UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
CARLOS KIYOSHI KATASHIMA
CARACTERIZAÇÃO DA S-NITROSAÇÃO DOS FATORES DE TRANSCRIÇÃO FOXO1/FOXO3A EM MÚSCULO ESQUELÉTICO EM DIFERENTES MODELOS
EXPERIMENTAIS DE ATROFIA
Campinas 2016
CARLOS KIYOSHI KATASHIMA
CARACTERIZAÇÃO DA S-NITROSAÇÃO DOS FATORES DE TRANSCRIÇÃO FOXO1/FOXO3A EM MÚSCULO ESQUELÉTICO EM DIFERENTES MODELOS
EXPERIMENTAIS DE ATROFIA
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Clínica Médica da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas como requisito parcial para obtenção de título de Doutor em Ciências, área de concentração Clínica Médica.
ORIENTADOR: PROF. DR. EDUARDO ROCHETE ROPELLE
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELO ALUNO CARLOS KIYOSHI KATASHIMA, E ORIENTADO PELO PROF. DR. EDUARDO ROCHETE ROPELLE.
Campinas 2016
BANCA EXAMINADORA DA DEFESA DE DOUTORADO
CARLOS KIYOSHI KATASHIMA
ORIENTADOR: PROF. DR. EDUARDO ROCHETE ROPELLE
MEMBROS:
1. PROF. DR. EDUARDO ROCHETE ROPELLE
2. PROFA. DRA. ANGÉLICA ROSSI SARTORI CINTRA
3. PROF. DR. ADELINO SANCHEZ RAMOS DA SILVA
4. PROF. DR. DENNYS ÉSPER CORREA CINTRA
5. PROF. DR. JOSÉ RODRIGO PAULI
Programa de Pós-Graduação em Clínica Médica da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas.
A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros da banca examinadora encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.
DEDICATÓRIA
Dedico esta obra aos meus amáveis e eternos pais Kuniaki Katashima, Alice Conde e a *Isis Guimarães (*em memória) que cuidaram e doaram incondicionalmente seu sangue e suor em forma de amor por mim.
Aos meus irmãos Claudia Keiko e Fabiano Senji a ligação eterna de amor e amizade para a vida.
A minha amada Amanda Cerávolo que deu sentido do verdadeiro amor em minha vida...
AGRADECIMENTOS
Deus é a fé que possuo em meu coração que me contemplou com a vida! Agradeço pelas pessoas que colocou em meu caminho que me inspiram, me apoiam, me amam e encorajam ser cada dia melhor.
Aos meus maravilhosos tios Mauro e Elisa que sempre me deram atenção, carinho e preciosos conselhos. O meu agradecimento ao Maurício, Priscilla e Thaís amáveis primos-irmãos pilares importantes de toda a minha jornada.
Ao Professor Dr. Eduardo Rochette Ropelle o meu apreço e admiração, pela competente orientação, compreensão e grande desprendimento em dividir seu conhecimento, além da amizade.
Aos Professores Drs. Dennys Cintra e Rodrigo Pauli agradeço pela oportunidade que me apresentaram de ver a ciência através de um outro olhar.
Professor Dr. José Barreto agradeço por abrir as portas de seu laboratório para que eu pudesse produzir ciência de forma singular.
Queridos ``Mestres´´ Vagner Ramon, Luciene Lenhare, Gustavo Pimentel, Thayana Micheletti, Érico Lins, Carla Bueno e amigos Juliana Alves, Maria Carolina Mendes, Rodrigo Marin e Daiane Sofia manifesto o meu carinho e gratidão pelo laço de alegria que dividimos em memoráveis jornadas que passamos juntos.
À Sandra Brambilla, profissional responsável do laboratório de oncologia molecular pela contribuição técnica e amizade.
Ao Professor Dr. Mário Saad e profissionais do Laboratório de Investigação Clínica de Resistência à Insulina (LICRI) Dioze, Andrey e Jósimo pela colaboração e por toda a estrutura oferecida para que pudesse realizar minhas atividades no laboratoriais. Em memória ao sr. Lu, um dos profissionais mais dedicados que tive o privilégio de conhecer.
Agradeço aos amigos do LaBMEx - FCA Limeira pelos e subsídios que sempre forneceram de forma atenciosa.
A técnica do CEMIB Érica, e do núcleo de medicina experimental Srs. Zé, Antônio e Marino agradeço pelas solicitações que prontamente eram atendidas.
Aos queridos alunos e atletas do Clube Jundiaiense e Romão de Souza, além do Grão-Mestre Salvador Rodrigues que me ensinaram através do Taekwondo a encarar todos os meus adversários com cortesia, integridade, perseverança, auto-controle e espírito indomável.
Agradeço às agências de fomento: Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia (INCT) e Obesity and Comorbidities Research Center (OCRC).
E todos que contribuíram de alguma forma para meu crescimento, e por terem compreendido minhas ausências, mostrando que eu era capaz de superar todos desafios.
EPÍGRAFE
``A vida sem ciência é uma espécie de morte´´ Sócrates
RESUMO
A atrofia é um fenômeno clínico complexo que ocorre no músculo esquelético como resultado de uma multiplicidade de causas como danos às conexões neurais, inflamação, estresse oxidativo, desuso dentre outros. Coletivamente, a perda da massa muscular possui estreita relação com uma variedade de condições fisiopatológicas que interferem na qualidade de vida em pacientes com câncer, sepse e diabetes mellitus tipo1 (DM1) (1-3). Recentes achados sublinham o papel central dos fatores de transcrição da família Forkhead Box subgroup O (FoxO) na regulação da massa muscular. Durante o estado de catabolismo muscular, esses fatores são translocados para o núcleo celular e iniciam a transcrição de moléculas relacionadas à proteólise muscular como a muscle-specific RING finger protein 1 (MuRF-1) e atrogin-1/muscle atrophy Fbox protein (Atrogin-1/MAFbx) (4-7). Embora evidências recentes tenham elucidado que a acetilação, a fosforilação, e a poliubiquitinação governa mecanismos pós-traducionais envolvidos na inibição da atividade desses fatores de transcrição, pouco se sabe como essas moléculas são ativadas. Nos últimos anos, a óxido nítrico sintase induzível (iNOS) foi descrita como a principal molécula produtora de óxido nítrico (NO) e responsável por modular a atividade de diversas proteínas durante o processo inflamatório através da S-nitrosação de proteínas (8-10). Neste sentido, o objetivo foi avaliar o papel da iNOS sobre a S-nitrosação das proteínas FoxO1 e FoxO3A em modelos experimentais de atrofia muscular induzida por sepse, tumor e DM1. Desse modo, nossos achados mostraram que a atrofia aumentou a expressão de iNOS e a S-nitrosação dos fatores de transcrição FoxO1 e FoxO3A. Por outro lado, camundongos nocaute para a molécula iNOS, ficaram protegidos da S-nitrosação e parcialmente da perda de peso no estado sepse, tumor e DM1. Coletivamente, estes dados sugerem que a atrofia muscular é mediada pela iNOS e S-nitrosação de proteínas FoxO1 e FoxO3A envolvidas no tumor, sepse e DM1.
ABSTRACT
The atrophy is a clinical complex phenomenon that occurs in skeletal muscle as a result of a multiplicity of causes such as damage to neural connections, inflammation, oxidative stress, disuse, fasting and others. Muscle atrophy has close relationship with a variety of pathophysiological conditions that affect the quality of life in patients with cancer, sepsis and type 1 diabetes mellitus (1-3). Recent studies highlight the central role of transcription factors Forkhead Box family subgroup O (FOXO) in the regulation of muscle mass. During the state of muscle catabolism, these transcription factors are translocated to the nucleus and initiate transcription of molecules related to muscle proteolysis such as muscle-specific RING finger protein 1 (MuRF-1) e atrogin-1/muscle atrophy Fbox protein (Atrogin-1/MAFbx) (4-7). Although some studies have elucidated that acetylation, phosphorylation, and polyubiquitination are post-translational mechanisms involved in the inhibition of the activity of these transcription factors, the precise mechanism by which these molecules are activated is poorly understand. Currently, the S-nitrosation of proteins has been considered as an important modification protein activity induced by nitric oxide (NO). In recent years, inducible nitric oxide synthase (iNOS) has been described as the main molecule producing NO and responsible for modulating the activity of various proteins during inflammatory processes through S-nitrosation mechanism (8-10). The objective of the project was evaluate whether S-nitrosation of FoxO1 protein and FoxO3A is responsible for the activation of these transcription factors during muscle atrophy in experimental model cachexia tumor-induced and sepsis, seeking to highlight the role of iNOS. Thus, our findings showed that atrophy increased iNOS expression and S-nitrosation of the FoxO1 and FoxO3A transcription factors. On the other hand, knockout mice for the iNOS molecule were protected from S-nitrosation and partially from weight loss in state of sepsis, tumor and DM1. Collectively, these data suggest that muscle atrophy is mediated through iNOS and S-nitrosation of FoxO1 and FoxO3A proteins in tumor, sepsis and DM1.
