CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA, IMUNOLOGIA E PARASITOLOGIA CURSO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS LICENCIATURA
Damaris Miriã Martins
Detecção de amostras de Staphylococcus aureus em uma população idosa residente em instituição de longa permanência de Florianópolis-SC
Florianópolis 2020
Damaris Miriã Martins
Detecção de amostras de Staphylococcus aureus em uma população idosa residente em instituição de longa permanência de Florianópolis-SC
Trabalho Conclusão do Curso de Graduação em Ciências Biológicas Licenciatura do Centro de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Santa Catarina como requisito para a obtenção do título de Licenciado em Ciências Biológicas
Orientador: Prof.ª. Dra. Fabienne A. Ferreira Coorientador:Dra. Mara Cristina Scheffer
Florianópolis 2020
Damaris Miriã Martins
Detecção de amostras de Staphylococcus aureus em uma população idosa residente em instituição de longa permanência de Florianópolis-SC
Este Trabalho Conclusão de Curso foi julgado adequado para obtenção do Título de “Licenciatura em Ciências Biológicas” e aprovado em sua forma final.
Florianópolis, 13 de Fevereiro de 2020.
________________________ Prof. Dr. Carlos Roberto Zanetti
Coordenador do Curso Banca Examinadora:
________________________ Dra. Mara Cristina Scheffer
Coorientadora
Hospital Universitário Polydoro Ernani de São Thiago
________________________ Prof.ª Dra. Jussara Kasuko Palmeiro
Avaliadora
Universidade Federal de Santa Catarina
________________________ Prof.ª Dra. Maria Luiza Bazzo
Avaliadora
AGRADECIMENTOS
Aos meus pais, por todo amor e apoio concedido ao longo de toda à minha caminhada e que me permitiu chegar até aqui. Ao Tiago Bernardes, por todo carinho, afeto e suporte durante esses anos de graduação, que certamente contribuíram para esse momento.
À Universidade Federal de Santa Catarina por proporcionar uma educação pública, gratuita e de qualidade contribuindo para a democratização do acesso ao ensino superior.
Às duas mulheres incríveis, fortes, que me inspiram e me orientaram no desenvolvimento desse trabalho. Minha orientadora Fabienne Ferreira, que me guiou e não desanimou apesar dos inúmeros desafios, de burocráticos a financeiros, enfrentados ao longo do percurso, estando sempre animada e alto astral. À minha coorientadora Mara Scheffer, sempre solícita, por todo o suporte e contribuição intelectual durante o período de processamento do material clínico e identificação microbiológica.
À instituição SERTE e toda a sua equipe que foram muito receptivos e prestativos, tendo sido fundamentais para a realização deste trabalho. Especial agradecimento à diretora Regina, a Lilian, Letícia e a todos os idosos participantes.
As demais parcerias que contribuíram para o enriquecimento desse trabalho. Profª Raquel Bonelli e Dra. Larissa Botelho, do Instituto de Microbiologia Paulo de Góes da Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ), pela realização do MALDI-TOF. Ao Prof. André Pitaluga pela gentileza em transportar e entregar as amostras na UFRJ.
Ao Prof. Marcos Machado do Departamento de Análises Clínicas da Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC), pela realização das análises estatísticas.
Aos amigos do laboratório de Microbiologia do Hospital Universitário: Juliano, Marcinho Gil, Mattei, Gustavo e Gabriel. Profissionais incríveis e dedicados que realizam seu trabalho com extrema responsabilidade e excelência. Obrigada por todo auxílio durante o processamento e isolamento das amostras.
A todos os colegas do laboratório de Genética Molecular de Bactérias (GEMBac) pela ótima convivência e pelos momentos de descontração, especialmente ao Bruno e Marcel pelo apoio e parceria em inúmeras PCRs. Ao Prof. Ricardo Mazzon por muitos direcionamentos.
Aos laboratórios de Protozoologia (PROTO), de Imunobiologia (LIDI), de Imunologia Aplicada à Aquicultura (LIAA) e Laboratório de Biologia Molecular, Microbiologia e Sorologia (LBMMS) do Hospital Universitário, pela colaboração na
utilização do termociclador, agarose e aparatos de eletroforese que contribuíram para tornar possível a realização desse trabalho.
Aos amigos da biologia que acompanharam com mais proximidade os caminhos e desafios percorridos até a conclusão deste trabalho e que das mais variadas formas contribuíram para a realização deste, especialmente a Natália Valério, Fernando Hartmann, Renan da Silva e Jéssica Andriotti.
E finalmente, a todos meus amigos e amores que foram compreensíveis em relação às ausências dos últimos meses necessárias para a realização desse trabalho. Obrigada!
RESUMO
Staphylococcus aureus é uma bactéria Gram-positiva que faz parte da microbiota anfibiôntica humana. Apesar dessa relação comensal, em algumas situações pode invadir o tecido resultando desde infecções de pele, como furúnculo e impetigo, a infecções invasivas como infecção de corrente sanguínea, osteomielite, artrite séptica, entre outras. O surgimento e disseminação de isolados resistentes a antimicrobianos betalactâmicos (conhecidos como S. aureus resistentes à meticilina; MRSA) resultou em diminuição das opções de tratamento e no aumento da morbidade e mortalidade. No Brasil, país em processo de transição demográfica, a estimativa aponta crescimento da população idosa para os próximos anos. Indivíduos idosos são mais propensos a infecções e entre idosos institucionalizados esse risco é maior. Apesar disso, a epidemiologia de S. aureus e MRSA em instituições de longa permanência para idosos (ILPIs) no Brasil é praticamente desconhecida. Portanto, esse estudo contribui com dados epidemiológicos acerca da detecção de S. aureus e MRSA colonizando idosos residentes em uma ILPI localizada na cidade de Florianópolis, reportados pela primeira vez no Estado de Santa Catarina (SC). Participaram do estudo 15 idosos da Instituição. Para a investigação do status de colonização permanente, intermitente ou não colonizado pela bactéria, foram realizadas três coletas de swab nasal para cada participante, com intervalo de 34 dias entre elas. A identificação de S. aureus foi realizada por coloração de Gram e teste da coagulase e confirmada por MALDI-TOF (matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometer). A identificação de MRSA foi realizada através da técnica de disco difusão com cefoxitina (30µg) e confirmada por meio da amplificação do gene mecA através de reação em cadeia da polimerase (PCR). De forma a avaliar os potenciais fatores de risco associados a aquisição de S. aureus e MRSA, foi realizado um questionário individual sobre os hábitos e histórico de saúde de cada participante. Entre os 15 participantes, a taxa de prevalência da colonização nasal de S. aureus foi de 60% (9/15), dos quais 26,7% (4/15) foram MRSA e 33,3% (5/15) de MSSA (S. aureus sensível à meticilina). Na avaliação do status da colonização (com a participação de 14 indivíduos), 28,5% (4/14) dos idosos foram classificados como portadores permanentes, 28,5% (4/14) como portadores intermitentes e 43% (6/14) como não portadores. Não foi possível estabelecer relações estatisticamente significativas entre os fatores de risco estudados para a colonização por S. aureus ou MRSA. As taxas de detecção reportadas nesse estudo para S. aureus e MRSA foram altas em comparação ao encontrado na literatura. As múltiplas coletas contribuíram com um acréscimo de 26,7% à taxa de detecção nasal de S. aureus, demonstrando a importância destas para o aumento da detecção da colonização nasal por S. aureus, especialmente na detecção de portadores intermitentes. Adicionalmente, a taxa de detecção de MRSA deste estudo foi considerada alta, já que o estado de Santa Catarina parece apresentar baixa prevalência de MRSA (4-8%) de acordo com um estudo de 2015 realizado com amostras hospitalares. Certamente mais estudos são necessários para a determinação da prevalência de S. aureus e MRSA, além dos fatores de risco associados à colonização, entre os idosos institucionalizados da cidade de Florianópolis e do Estado de Santa Catarina. Uma melhor compreensão da epidemiologia poderá servir para o desenvolvimento de estratégias que visem reduzir a disseminação, colonização e a infecção por S. aureus e MRSA em ILPIs.
Palavras-chave: Staphylococcus aureus, MRSA, colonização nasal, idoso, instituição de longa permanência.
