Análise morfológica de células musculares cardíacas em humanos adultos e senis

Texto

(1)UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE ANATOMIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MORFOLOGIA. ANÁLISE MORFOMÉTRICA DE CÉLULAS MUSCULARES CARDÍACAS EM HUMANOS ADULTOS E SENIS. JOSE ANTONIO CARDOSO. RECIFE 2002.

(2) JOSE ANTONIO CARDOSO. ANÁLISE MORFOMÉTRICA DE CÉLULAS MUSCULARES CARDÍACAS EM HUMANOS ADULTOS E SENIS. Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Morfologia do Departamento de Anatomia do Centro de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Pernambuco para obtenção do título de Mestre em Morfologia. Orientadora: Profª. Drª. Silvia Regina Arruda de Moraes. RECIFE 2002.

(3) Cardoso, Jose Antonio Análise morfométrica de células musculares cardíacas em humanos adultos e senis / Jose Antonio Cardoso. – Recife : O Autor, 2002. 40 folhas : il., tab., gráf. Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de Pernambuco. CCB. Morfologia, 2002. Inclui bibliografia e anexos. 1. Morfologia – Coração – Fibras musculares. 2. Coração de adultos e idosos – Análise morfométrica. I. Título. 611.018.63 611.1. CDU (2.ed.) CDD (20.ed.). UFPE BC2004-429.

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(8) DEDICATÓRIA. Aos meus Pais JOSÉ PEDRO CARDOSO e MARIA RODRIGUES CARDOSO, que ensinaram-me a dar os primeiros passos na vida; o amor, a dedicação, apoio e incentivos dispensados todos esses anos.. À Minha Esposa VERA LUCIA DOS SANTOS CARDOSO e a Minha Filha EDLA NIEDJA DOS SANTOS CARDOSO por terem me acompanhado nesta jornada, muitas vezes porém no momento em que me encontrava em grandes dificuldades, sabendo superar minha ausência, dando apoio, dedicação, amor e incentivo, ajudando-me desta forma para que a concretização desta pesquisa se tornasse possível.

(9) AGRADECIMENTOS. A DEUS que todos os dias está do nosso lado ajudando a superar todas as dificuldades do dia-a-dia, obrigado Senhor por ter dado forças para concretizar mais uma das conquistas das nossas vidas.. À minha Orientadora Profª Drª. SILVIA REGINA ARRUDA DE MORAES que acreditando no meu sucesso, aceitou o convite de orientar na construção deste estudo, reafirmando a grande amizade existente. Diante de sábia orientação e do muito que me foi oferecido, o meu profundo respeito e agradecimento.. Aos meus colegas do Depto de Anatomia da UFPE, pela paciência nos momentos de mau humor de minha parte e pela força nos momentos de desânimo e ainda por aceitar fazer parte da construção deste estudo.. Aos Professores ex-chefes do Depto de Anatomia da UFPE ANTONIO ROMEU CABRAL DE MEDEIROS, JENNECY SALES CAVALCANTE E ALEXANDRE MOTTA BITTENCOURT que dedicados ao ensino e à ciência, minha sincera gratidão pelo incentivo, apoio e confiança em mim depositados em favor de minha formação e o desenvolvimento deste departamento. Ao Prof. Dr. AUSTREGESILO VIEIRA DA COSTA SOBRINHO, que dedica-se ao ensino e à ciência de forma brilhante, pelo incentivo e apoio, minha sincera e eterna amizade..

(10) Ao Prof. TETSUO TASHIRO pelo apoio na utilização do seu laboratório e com sugestões para o desenvolvimento deste trabalho. Nosso agradecimento pelo acolhimento caloroso e agradável durante todo este período.. Aos Profs. CLAUDIO A. FERRAZ DE CARVALHO, II-SEI WATANABE e ROMEU RODRIGUES DE SOUZA do Departamento de Anatomia do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo, que depositaram voto de confiança quando iniciava meus estudos naquela instituição, transmitiram seus conhecimentos e experiências profissionais, para que a minha formação fosse também um aprendizado de vida. Aos Funcionários do Departamento de Anatomia do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo, em especial aos Srs. SEBASTIÃO APARECIDO BOLETA e ZILDA OLIVEIRA MARTIM pelos auxílios prestados na parte prática deste trabalho. Ao Estagiário JOSÉ EMERSON ABRANTES DINIZ pela paciência, atenção, auxílio, dedicação e pela troca de conhecimentos dispensados para execução deste trabalho.. Aos colegas de turma pela amizade e troca de experiências que contribuíram na concretização dos nossos trabalhos para conclusão do curso.. Aos funcionários do Depto de Anatomia da Universidade Federal de Pernambuco, pelo apoio e amizade durante esta jornada, o meu tributo de gratidão. A todos que contribuíram direta ou indiretamente na construção deste trabalho..