LISTA DE ILUSTRAÇÃO
Figura esquemática 1: Fatores de Transcrição da Família FOXO ... 20
Figura esquemática 2: Transcrição de Moléculas Proteolíticas ... 21
Figura esquemática 3: Fosforilação dos Fatores de Transcrição FoxO ... 23
Figura esquemática 4: Acetilação da FoxO ... 24
Figura esquemática 5: S-nitrosação dos Fatores de Transcrição FoxO ... 26
Figura esquemática 6: Método de Biotinilação ... 38
Figura 1 A: Representação esquemática da produção experimental | GSNO ... 40
Figura 2 A: Representação esquemática da produção experimental | SEPSE ... 45
Figura 4 A: Representação esquemática da produção experimental | TUMOR ... 54
Figura 5 A: Representação esquemática da produção experimental | DM1 ... 59
Figura esquemática 7: Atrofia muscular mediado por S-nitrosação de FoxO1 e FoxO3A ... 66
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
Akt - Protein Kinase B (PKB) Proteína serina treonina-quinase
Atrogin-1/MAFbx - Atrogin-1/muscle
atrophy F-box protein
Atrogin-1/MAFbx é um gene marcador de atrofia muscular
DM1 - Diabetes Mellitus Tipo 1 Diabetes Mellitus Tipo 1
eNOS/NOS 3 - Endotelial Nitric Oxide
Synthase
Óxido Nítrico Sintase Endotelial
FoxO1 - Forkhead Box Protein O1 Fator de transcrição FoxO1
FoxO3A - Forkhead Box Protein 3A Fator de transcrição FoxO3A
GSH - Glutathione Glutationa
GSNO - S-nitrosogluthatione S-nitrosoglutationa
iNOS - Inducible Nitric Oxide Synthase Óxido Nítrico Sintase Induzível
iNOS-/- - Inducible Nitric Oxide Synthase knockout
Nocaute para iNOS
iNOS KO - Inducible Nitric Oxide
Synthase knockout
Nocaute para iNOS
L-NIL - N6- (1-iminoethyl)-L-lysine
(dihydrochloride)
LPS - Lipopolysaccharides Moléculas que consistem um lipídeo e um polissacárido
nNOS/NOS 1 - Neuronal Nitric Oxide
Synthase
Óxido Nítrico Sintase Neuronal
NO - Nitric Oxide Óxido nítrico
S-H - Thiol Grouping Grupamento tiol
S-NO - Grouping nitroso-thiol Grupamento nitroso-tiol
STZ - Streptozotocin Estreptozotocina, indutor de diabetes
mellitus tipo 1
Wild type (WT) - Wild type Refere-se ao fenótipo da forma típica de
uma espécie tal como ocorre na natureza (Camundongos selvagens)
TNF-α - Tumor Necrosis Factor α Fator de necrose tumoral α
NF-kB - Nuclear Factor kappa B Fator nuclear de transcrição kappa B
Interferon-γ (IFN-γ) - Interferon gamma Citocina solúvel dimerizada, membro do
tipo II da classe de interferões
IL-6 - Interleukin 6 Interleucina que atua como uma citocina
pró-inflamatória e miocina anti-inflamatória
MyoD - Myogenic Differentiation Proteína que desempenha um papel
importante na regulação da diferenciação muscular
MuRF-1 - Muscle-specific RING finger
protein 1
MuRF-1 gene marcador de atrofia muscular
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Avaliação da S-nitrosação dos fatores de transcrição FoxO1 e FOXO3A de camundongos tratados com S-nitrosoglutationa (GSNO). Camundongos de 8 semanas de idade foram submetidos ao tratamento com injeção intraperitoneal de GSNO (0,1 mol/L) ou glutationa (GSH) duas vezes ao dia (a cada 12h) durante 5 dias. Representação esquemática da produção experimental | GSNO (A). Western blot representando a expressão de iNOS (B). Determinação da S-nitrosação dos fatores de transcrição FoxO1 e FOXO3A quantificado pelo método de biotina (C). Avaliação de expressão proteica MURF-1, Atrogin-1/MAFbx, fosforilação de FoxO1, FoxO3A e fosforilação Smad2, Smad3 no músculo gastrocnêmio de camundongos tratados com GSNO (D-F). Extrato nuclear dos fatores FoxO1 e FOXO3A (G). A proteína α-tubulina foi utilizada como controle quantitativo (B e D-F). A proteína HDAC2 foi utilizada como controle quantitativo extrato nuclear (G). Imunofluorescência da FoxO1 e 3A do músculo gastrocnêmio (H). Técnica Hematoxilina e Eosina (HE) do gastrocnêmio de camundongos tratados com GSNO ou GSH (I). Quantificação do diâmetro de fibra muscular (J). Foram realizados 2 experimentos isolados com n=6-8 animais por grupo. As barras representam a média ± EPM (erro padrão da média), (***p<0,0001) vs Wild type... .43
Figura 2. Implicações da sepse na atrofia muscular em camundongos Wild
type e iNOS-/-. Após 48h da cirurgia de sepse foi extraído o músculo gastrocnêmio.
Representação esquemática da produção experimental | Sepse (A). As amostras do tecido muscular de EDL, sóleo e gastrocnêmio, foram analisadas por Western blot com uso de anticorpo específico (anti-NOS2) (B). Nos tempos em curso de 0, 24 e 48 horas após cirurgia de sepse avaliação da expressão da iNOS do músculo gastrocnêmio (C). A análise de variação de peso corporal (D), delta de peso (E) e gordura epididimal de camundongos após 48 horas de cirurgia de sepse realizada pelo aparelho Dexa (F). Expressão da S-nitrosação dos fatores de transcrição FoxO1 e FoxO3A quantificado pelo método de biotina (G). Após 48 horas de sepse fragmentos do gastrocnêmio revelou expressão de MURF-1, Atrogin-1/MAFbx, fosforilação de FoxO1, 3A, fosforilação Smad2 e Smad3 (H-J). Para melhor
compreensão dos efeitos deletérios da sepse no tecido muscular realizamos o exame imunofluorescência para co-localizar FoxO1/3A no núcleo celular (K). Hematoxilina e Eosina (HE), combinado com a avaliação do diâmetro e quantificação do gastrocnêmio (L-M). A proteína α-tubulina foi utilizada como controle quantitativo (B-C e H-J). Foram realizados 2 experimentos isolados com n=8-10 animais por grupo. As barras representam a média ± EPM (erro padrão da média), (***p<0,0001) vs Wild type sepse 0h; (*p<0,05) vs Wild type sepse; (###p<0,0001) vs Wild type sepse; (**p<0,001) vs Wild
type...49
Figura. 3. Efeitos do tratamento com inibidor da iNOS (L-NIL) em camundongos
Wild type sepse. Camundongos Wild type sepse foram tratados com uma injeção
intraperitoneal do inibidor iNOS L-NIL-N6- (1-iminoethyl) -L-lysine (dihydrochloride)
ou salina duas vezes por dia (a cada 12h) no período de 2 dias. Avaliação da iNOS após o tratamento (A). Efeitos do L-NIL na S-nitrosação dos fatores de transcrição FoxO1 e FoxO3A quantificado pelo método de biotina (B). Foram extraídos fragmentos do tecido gastrocnêmio para análise de expressão proteolítica MURF-1 e Atrogin-1/MAFbx (C). Hematoxilina e Eosina (HE) e quantificação do diâmetro de fibra muscular Wild type e Wild type sepse tratados com inibidor da iNOS (D-E). A proteína α-tubulina foi utilizada como controle quantitativo (A e C). Foram realizados 2 experimentos isolados com n=5-6 animais por grupo. As barras representam a média ± EPM (erro padrão da média), (***p<0,0001) vs outros grupos...52
Figura 4. Efeitos do tumor no tecido muscular de camundongos WT e iNOS-/-.