ABSTRACT
Staphylococcus aureus is a Gram-positive bacteria that is part of the human microbiota. Despite the commensal relationship, in some situations it can invade the tissue resulting from skin and soft tissue infections, e.g. furuncle and impetigo, to invasive infections, e.g. bloodstream infection, osteomyelitis and septic arthritis. The emergence and dissemination of beta-lactam antibiotic-resistant isolates (known as Methicillin-resistant S. aureus; MRSA) led to a reduction of treatment options and an increasing of morbidity and mortality. In Brazil, a country going through a demographic transition process, the growth of the elderly population is estimated for the next years. Elderly individuals are more prone to infections, especially among institutionalized elders.Despite that, the S. aureus and MRSA epidemiology in long-term care facilities (LTCFs) in Brazil is virtually unknown. Therefore, this study contributes on epidemiologic data about the detection of S. aureus and MRSA colonization among elders residing in an LTCF located in the city of Florianópolis, being reported for the first time in the state of Santa Catarina (SC). Participated in this study 15 elders of this institution. To investigate the colonization status (permanent, intermittent, or non-colonization) by the bacteria, three nasal swab collections were performed for each participant, with a 34 days interval between each collection. The identification of S. aureus was performed by Gram staining and coagulase test and confirmed by MALDI-TOF (matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometer). The identification of MRSA was performed using the disk diffusion method with cefoxitin (30 µg) and confirmed with the amplification of the mecA gene by polymerase chain reaction (PCR). In order to evaluate potential risk factors associated to the acquisition of S. aureus and MRSA, an individual questionnaire was conducted for each patient about their habits and health history. Among the 15 participants, the detection rate of nasal colonization was 60% (9/15), of which 26.7% (4/15) were MRSA and 33.3% (5/15) were MSSA (Methicillin-susceptible S. aureus). In From the colonization status evaluation (in which 14 individuals participated), 28.5% (4/14) of the elders were classified as permanent carriers, 28.5% (4/14) as intermittent carriers and 43% (6/14) as non-carriers. It was not possible to establish statistically significant relationships between the risk factors studied and the S. aureus or MRSA colonization. The detection rates reported in this study for S. aureus and MRSA were high compared to those found in the literature. The multiple collections contributed to an increase of 26.7% to the nasal detection rate of the S. aureus, demonstrating their importance to the increase of detection of the nasal colonization by S. aureus. Additionally, the MRSA rate here was considered high, since the state of Santa Catarina seems to present a low prevalence of MRSA (4-8%) at least according to a study from 2015 conducted with hospital isolates. Further studies are needed to determine the prevalence of S. aureus and MRSA (including the risk factors associated to the colonization), among institutionalized elderly in the city of Florianópolis and the state of Santa Catarina. A better understanding of epidemiology could help the development of strategies aiming to reduce the dissemination, colonization and infection by S. aureus and MRSA in LTCFs.
Keywords: Staphylococcus aureus, MRSA, nasal colonization, elderly, long-term care facilities.
LISTA DE QUADROS
Quadro 1 – Relação das amostras da primeira coleta (05/07) que apresentaram colônia positiva para a fermentação do manitol e foram submetidas ao teste da coagulase...37 Quadro 2 – Relação das amostras da segunda coleta (09/08) que apresentaram colônia positiva para a fermentação do manitol e foram submetidas ao teste da coagulase...37 Quadro 3 – Relação das amostras da terceira coleta (13/09) que apresentaram colônia positiva para a fermentação do manitol e foram submetidas ao teste da coagulase...38 Quadro 4 – Indivíduos colonizados por S. aureus com status da colonização nasal do tipo persistente...41 Quadro 5 – Indivíduos colonizados por S. aureus com status da colonização nasal do tipo intermitente...42 Quadro 6 – Relação dos indivíduos colonizados por MRSA...43 Quadro 7 – Determinação da sensibilidade ou resistência por método fenotípico do tipo disco difusão com cefoxitina (30µg)...46
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Confirmação da identificação dos isolados previamente identificados como S. aureus por meio de MALDI-TOF...39 Tabela 2 – Detecção média (%) da colonização nasal por S. aureus...40 Tabela 3 – Caracterização geral dos indivíduos idosos participantes do estudo relativas ao histórico médico e dados demográficos...47 Tabela 4 – Análise da existência de associação da variante idade como potencial fator de risco para a colonização por S. aureus...49 Tabela 5 – Tabela 5 – Características demográficas e hábitos pessoais como potenciais fatores de risco para à colonização por S. aureus...50 Tabela 6 – Condições de saúde e histórico médico como potenciais fatores de risco para à colonização por S. aureus...51 Tabela 7 – Análise da existência de associação da variante idade como potencial fator de risco para a colonização por MRSA...53 Tabela 8 – Características demográficas e hábitos pessoais como potenciais fatores de risco para colonização por MRSA...53 Tabela 9 - Condições de saúde e histórico médico como potenciais fatores de risco para colonização por MRSA...54
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ATCC – Coleção Americana De Culturas-Tipo (American Type Culture Collection) CA-MRSA – Staphylococcus aureus resistentes à Meticilina associado à
comunidade (community-associated Methicilin resistant Staphylococcus aureus)
CLSI – Instituto de Padrões Clínicos e Laboratoriais (Clinical and Laboratory Standards Institute)
CEPSH – Comitê de Ética em Pesquisa com Seres Humanos EDTA – Ácido Etilenodiamino Tetra-acético
EUA – Estados Unidos da América
HA-MRSA – Staphylococcus aureus resistentes à Meticilina associado ao hospital (hospital-associated Methicilin resistant Staphylococcus aureus) Luk - Leucocidina (Leukocidin)
IBGE – Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística ILPI – Instituição de Longa Permanência para Idosos IPEA – Instituto de Pesquisa Econômica Aplicada IMC – Índice de Massa Corporal
MALDI-TOF – Ionização e Dessorção a Laser Assistida Por Matriz (Matrix Associated Laser Desorption-Ionization - Time of Flight)
MLST – Tipagem através de sequenciamento de multilocus (Multilocus sequencing Typing) MRSA – Staphylococcus aureus resistentes à Meticilina (Methicilin-resistant Staphylococcus aureus)
MSSA – Staphylococcus aureus sensíveis à Meticilina (Methicilin-susceptible Staphylococcus aureus)
PBP – Proteína ligante de Penicilina (Penicilin-binding protein) PCR – Reação em cadeia da Polimerase (Polymerase chain reaction) PVL – Leucocidina de Panton-Valentine (Panton-Valentine Leukocidin)
SCCmec – Cassete Cromossômico Estafilocócico mec (Staphylococcal cassette chromosome mec)
SERTE – Sociedade Espírita de Recuperação, Trabalho e Educação SISAP – Sistema de Saúde e Acompanhamento de Políticas do Idoso SUAS – Sistema Único de Assistência Social
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ... 16
1.1 O GÊNERO Staphylococcus E Staphylococcus aureus ... 16
1.2 COLONIZAÇÃO NASAL POR S. aureus ... 16
1.3 INFECÇÕES POR S. aureus ... 18
1.4 PATOGÊNESE DE S. aureus ... 20
1.5 S. aureus RESISTENTE À METICILINA (MRSA) ... 22
1.6 POPULAÇÃO IDOSA E INSTITUIÇÕES DE LONGA PERMANÊNCIA PARA IDOSOS NO BRASIL ... 25
1.7 COLONIZAÇÃO POR S. aureus E MRSA EM ILPI ... 26
2 JUSTIFICATIVA ... 27
3 OBJETIVOS ... 29
3.1 OBJETIVO GERAL ... 29
3.1.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 29
4 MATERIAIS E MÉTODOS ... 30
4.1 AMOSTRAGEM E CARACTERÍSTICAS DA POPULAÇÃO ... 30
4.2 COLETA E PROCESSAMENTO DO MATERIAL CLÍNICO ... 31
4.3 ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DE S. aureus ... 32
4.4 IDENTIFICAÇÃO DA RESISTÊNCIA À METICILINA ... 33
4.4.1 Fenotípica ... 33
4.4.2 Molecular ... 34
4.5 AVALIAÇÃO DOS FATORES DE RISCO ... 35
5 RESULTADOS ... 36
5.1 COLONIZAÇÃO E PREVALÊNCIA DE S. aureus ... 36
5.2 STATUS DA COLONIZAÇÃO ... 41
5.3 PERCENTUAL DE RESISTÊNCIA (MRSA) E MSSA ... 42
5.5 FATORES DE RISCO PARA AQUISIÇÃO DE S. aureus ... 49
5.6 FATORES DE RISCO PARA AQUISIÇÃO DE MRSA ... 52
6 DISCUSSÃO ... 57
7 CONCLUSÃO ... 65
7.1 CONCLUSÃO ... 65
7.2 PERSPECTIVAS ... 65
1 INTRODUÇÃO
1.1 O GÊNERO Staphylococcus E Staphylococcus aureus
O gênero Staphylococcus, atualmente compreendido por cinquenta e quatro espécies (LPSN, 2019), é composto por bactérias esféricas, gram-positivas, com cerca de 1 μm de diâmetro e frequentemente agrupadas em forma de cachos irregulares. São microrganismos anaeróbicos facultativos, imóveis e não esporulados. Estafilococos também são considerados catalase-positivo pela presença da enzima catalase, que converte o peróxido de hidrogênio em oxigênio e água (CARROLL, 2014).