(11) ABREVIATURAS. ao mioc = área da secção transversa unitária do miócito. ao nu = área da secção transversa unitária do núcleo fc = fator de compressão fs = fator de redução linear Ic = direção do corte Io = direção da face do bloco Ió = comprimento do bloco do tecido a fresco lo mioc = comprimento do perímetro unitário do miócito Is = comprimento do tecido retraído Nmm ^3 mioc = número de miócitos por unidade de volume Nmm ^3 nu = número de núcleos por milímetro cúbico S = septo interventricular VD = ventrículo direito VE = ventrículo esquerdo vo mioc = volume unitário do miócito vo nuc = volume unitário médio do núcleo Vv mioc = densidade volumétrica dos miócitos Vv nu = densidade volumétrica nuclear hmioc = comprimento da miocélula hnu = média do diametro maioe e menor do núcleo Pmioc = ponto na miocélula Nmioc = secção de miocélula Imioc = intersecção na miocélula Pnu = ponto no núcleo Nnu = secção do núcleo 0,98 µm = distância entre dois pontos (D) 100 = número de pontos do sistema-teste (Pt) 6 µm = espessura do corte histológico.

(12) LISTA DE FIGURAS. Fig. 01 –Valores médios da área da secção transversa unitária dos miócitos. Fig. 02 – Valores médios do comprimento do perímetro unitário do miócito. Fig. 03 – Valores médios do volume unitário do miócito. Fig. 04 – Valores percentuais da densidade volumétrica dos miócitos. Fig. 05 – Número de miócitos por unidade de volume. Fig. 06 – Valores da densidade volumétrica nuclear. Fig. 07 – Número de núcleos por milímetros cúbicos. Fig. 08 – Volume unitário médio do núcleo. Fig. 09 – Área da secção transversa unitária do núcleo.

(13) SUMÁRIO. RESUMO 1 INTRODUÇÃO.........................................................................................................................05 2 REVISÃO DA LITERATURA................................................................................................07 3 OBJETIVOS..............................................................................................................................11 3.1 Geral............................................................................................................................11 3.2 Específicos...................................................................................................................11 4 MATERIAL E MÉTODOS.....................................................................................................12 4.1 Material.......................................................................................................................12 4.2 Métodos.......................................................................................................................12 4.2.1 CATETERIZAÇÃO E FIXAÇÃO DO MATERIAL...................................12 4.2.2 DISSSECÇÃO DO MATERIAL..................................................................12 4.2.3 PROCESSAMENTO HISTOLÓGICO.........................................................13 4.2.4 ANÁLISE MICROSCÓPICA.......................................................................13 4.2.5 ANÁLISES HISTOCITOMÉTRICAS..........................................................13 4.3 Análise Estatística.......................................................................................................14 5 RESULTADOS..........................................................................................................................15 5.1 Área da secção transversa unitária do miócito........................................................15 5.2 Comprimento do perímetro unitário do miócito.....................................................15 5.3 Volume unitário do miócito.......................................................................................16 5.4 Densidade volumétrica (fração de volume) dos miócitos........................................17 5.5 Número de miócitos por unidade de volume............................................................18 5.6 Densidade volumétrica nuclear.................................................................................18 5.7 Número de núcleos por milímetro cúbico.................................................................19 5.8 Volume unitário médio do núcleo..............................................................................20 5.9 Área da secção transversa unitária do núcleo..........................................................20 6 DISCUSSÃO..............................................................................................................................22 7 CONCLUSÃO...........................................................................................................................28 8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS....................................................................................29 ANEXOS.