Determinação da massa muscular de camundongos Wild type e iNOS-/- 14-21 dias após inoculação do tumor. Representação esquemática de modelos experimentais | Tumor (A). A análise de peso corporal, variação de peso e gordura epididimal de camundongos avaliados pelo aparelho Dexa (B-D). Amostras do músculo de EDL, sóleo e gastrocnêmio por técnicas de Western blot mostraram os níveis da proteína (anti-NOS2) (E). Expressão proteica do músculo gastrocnêmio de camundongos Wild type e iNOS-/- tumor foram analisados (F). Efeitos da S-nitrosação analisada
através de Biotin Switch Method dos fatores FoxO1 e FoxO3A (G). As transferências de Western blot mostraram os níveis das proteínas MURF-1 e
Atrogin-1/MAFbx, fosforilação de FoxO1, 3A e fosforilação de Smad2, Smad3 no músculo gastrocnêmio de modelos experimentais de tumor (H-J). Hematoxilina e Eosina (HE) para quantificação do diâmetro de fibra muscular foram analisadas (K-L). A proteína α-tubulina foi utilizada como controle quantitativo (E-F e H-J). As barras representam a média ± EPM (erro padrão da média). Foram realizados 2 experimentos isolados com n=6-8 animais por grupo, (***p< 0,0001) vs outros grupos; (**p< 0,001) vs Wild type tumor; (**p< 0,001) vs Wild type tumor; (***p< 0,0001) vs outros grupos...57
Figura 5. Camundongos com Diabetes Mellitus tipo 1 apresentam redução da massa muscular e aumento da iNOS e S-nitrosação dos fatores de transcrição FoxO1 e FoxO3A. Representação esquemática de modelos experimentais de DM1 (A). Após 7 dias do tratamento realizado com estreptozotocina, foi constatado o DM1 através dos testes de tolerância à insulina (ITT) e tolerância à glicose (GTT) (B-C). A avaliação de peso e gordura epididimal de camundongos Wild type e iNOS -/- após 20 dias do tratamento STZ realizado por Dexa (D-E). Os tecidos musculares
EDL, sóleo e gastrocnêmio foram avaliados por Western blot com uso de anticorpo específico (anti-NOS2) (F-G). Avaliação da S-nitrosação dos fatores de transcrição FoxO1 e FoxO3A (H). Western blot representando a expressão da MURF-1 e Atrogin-1/MAFbx, fosforilação de FoxO1, 3A e fosforilação da Smad2 e Smad3 do músculo gastrocnêmio de modelos experimentais de DM1 (I-K). A proteína α-tubulina foi utilizada como controle quantitativo (F e G, I-K). As barras representam a média ± EPM (erro padrão da média). Foram realizados 2 experimentos isolados com n=8-10 animais por grupo (***P< 0,05) vs Wild type; (**P< 0,05) vs Wild type; (**P< 0,05) vs Wild type STZ; (*P< 0,05) vs Wild type STZ...61
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ... 19
Massa muscular atrofia e sobrevida ... 19
Fatores de transcrição da família FoxO e atrofia muscular ... 20
Fatores de Transcrição da Família FOXO ... 20
Transcrição de Moléculas Proteolíticas ... 21
Fosforilação dos Fatores de Transcrição FoxO ... 23
Acetilação da FoxO ... 24
Modulação pós-traducional de proteínas através da S-nitrosação... 24
S-nitrosação dos Fatores de Transcrição FoxO... 26
2. JUSTIFICATIVA ... 27 3. OBJETIVOS ... 27 Objetivo geral ... 27 Objetivos específicos ... 27 4. MATERIAIS E MÉTODOS ... 31 Reagentes e anticorpos ... 31 Animais ... 31 Cultura de células ... 31
Protocolos experimentais de atrofia ... 32
Sepse ... 32
Tumor ... 32
Definição de anorexia de câncer ... 32
Diabetes Mellitus Tipo 1 ... 33
Tratamento com S-nitrosoglutationa (GSNO) ... 33
Tratamento com inibidor iNOS L- N 6- (1-iminoetil) lisina (L-NIL) ... 33
Avaliação de composição corporal por Dexa ... 33
Teste de tolerância intraperitoneal à insulina (ip ITT) e Teste de tolerância intraperitoneal à glicose (ip GTT) ... 34
Extração de extrato nuclear ... 35
Microscopia Óptica ... 35
Análise histológica dos cortes pelo método da hematoxilina e eosina (HE) ... 36
Quantificação diâmetro de fibra muscular ... 36
Análise proteica por immunoblotting ... 37
Método da troca por biotina ... 37
Análise estatística ... 39
5. RESULTADOS ... 39
S-nitrosoglutationa (GSNO) induz o aumento da S-Nitrosação dos fatores de transcrição FoxO1 e FOXO3A no tecido muscular. ... 39
Sepse promove aumento da iNOS e S-nitrosação de marcadores de atrofia muscular em camundongos WT. ... 44
Tratamento intraperitoneal com L-NIL reduz S-nitrosação e marcadores de proteólise muscular. ... 50
Tumor induz aumento da iNOS e S-nitrosação dos fatores de transcrição FoxO1 e FoxO3A. ... 53
Diabetes Mellitus tipo 1 promove amento da iNOS, S-nitrosação e atrofia muscular de modelos experimentais. ... 58
6. DISCUSSÃO ... 62
7. CONCLUSÃO ... 65
8. REFERÊNCIAS ... 67
9. ANEXOS ... 72
Artigo relacionados à tese ... 72
Artigos publicados. ... 79
1. INTRODUÇÃO
Massa muscular atrofia e sobrevida
Atrofia é proveniente do grego àtrophos e é considerado um fenômeno clínico e complexo que ocorre no músculo esquelético como resultado de uma multiplicidade de causas, tais como danos às conexões neurais, inflamação, estresse oxidativo, desuso, jejum prolongado dentre outros (11). Além do mais, a significativa perda de massa muscular possui estreita relação com uma variedade de condições fisiopatológicas que interferem na qualidade de vida de indivíduos com câncer, sepse, diabetes mellitus tipo1 (DM1) e AIDS, além de comprometer a condição de vida em idosos (12).
Evidências acumuladas demonstraram que a atrofia é um importante fator prognóstico no câncer, sendo quanto maior a extensão da perda da massa muscular, menor o tempo de sobrevida, uma vez que, a morte de pacientes com câncer ocorre com a perda de 25 a 30% do peso corporal (3). Uma situação semelhante é encontrada em pacientes com síndrome de imunodeficiência adquirida (AIDS), na qual a morte geralmente ocorre quando a perda do peso corporal atinge cerca de 34% (4). Paralelamente, o envelhecimento possui ainda estreita relação com a diminuição da massa muscular, e consequente redução de força e aumento da mortalidade em idosos (13). No entanto, independentemente do tipo de estímulo, a atrofia do músculo esquelético é geralmente caracterizada pela diminuição da síntese proteica, diâmetro da fibra, produção de força e resistência à fadiga (14).
A variedade de condições fisiopatológicas que induzem a atrofia implica no envolvimento de diversas vias de sinalização intracelular. As principais vias que levam a lesão e degradação muscular são: via de ubiquitina-proteassoma (15-18), via da calpaína-calpastatina (19-21), via lisossomal (22, 23),vias de apoptose ou morte celular programada (24-26). Coletivamente, o prejuízo com a degradação da massa muscular que ocorre na maioria dos transtornos de elevado grau inflamatório que pode ser explicado pela participação de uma ou mais destas vias.
Neste sentido, diversos estudos sugerem que a atrofia muscular está envolvida em doenças relacionadas como câncer, sepse e DM1, por outro lado, a compreensão de como os mecanismos que regulam a massa muscular permanece incerta.