Staphylococcus aureus, Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus epidermidis e Staphylococcus lugdunensis são algumas das espécies de maior frequência e importância clínica. Entre os estafilococos de importância clínica para humanos, apenas S. aureus é denominado coagulase-positivo, devido à produção de uma proteína que coagula o plasma na presença do fator protrombina contido no soro, característica que contribui para a diferenciação da espécie (CARROLL, 2014). S. aureus apresenta colônias arredondadas, lisas, brilhantes e de coloração amarela quando crescidas em ágar. Também possui a capacidade de fermentar o manitol, produzindo ácido lático, e crescer na presença de até 10% de cloreto de sódio (MURRAY; ROSENTHAL; PFALLER, 2009; SANTOS et al., 2007).
S. aureus pode ser encontrado em locais de circulação humana, sendo o homem o seu principal reservatório (SANTOS et al. 2007), são constituintes da microbiota anfibiôntica, frequentemente encontrado na pele, fossas nasais, garganta e trato gastrintestinal de pessoas saudáveis (CARROLL, 2014). Outros sítios como região perianal, vagina, e axila podem apresentar colonização (SAKR et al., 2018). Apesar de ser uma espécie comensal humana, S. aureus também apresenta relevante importância clínica (JENUL; HORSWILL, 2018), estando entre os microrganismos que mais causam infecções associadas à assistência à saúde e à comunidade, além de ser um dos principais patógenos relacionados a causas de morbimortalidade no mundo (WERTHEIM et al., 2008; ZHANG et al., 2018).
1.2 COLONIZAÇÃO NASAL POR S. aureus
Apesar de colonizar diferentes sítios, a cavidade nasal é o local de maior frequência de detecção de S. aureus. O início da colonização pode ocorrer ainda nos primeiros dias de
vida (SAKR et al., 2018). Estima-se que as narinas de 30% da população humana adulta e saudável seja colonizada por S. aureus (KRISMER et al., 2017).
Em relação ao status da colonização nasal, os indivíduos podem ser classificados como não portadores, portadores persistentes e portadores intermitentes (PAN et al., 2005). Indivíduos colonizados de forma persistente apresentam detecção da bactéria em coletas consecutivas em um determinado intervalo de tempo entre estas. Estes indivíduos apresentam, em geral, uma carga bacteriana maior e um risco de infecção aumentado em comparação a colonizados intermitentemente (SAKR et al., 2018). Indivíduos colonizados de forma intermitente apresentam intervalos de detecção e não detecção da bactéria em coletas consecutivas. O status da colonização nasal entre adultos saudáveis é de aproximadamente 20% persistente e 30% intermitente, enquanto 50% são classificados como não portadores (WERTHEIM et al., 2008).
Não há uma definição precisa na literatura sobre o número de vezes que devem ser coletadas as amostras biológicas para determinar o status da colonização por S. aureus (SAKR et al., 2018). No entanto, é necessária a realização de, no mínimo, duas coletas sequenciais (NOUWEN et al., 2004). Diversos estudos também adotam diferentes intervalos de tempo entre as coletas, variando de 7 até 60 dias (MEHRAJ et al., 2016; NOUWEN et al. 2004; VAN BELKUM et al., 2009;). Os indivíduos são classificados como portadores persistentes de S. aureus quando pelo menos duas amostras coletadas de forma consecutiva são positivas para a bactéria; portadores intermitentes apresentam intermitência na positividade entre as coletas consecutivas; e, finalmente, o status de não portador é definido quando em todas as amostras coletadas não é detectada a bactéria (WERTHEIM et al., 2008).
É possível que existam correspondências entre fatores bacterianos e fatores do hospedeiro que resultem no status da colonização, mas estes não são, ainda, totalmente definidos (SAKR et al., 2018). Em um estudo publicado em 2004 por Nouwen e colaboradores, observou-se que quando indivíduos não portadores foram inoculados com uma mistura de diferentes cepas de S. aureus, a maioria (seis entre oito participantes) retornou ao seu status inicial (não colonizado) entre 2-23 semanas após a inoculação. Quando os indivíduos portadores persistentes foram inoculados com a mesma mistura, a maioria deles (sete entre onze participantes) selecionaram para a sua cepa residente original após 2-13 semanas (NOUWEN et al., 2004). O retorno ao status não portador pode estar relacionado à ocupação do nicho por outras espécies de microrganismos, impedindo o estabelecimento de S. aureus no local (NOUWEN et al., 2004; ZIPPERER et al., 2016). A colonização nasal pode
ser modulada pela presença de outras espécies bacterianas que competem pelo mesmo nicho, eliminando ou modulando a abundância de S. aureus por meio da síntese de moléculas anti-estafilococos. A produção de peróxido de hidrogênio (H2O2) por Streptococcus pneumoniae e
de um composto denominado lugdunina por Staphylococcus lugdunensis, pode ser bactericida sobre S. aureus (SAKR et al., 2018; ZIPPERER et al., 2016). Também foi observada uma baixa incidência (8,5%) de colonização por S. aureus em portadores de corinebactérias quando comparado a não portadores (44,5%). Após inoculações de Corynebacterium sp. em indivíduos saudáveis portadores de S. aureus, foi observada uma taxa de 71% de erradicação nasal de S. aureus (UEHARA et al., 2000). A colonização nasal também pode estar relacionada a respostas imunológicas do hospedeiro e a outros fatores predisponentes, tais como infecção por HIV, infecção de pele, dermatite atópica, entre outros (SAKR et al. 2018).
De acordo com diversos estudos (BROWN et al., 2014; KRISMER et al., 2017; WERTHEIM et al., 2008), a colonização nasal é um fator de risco bem definido para o desenvolvimento de infecções nosocomiais ou adquiridas na comunidade. Indivíduos hospitalizados, colonizados por S. aureus, apresentam maior risco de desenvolver infecção de corrente sanguínea em relação aos indivíduos não colonizados, sendo o isolado nasal do portador, frequentemente, o agente da infecção (KRISMER et al., 2017). Também é reportado que cerca de 80% das infecções invasivas por S. aureus são autoinfecções de isolados presentes na cavidade nasal do hospedeiro (WERTHEIM et al., 2008).
1.3 INFECÇÕES POR S. aureus
Em geral, as infecções decorrem do comprometimento de barreiras epiteliais, por exemplo, procedimentos cirúrgicos ou feridas, permitindo o alcance de S. aureus ao tecido subjacente ou a corrente sanguínea, que podem resultar desde infecções de menor gravidade a infecções invasivas e de alta morbidade e mortalidade (LEE et al., 2018).
S. aureus é o principal agente responsável por uma diversidade de infecções de pele e tecidos moles, sendo o microrganismo mais frequentemente isolado em celulites purulentas e abcessos cutâneos. Outras infecções de pele e tecidos moles como furunculose, foliculite e impetigo, também podem ser relacionados à S. aureus (TONG et al., 2015). De um modo geral, embora as infecções invasivas causadas por S. aureus sejam mais graves, as infecções de pele e tecidos moles são as mais frequentes, sendo normalmente crônicas e recorrentes (BROWN et al., 2014). A partir das infecções de pele e tecidos moles, a bactéria pode atingir
tecidos adjacentes, podendo causar infecções invasivas. Na piomiosite, por exemplo, infecção no músculo esquelético com formação de abcessos, S. aureus é frequentemente o agente causador (COMEGNA et al., 2016). A piomiosite pode progredir, em alguns casos, para fasciíte necrosante, sendo esta uma infecção de rápida progressão e alta gravidade (COMEGNA et al., 2016).