(14) RESUMO. O objetivo do trabalho foi realizar uma avaliação quantitativa nas células do miocárdio humano de indivíduos adulto jovem e senil e em cada grupo nas regiões ventriculares direita e esquerda e septal. Foram utilizados 10 corações de cadáveres de indivíduos sem enfermidades cardíacas, de ambos os sexos, com idade entre 20 e 87 anos, divididos em grupo adulto e senil. Os corações foram cateterizados através da artéria coronária esquerda, lavados com solução salina a 0,9% e fixados com paraformaldeído a 10% em tampão fosfato. Após a fixação durante um período de 48 horas, foram coletados fragmentos do miocárdio medindo 2x2 cm das parede ventricular direita (VD), ventricular esquerda (VE) e da parede septal (S) e processados por técnica histológica, incluídos em uma mistura de parafina com 5% de cera de carnaúba, seccionados e corados com hematoxilina férrica. Em cada corte foram analisados 30 campos microscópicos escolhidos aleatoriamente, e foram determinados os seguintes parâmetros estereológicos: área da secção transversa unitária do miócito (ao mioc); comprimento do perímetro unitário do miócito (lo mioc); volume unitário do miócito (vo mioc); densidade volumétrica dos miócitos (Vv mioc); número de miócitos por unidade de volume (Nmm ^3mio); densidade volumétrica nuclear (Vv nu); número de núcleos por milímetro cúbico (Nmm ^3 nu); volume unitário médio do núcleo (vo nu) e área da secção transversa unitária do núcleo (ao nu). Foi aplicado o. teste “t’ de Student. Comparando os corações dos grupos adulto e senil,. obtivemos os seguintes resultados: área da secção transversa unitária do miócito: Grupo Adulto (S = 1,800 µm2 ,VD = 1,635 µm2 e VE = 1,836 µm2), no Grupo Senil (S= 1,554 µm2 ,VD= 1,509 µm2.e VE = 1,710 µm2); comprimento do perímetro unitário dos miócitos: grupo Adulto (S= 5,851 µm, VD= 5,571 µm e VE = 5,498 µm), grupo Senil (S = 5,109 µm,, VD= 5,162 µm e VE= 6,197µm); volume unitário dos miócitos: grupo Adulto ( S= 87,754 µm 3, VD= 68,317 µm 3.

(15) 2 e VE =73,328 µm3), grupo Senil (S = 94,036 µm 3, VD= 88,752 µm 3 e VE = 122,408 µm 3 ); densidade volumétrica dos miócitos: grupo adulto (S = 0,416 %; VD = 0,411 % e VE = 0,436), no grupo Senil (S = 0,400%; VD = 0,39 % e VE = 0,413 %); número de miócitos por unidade de volume: grupo Adulto (S = 2690066,1 mioc/mm3; VD = 2361561,7 mioc/mm3 e VE = 2294502,3 mioc/mm3), grupo Senil (S = 2702357,7 mioc/mm3; VD = 2493591,4 mioc/mm3 e VE = 2660843,3 mioc/mm3); densidade volumétrica nuclear; grupo adulto (S=0,032%, VD= 0,031% e VE=0,032%), grupo senil (S=2,980E-02, vd=2,840E-02 e VE=3,560E-02%); número de núcleos por milímetros cúbicos: grupo Adulto (S = 369081,67 nu/mm3; VD = 339481,12 nu/mm3 e VE = 332629,30 nu/mm3), grupo Senil (S = 409369,14 nu/mm3; VD = 34960,69 nu/mm3 e VE = 431970,04 nu/mm3); volume unitário médio do núcleo: grupo Adulto (S = 88,799 µm3; VD = 102,136 µm3 e VE = 98,393 µm3), grupo Senil (S = 73,256 µm3; VD = 84,041 µm3 e VE = 83,009 µm3);área da secção transversa unitária do núcleo: grupo Adulto (S = 2,145 µm2, VD= 2,040 µm2 e VE= 2,015 µm2), grupo Senil (S =1,997 µm2, VD= 2,082 µm2 e VE = 2,318 µm2). As diferenças entre os dois grupos não foram estatisticamente significantes (p>0,05). Os resultados obtidos sugerem que ocorrem modificações nas dimensões da miocélula do coração humano no decorrer do envelhecimento do indivíduo, entretanto, essas diferenças são sutis e parece significar a adaptação do tecido às mudanças funcionais que se instalam no decorrer da vida..