Fatores de transcrição da família FoxO e atrofia muscular
A família FoxO (do inglês - Forkhead Box subgroup O) no músculo esquelético é composta por três isoformas: FoxO1, FoxO3 e FoxO4. FoxO é uma importante família de fatores de transcrição responsável pela modulação da expressão de genes envolvidos na apoptose, ciclo celular, estresse oxidativo, diferenciação celular, metabolismo da glicose, crescimento celular, proliferação, longevidade entre outras funções (5, 6, 27).
Fatores de transcrição da família FOXO
Figura esquemática 1 - FoxO é uma importante família de fatores de transcrição responsável pela modulação da
expressão de genes envolvidos no ciclo celular, estresse oxidativo, apoptose, metabolismo da glicose além de diferenciação celular, crescimento celular, proliferação e longevidade entre outras funções.
No músculo, os fatores FoxO1 e FoxO3A são conhecidos por induzir atrofia através da transcrição de moléculas relacionadas à proteólise muscular como a
muscle-specific RING finger protein 1 (MuRF-1) e atrogin-1/muscle atrophy F-box protein (Atrogin-1/MAFbx). Atualmente, os genes Atrogin-1/MAFbx e MuRF1 são importantes marcadores para a atrofia muscular, considerando que camundongos knockout para essas moléculas são parcialmente resistentes à atrofia (18, 28-30).
Transcrição de Moléculas Proteolíticas
Figura esquemática 2 - No músculo esquelético, os fatores de transcrição FoxO1 e FoxO3 são conhecidos por
induzir atrofia através do aumento da expressão de moléculas relacionadas à proteólise muscular como a muscle-specific RING finger protein 1 (MuRF-1) e atrogin-1/muscle atrophy F-box protein (atrogin-1/MAFbx).
Diante dessas evidências, dois grupos demonstraram de forma independente que a superexpressão da FoxO1 no músculo esquelético de camundongos é suficiente para induzir atrofia muscular (6, 31). Em paralelo, foi observado aumento da expressão de proteínas associadas à atrofia muscular (6) e redução da ativação da mammalian target of rapamycin (mTOR), molécula responsável pela síntese proteica (31). Por outro lado, a redução da FoxO1 através da utilização do RNA de interferência, foi capaz de bloquear a expressão de Atrogin-1/MAFbx durante a atrofia muscular em modelos experimentais (32).
Além da FoxO1, a superexpressão da FoxO3 também é capaz de induzir a expressão Atrogin-1/MAFbx (1). A exposição de células musculares à glicocorticoides aumenta a expressão do gene FoxO, particularmente 1 e 3A (33). De forma interessante, células transfectadas com o dominante negativo da FoxO3A preveniu a atrofia das células musculares induzida por glicocorticoides, bem como a expressão de atrogin-1 (7). Coletivamente, estes dados indicam que o aumento da expressão da FoxO1 e da FoxO3A é capaz de ativar um programa transcricional de genes responsáveis por desencadear a proteólise muscular, dentre eles destacam-se MuRF1, Atrogin-1/MAFbx, catepsina L, PDK4, p21, GADD45, 4E-BP, SMAD2 e SMAD3 (34-37).
Paralelamente, dentre as moléculas que desempenham um papel permissivo na atrofia muscular podemos destacar as SMAD´s. Smad´s são proteínas citoplasmáticas que possui status funcional onipresente no núcleo celular. São estruturalmente semelhantes, e a partir da sinalização de membrana em seu estado fosforilado ligam-se a promotores específicos de genes alvo, favorecendo robusta atividade transcricional nuclear diferenciada (38). Em adição, um interessante estudo de Goodman e colaboradores demonstrou que a Smad3 estimulou a atividade promotora de atrogina-1 e inibiu a cascata de sinalização do eixo Akt/mTOR e síntese proteica, favorecendo redução muscular através de um mecanismo dependente de Smad3 (39).
A atrofia muscular desencadeada por fatores de transcrição pode estar atrelada não somente a um aumento na degradação de proteínas, mas também outros mecanismos que inibem a sinalização de síntese proteica. Em conjunto, as ligases E3 MuRF1 e Atrogin-1 estão envolvidas na ubiquitinação e degradação de proteínas pelo sistema de ubiquitina-proteassoma e determinam como regulador principal de genes que codificam proteínas envolvidas na degradação de fibras musculares.
Emergentes evidências demonstraram um significativo aumento dos níveis de MuRF1 e Atrogin-1 no músculo esquelético de animais durante a atrofia muscular induzidos por tumor e sepse (7, 40). De forma contrária, a inibição da atividade da FoxO1 impediu a redução das fibras musculares. Em adição, um outro estudo
conduzido por Lecker e colaboradores demonstrou em modelos experimentais de diabetes mellitus tipo 1, jejum, uremia e câncer promove elevados níveis de expressão gênica dos fatores de transcrição FoxO1 e 3A (36).
Embora a expressão proteica e o status funcional dos fatores de transcrição FoxO1/3A possua estreita relação com a indução de atrofia, a translocação desses fatores de transcrição ao compartimento nuclear é crucial para o processo atrófico em mamíferos (41). Atividade dos fatores de transcrição da família da FoxO é regulada por várias modificações pós-transcricionais, incluindo acetilação, fosforilação e poliubiquitinação (7, 42, 43). Dentre esses mecanismos, os mais conhecidos são a fosforilação e a acetilação. A fosforilação parece ser um mecanismo inibitório das proteínas FoxO1 e 3A. Evidências demonstram que a Akt fosforila a FoxO1 e 3A, promovendo a exportação desses fatores de transcrição do núcleo para o citoplasma, reprimindo suas atividades (5) (Forma esquemática 1). Contrariamente, a redução na atividade da Akt observada em diferentes modelos de atrofia muscular, resulta na diminuição dos níveis de fosforilação da FoxO no citoplasma e um aumento acentuado de proteínas FoxO nuclear (1, 44, 45).
Fosforilação dos fatores de transcrição FoxO
Figura esquemática 3 - Akt fosforilada promove exportação dos fatores de transcrição FoxO do núcleo celular para
Os fatores de transcrição FoxO também podem ser regulados através de mecanismos de acetilação e desacetilação por ação da proteína SIRT2, sendo que a acetilação desse fator de transcrição cursa em menor atividade nuclear.
Nota-se, portanto, que alguns mecanismos pós-traducionais são responsáveis pela inibição da atividade das proteínas da família FoxO, reprimindo a atividade desses fatores de transcrição. Contudo, os fatores relacionados à ativação dessas moléculas permanecem desconhecidos.
Acetilação da FoxO
Figura esquemática 4 - Além de ser controlado por fosforilação, o fator de transcrição FoxO1 pode ser regulado
através de mecanismos de acetilação e desacetilação por ação da proteína desacetilase SIRT2 de forma semelhante a fosforilação, a acetilação da FoxO1 resulta na redução da sua atividade nuclear (47, 48).
Modulação pós-traducional de proteínas através da S-nitrosação.
Ao longo das últimas décadas demonstrou-se que S-nitrosação de proteínas desempenha uma ação fundamental em inúmeras doenças em humanos (49-51). O óxido nítrico (NO) produzido pela proteína óxido nítrico sintase (NOS) é um importante sinalizador intracelular capaz de modificar a função proteica por diversos mecanismos em etapas pós-traducionais, incluindo nitrosilação, nitração e nitrosação. A S-nitrosação ocorre pela reação do NO com resíduos de cisteína nas proteínas para formar S-nitrosotiol (S-NO). Esse processo é capaz de alterar transitoriamente a atividade de determinadas proteínas (10, 49, 52).
Nos últimos 10 anos, foi demonstrado que além de suas ações vasodilatadoras, o NO tem também papel fundamental, controlando várias funções da célula (27, 53, 54). As NO-Sintases são as principais fontes intracelulares de NO divididas em 3 subtipos. A NO Sintase Neuronal (nNOS ou NOS 1) e a NO Sintase Endotelial (eNOS ou NOS 3) são cálcio dependentes e exercem funções biológicas importantes em seus respectivos tecidos como regulação da apoptose neuronal e vasodilatação (50, 53). A NO Sintase Induzível (iNOS ou NOS 2), não é cálcio dependente e pode ter sua expressão induzida a partir do estímulo com interleucinas ou lipopolissacarídeo (LPS) (14, 55). Uma vez produzido, o NO pode modificar a função proteica através de processos químicos distintos que dependem principalmente da disponibilidade de espécies oxidantes e da concentração de NO liberada (53, 54).