Em outras infecções invasivas, como as infecções osteoarticulares (osteomielite e artrite séptica), S. aureus é o patógeno mais comumente encontrado (TONG et al., 2015). Em um estudo brasileiro sobre infecção osteoarticular pediátrica, S. aureus foi o principal microrganismo associado, com ocorrência em 54,5% dos casos (JAÑA NETO; ORTEGA; GOIANO, 2018). Adicionalmente, um estudo colaborativo internacional realizado por Fowler e colaboradores (2005), compreendendo dados de 16 países, demonstrou que S. aureus foi o principal patógeno associado à endocardite infecciosa, sendo responsável por 31,4% dos casos. No Brasil, estudo publicado recentemente também reportou S. aureus como o microrganismo predominante em endocardites infeciosa, sendo responsável por 30,1% dos casos (DAMASCO et al., 2019). A endocardite infeciosa é uma doença de baixa frequência, no entanto de alta gravidade e com taxa de mortalidade em torno de 25% (AMBROSIONI et al., 2017).
As infecções de corrente sanguínea tendo S. aureus como agente etiológico são bem documentadas e a taxa de prevalência chega a 30% das infecções, com maior incidência nos primeiros anos de vida e em indivíduos idosos (DIEKEMA et al., 2019; TONG et al., 2015). No Brasil, em estudo realizado em uma unidade de hemodiálise localizada na cidade de São Paulo, S. aureus foi o agente mais prevalente (32,1%) em infecção de corrente sanguínea (FRAM et al., 2015). Em outro estudo brasileiro, realizado em 16 hospitais de 5 regiões geográficas do país, S. aureus também foi o microrganismo mais prevalente em infecções de corrente sanguínea, com 15,3% das infecções atribuídas a esta bactéria (CAMARGO et al., 2015). S. aureus ainda pode ser o patógeno responsável por infecções como pneumonia nosocomial e pneumonia adquiridas na comunidade (TONG et al., 2015), além de meningite e sepse (ZHANG et al., 2018). Ademais, também é a causa mais comum de infecções relacionadas à utilização de dispositivos médicos implantáveis, como cateteres periféricos e profundos, próteses osteoarticulares, dispositivos cardíacos, entre outros. Estas infecções estão principalmente relacionadas à formação de um biofilme na superfície desses dispositivos. O biofilme constitui comunidades microbianas complexas aderidas a uma superfície e que costumam ser refratárias ao tratamento antimicrobiano e a atuação do sistema
imunológico, levando a cronificação da infecção e a necessidade de remoção cirúrgica do dispositivo médico implantado (TONG et al., 2015).
1.4 PATOGÊNESE DE S. aureus
S. aureus é um microrganismo bem sucedido na colonização e na infecção dos mais diversos tecidos e locais do corpo. A presença e expressão de uma ampla variedade de fatores de virulência contribuem para a patogenicidade de S. aureus. Esses fatores incluem proteínas de superfície celular e liberação de moléculas diretamente no ambiente extracelular, que podem promover adesão às células hospedeiras e evasão do sistema imune, degradação tecidual e/ou aquisição de nutrientes (JENUL; HORSWILL, 2018). Para uma colonização bem sucedida, S. aureus expressa proteínas com funções adesivas que interagem com a superfície celular do hospedeiro. Na colonização nasal, as principais proteínas de superfície que parecem estar envolvidas na adesão ao epitélio são o fator clumping B (ClfB) e o determinante de superfície regulado por ferro A (IsdA) (SAKR et al., 2018). Wertheim e colaboradores (2008) avaliaram o papel de ClfB na colonização nasal inoculando uma cepa mutante ClfB- (knockout) nas narinas de voluntários. O resultado demonstrou que a cepa mutante foi eliminada mais rapidamente do que a cepa do tipo selvagem, que persistiu por 28 dias após a inoculação em 19% dos voluntários contra 0% do tipo mutante. As proteínas de superfície SasG e SasX, entre outras, também são importantes na adesão e interação da bactéria com as células do hospedeiro (SAKR et al., 2018).
A fagocitose por macrófagos e neutrófilos é o principal mecanismo atuante no controle de S. aureus pelo sistema imunológico. No entanto, S. aureus possui uma variedade de mecanismos que contribuem para subverter e evadir as respostas imunes inatas do hospedeiro, que incluem a capacidade de sobreviver no interior de células de defesa, evitar a captura por fagócitos e a síntese de diversas toxinas com função citolítica específica, como as leucocidinas, que lisam leucócitos e outros tipos de células (POLLITT et al., 2018) S. aureus também possui a capacidade de inibir o extravasamento e a quimiotaxia de neutrófilos pela produção de exoproteínas estafilocócicas do tipo superantígeno (SSL), proteína inibidora da quimiotaxia de S. aureus (CHIPS), entre outras (THAMMAVONGSA et al., 2015). A ativação do sistema complemento, a fagocitose e a morte das bactérias fagocitadas pelos neutrófilos é inibida pela expressão de uma variedade de fatores que interferem na opsonização (proteína A – Spa; SSL), clivam (aureolisina - Aur) peptídeos antimicrobianos
(DltA-D; MprF), reduzem o estresse oxidativo (catalase KatG), entre outros, impedindo a degradação bacteriana. Além disso, S. aureus também possui a capacidade de prejudicar as funções ou promover a lise das células do sistema imune do hospedeiro pela secreção de toxinas formadoras de poros (β-PFTs), que formam poros na bicamada lipídica da bactéria promovendo alterações fisiológicas celulares. Diversas β-PFTs são também denominadas hemolisinas e, em geral, os isolados de S. aureus secretam ao menos três: HlgA, HlgB e HlgC. Adicionalmente, outros isolados também podem expressar leucocidinas, como a Leucocidina de Panton-Valentine (PVL), LukED ou LukMF (THAMMAVONGSA et al., 2015). Outra característica comum a todos os S. aureus e que contribui para a patogênese é a capacidade de formar coágulo pela expressão de duas proteínas com potencial de coagulação: coagulase A (Coa) e proteína de ligação ao fator von Willebrand (vWbp). Essas duas proteínas associadas convertem a protrombina contida no plasma em estafilotrombina ativa, que converte o fibrinogênio em uma malha de fibrina na superfície estafilocócica, porém sem ativar outros fatores de inflamação que normalmente seriam ativados pela trombina (CROSBY; KWIECINSKI; HORSWILL, 2016; THAMMAVONGSA et al., 2015). Essa aglutinação de S. aureus com a rede de fibrina parece fornecer proteção contra neutrófilos e fagocitose, circunscrevendo o sítio infeccioso (THAMMAVONGSA et al., 2015).
S. aureus também é capaz de formar biofilme na superfície de dispositivos médicos implantados. O biofilme é uma comunidade de bactérias sésseis imersas em uma matriz extracelular composta por água, polissacarídeos, nutrientes, proteínas e DNA (TONG et al., 2015), que fornece um microambiente único, contribuindo para a aptidão de S. aureus em ambientes hospitalares (FIGUEIREDO et al., 2017). Os mecanismos envolvidos na formação do biofilme são diversos, de modo que a predominância dos componentes do biofilme pode variar de acordo com os sinais do ambiente, oferecendo vantagens na aptidão de S. aureus na colonização e infecção de diferentes órgãos e tecidos (FIGUEIREDO et al., 2017). Além disso, para colonizar um dispositivo estima-se que é necessária uma carga bacteriana 10.000 vezes mais baixa do que a necessária para causar um abscesso na pele, provavelmente devido a não vascularização e menor presença de fatores imunes (PAHARICK; HORSWILL, 2016). S. aureus inicia a adesão ao dispositivo por meio de uma variedade de proteínas de superfície, ancoradas na parede celular, que são capazes de aderir aos componentes da matriz depositada pelo hospedeiro como fibrinogênio, fibronectina e colágeno. Entre estas proteínas, a proteína de ligação à fibronectina (FnBPA e FnBPB), fatores clumping (ClfA e ClfB), determinantes de superfície regulados por ferro (IsdA, IsdB, IsdC e IsdH), entre outras, são relacionadas à
adesão ao substrato da matriz hospedeira, além de outras ligações como interações eletrostáticas e hidrofóbicas (MOORMEIER; BAYLES, 2017). Após a etapa de adesão, o processo de formação do biofilme ainda passa pelas seguintes etapas: multiplicação, marcada por intensa proliferação celular; êxodo, onde algumas células se desprendem do biofilme; maturação, acumulação e aumento da área superficial do biofilme. Também na fase de maturação, subpopulações podem se desprender e se dispersar iniciando novos focos de infecção (FIGUEIREDO et al., 2017). O biofilme proporciona uma matriz protetora para S. aureus, formando uma barreira que dificulta a difusão de antimicrobianos e a atuação do sistema imune do hospedeiro, dificultando o tratamento da infecção e erradicação do biofilme (TONG et al., 2015).