(16) SUMMARY. The aim of the work was to realize a quantitative evaluation in the cells of the human myocardium of young and aged adults and in each group in the right and left ventricular regions and the septal region. Ten (10) hearts of human corpse with no cardiopathy, of both sexes, in 27 – 80 age range, divided into two groups: adult and aged, were used. The hearts were catheterized through the left coronary artery washed with saline solution 0,9% and fixed with paraformaldehyde 10% in phosphate buffer. After the fixation, during a period of 48 hours, fragments of myocardium were collected with 2x2 cm of size of the right ventricular wall (VD), left ventricular wall (VE) and the septal wall (S) which were processed by histological technique, included in a mixture of paraffin with 5% carnauba wax, divided into sections and stained with ferric hematoxylin. In each section 30 microscopic fields were selected at random, analyzed and determined the following stereologic parameters: area of unitary transverse section of myocyte (ao mioc); length of unitary perimeter of myocyte (lo mioc); unitary volume of myocyte (vo mioc); volumetric density of myocyte (Vv mioc); number of myocytes per unit of volume (Nmm ^3mio); nuclear volumetric density (Vv nu); number of nucleus per cubic millimeter (Nmm ^3 nu); medium unitary volume of nucleus (vo nu) and area of unitary transverse section of nucleus (ao nu). The “t” test of Student was applied. Comparing the hearts of groups adult and aged, the following results were obtained: area of unitary transverse section of myocyte: Adult Group (S = 1,800 µm2 ,VD = 1,635 µm2 and VE = 1,836 µm2), Aged Group (S= 1,554 µm2 ,VD= 1,509 µm2 and VE = 1,710 µm2); length of unitary perimeter of myocyte: Adult Group (S= 5,851 µm, VD= 5,571 µm and VE = 5,498 µm), Aged Group (S = 5,109 µm,, VD= 5,162 µm and VE= 6,197µm); unitary volume of myocyte: Adult Group ( S= 87,754 µm 3, VD= 68,317 µm 3 and VE =73,328 µm3), Aged Group (S = 94,036 µm 3, VD= 88,752 µm 3 and VE = 122,408 µm 3 ); volumetric.

(17) 4 density of myocyte: Adult Group (S = 0,416 %; VD = 0,411 % and VE = 0,436), Aged Group (S = 0,400%; VD = 0,39 % and VE = 0,413 %); number of myocytes per unit of volume: Adult Group (S = 2690066,1 mioc/mm3; VD = 2361561,7 mioc/mm3 and VE = 2294502,3 mioc/mm3), Aged Group (S = 2702357,7 mioc/mm3; VD = 2493591,4 mioc/mm3 and VE = 2660843,3 mioc/mm3); nuclear volumetric density: Adult Group (S=0,032%, VD= 0,031% and VE=0,032%), Aged Group (S=2,980E-02, vd=2,840E-02 and VE=3,560E-02%); number of nucleus per cubic millimeter: Adult Group (S = 369081,67 nu/mm3; VD = 339481,12 nu/mm3 and VE = 332629,30 nu/mm3), Aged Group (S = 409369,14 nu/mm3; VD = 34960,69 nu/mm3 and VE = 431970,04 nu/mm3); medium unitary volume of nucleus: Adult Group (S = 88,799 µm3; VD = 102,136 µm3 and VE = 98,393 µm3), Aged Group (S = 73,256 µm3; VD = 84,041 µm3 and VE = 83,009 µm3); area of unitary transverse section of nucleus: Adult Group (S = 2,145 µm2, VD= 2,040 µm2 and VE= 2,015 µm2), Aged Group (S =1,997 µm2, VD= 2,082 µm2 and VE = 2,318 µm2). The differences between the two groups were statistically insignificant (p>0,05). The obtained results suggest that modifications in the length of myocell of human heart occur during the aging process of the human being, however, these differences are subtle ad seem to mean the adaptation of the tissue to the functional changes that happen during the period of life..