A S-nitrosação tem importância biológica devido à alta concentração celular de tióis de massa molecular pequena, como a glutationa, que poderia funcionar como transportadora do nitrosonium para outros ambientes celulares, distantes daqueles onde a formação do NO (56). Existem ainda outros modelos bioquímicos identificados in vitro para explicar a formação de nitrosotióis, como os obtidos a partir da doação de NO por nitrito (57), ou catalizada até mesmo por metaloproteinas (51). Várias proteínas podem ter sua função modificada por S-nitrosação, como por exemplo, FoxO4 (58), ERK (59), IR (8, 9), IRS-1(8, 9), AKT (52), STAT3 (60), p21ras (61), NFkB (62), a família HIF (fatores induzidos por hipóxia) (63), metaloproteinases matriciais (64) dentre outras.
Atualmente, a S-nitrosação vem sendo valorizada como uma das principais formas de modificação proteica induzida pelo NO, devido a sua alta reatividade, por ocorrer em condições fisiológicas, e devido à grande quantidade de processos celulares regulados por S-nitrosação. Nos últimos anos nosso grupo se dedicou e investigar os efeitos da S-nitrosação das proteínas que compõem a via de transmissão de sinal da insulina em modelos de obesidade e envelhecimento (8, 9, 65, 66). Em um desses estudos, demonstramos que o aumento da expressão da iNOS observada em roedores obesos induzidos por dieta rica em gordura é responsável pela redução da fosforilação do receptor de insulina (IR), do substrato 1 do receptor de insulina (IRS-1) e também a fosforilação da Akt através da S-nitrosação dessas moléculas (9, 65). De maneira
interessante, camundongos nocaute para a iNOS (iNOS-/-), não apresentaram a
S-nitrosação das proteínas IR, IRS-1 e Akt no músculo esquelético e ficaram protegidos de desenvolver resistência à insulina mesmo quando expostos à dieta rica em gordura (65).
Adicionalmente, demonstramos o mesmo fenômeno em modelo experimental de envelhecimento, ao passo que animais iNOS-/- ficaram protegidos de resistência à
insulina, apresentam baixos níveis de S-nitrosação de proteínas e de maneira surpreendente, preservaram a massa magra mesmo após o envelhecimento (8). Paralelamente, um elegante estudo conduzido por Bae e colaboradores evidenciou que camundongos nocaute para iNOS ficaram protegidos da atrofia induzida por imobilização. Paralelamente, os autores observaram baixos níveis da fosforilação da FoxO1 no músculo esquelético (67).
Suzuki e colegas determinaram que drogas doadoras de NO reduziram a fosforilação da FoxO1, aumentando sua expressão nuclear em células musculares (27). Coletivamente, esses dados sugerem fortemente que a iNOS e o óxido nítrico podem modular a atividade dos fatores de transcrição da família FoxO no músculo esquelético, contudo esses mecanismos ainda não são bem esclarecidos. Baseado nestas evidências, aventamos a hipótese de que a iNOS poderia mediar a S-nitrosação de membros da família da FoxO, especialmente a FoxO1 e a FoxO3A com participação determinante na atrofia muscular em modelos experimentais de sepse, tumor e DM1.
S-nitrosação dos fatores de transcrição FoxO
Figura esquemática 5 - A hipótese criada é de que os fatores de transcrição FoxO poderiam ser regulados através
2. JUSTIFICATIVA
O aumento da atividade dos fatores de transcrição FoxO1 e FoxO3A contribui para uma multiplicidade de doenças crônicas como a atrofia no músculo esquelético. Paralelamente, diversos estudos mostraram que a atividade dos fatores de transcrição da família da FoxO é regulada por várias modificações pós-traducionais, incluindo acetilação, fosforilação e poliubiquitinação. Porém, mecanismos biológicos e moleculares responsáveis pelo aumento da atividade dos fatores de transcrição FoxO1/3A que causam efeitos deletérios na atrofia muscular permanece incerto. Assim, a caracterização da S-nitrosação da FoxO1 e FoxO3A na atrofia muscular lança luz sobre a biologia dos fatores que interferem no desfecho da doença, favorecendo melhor compreensão terapêutica.
3. OBJETIVOS:
Objetivo geral:
O objetivo central deste estudo é investigar a S-nitrosação de proteínas FoxO1 e FoxO3A e o papel do Óxido Nítrico Sintase induzível (iNOS) na regulação de proteínas em diferentes modelos experimentais de atrofia muscular.
Objetivos específicos:
Tratamento S-nitrosoglutationa (GSNO)
GSNO
Os camundongos (Wild type e iNOS-/-) foram categorizados em 2 grupos conforme
representados abaixo:
1. Camundongos Wild type foi administrado intraperitonealmente durante cinco dias duas vezes ao dia GSH 0,1 mol/l (Wild type GSH);
2. Camundongos Wild type GSNO foi administrado intraperitonealmente durante cinco dias duas vezes ao dia GSNO 0,1 mol/l (Wild type GSNO);
Objetivos específicos 1 - Avaliar o efeito do tratamento intraperitoneal com o doador de NO (GSNO) sobre atrofia muscular de camundongos. Analisar a expressão de iNOS, fosforilação e S-nitrosação das proteínas FoxO1 e FoxO3A após o tratamento com GSNO. Investigar a expressão de extrato nuclear das proteínas FoxO1 e FoxO3A em de animais tratados com GSNO. Avaliar a atrofia muscular e a S-nitrosação das proteínas FoxO1 e FoxO3A em camundongos nocaute para iNOS tratados com GSNO.
Modelos de atrofia
SEPSE
Os camundongos (Wild type e iNOS-/-) foram categorizados em 4 grupos
conforme representados abaixo:
1.
Camundongos Wild type foram submetidos ao procedimento cirúrgico com exceção do passo de perfuração do ceco (Wild type SHAM);2. Camundongos Wild type sepse foram submetidos à perfuração do ceco uma única vez, entre a ligação e a ponta do ceco numa direção mesentérica para antimesentérica (Wild type SEPSE);
3. Camundongos iNOS-/- foram submetidos ao procedimento cirúrgico com exceção
do passo de perfuração do ceco (iNOS-/- SHAM);
4. Camundongos iNOS-/- sepse foram submetidos a perfuração do ceco uma única
vez, entre a ligação e a ponta do ceco numa direção mesentérica para antimesentérica (iNOS-/- SEPSE).
Objetivos específicos 2 - Avaliar a expressão da iNOS e fosforilação, S-nitrosação das proteínas FoxO1 e FoxO3A, além de marcadores de proteólise no tecido muscular de camundongos sépticos. Avaliar a atrofia muscular e a S-nitrosação das proteínas FoxO1 e FoxO3A em camundongos nocaute para iNOS em modelos experimentais de sepse.
Tratamento L-NIL (inibidor iNOS)
L-NIL
Os camundongos (Wild type) foram categorizados em 3 grupos conforme representados abaixo:
1. Camundongos Wild type SHAM foi administrado intraperitonealmente salina duas vezes dia no período de 2 dias (Wild type SHAM);
2. Camundongos Wild type sepse foram submetidos à perfuração do ceco uma única vez, entre a ligação e a ponta do ceco numa direção mesentérica para antimesentérica (Wild type SEPSE);
3. Camundongos Wild type sepse L-NIL foram submetidos à perfuração do ceco uma única vez, entre a ligação e a ponta do ceco numa direção mesentérica para antimesentérica. Foi administrado intraperitonealmente inibidor da iNOS (L-NIL) (80mg/kg | peso corporal) no período de dois dias em camundongos (Wild type SEPSE L-NIL).
Objetivos específicos 3 - Investigar os efeitos do tratamento com o inibidor farmacológico da iNOS (L-NIL) sobre a massa muscular e S-nitrosação das proteínas FoxO1 e FoxO3A em camundongos induzidos sepse.