S. aureus também é capaz de produzir uma variedade de exotoxinas, sendo responsável por uma série de doenças mediadas por toxinas como síndrome da pele escaldada, intoxicação alimentar estafilocócica e síndrome do choque tóxico (JENUL; HORSWILL, 2018).
1.5 S. aureus RESISTENTE À METICILINA (MRSA)
As infecções por isolados S. aureus resistentes à meticilina (MRSA) estão associadas a taxas de mortalidade mais altas quando em comparação a infecções causadas por isolados suscetíveis à meticilina (MSSA). Além disso, MRSA aumentam o tempo de internação hospitalar e os custos associados à assistência médica. Essas infecções geralmente representam de 25% a 50% do total de infecções hospitalares por S. aureus (LAKHUNDI; ZHANG, 2018). No entanto, a taxa de infecções por MRSA pode variar amplamente entre os países, com cerca de 2% em alguns países escandinavos a mais de 90% em alguns países africanos (OMS, 2014).
No início dos anos 1940, S. aureus apresentava sensibilidade à penicilina. De 1944 a 1945, isolados produtores de betalactamase, enzima que hidrolisa o anel betalactâmico da penicilina, inativando-a, começaram a ser registrados em diversos hospitais, limitando o uso deste antimicrobiano. A partir de 1950, a resistência à penicilina passou a prevalecer entre os isolados de S. aureus em hospitais (ROSSI; ANDREAZZI, 2005). A meticilina, uma penicilina semissintética, foi lançada em 1960 como alternativa ao tratamento de infecções causadas por S. aureus resistentes à penicilina. Porém, um ano após a introdução do novo fármaco, surgiram relatos de isolados resistentes à meticilina e aos demais betalactâmicos,
sendo denominados MRSA (Methicillin-resistant Staphylococcus aureus), de modo que as opções terapêuticas para o tratamento de infecções causadas por S. aureus ficaram limitadas a poucos antimicrobianos (ROSSI; ANDREAZZI, 2005).
S. aureus é uma espécie bacteriana que possui um genoma central bastante conservado. O desenvolvimento da resistência a antimicrobianos é impulsionado principalmente por mutações no DNA bacteriano ou pela aquisição de DNA exógeno por mecanismos de transferência horizontal de genes (JENUL; HORSWILL, 2018). O surgimento do MRSA está associado à aquisição de um elemento genético móvel denominado SCCmec (staphylococcal cassette chromosome mec), no qual está inserido o gene mecA (LEE et al., 2018). O gene mecA é responsável por codificar uma proteína PBP (penicillin-binding protein) alternativa, denominada PBP2a. Diferente das outras PBPs, a PBP2a possui baixa afinidade pela meticilina e outros betalactâmicos, de modo que essas moléculas não são capazes de ligar-se ao receptor da proteína para impedir a síntese da parede celular bacteriana, resultando na ineficácia dos fármacos (MIMICA; MENDES, 2007).
No ano de 2007, foi detectado um isolado de MRSA pelo teste de disco difusão em ágar com cefoxitina e oxacilina em amostras de leite no Reino Unido (Inglaterra). No entanto, os repetidos testes para o gene mecA e PBP2a foram negativos. Mais tarde, o sequenciamento do genoma deste isolado revelou a presença de um gene semelhante (69%) ao mecA, que expressa uma proteína com cerca de 63% de similaridade à PBP2a original. O gene foi denominado mecC pelo Grupo de Trabalho Internacional para a Classificação dos Elementos Cromossômicos de Cassetes Estafilocócicos (IWG-SCC). Desde então, isolados de MRSA positivos para a presença do gene mecC foram identificados também em humanos (LAKHUNDI; ZHANG, 2018). Além do gene mecA ou mecC, que conferem resistência aos betalactâmicos, também podem estar presentes no SCCmec de MRSA vários outros elementos genéticos, incluindo elementos de inserção, plasmídeos e transposons. Com base nas variações estruturais e genéticas encontradas em SCCmec presentes em diferentes amostras de MRSA, estes elementos foram classificados, até o momento, em 13 tipos (I a XIII) (LAKHUNDI; ZHANG, 2018). Alguns tipos de SCCmec também conferem aos MRSA resistência a outras classes de antimicrobianos como aminoglicosídeos, macrolídeos e tetraciclinas (FIGUEIREDO; FERREIRA, 2014). Além disso, a resistência a betalactâmicos em alguns isolados MRSA podem não estar associada à aquisição do SCCmec, mas ser decorrente da hiperprodução de enzima betalactamase (SANTOS et al., 2007).
Por muito tempo, as infecções por MRSA foram relacionadas majoritariamente a ambientes hospitalares, denominada HA-MRSA (hospital-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus), em pacientes com fatores de risco conhecidos (NAIMI et al., 2003). Esse perfil epidemiológico foi alterado nas últimas décadas pela emergência de infecções causadas por MRSA oriundas da comunidade, denominada CA-MRSA (community-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus). Em geral, existem algumas características genotípicas e fenotípicas que são diferentes entre S. aureus comunitário e S. aureus causador de infecções hospitalares. CA-MRSA normalmente são menos resistentes a antibióticos não betalactâmicos, favorecendo o tratamento das infecções (LAKHUNDI; ZHANG, 2018). Além disso, geralmente apresentam elevado potencial de virulência, que é associado à presença dos genes lukS-PV e lukF-PV, que codificam a leucocidina denominada PVL (mencionada anteriormente), capaz de lisar e induzir a apoptose de leucócitos (THAMMAVONGSA et al., 2015). Por algum tempo, isolados HA-MRSA foram associados principalmente a SCCmec do tipo I, II ou III, enquanto CA-MRSA eram associados a detecção de SCCmec IV e V (GELLATI et al. 2009). Isolados CA-MRSA eram limitados a populações sem contato com estabelecimentos de saúde e associados principalmente a infecções de menor gravidade, como infecções de pele e tecidos moles. No entanto, atualmente uma distinção epidemiológica e molecular de CA-MRSA e HA-MRSA não é bem definida, visto que isolados CA-MRSA e HA-MRSA podem ser encontrados nos mais diversos ambientes, de hospitalares a ambulatoriais (LAKHUNDI; ZHANG, 2018).
Isolados MRSA também podem ser encontrados colonizando e causando infecções em diversos tipos de animais, relacionados principalmente a extensiva utilização de antimicrobianos na pecuária, sendo denominados LA-MRSA (livestock-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus). Esses animais são considerados reservatórios de MRSA, de modo que humanos em contato com estes tem alto risco de colonização e infecção por LA-MRSA, contribuindo para a disseminação de isolados resistentes (LAKHUNDI; ZHANG, 2018).
Em estudo publicado recentemente sobre a tendência da suscetibilidade de S. aureus a antimicrobianos nos últimos 20 anos, o Programa de Vigilância Antimicrobiana (SENTRY) avaliou a atividade in vitro de antimicrobianos em isolados clínicos coletados de 427 centros, em 45 países, entre 1997 a 2016 (DIEKEMA et al., 2019). No total, 191.460 isolados de S. aureus provenientes de infecções sanguíneas, pneumonia nosocomial, trato urinário e infecções de pele foram avaliados, entre os quais 77.146 eram MRSA, uma prevalência geral
de 40,3%. A taxa de isolados MRSA é maior em ambiente hospitalar, embora a taxa de isolados na comunidade também seja bastante representativa. Entre os isolados oriundos da comunidade, 36,8% eram MRSA contra 47,0% dos isolados nosocomiais. O mesmo estudo reportou que a proporção de infecções por MRSA alcançou seu pico há uma década (44,2%) e desde então, caiu para 42,3% em 2009–2012 e posteriormente para 39,0% em 2013–2016. A prevalência de MRSA também variou geograficamente, de 26,8% (Europa) a 47,0% (América do Norte). Para a América Latina a taxa reportada foi de 38,7% (DIEKEMA et al., 2019). Em outro estudo, envolvendo isolados de infecção de corrente sanguínea de hospitais de nove países da América Latina, o Brasil foi o país que apresentou maior taxa de isolados MRSA (62,0%), seguido por Venezuela e México (57%), Peru e Guatemala (54%), Chile e Argentina (40 e 45%) e finalmente Equador e Colômbia com 29% e 22%, respetivamente (ARIAS et al., 2017).
