aparecimento de aneuploidias (Figura 18).
Population Doubling Time
50 40 30 20 10 0 Tempo (h)
*
*
*
(f)Figura 18 - Análise citogenética de CTMs de polpa dentária, na quinta passagem. Observa-se um cariótipo normal para todas amostras: 1A SFB e 1B LP (46, XY); 2A SFB e 2B LP (46,XX); 3A SFB e 3B (46, XY).
1A SFB - 46,XY – Padrão 400/600 bandas – 20 metáfases
1B LP - 46,XY – Padrão 400/600 bandas – 20 metáfases
2B LP - 46,XX – Padrão 400/600 bandas – 20 metáfases
3A SFB - 46,XY – Padrão 400/600 bandas – 20 metáfases
3B LP - 46,XY – Padrão 400/600 bandas – 32 metáfases
5.6 Análise da morfologia das células-tronco de polpa dentária expandidas em LP e SFB
As CTMs expandidas no LP, mantiveram a morfologia típica fibroblastóide igualmente às do SFB, para todas as amostras: 1A SFB, 1 B LP, 2A SFB, 2B LP, 3A SFB e 3ª LP. Na fase log (60% de confluência) observou-se na cultura algumas células menores e
mais arredondadas nas amostras que correspondem ao LP e outras densamente sobrepostas (Overlapping), quando comparadas as células mais esparçadas no SFB (Figura 19).
Figura 19- Fotos de microscopia (10x) CTMs de polpa dentária na quinta passagem com 50 % de confluência (4 dias após o plaqueamento), das amostras : 1A SFB e 1B LP. 1A SFB- 10X 1B LP – 10X CTM P.5 CTM P.5
6 DISCUSSÃO
Derivados de plaquetas vêm sendo utilizados, há décadas, em diversas áreas da saúde, devido a seus inúmeros grânulos que desempenham um papel fisiológico importante na hemostasia corporal e na reparação de tecidos, fundamentando o seu uso em vários campos da medicina regenerativa. Alguns derivados, como o plasma rico em plaquetas (PRP), são descritos em aplicações clínicas em cirurgia buco-maxilo facial, ortopedia e cirurgia plástica. Em seus grânulos, ficam armazenados inúmeros fatores de crescimento e potentes mediadores bioativos, que o tornaram alvo de pesquisas direcionadas para o seu uso como suplemento na cultura de células destinadas à terapia celular.
O campo da terapia celular para a cura ou tratamento de diversas doenças expandiu-se à medida que células progenitoras multipotentes como as CTMs vêm sendo testadas e manipuladas fora do seu nicho natural, para uma melhor compreensão da natureza das mesmas e das suas inúmeras propriedades in vitro e in vivo como a capacidade de proliferação, diferenciação em múltiplas linhagens e funções imunomoduladoras. A necessidade da sua expansão in vitro para fins terapéuticos exigem um maior conhecimento do comportamento destas células quando submetidas a diferentes condições na cultura, entre elas, o suplemento que irá ser utilizado. O uso estandardizado do soro fetal bovino (SFB) na cultura celular, trouxe preocupações à comunidade científica desde que células com fins terapêuticos foram expandidas in vitro para uso em ensaios clínicos (Lazarus et al, 1995), devido à possibilidade da transmissão de patógenos, como endotoxinas, micoplasma, vírus e proteínas (príons).
Diversos trabalho tem utilizado o lisado de plaquetas humanas (LP) em substituição ao soro fetal bovino (SFB) como suplemento no meio de cultura, durante a expansão de células destinadas à terapia, em condições isentas de componentes xenógenos. Os diferentes protocolos para o seu processamento, descritos na literatura, demonstram que ainda existem dúvidas sobre qual o protocolo mais apropriado para torná-lo um suplemento eficaz na cultura celular.
Neste trabalho, 6 protocolos diferentes foram testados em cultura, mais apenas 2 deles foram capazes de sustentar a expansão de CTMs de polpa dentária, quando comparados ao SFB. São eles o LP4 e o LP6. Alguns fatores interferiram na
eficácia de alguns dos lisados, a principal delas, era a coagulação do meio de cultura quando o lisado era adicionado e levado à estufa a 37ºC. Desta maneira, as células cresciam normalmente no meio coagulado, mais sem aderir-se à placa de cultura, em uma dimensão 3D semelhante a um gel o que impedia a sua tripsinização para a repicagem das mesmas.