TUMOR
Os camundongos (Wild type e iNOS-/-) foram categorizados em 4 grupos
conforme representados abaixo:
1. Camundongos Wild type receberam uma injeção na região posterior do flanco contendo 0,1 ml de solução salina (Wild type);
2. Camundongos Wild type tumor foram inoculados na região do posterior do flanco (1.0x106 em 0,1ml) de células LLC (Wild type TUMOR);
3. Camundongos iNOS-/- receberam uma injeção na mesma região contendo 0,1 ml
de solução salina (iNOS-/-);
4. Camundongos iNOS-/- tumor foram inoculados na mesma região contendo
(1.0x106 em 0,1ml) de células LLC (iNOS-/- TUMOR).
Objetivos específicos 4 - Avaliar a expressão da iNOS e fosforilação, S-nitrosação das proteínas FoxO1 e FoxO3A, além de marcadores de proteólise no tecido muscular de camundongos induzidos atrofia por tumor. Avaliar o tecido muscular e a S-nitrosação das proteínas FoxO1 e FoxO3A em camundongos nocaute para iNOS de modelos experimentais de tumor.
DIABETES MELLITUS TIPO 1
Os camundongos (Wild type e iNOS-/-) foram categorizados em 4 grupos
conforme representados abaixo:
1. Camundongos Wild type receberam uma injeção intraperitoneal dose única de contendo 0,1 ml de tampão citrato (Wild type);
2. Camundongos Wild type STZ receberam uma injeção intraperitoneal dose única de STZ contendo 100 mg/kg de peso em tampão citrato (Wild type STZ);
3. Camundongos iNOS-/- receberam uma injeção intraperitoneal dose única de
contendo 0,1 ml de tampão citrato (iNOS-/-);
4. Camundongos iNOS-/- STZ receberam uma injeção intraperitoneal dose única de
STZ contendo 100 mg/kg de peso em tampão citrato (iNOS-/- STZ);
Objetivos específicos 5 - Avaliar a expressão da iNOS e fosforilação, S-nitrosação das proteínas FoxO1 e FoxO3A, além de marcadores de proteólise no tecido muscular de camundongos DM1. Avaliar tecido muscular e a S-nitrosação das proteínas FoxO1 e
FoxO3A em camundongos nocaute para iNOS em modelos experimentais de diabetes mellitus tipo1.
4. MATERIAIS E MÉTODOS
Reagentes e anticorpos
Os reagentes e os aparelhos para o gel de sódio dodecil sulfato de poliacrilamida (SDS-PAGE) foram utilizados da Bio-Rad (Richmond, CA). Metano hidroximetilamina (TRIS), fenilmetilsulfonilfluoreto (PMSF), aprotinina e ditiotreitol (DTT) Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). A membrana de nitrocelulose (BA85, 0,2) utilizada no estudo foi Schleicher & Schuell. Os anticorpos anti-FoxO1 e anti-FoxO3A, anti-fosfo FoxO1ser256,
anti-fosfo FoxO3Aser253, Phospho-Smad2ser245/250/255, Phospho-Smad3ser423/425,
anti-α-Tubulin e HDAC2 foram importados da Cell Signaling Technology, Inc. iNOS2, Anti-Atrogin-1/MAFbx e anti-MuRF1 foram importados da Santa Cruz Technology (Santa Cruz, CA).
Animais
Camundongos machos C57BL/6J (Wild type) e C57BL/6 iNOS Ko/J (iNOS-/-) (6-8
semanas de idade), provenientes do Centro de Bioterismo da UNICAMP (CEMIB) foram adquiridos. Todos experimentos foram realizados de acordo com as diretrizes do Colégio Brasileiro de Experimentação Animal e foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa Animal da Universidade de Campinas sob número 2736-1. Os animais foram previamente pesados, alocados em gaiolas individuais e receberam água e um tipo de dieta, ração padrão para roedores ad libitum durante 8 semanas. Os roedores foram expostos em ciclos de 12 horas claro e 12 horas escuro e a temperatura do ambiente permaneceu entre 20ºC e 22ºC.
Cultura de células
As células Lewis Lung Carcinoma (LLC) foram obtidas da ATCC, Philadelphia, PA, EUA. As células foram cultivadas em RPMI contendo 10% de FBS e glutamina sem adição de antibióticos ou fungicidas e foram mantidos a 37°C, 5% de CO2.
Protocolos experimentais de atrofia
Sepse: camundongos C57BL/6J e C57BL/6 iNOS Ko/J (iNOS-/-) foram
anestesiados intraperitonealmente com ketamina (80-100mg/kg) e xilazina (5-15mg/kg). O primeiro passo foi realizar a incisão na linha média longitudinal da pele com um bisturi identificando a linha alba da musculatura abdominal que foi divulsionada as camadas peritoneais. O próximo passo foi localizar o ceco, e em seguida expondo na posição desejada. Adicionalmente, realizamos a perfuração do ceco uma única vez, entre a ligação e a ponta do ceco numa direção mesentérica para antimesentérica. Por fim, fechamos o peritônio e a musculatura abdominal através de sutura. Os animais controle foram submetidos exatamente aos mesmos procedimentos, com exceção do passo de perfuração do ceco (69). Este modelo de cirurgia tem sido utilizado como um padrão de infecção grave em modelos experimentais de sepse. A extração ocorreu 24-48 horas após a cirurgia.
Tumor: camundongos C57BL/6J e C57BL/6 iNOS Ko/J (iNOS-/-) foram
implantadas na região subcutâneo dorsal do flanco direito (1.0x106 em 0,1ml) células
de Carcinoma Pulmonar de Lewis (Lewis Lung Carcinoma-LLC) e os camundongos controle receberam uma injeção subcutânea na mesma região contendo 0,1 ml de solução salina no momento da inoculação de células tumorais (68). A quantidade implantada sugere que a massa tumoral seja de 15-20% do peso dos animais no momento dos experimentos. Os experimentos tiveram início 14-21 dias após o implante do tumor. Quatro dias após o início da anorexia, os camundongos foram sacrificados e o tecido muscular foi extraído.
Definição de anorexia de câncer: a ingestão alimentar individual de 24 horas de cada animal foi definida como a ingestão média diária de alimentos ao longo de um período de 4 dias consecutivos. Nos animais portadores de tumor, a anorexia do câncer foi definida como valor único de 70% da linha de base que ocorre após um declínio constante de pelo menos 4 dias duração.
Diabetes Mellitus Tipo 1: camundongos C57BL/6J e C57BL/6 iNOS Ko/J (iNOS-/-) foram alimentados com ração padrão e água ad libitum. O alimento foi retirado
10-12hs antes dos experimentos com os camundongos diabéticos e seus respectivos controles. O diabetes foi induzido com estreptozotocina (Streptozotocin - STZ) em tampão citrato, pH 4.5, administrado intraperitonealmente em uma dose única de 100 mg/kg de peso corporal para camundongos em jejum às 18hs. Os camundongos diabéticos foram analisados 7 dias após a injeção de STZ (70).
Tratamento com S-nitrosoglutationa (GSNO)
Tratamento S-nitrosoglutationa (GSNO) foi preparado pela reação de glutationa com nitrito de sódio em solução e realizado com injeção intraperitoneal de GSNO com 0,1 mol/L administrado ou glutationa (GSH) (10) duas vezes por dia (a cada 12h) durante 5 dias. Este protocolo de tratamento com GSNO foi adaptado a partir de modelo experimental publicado (65).
Tratamento com inibidor iNOS L- N 6- (1-iminoetil) lisina (L-NIL)
Camundongos C57BL/6J (sepse) receberam tratamento intraperitoneal do inibidor iNOS L- N 6- (
1-iminoetil) lisina (L-NIL; 80mg/kg de peso corporal) ou salina duas
vezes por dia (a cada 12h) no período de 2 dias. Após a última dose, os animais ficaram em jejum durante 8 horas para a remoção de fragmentos muscular. Este protocolo de tratamento com L -NIL foi adaptado a partir de um modelo experimental publicado (65, 71).
Avaliação de composição corporal por Dexa
Os animais dos experimentos de sepse e tumor foram previamente pesados, alocados em gaiolas metabólicas individuais 48 horas antes da cirurgia para adaptação do ambiente. Foi avaliado massa magra e peso corporal no dia da inoculação e cirurgia de sepse e após 48 horas na sepse e 14-21 dias após inoculação do tumor. A análise corporal foi realizada pelo aparelho Dexa modelo: Discovery Wi (S/N 83901).