1.6 POPULAÇÃO IDOSA E INSTITUIÇÕES DE LONGA PERMANÊNCIA PARA IDOSOS NO BRASIL
Estimativas sugerem que a população idosa deve seguir aumentando em todo o mundo nos próximos anos. Um relatório recente publicado pelas Nações Unidas estimou que em 2030, 11,7% da população mundial terá idade igual ou superior a 65 anos. Na América do Sul, a estimativa é de que 12,8% da população tenha idade igual ou superior a 65 anos em 2030, um crescimento de 3,6% em 10 anos (NAÇÕES UNIDAS, 2019).
No Brasil, a população idosa segue ascendendo rapidamente. De acordo com a legislação brasileira, são consideradas idosas as pessoas com idade igual ou superior a 60 anos (BRASIL, 2003). Segundo informações do IBGE (Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística), nos últimos cinco anos o número de pessoas idosas aumentou em 4,789 milhões de pessoas, alcançando um total de 30,275 milhões de idosos em 2017 (IBGE, 2018). De acordo com a projeção do IBGE, esta população deverá seguir em expansão de modo que, em 40 anos, 25,5% da população brasileira seja composta por indivíduos idosos.
Apesar desse cenário, no Brasil há escassez de dados recentes acerca da quantidade de Instituições de Longa Permanência para Idosos (ILPIs) e de idosos residentes nessas instituições. As ILPIs são instituições caracterizadas como residências coletivas, destinadas a idosos em situação de carência de renda e/ou de família ou aqueles com algumas dificuldades para o desempenho das atividades diárias, que necessitem de cuidados prolongados, ou seja,
são domicílios coletivos que além da moradia, oferecem cuidados e alguns serviços de saúde (CAMARANO; KANSO, 2010; QUADROS; PATROCINIO, 2015). Uma pesquisa realizada pelo IPEA (Instituto de Pesquisa Econômica Aplicada), no período de 2007 a 2009, apontou que 83 mil idosos residiam em ILPIS e localizou um total de 3.548 instituições no território brasileiro, das quais 65,5% eram filantrópicas contra 28,2% de instituições privadas e 6,6% de instituições públicas (IPEA, 2011). O censo realizado pelo SUAS (Sistema Único de Assistência Social) em 2018, que diz respeito a instituições públicas ou que recebem recursos do poder público, reportou a existência de 1.778 instituições no território brasileiro divididas em filantrópicas (89,3%) e públicas (10,7%) caracterizadas por serem, em sua maioria (42,5%), instituições pequenas, com capacidade de atendimento de 21-40 pessoas (SUAS, 2019). Também foi observado crescimento (33%) no total de idosos que residem em ILPIs públicas ou filantrópicas no período de 2012-2017 (SUAS, 2018). Não foram encontrados dados recentes acerca do número total de ILPIs privadas no país e do percentual de idosos residentes, mas há indícios de que esse número atualmente seja significativamente maior do que o reportado pela pesquisa do IPEA em 2011, visto que no período de 2000-2010 foi observado um crescimento acentuado nas ILPIs com fins lucrativos (64,2%) (IPEA, 2011) e que este se constitui em um segmento do mercado em expansão, devido ao envelhecimento da população brasileira.
De acordo com o IBGE, a população estimada em Florianópolis no ano de 2019 é de 500.973 pessoas. Desse total, segundo o SISAP (Sistema de Saúde e Acompanhamento de Políticas do Idoso) 15,73% (78.650) da população florianopolitana é composta por pessoas com mais de 60 anos de idade (FIOCRUZ, 2018). A região sul conta com 282 instituições para idosos cadastradas no SUAS, das quais 36 estão localizadas no estado de Santa Catarina (SUAS, 2018).
1.7 COLONIZAÇÃO POR S. aureus E MRSA EM ILPI
Existem diversos relatos de surtos por S. aureus e MRSA na comunidade, principalmente em instituições onde o contato entre os indivíduos é bastante próximo, tal como entre recrutas militares (ZINDERMAN et al, 2004), atletas (WILLIAMS et al., 2015), crianças em creches (LEISTNER et al., 2017), tripulantes de navio (ZINDERMAN, MACKDONALD E LAMAR, 2003) e instituições correcionais (BOURIGAULT et al., 2014). Do mesmo modo, encontrar indivíduos colonizados por MRSA em instituições de longa
permanência para idosos é comum (BATINA et al., 2016). De acordo com Zhang e colaboradores (2015), idosos institucionalizados representam potenciais reservatórios de S. aureus e MRSA e residir em ILPIs é considerado um fator de risco para a aquisição destes microrganismos (ALMEIDA et al., 2014; GARAZI et al., 2009). De fato, um estudo comparativo entre idosos com mais de 60 anos residentes em ILPI e em residência familiar revelou uma taxa maior de colonização por S. aureus entre os idosos residentes em instituições de longa permanência quando comparado aos demais idosos participantes (24,4% vs. 19,7%, respectivamente). A taxa de MRSA também foi superior para idosos institucionalizados (5,7% vs. 1,5% não institucionalizados) e residir em ILPI foi reportado como fator de risco tanto para a colonização por S. aureus como por MRSA (ALMEIDA et al., 2014). Muitos idosos apresentam a condição de fragilidade, que pode ser entendida como o declínio de diversos sistemas fisiológicos, tornando a pessoa idosa vulnerável a eventos estressores menores, além da diminuição da capacidade de realizar tarefas cotidianas e consequente aumento da dependência (CLEGG et al., 2013). A fragilidade é medida por testes que avaliam a capacidade de cognição, independência funcional, estado geral de saúde, desempenho funcional, entre outros (BORGES et al., 2013). A população idosa institucionalizada geralmente apresenta maior taxa de fragilidade (BORGES et al., 2013) quando comparada a idosos não institucionalizados (CARNEIRO et al., 2017) e essa taxa tende a aumentar com o avançar da idade (BORGES et al., 2013; CARNEIRO et al., 2017). O envelhecimento associado à maior taxa de fragilidade reportada para idosos institucionalizados sugere que pessoas idosas que residem em ILPIs têm um maior risco de colonização e de desenvolver infecções por S. aureus e MRSA.
2 JUSTIFICATIVA
Atualmente, o Brasil é um país em transição demográfica, com índices de natalidade e fecundidade em queda e aumento da expectativa de vida, refletindo mudanças no perfil populacional, com aumento da representatividade da população idosa. Embora o número de instituições de longa permanência para idosos ainda seja relativamente pequeno no Brasil, a tendência é de crescimento, devido ao envelhecimento populacional e consequente aumento na demanda por essas instituições. Com base nesta demanda, fazem-se necessários estudos relacionados ao monitoramento da qualidade de vida e prevenção de infecções e doenças na população idosa, principalmente da população institucionalizada, que tende a apresentar
maiores taxas de fragilidade quando comparada a população idosa não institucionalizada. Neste contexto, a investigação epidemiológica da colonização por S. aureus e MRSA em idosos institucionalizados, bem como o estudo dos fatores de riscos associados à esta colonização contribuem para a adoção de estratégias de controle da transmissão e prevenção das infecções por S. aureus nesta população.
Adicionalmente, acerca de nosso conhecimento, não existem estudos publicados sobre a prevalência da colonização por S. aureus na população do Estado de Santa Catarina. Além disso, apenas um estudo foi publicado sobre amostras MRSA associadas a infecções no Estado (SILVEIRA et al., 2015). Desta forma, é praticamente desconhecida a epidemiologia de S. aureus e MRSA na população absoluta e em idosos institucionalizados de Santa Catarina. Assim, o presente trabalho objetiva contribuir no estudo da colonização por S. aureus na população idosa institucionalizada, apresentando dados epidemiológicos pela primeira vez no Estado de Santa Catarina. O estudo contemplou amostras biológicas das fossas nasais coletadas de idosos residentes do Lar dos Idosos Irmão Erasto (localizado em Florianópolis-SC), que foram estudadas quanto a presença de S. aureus, classificando-os como MSSA ou MRSA. Além disso, foram investigados potenciais fatores de risco associados à colonização por estes microrganismos.