O concentrado de plaquetas pode ser obtido tanto de uma doação de sangue da maneira convencional (sangue total), quanto pela doação por aférese (plaquetaférese), onde o sangue é retirado do braço do doador, passa por um circuito- extra corpóreo, e através de uma centrifugação o componente desejado é drenado para uma bolsa de coleta e os demais componentes vão retornando continuamente ao doador. A quantidade de plaquetas contidas nas bolsas de plaquetaféreses são muito maiores do que as do sangue total.
O LP1 que foi processado a partir de bolsas de CP de sangue total, foi reproduzido a partir de protocolos descritos por Lohmann et al (2011), Govindasamy et al (2011), Kolle et al (2013) e Jonsdottir-Bush et al (2013), onde a lise dos grânulos plaquetários deu-se por choques térmicos (ciclos de congelamento/resfriamento). Este choque foi realizado diretamente nas bolsas, para prevenir a contaminação durante a manipulação das mesmas, o que trouxe alguma preocupação, visto que as plaquetas são armazenadas em bolsas plásticas especiais, que permitem a troca de gases com o meio durante o seu armazenamento a 22⁰C sob agitação constante. Somente após os ciclos, as bolsas foram aliquotadas e processadas. Ao fim das centrifugações para remoção dos restos de membrana das plaquetas, não foi possível a filtração por pressão negativa com filtro 0,22 µm, devido à formação de alguns restos de fibrina, portanto ela foi realizada com filtro 0,22µm acoplado à seringa plástica. A heparina utilizada foi a HNF (heparina não fracionada 5000 UI) cujo mecanismo de ação se processa pela ligação com a anti-trombina III aumentando a sua afinidade pela trombina (fator IIa) e o fator X ativado (Xa). Durante os ensaios com CTM para avaliar este lisado, constatou-se que as alíquotas conservadas a - 22⁰C, quando descongeladas para adicionar-las ao meio de cultura, apresentavam grumos de fibrina, mesmo assim, uma nova filtração foi realizada antes da sua adição ao meio. Após 24 h, as placas que foram suplementadas com este lisado coagularam na sua totalidade, por isso foi descartado em testes posteriores.
A partir do LP2, todos os lisados foram processados a partir de bolsas de plaquetaféreses. O LP2 e o LP3 foram testados no mesmo ensaio, e preparadas igualmente, variando apenas na concentração da heparina. Diferentemente ao LP1, foi feito um pool das bolsas antes do seu processamento. O número de ciclos de congelamento/resfriamento e centrifugações foram aumentados com relação ao LP1. A heparina utilizada foi a heparina de baixo peso molecular (HBPM) enoxaparina. Para o LP2 foi utilizado a concentração de 2UI/ml (Doucet et al, 2005; Horn et al, 2010 e Govindasamy et al 2011) e para o LP3 a concentração recomendada por Hemeda et al (2013), que propõe a adição de 0.024 mg/mL de HBPM para prevenir a coagulação do LP. O autor relata que concentrações mais elevadas podem prejudicar a proliferação celular, podendo ocorrer redução no número de unidades formadoras de colônias (UFCs) e redução na diferenciação in vitro de CTM para adipogênica e osteogênica. Nos nossos resultados a baixa adição de heparina implicou na gelatinização do meio de cultura. O LP2 apesar de não gelatinizar formou grumos no meio durante a cultura, numa quantidade menor quando utilizada na concentração de 5%. Por esse motivo, o LP2 na concentração mais baixa, foi testada novamente em ensaios posteriores.
Partindo da dificuldade para processar um lisado que não sofre-se gelatinização, resolveu-se tentar um método que envolvia a remoção de todo o plasma por centrifugação e a ressuspensão das plaquetas em soro fisiológico a 0,9% (Rauch, 2011), visando remover proteínas plasmáticas envolvidas na coagulação, como o fibrinogênio. Apesar de não ocorrer a gelatinização dos meios suplementados com o LP4 5% nem a formação de grumos, e ter a sua eficiência semelhante ao SFB 10% nos ensaios, nao teve como padronizar o seu processamento, pois após a centrifugação para a remoção do plasma e da camada eritrocitária formada no fundo do tubo, não havia parâmetros para recolher sempre a mesma quantidade de plaquetas, já que o pellet ainda ficava com um resíduo de plaquetas juntamente com os eritrócitos. No trabalho descrito por Rauch, a contagem das plaquetas foi realizada por contador automático (CASY® Technology Model TT -Innovatis AG, Bielefeld, Germany). No nosso experimento, mesmo após diluições seriadas, não foi possível a contagem das plaquetas, pois fora do plasma elas tentem a se agregar, impossibilitando a sua contagem pelo método com o uso de hemocitômetro.