(18) 1 INTRODUÇÃO. A senescência tem sido um assunto amplamente discutido e de interesse mundial na atualidade, em decorrência do aumento da média de vida, ocasionando um crescimento da população senescente nos últimos anos. O processo de envelhecimento normal está associado a uma variedade de mudanças físicas, psíquicas e culturais. O reconhecimento dessas alterações na estrutura e função cardiovascular que ocorre durante o envelhecimento da população é essencial para a avaliação das doenças cardíacas em pacientes idosos (LEWIS e MARON, 1992). Entretanto, o estudo dos efeitos apenas do envelhecimento sobre a estrutura e função cardiovascular é dificultado pela instalação de processos patológicos os quais podem ocultar as características do processo de envelhecimento funcional (SAFAR, 1990; CAMILLERI, 1992). A percentagem de indivíduos idosos na população vem aumentando nos últimos anos e muitos desses indivíduos idosos apresentam doenças cardiovasculares. Dessa forma, o conhecimento das alterações fisiológicas normais que acompanham o envelhecimento do coração é de extrema importância (CHIDA et al, 1994), visto que muitos dos estudos desenvolvidos tratam das alterações observadas no coração senil associadas a distúrbios patológicos, enquanto poucos se referem ao processo de envelhecimento normal. O conhecimento das alterações fisiológicas que acompanham o processo normal de envelhecimento da espécie mostra-se de extrema importância até mesmo para melhoria da qualidade de vida do indivíduo. A importância do estudo dos aspectos pertinentes a morfometria e estereologia do miocárdio humano são de importância no sentido de se compreender os mecanismos compensatórios observados nessa fase da vida. Entretanto, poucos são os dados na literatura que tratam dos aspectos morfométricos do coração durante o processo de envelhecimento normal,.

(19) 6 embora este músculo seja largamente estudado, sob o ponto de vista qualitativo em diferentes mamíferos e no homem em situações patológicas diversas. (TRUEX, 1972; KORECKY e RAKUSAN, 1978; GERDES et al., 1979; HOSHINO et al., 1983; ANVERSA et al., 1986; OBERPRILLER et al., 1987; OLIVETTI et al., 1996; PEREIRA et al., 1998; DI SOMMA et al., 2000). Embora existam estudos quantitativos do miocárdio normal em mamíferos (BISHOP e DRUMMOND, 1979; GERDES e KASTEN, 1980; ENGELMANN et al., 1987; MANDARIMDE-LACERDA, 1987; BAI et al., 1990), aquela que diz respeito a avaliações histológicas quantitativas do miocárdio humano é escassa e irregular. A maioria dos artigos abordam medições dos vários elementos miocárdicos com alterações que variam conforme condições patológicas diversas. Poucos destes artigos contém dados significantes sobre as variações quantitativas em condições fisiológicas normais. Os achados da literatura sugerem, entretanto, que o desenvolvimento das miocélulas cardíacas estaria diretamente relacionado com o desenvolvimento da hipertrofia das mesmas. Contudo, os estudos realizados, na sua grande maioria, restringem-se a estudos experimentais ou em humanos com alguma patologia pré-adquirida, o que impossibilita o estudo das modificações dessas células apenas decorrentes do envelhecimento fisiológico. Sendo assim, conscientes da importância desse tema, elaboramos o presente trabalho, visando contribuir para um maior aprofundamento dos conhecimentos sobre os aspectos morfométricos das miocélulas do coração humano durante a fase senescente do indivíduo, com vistas à obtenção de subsídios no sentido de estabelecer correlações anátomo-funcionais que possam fornecer uma melhor compreensão dos processos patológicos tão freqüentes nessa fase de vida do indivíduo..

(20) 2 REVISÃO DA LITERATURA. O interesse a cerca dos mecanismos que podem determinar a diferença observada na espessura das paredes ventriculares já é bastante antigo. TANDLER apud KEIBEL e MAIL (1912) demonstrou que a parede ventricular esquerda é definitivamente mais espessa do que a direita. Entretanto, em 1930 PATTEN demonstrou que as espessuras das paredes ventriculares no feto são essencialmente iguais e que a parede mais espessada do ventrículo esquerdo é gradualmente adquirida como resultado do trabalho executado após o nascimento. Corrobando com esse dado HARRISON et al. (1932) sugeriram que o diâmetro da fibra muscular cardíaca estaria diretamente relacionado ao batimento rítmico do coração. ASHLEY (1945) verificou, com particular interesse, a presença de um maior diâmetro médio da fibra muscular cardíaca no ventrículo direito que no esquerdo. ANGELAKOS et al. (1964), empregando preparações histológicas de corações de ratos adultos com idade de 6 a 7 meses, mensuraram o diâmetro de 3600 fibras encontrando valores de 11,8 ± 4,8 µ e 11,5 ± 4,3 µ respectivamente para os ventriculos direito e esquerdo, não sendo essas diferenças morfométricas entre as fibras musculares dos dois ventrículos estatisticamente significantes. BRANDI e McGREGOR (1969) demonstraram que a área de miocélula próxima à região endocárdica é maior que aquelas próximas à região epicárdica. KORECKY e RAKUSAN (1978) concluíram que o desenvolvimento cardíaco normal em ratos recém-natos é quase inteiramente devido ao crescimento das miocélulas existentes, isto é, a hipertrofia celular..