3 OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL
Investigar a presença de S. aureus colonizando a cavidade nasal de um grupo de idosos residentes no Lar dos Idosos Irmão Erasto (Florianópolis, SC), bem como estabelecer os fatores de risco relacionados à esta colonização.
3.1.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Isolar e identificar S. aureus colonizando a cavidade nasal de idosos residentes na Instituição Lar dos Idosos Irmão Erasto;
Detectar a presença de MRSA entre os isolados de S. aureus identificados;
Determinar o status de colonização (persistente, intermitente ou não colonizado) por S. aureus e MRSA na população de idosos do Lar dos Idosos Irmão Erasto;
Investigar os potenciais fatores de risco associados à colonização por S. aureus e MRSA na população estudada;
4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 AMOSTRAGEM E CARACTERÍSTICAS DA POPULAÇÃO
Este estudo foi realizado na Instituição Lar dos Idosos Irmão Erasto, localizado no município de Florianópolis, SC (27°25'26.4"S 48°25'43.4"W), que abrigava uma população total de 56 indivíduos no período da pesquisa, realizada entre Julho e Setembro de 2019. Inaugurada em 1967, a Instituição Lar dos Idosos Irmão Erasto é mantida pela Sociedade Espírita de Recuperação, Trabalho e Educação (SERTE). Os residentes possuem assistência médica e odontológica, fisioterapeutas, nutricionistas, psicólogos, enfermeiros e técnicos de enfermagem. A instituição também oferece atividades de ginástica, alongamento e caminhada, bem como atividades de socialização, cultural e de lazer. Cerca de 57% dos moradores são oriundos de famílias carentes e chegaram à residência geriátrica por motivo de abandono (5%), conflitos (8%), inexistência de família (21%) ou por decisão própria (10%).
O estudo foi submetido ao comitê de ética em pesquisa com seres humanos (CEPSH) da Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC) e aprovado sob o número 12823519.0.0000.0121. A participação dos idosos nesse estudo foi voluntária, mediante a assinatura do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE).
Participaram deste estudo um grupo de 15 idosos residentes na Instituição. De forma a determinar a amostragem mínima do estudo que tem representatividade com relação à população total residente na Instituição, o tamanho mínimo da amostra (n) necessário para realizar a pesquisa foi calculada de acordo com Miot (2011), através da fórmula:
𝑛 = 𝑁. 𝑝. 𝑞. ( 𝑍𝛼 2 ) 2 (𝑁 − 1). (𝐸)2+ 𝑝. 𝑞. (𝑍𝛼 2 ) 2 Onde: n: tamanho da amostra (12);
N: tamanho da população (finita) (56);
p: proporção de resultados favoráveis da variável na população (17,7%); q: proporção de resultados desfavoráveis na população (q=1-p);
Zα/2: valor crítico para o grau de confiança desejado, usualmente 1,96 (95%); E: erro padrão tolerável da amostra.
Para fins comparativos, foi utilizado o dado de prevalência de colonização de S. aureus (17,7%) em população idosa residente em Instituições localizadas na cidade de Bauru (SP) (SILVEIRA et al., 2018). Acerca de nosso conhecimento, este é o único estudo publicado no Brasil sobre colonização de S. aureus em população idosa institucionalizada até o momento. Portanto, considerando 17,7% de prevalência de S. aureus, com um erro tolerável de 20% dessa estimativa e com confiança de 95%, o número mínimo de pacientes a serem avaliados em nosso estudo é de doze (12) indivíduos.
Nosso estudo foi realizado com apenas 26,8% (15/56) da população residente na Instituição, uma vez que os 41 internos não recrutados na pesquisa foram considerados pela instituição como “não lúcidos”, não estando aptos a compreender a pesquisa de modo geral, incluindo a impossibilidade de ler, compreender e assinar o TCLE. Todos os 15 indivíduos recrutados no estudo foram considerados como “lúcidos” pela Instituição, estando aptos a compreender a pesquisa e ter autonomia para ler, assinar e responder ao TCLE e ao questionário proposto.
4.2 COLETA E PROCESSAMENTO DO MATERIAL CLÍNICO
Este estudo contou com a participação de 15 idosos voluntários residentes no Lar dos Idosos Irmão Erasto. No total, três coletas de swab nasal foram realizadas para cada participante, com um intervalo de 34 dias entre as mesmas. As amostras foram obtidas nos dias 05/07, 09/08 e 13/09 do ano de 2019. Na primeira coleta foram obtidas amostras de 15 idosos. Nas duas coletas subsequentes foram coletadas amostras de 14 idosos, devido ao óbito de um dos idosos participantes.
O material biológico foi coletado de ambas as fossas nasais por meio da utilização de um swab único de algodão estéril (haste plástica em polipropileno, 15 cm) umedecido em solução salina (cloreto de sódio a 0,85%; p/v) estéril, efetuando movimentos circulares delicados, por três vezes. Em seguida, os swabs foram inseridos em meio de transporte Stuart (Laborclin®) e encaminhados ao laboratório de Microbiologia do Hospital Universitário (HU). As amostras foram mantidas em temperatura ambiente até o momento do processamento, sendo este realizado num prazo máximo de 6h após a coleta.
Para determinar o status da colonização nasal entre os idosos institucionalizados, os participantes foram classificados, quanto à detecção de S. aureus, em três categorias: (1) Não portador, quando nenhuma das três coletas foi positiva; (2) Portador persistente, quando
apresentaram duas ou três coletas positivas consecutivas; (3) Portador intermitente, quando somente uma coleta foi positiva, ou duas coletas foram positivas para S. aureus de forma não consecutiva (adaptado de VIEIRA, 2016).
4.3 ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DE S. aureus
Para fim de isolamento seletivo, os swabs contendo as amostras nasais foram semeadas em ágar manitol salgado (KASVI) e as placas incubadas em estufa bacteriológica à temperatura de 35 ± 2°C por 24-48h. Após esse período, as colônias suspeitas de S. aureus (devido à alteração na coloração do meio de cultura em decorrência da fermentação do manitol; KONEMAN et al., 2001) foram repicadas pela técnica de esgotamento em ágar sangue de carneiro (Laborclin®) para manutenção da cultura. As placas de ágar sangue foram também incubadas a 35 ± 2°C por 24h.
A identificação inicial de S. aureus foi realizada por meio de microscopia ótica utilizando-se o método da coloração de Gram (KONEMAN et al., 2001) e teste da coagulase. Para a realização destes testes, utilizou-se o crescimento bacteriano oriundo do ágar sangue, selecionando-se uma única colônia bacteriana isolada para cada teste. No teste da coagulase, cada colônia selecionada foi inoculada em um tubo contendo 200µl de plasma de coelho com EDTA (Coagu-plasma; Laborclin®). O tubo foi incubado a temperatura de 35 ± 2°C. A leitura do teste foi realizada após 4h de incubação, sendo consideradas positivas as amostras que apresentaram formação de coágulo. As amostras que não apresentaram coágulo nas primeiras 4h foram incubadas por 24h e novamente verificadas após esse período.