O LP5 que também foi testado neste trabalho, envolveu a depleção do fibrinogênio do plasma. (Luzzani et al, 2015) por calcificação com CaCl2 a 10 mM, o
que não foi suficiente para evitar a gelatinização do meio de cultura. A gelatinização do meio, pode ter ocorrido, porque a enoxaparina foi adicionada após a calcificação, e a incubação feita em banho maria a 37⁰C e não na estufa. Junto com o ensaio para o LP5, testou-se novamente o LP2 5% e concluímos que este lisado ao final de 4 dias não manteve a curva de crescimento populacional na cultura de CTMs de polpa dentária humana, comparado ao SFB 10%.
O LP6 que teve a depleção do fibrinogênio do plasma com CaCl2 a 20
mM, antes do seu processamento, as bolsas eram congeladas a -20⁰C e deixadas a 4⁰C por 3 horas antes de serem aliquotadas em tubos, através de um congelamento controlado (Copland et al, 2013), até chegar numa textura ideal semelhante a de um “sorvete derretido” e imediatamente levados a -80⁰C para os ciclos de congelamento/resfriamento para a lise das plaquetas, sendo isto, o ponto crítico da preparação. Pequenas varaiações, nesta fase resultaram na gelatinização do lisado. Após o teste deste lisado através dos ensaios descritos no trabalho, verificamos que o LP6 funcionou eficientemente na expansão de CTMs de polpa dentária. Não houve gelatinização do meio de cultura na estufa, mesmo após a troca dos meios. A proliferação celular foi superior quando comparada ao SFB 10%. Ao final de 5 dias o poço suplementado com o LP6 10% já estava confluente.
Com o resultado positivo destes experimentos, o lisado preparado para os ensaios seguintes com as CTMs de polpa dentária, foram processados como descritos para o LP6. Daí por diante, chamados de apenas LP. Como as bolsas foram processadas separadamente, um pool deste lisado, foi realizado antes dos ensaios. O teste de endotoxina foi negativado para o pool, igualmente ao lote do SFB utilizado neste trabalho.
A expansão destas células demostraram que após 5 passagens, as amostras (n = 3) plaqueadas a uma densidade inicial de 1 x 10ᶾ células por cm², atingiram um population doubling level (PDL) de 17,9 a 19,4 para as CTMs expandidas em SFB e de 19 a 22,8 para as do LP, considerando o limite máximo descrito por Hayfflick (1965) para as células diplóides humanas de 50 PDs (+/-10),
quanto elas se tornam senescentes e param de proliferar. Nestes resultados não se incluem o número de PDs durante a expansão clonal, considerado como P.0.
Nas diferenciações in vitro das CTMs de polpa dentária expandidas em LP e SFB, para a diferenciação osteogênica, observou-se a coloração intensa por corante Alizarin red que cora depósitos de cálcio sintetizados por osteoblastos, comparado a seus controles. Para a diferenciação adipogênica, evidenciou-se gotículas de gordura esperadas para todas as amostras, em comparação a seus controles. Para a diferenciação condrogênica, utilizou-se a cultura de micromassa (Zhang et al, 2010) o que impossibilita a fixação e preparação histológica do pellet formado, devido a seu mínimo tamanho. Na coloração com Alcian blue, podem ser observados proteoglicanos corados em azul, secretados pelo condroblastos (que não ficaram evidentes nas imagens de microscopia). Os resultados das colorações foram compatíveis com imagens de diferenciações de CTMs de polpa dentária em vários trabalhos, demostrando que o LP como suplemento no meio de cultura para a expansão de CTMs de polpa dentária não afetou a capacidade multipotencial destas células, quando comparadas às do SFB. (Gronthos et al, 2002; Laino et al, 2005; d'Aquino et al, 2007; Otaki et al, 2007; Yu et al, 2007; Gandia et al, 2008; Huang et al, 2008; Karaoz et al, 2010).