Teste de tolerância intraperitoneal à insulina (ip ITT) e Teste de tolerância intraperitoneal à glicose (ip GTT)
Camundongos foram mantidos em jejum durante 6h para ipITT e 12h para ipGTT e submetido a um teste de tolerância à insulina de 30 minutos (72). No experimento foi administrado 1mU/Kg de insulina infundido por via intraperitoneal em camundongos e a glicose foi medida às 0 (basal), 5, 10, 15, 20, 25 e 30 minutos após. A taxa de desaparecimento de glicose (KITT) foi calculada a partir da fórmula de 0,693 / t 1/2, em
que t 1/2 meios para a glucose tempo para atingir 50% do valor basal. Glicose t 1/2 foi
calculada à partir do declive da análise dos mínimos quadrados da concentração de glucose no sangue durante a fase linear de descida (72).
Para o GTT os animais receberam injeção contendo glicose (2g/Kg de peso corporal) para o teste de tolerância à glicose. Após a infusão foram coletadas alíquotas nos tempos 15, 30, 60, 90 e 120 minutos. Todas as alíquotas tiveram suas glicemias mensuradas utilizando-se fitas reativas (Roche®) e glicosímetros (Accu-chek Active Roche, Mannheim, Alemanha) (72).
Extração do tecido muscular
Os camundongos foram anestesiados com ketamina (50mg/Kg de peso corporal) e xilasina (50mg/Kg de peso corporal) e para controle de anestesia observamos os reflexos pedal e de córnea, antes de qualquer procedimento experimental. Após o término dos reflexos, amostras do músculo gastrocnêmio (G), sóleo (S) e extensor longo dos dedos (EDL) foram extraídos e homogeneizados em tampão contendo 1% de TritonX100, 100mM de Tris (pH 7,4), 100mM de pirofosfato de sódio, 100mM de fluoreto de sódio, 10mM de EDTA, 10mM de ortovanadato de sódio, 2mM de PMSF e 0,1 mg/mL de aprotinina a 4 ºC. O homogeneizado de cada amostra foi então centrifugado à 11.000 RPM por 40 minutos. Na porção sobrenadante da amostra, foi determinada a concentração de proteína utilizando o método de Bradford. Em seguida, o tampão de Laemmli foi acrescido a cada uma das amostras que posteriormente fervidas por 5 minutos e armazenadas à -80°C para futura análise das técnicas Biotin Switch Method e Western blot (73).
Extração de extrato nuclear
O músculo foi macerado em nitrogênio líquido. Em seguida a amostra foi adicionada em tubo de eppendorf (2mL) e acrescentado o Tampão A (800μl) (músculo), homogeneizadas e centrifugadas a 2.000g durante 10 minutos a 4ºC. Após a centrifugação, foi retirado o sobrenadante (extrato citoplasmático) e guardado em tubos eppendorf (1,5mL) para posterior leitura de proteínas por Biureto. Ressuspendemos o pellet com o Tampão A (400μl) e submetemos em uma nova centrifugação de 2.000g por 10 minutos a 4ºC. Após a centrifugação, foi desprezado o sobrenadante e ressuspenso novamente o pellet em Tampão B (400μl) que ficou sob agitação na câmara fria por 30 minutos para a extração de extrato nuclear. Após 30 minutos, centrifugamos a 16.000g por 30 minutos em 4ºC. Retiramos o sobrenadante (extrato nuclear) e realizamos a leitura de proteínas pelo método de Biureto, em seguida as amostras foram guardadas em eppendorf (1,5ml) e armazenadas à -80ºC.
Tampão A (para 100 ml) Tampão B (para 100 ml)
Hepes 10mM pH 7,9 1ml do 1M Hepes 20mM pH 7,9 2ml do 1M
KCl 10mM 300μl do 3M KCl 10mM 300μl do 3M
MgCl 1,5mM 150μl do 1M NaCl 0,42M 2,457g
DTT 1mM 0,0154g DTT 1mM 0,0154g
Ortovanadato 1mM 0,0185g Ortovanadato 1mM 0,0185g
PMSF 1mM 0,0175g (diluído em álcool) Glicerol 20% 20ml
Aprotinina 10μg/ml 400μl Aprotinina 10μg /ml 400μl
Microscopia Óptica
Após a extração, os tecidos foram fixados por imersão de formaldeído 4%, desidratados com banhos de álcool e xilol. Em seguida esses tecidos foram emblocados em parafina e seccionados em cortes de 5μm de espessura. As lâminas foram reidratadas e imersas em tampão citrato (0,01mol/L, pH 6,0) e aquecidas em forno microondas por 10 minutos. Em seguida foram resfriadas à temperatura ambiente. Adicionalmente, realizamos a lavagem com TBS, Bloqueio com BSA 3% por 60 minutos, lavagem com TBST novamente. Os cortes foram incubados com os anticorpos
primários para Foxo1 e Foxo3A incubados overnight a 4°C (Santa Cruz Biotechnology) na diluição de 1:50. Posteriormente foi feita a incubação com os anticorpos secundários conjugados com seus respectivos fluoróforos (Santa Cruz Biotechnology) durante uma hora a temperatura ambiente e marcadas com DAPI. Após a marcação, as lâminas foram montadas com Glicerol (Merck, Darmstadt, Germany). Os experimentos foram realizados em triplicata para cada animal e analisados em microscópio (Zeiss).
Análise histológica dos cortes pelo método da hematoxilina e eosina (HE)
Os tecidos foram colocados em paraformoldeído tamponado a 4% por um período máximo de 24h em temperatura ambiente. Após a fixação, os tecidos foram imersos em álcool etílico em concentrações crescentes (70%, 80%, 95% e 100%), e logo após, foram imersos em xilol e emblocados em parafina, previamente identificados. Em seguida, os materiais foram seccionados no micrótomo rotativo (Biocut 1130 - Reichert-Jung, Munique, Alemanha) com espessura de 5µm e fixados em lâminas de microscopia. Para a visualização das estruturas em microscópio óptico, os cortes foram corados com hematoxilina e eosina. As lâminas são desparafinizadas em estufa e reidratadas com o seguinte procedimento: xilol, álcool etílico em processo decrescente 100%, 95%, 80% e 70%, e então água destilada. Para obter a coloração, as lâminas foram imersas em hematoxilina de Erlich, e em eosina alcoólica 0,5%. Após a coloração, as lâminas foram desidratadas em álcool etílico em concentrações crescentes (70%, 80%, 95% e 100%) e também em xilol. Finalmente as lâminas foram montadas utilizando-se resina Entelan® (Merck, Darmstadt, Germany).
Quantificação diâmetro de fibra muscular
Para a avaliação das dimensões das fibras musculares utilizou-se o programa Axio Vision do microscópio Scope A1 Zeiss. Foram feitas as secções do músculo na transversal e a quantificação do diâmetro das fibras musculares com a área µm².
Análise proteica por immunoblotting
As amostras foram tratadas com tampão de Laemmli (74) contendo DTT 100mM e aquecidas em banho maria seco por 5 minutos. A seguir foram aplicadas em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE 6%) no aparelho para gel (Bio-Rad). Como padrão um marcador de peso molecular com valores estabelecidos em miosina (205-195 kDa), ß-galactosidase (116 kDa), albumina de soro bovino (80 kDa) e ovalbumina (49,5 kDa). A transferência das proteínas separadas no gel foi feita eletricamente para uma membrana de nitrocelulose, através de um aparelho também da Bio-Rad por 2 horas a 120 volts, como descrito por Towbin e colaboradores (75). Porém no tampão será acrescido SDS 0,1% para melhorar a eluição de proteínas de alto peso molecular. A ligação inespecífica de proteínas na membrana de nitrocelulose será diminuída pela incubação destas com uma solução bloqueadora (leite desnatado Molico 5%, Tris 10mM, NaCl 150mM e Tween 20 0,02%) a 4°C overnight. Estas membranas serão então incubadas com 1,3μl de anticorpo secundário e posteriormente incubadas com solução de quimioluminescência (Thermo Scientific SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate). A reação do anticorpo secundário com a solução quimioluminescente foi detectada e visualizada em sistema de imagem gel ChemiDoc™ MP (BIO-RAD modelo 1708280) software Image Lab™ version 5.2.