A identificação dos isolados de S. aureus foi confirmada por meio de MALDI-TOF (Matrix Associated Laser Desorption-Ionization - Time of Flight) (MANUKUMAR; UMESHA, 2017). As amostras foram submetidas ao equipamento Microflex LT (Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Alemanha) do Instituto de Microbiologia Paulo de Góes da Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ), em colaboração com a Prof.ª Dra. Raquel Bonelli. Primeiramente, as amostras previamente identificadas como S. aureus pela coloração de Gram e teste da coagulase foram semeadas em placas de Petri contendo ágar TSA (Trypticase Soy Agar; KASVI) e incubadas a 35 ± 2°C por até 48h antes do teste. As amostras foram preparadas por transferência direta estendida da seguinte forma: colônias bacterianas foram colhidas e depositadas (em duplicata) nos alvos de uma placa de aço polido, sendo aplicado 1µl de ácido fórmico a 70% (v/v), e após a secagem, 1µl da solução matriz (HCCA;
alfa-ciano-4-hidroxicinâmico). Para obtenção dos dados, foram realizados dois experimentos independentes para cada amostra. Além disso, foi utilizada a cepa DH5α de Escherichia coli como padrão para calibração e espectro de referência do equipamento. O processamento dos espectros das proteínas entre 2 e 20 kDa foi obtido através do software flexControl versão 3.4 (Bruker Daltonics, EUA) e comparado com os espectros presentes no pacote MBT 7854 MSP Library do software MALDI Biotyper versão 3.1 (Bruker Daltonics). Os parâmetros utilizados para interpretação dos resultados da identificação por meio de MALDI-TOF foram os seguintes: a) A identificação da espécie foi considerada como altamente provável quando a pontuação foi de 3.000 a 2.300; b) A identificação em nível de gênero foi considerada segura e de espécie considerada provável quando a pontuação foi de 2.299 a 2.000; c) A identificação apenas em nível de gênero foi considerada provável quando a pontuação foi de 1.999 a 1.700; d) A identificação foi classificada como não confiável quando a pontuação foi ≤ 1.699.
4.4 IDENTIFICAÇÃO DA RESISTÊNCIA À METICILINA
4.4.1 Fenotípica
Para identificação da resistência, foi realizado o teste de sensibilidade à meticilina pela técnica de disco difusão em ágar, conforme os parâmetros atuais estabelecidos pelo Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) (CLSI–M100, 2018). O inóculo bacteriano foi preparado pelo método de suspensão direta em solução salina (cloreto de sódio a 0,85%; p/v) estéril. Para tanto, três colônias bacterianas (inoculadas em ágar sangue e incubadas a 35 ± 2°C por 18-24h) foram depositadas em 3ml de solução salina e homogeneizado em vórtex. A densidade da suspensão foi ajustada utilizando-se o instrumento DensiCHEK™ (BioMérieux) ao padrão de turbidez 0,5 da escala de McFarland, que corresponde a 1,5 x 108 unidades formadoras de colônias por mL (UFC/mL). Em seguida, as suspensões foram inoculadas com swab de algodão estéril, em ágar Mueller Hinton (KASVI) e posteriormente aplicado o disco de cefoxitina (30μg) (BIO-RAD). Após um período de 18-24h de incubação a 35 ± 2°C, foram realizadas as aferições dos halos de inibição. O halo de inibição, caracterizado por uma região sem crescimento bacteriano, corresponde à sensibilidade da amostra bacteriana com relação à difusão do antimicrobiano no ágar. As amostras foram classificadas como sensíveis quando o halo de inibição foi ≥ 22 mm ou resistentes ≤ 21 mm (CLSI–M100, 2018). Para realizar o estoque das amostras de S. aureus,
ao final do teste de disco difusão, foi obtido um raspado do crescimento bacteriano diretamente do ágar Mueller Hinton, seguido da transferência para microtubo estéril contendo caldo Mueller Hinton estéril (KASVI) e glicerol (15%; p/v) e congelamento a -80°C.
4.4.2 Molecular
Para a confirmação da resistência à meticilina foi realizada a detecção do gene mecA, pela técnica de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR). O DNA bacteriano foi extraído pelo método da lise térmica (PACHECO et al., 1997). De forma resumida, algumas colônias semeadas em placas de Petri contendo TSA (incubadas a 37°C por 24h) foram transferidas para um microtubo contendo 1ml da solução tampão TE (TRIS 1M e EDTA 0,5M), seguidas de duas lavagens com TE e centrifugações (2min/15.093G), vórtex, e fervura da suspensão final (10min/100°C). Após centrifugação (2min/15.093G) final, o sobrenadante foi armazenado em tubo criogênico a -20°C.
Para a amplificação do gene mecA foi utilizado o iniciador (primer) senso (forward) mecA P4 (5′-TCCAGATTACAACTTCACCAGG-3') e iniciador anti-senso (reverse) mecA P7 (5′-CCACTTCATATCTTGTAACG-3) (GUIMARÃES et al., 2015). Para 20 µl de reação foram utilizados: 5U/µl de Taq DNA polimerase (Invitrogen®), tampão de PCR (TRIS-HCl 200 mM, pH 8,4, KCl500 mM) (Invitrogen®), 50mM MgCl2 (Invitrogen®), 200µM de cada
dNTP (Promega®), 0,01 µM iniciador senso, 0,01 µM iniciador anti-senso e 2,0 µl de DNA da amostra. O termociclador SimpliAmp™ Thermal Cycler (Thermo Fisher Cientific®) seguiu a seguinte programação: desnaturação inicial a 95°C/4min, 35 ciclos de 95°C/30s para desnaturação, 55°C/30s para hibridação dos iniciadores, 72°C/45s para a extensão e 1 ciclo de 72°C/45s para a extensão final. Como controle positivo e negativo para o gene mecA foi utilizada a cepa Mu50 (cepa MRSA cedida gentilmente pela Prof.ª Thais Sincero; UFSC) e ATCC25923 (cepa MSSA), respectivamente. Também foi realizado um controle da reação, substituindo o mesmo volume de DNA por água MiliQ estéril. O marcador de peso molecular utilizado foi de 100pb (Ludwig®) e 50pb (Ludwig®). O resultado da amplificação do produto da PCR foi visualizado por eletroforese (100V/400Å/30min) em gel de agarose (1,5%; p/v) e TBE (TRIS 1M; ácido bórico-H3BO3 0,8M; EDTA 0,5M) foi utilizado como tampão de corrida.
4.5 AVALIAÇÃO DOS FATORES DE RISCO
Para determinar os potenciais fatores de risco associados à colonização por S. aureus e MRSA foram investigados dados demográficos (idade, peso, etnia, escolaridade, sexo, tempo de instituição), hábitos pessoais (frequência de banho, lavagem das mãos e roupas de cama, elitismo, tabagismo, atividade física, compartilhamento de objetos pessoais, etc.) e histórico médico dos últimos 12 meses (infecção, uso de antimicrobianos, internação em unidade hospitalar, realização de procedimentos invasivos e doenças crônicas), acessados por meio da aplicação de um questionário individual (Apêndice A) e consulta aos prontuários médicos da Instituição.
A associação entre a colonização de S. aureus ou MRSA e os potenciais fatores de risco foi realizada por meio de análise estatística descritiva, com a distribuição de frequência das variáveis qualitativas (nominais ou ordinais), medidas de tendência central e dispersão (mediana, intervalo interquartil, média, desvio padrão e valor máximo e mínimo) das variáveis quantitativas (discretas ou contínuas). Os dados dos questionários foram organizados e digitados no programa Microsoft Excel (Micorsoft Office 2010) e posteriormente importados para o programa MedCalc® versão 19.1.5 (MedCalc Software bvba 1993-2020, Bélgica). Neste estudo foram utilizados os testes estatísticos (não paramétricos): Teste Mann-Whitney para comparação de medianas e teste de exato de Fischer para comparar as associações entre as variáveis qualitativas. Foi considerado como nível de significância o valor de p < 0,05. Os testes estatísticos e a utilização do programa foram realizados em colaboração com o Prof. Marcos José Machado do Departamento de Análises Clínicas da Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC).
5 RESULTADOS
5.1 COLONIZAÇÃO E PREVALÊNCIA DE S. aureus
Na primeira coleta, realizada no dia 5 de julho de 2019, foram coletadas amostras de swab nasal de 15 idosos. Cada amostra (swab) foi identificada como LI (Lar dos Idosos), seguida do número correspondente do respectivo participante. Analisando as culturas em ágar manitol salgado, colônias positivas para a fermentação do manitol (colônias amarelas; Figura 1) foram identificadas em 12 amostras (LI01, LI03, LI04, LI05, LI07, LI08, LI09, LI10, LI11, LI13, LI14, LI15).
Figura 1 – Cultura de swab nasal em meio ágar manitol salgado com a presença de colônias de S. aureus. À esquerda, amostra identificada como LI10, a direita amostra LI11, referentes à
1º coleta realizada em 05/07.
Fonte: Autora
Dentre essas 12 amostras, 5 delas (LI04, LI10, LI11, LI13, LI14) apresentaram a formação de coágulo no teste da coagulase. Infelizmente, após a primeira coleta, um dos idosos voluntários (denominado LI13) e colonizado por S. aureus veio a óbito, não sendo esse evento relacionado à infecção por este microrganismo (Quadro 1).