Para as caracterizações por imunofenotipagem, os histogramas demostram a expressão das moléculas de superfície CD90 (proteína ancorada em GPI) e CD73 (ecto-5’-nucletidase), que são marcadores altamente expressos em CTMs. Os marcadores CD34 (marcador de célula-tronco hematopoiética primitiva), e CD 45(tirosina fostase), são marcadores da linhagem hematopoiética e são negativadas em CTMs (Dominici et al 2006; Karaoz et al, 2010, Li et al, 2011), conforme nossos resultados (Tabela 8). O CD19, marcador de células linfóides do tipo B e o HLA-DR (antígeno leucocitário humano), receptor de monócitos e macrófagos do compiexo de histocompatibilidade tipo II (MHC II), foram negativadas.
O ensaio de Population doubling time (PDT), demonstrou através de algumas passagens (da 2ª a 5ª) que o LP estimulou a proliferação das CTMs de polpa dentária mostrando a média de PDT para a amostra 1A SFB de 41,8h ( +/-1,39) para um PD de 3,4 comparado com a amostra 1B LP de 34,6h (+/- 1,22) para um PD de 4,2. A média de PDT da amostra 2A SFB foi de 38,7h (+/- 0,7) para um PD de 3,6
comparado com a amostra 2B LP de 34,2h (+/-0,9) para um PD de 4,2. Finalmente, o PDT da amostra 3A SFB apresentou uma média de PDT de 38,8 (+/-0,06) e um PD de 3,6 comparado com a amostra 3B LP de 36h (+/-0,44) e um PD de 3,6. Trabalhos como o de Gotimpamula et al, (2012) apresentam resultados semelhantes ao nosso neste ensaio, o que fundamenta a superioridade do LP com relação ao potencial mitogênico deste suplemento durante a expansão de CTMs em comparação ao SFB. (Govindasamy et al, 2011; Jonsdottir et al, 2012).
A cariotipagem das amostras, realizado pela técnica de bandeamento GTG, mostrou que houve a manutenção do cariótipo diplóide, na quinta passagem e das 20 metáfases avaliadas, só a amostra 3 B apresentou um marcador, o que gerou dúvidas se poderia ser um artefato de preparo, por isso, extendeu-se para 32 as metáfases avaliadas, que se apresentaram normais, descartando-se o aparecimento de aneuploidias. Estes resultados estão de acordo com resultados apresentados por Govindasamy et al, (2010) que demostraram que o cultivo prolongado in vitro de CTMs de polpa dentária, tiveram uma alta taxa de proliferação e não demonstraram qualquer anormalidade, após 9 passagens. O ponto crucial descrito pelo pesquisador foi a densidade de plaqueamento, em torno de 800 a 1000 células por cm² de área para alcançar melhores resultados na cultura; a mesma densidade que foi utilizada nos experimentos deste trabalho. Resultados conflitantes, como os trabalhos descritos por Stultz et al, (2015) e Bochkow et al, (2007) mostram a necessidade de uma análise aprofundada sobre o perfil genético de células destinadas a terapia, pelas variações genéticas e epigenéticas que podem se apresentar na cultura (Binato et al, 2013). Estas variações, como a diminuição de anormalidades cromossômicas através das passagens, descritas por Stultz et al, (2015), refletem a seletividade da cultura durante a expansão de CTMs. Nossos resultados, estão de acordo com o sugerido pela Sociedade Internacional para Terapia Celular (International Society for Cellular Therapy-ISCT), de que a presença de 2 metáfases anormais idênticas de 20 examinadas, seriam o limite para exclusão do uso clínico de CTMs (Barkholt et al, 2013).
A análise morfológica das CTMs da polpa dentária expandidas em LP demonstrou características semelhantes aos descritos por Govindasamy et al (2011), na qual as células preservavam seu formato fibroblastóide mas ocorria a presença de células arredondadas em maior quantidade do que nas placas do SFB.
7 CONCLUSÃO
O LP padronizado neste trabalho, processado a partir de bolsas de concentrados plaquetários humanos expirados, pode se tornar um suplemento eficiente para a expansão de CTMs de polpa dentária, aumentando a sua proliferação in vitro sem alterações no seu potencial de diferenciação, características morfológicas, imunofenotípicas e cariotípicas.
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