Método da troca por biotina
O método “Biotin Switch Method” ou “método da troca por biotina” desenvolvido por Samie Jaffrey e Solomon Snyder (76) e identifica os compostos S-nitrosados numa sequência de 3 passos principais. No passo 1, os tióis livres presentes nas proteínas foram bloqueados pela incubação com o agente metil metanotiosulfonato (MMTS). Nas condições utilizadas, o MMTS não é capaz de reagir com os nitrosotióis ou com as pontes dissulfeto pré-existentes. Após o bloqueio dos tióis livres, as ligações dos nitrosotióis são seletivamente decompostas pela adição de ácido ascórbico (passo 2), resultando na redução dos nitrosotióis em tióis. No passo 3, os tióis recém formados reagem com o agente sulfidril-biotinilante específico N-[6-(biotinamido)hexyl]-3´-(2´-pyridyldithio) propionamide (HPDP). Uma vez que o MMTS compete com a biotin-HPDP pelos grupamentos tióis, é necessário remover o MMTS completamente através
da precipitação das proteínas com acetona. As proteínas marcadas podem ser facilmente precipitadas com estreptavidina e detectadas por immunoblotting com os anticorpos específicos.
Método de Biotinilação
Figura esquemática 6 - Uma proteína é indicada com cisteínas em conformação de tiol livre, nitrosotiol e formando
pontes dissulfeto. No passo preliminar, os tióis livres são bloqueados por metiltiolação com MMTS. O MMTS excedente é removido no passo subsequente através de precipitação com acetona. O nitrosotiol é então reduzido com ácido ascórbico formando novamente um tiol livre que reage com a biotin-HPDP.
Tampão 1 (Hepes. NaOH pH 7,7 250 Mm / EDTA 1 mM / Neocuproína 0,1 mM)
Tampão 2 (Tampão 1 / SDS 1%)
Tampão 3 (Hepes. NaOH pH 7,7 20 Mm / NaCl 100 mM / EDTA 1 mM / Triton x-100 0,5%)
Tampão 4 (Tampão 3 / NaCl 600 mM)
Tampão 5 (Hepes.NaOH pH 7,7 20 mM / NaCl 100 mM / EDTA 1 mM / 2 mercaptoetanol 100 mM)
Solução bloqueadora (Tampão 1 / SDS 2,5% / MMTS 20 mM)
1 - Metiltiolação - MMTS
2 - Redução das cisteínas S-nitrosadas 3 - Biotinilação
Análise estatística
Os resultados foram analisados através de teste “t de Student”, quando comparados dois grupos e análise de variância (one-two-way ANOVA) comparações entre mais de dois grupos com teste análise de significância (Bonferroni post-test) quando apropriado, comparando grupos controle e experimentais. A significância estatística foi estabelecida com a média ± SEM. P <0,05. O programa GraphPad Prism versão 5 foi empregado para efetuar as análises.
5. RESULTADOS
S-nitrosoglutationa (GSNO) induz o aumento da S-Nitrosação dos fatores de transcrição FoxO1 e FOXO3A no tecido muscular.
No músculo esquelético, os fatores de transcrição FoxO1 e FoxO3 são conhecidos por induzir atrofia através do aumento da expressão de moléculas relacionadas à proteólise muscular como a muscle-specific RING finger protein 1 (MuRF-1) e atrogin-1/muscle atrophy F-box protein (Atrogin-1/MAFbx). Além da FoxO1, a superexpressão da FoxO3 também é capaz de induzir a expressão Atrogin-1/MAFbx e desencadear o processo de atrofia muscular (28-30). Neste sentido, avaliamos os efeitos do tratamento de 5 dias via intraperitoneal com o doador de NO (GSNO) sobre os efeitos da S-nitrosação em camundongos WT (Fig. 1A). Após 24 horas do último tratamento, extraímos o tecido muscular e observamos o significativo aumento da expressão de iNOS e S-nitrosação dos fatores de transcrição FoxO1 e FoxO3A de camundongos tratados com GSNO (Fig. 1B-C). Baseado nessas evidências fomos examinar a expressão proteica dos marcadores de atrofia muscular muscle-specific RING finger protein 1 (MuRF-1) e atrogin-1/muscle atrophy F-box protein (Atrogin-1/MAFbx). Coletivamente, os animais tratados com GSNO tiveram o aumento da expressão proteica tanto de MuRF-1 quanto Atrogin-1/MAFbx. Por outro lado, houve uma redução da fosforilação de FoxO1 e FoxO3A, além do aumento da fosforilação de Smad2 e Smad3. (Fig. 1D-F) que indicou atividade de proteólise. SMAD’s são proteínas, onde ativam a transcrição de alguns genes. As SMAD’s em seu estado fosforilado inibe a síntese de proteínas como AKT/mTOR (77-79). Por
outro lado, essas moléculas favorecem marcadores de atrofia como MuRF-1 e Atrogin-1/MAFbx (38, 80, 81). Contudo, estes dados indicam que o aumento da expressão da FoxO1 e FoxO3A é capaz de ativar um programa transcricional de genes responsáveis por desencadear a atrofia muscular. Esse processo é capaz de alterar transitoriamente a atividade de determinadas proteínas. Diante deste cenário, fomos averiguar a
expressão dos fatores de transcrição FoxO1 e FoxO3A no núcleo celular de animais tratados com GSNO. Nossos achados evidenciaram que camundongos WT tratados com GSH não apresentação qualquer modulação do fator de transcrição FoxO1 e 3A no núcleo celular. Por outro lado, animais tratados com GSNO apresentaram fortemente o aumento desses fatores no núcleo celular como demonstrado no experimento de extrato nuclear (Fig. 1G). Coletivamente, esses dados sugerem que o óxido nítrico pode modular a atividade dos fatores de transcrição da família FoxO no músculo esquelético em condições de depleção muscular. Para esclarecer se a FoxO1 e 3A poderiam estar realmente no núcleo celular modulando determinados fatores de transcrição, avaliamos as fibras musculares através de imunofluorescência. De acordo com as análises de imunofluorescência, as moléculas FoxO1/3A exibiam sua expressão localizadas principalmente no núcleo celular de roedores tratados com GSNO (Fig.1 H). Paralelamente, a técnica histológica de hematoxilina-eosina HE demonstrou redução da fibra muscular analisado por quantificação do diâmetro de fibra (Fig.1I e J).
Figura 1
B) C)
D) E)
0 500 1000 1500 2000
W ild type GSNO W ild type *** ***P<0.0001vs W ild type D iâ m e tro F ib ra M u s c u la r (u M 2) I) J)
Figura 1. Avaliação da S-nitrosação dos fatores de transcrição FoxO1 e FOXO3Ade camundongos tratados com S-nitrosoglutationa (GSNO). Camundongos de 8 semanas de idade foram submetidos ao tratamento com
injeção intraperitoneal de GSNO (0,1 mol/L) ou glutationa (GSH) duas vezes ao dia (a cada 12h) durante 5 dias. Representação esquemática da produção experimental | GSNO (A). Western blot representando a expressão de iNOS (B). Determinação da S-nitrosação dos fatores de transcrição FoxO1 e FoxO3A quantificado pelo método de
Biotin Switch Method (C). Avaliação da expressão de MURF-1, Atrogin-1/MAFbx, fosforilação de FoxO1, FoxO3A e
fosforilação de Smad2 e Smad3 no tecido muscular gastrocnêmio de camundongos tratados com GSNO (D-F). Extrato nuclear dos fatores de transcrição FoxO1 e FoxO3A (G). Imunofluorescência do tecido gastrocnêmio (H). HE do tecido gastrocnêmio de camundongos tratados com GSNO ou GSH (I). Quantificação do diâmetro de fibra muscular (J). A proteína α-tubulina foi utilizada como controle quantitativo (B e D-F). A proteína HDAC2 foi utilizada como controle quantitativo de extrato nuclear (G). Foram realizados 2 experimentos isolados com n=6-8 animais por grupo. As barras representam a média ± EPM (erro padrão da média), (***P<0,0001) vs Wild type.