(21) 8. Estudando o coração de ratos com idade de 110. meses, GERDES et al. (1979). observaram que no miocárdio ventricular esquerdo desses animais, as áreas da secção transversa das miocélulas eram 62% maiores nas áreas próximas ao endocárdio do que as áreas das miocélulas vizinhas à região do epicárdio. HATT et al. (1979) comparando o tamanho das miocélulas em corações hipertróficos, verificaram que são maiores próximo ao endocárdio do que na região média, contudo em corações normais não observaram esta diferença. GERDES e KASTEN (1980) analisando morfometricamente ventrículos de cães adultos, não verificaram diferenças regionais com relação ao volume percentual das miocélulas. Estudos ecocardiográficos em indivíduos vivos demonstraram aumento da espessura da parede septal durante o envelhecimento, acompanhado por um pequeno aumento da epessura da parede ventricular esquerda (HENRY et al. ,1980) RAKUSAN et al. (1980) não observaram diferenças nas miocélulas entre regiões ventriculares em corações de ratos normais, contudo, em corações hipertroficos, a região subendocárdica apresentou uma quantidade menor de miocélulas que em outras áreas do coração. HOSHINO et al. (1983) mediram os diâmetros das fibras miocárdicas em diferentes regiões do coração humano adulto normal, hipertenso, e com cardiopatia hipertrófica, concluindo que há variação no diâmetro das miocélulas na parede ventricular esquerda e no septo, contudo não há diferença significante entre as paredes ventriculares direita e esquerda. LOUD et al. (1984) analisando corações de ratos que tiveram exercício pré-condicionado, observaram que houve um aumento na fração de volume no ventrículo direito, no entanto, observou erros na medição morfométrica quando relacionou medições em cortes oblíquos e transversos..

(22) 9 ANVERSA et al. (1986) demonstraram que, com o envelhecimento, ocorre uma diminuição no número e um aumento no tamanho dos miócitos no miocárdio humano. ENGELMANN et al (1987) estudando ratos normotensos com idade de 1, 6, 12, 18 e 24 meses verificaram que a área da secção transversa da miocélula aumentou significantemente entre 12 e 18 meses e diminui significantemente entre 18 e 24 meses. KITZMAN et al. (1988) demonstraram através de um estudo realizado em autópsias de 765 corações humanos normais, que a espessura das paredes ventriculares direita e esquerda permanece relativamente constante com o envelhecimento, enquanto que a espessura da parede septal aumenta significantemente. entre a terceira e décima décadas de vida. BURNS. et al. (1990) compararam a estrutura do ventrículo esquerdo e do septo. interventricular de indivíduos geriátricos com idade entre 79 a 91 anos com indivíduos adultos com idade de 22 a 52 anos e encontraram uma hipertrofia relativa dos miócitos mais acentuada no miocárdio do grupo senil. Segundo KITZMAN e EDWARDS (1990) com o envelhecimento ocorre um aumento na espessura da parede ventricular septal e, provavelmente, da parede ventricular esquerda com aumento significante do peso do coração OLIVETTI et al. (1991) em estudo realizado com 67 corações de indivíduos com idade entre 17 a 90 anos demonstrou uma perda de 38 e 14 milhões de miócitos na parede miocárdica dos ventrículos esquerdo e direito respectivamente que foi acompanhada por um progressivo aumento no volume do miócito por núcleo em ambos os ventrículos Em 1994 CHIDA et al. analisando 141 corações humanos de ambos os sexos, com idade igual e superior a 60 anos e sem diagnóstico de alterações patológicas, observaram que havia uma significante diminuição do volume do ventrículo esquerdo com o avançar da idade desses indivíduos..

(23) 10 OLIVETTI et al (1996) estudando 72 corações de indivíduos sem doenças cardiovasculares, com intervalo de idade variando de 26 a 93 anos de idade, verificaram que o envelhecimento não alterava a proporção relativa dos miócitos. Em estudo experimental do miocárdio de ratos jovens e idosos ÁGUILA et al. (1998) demonstraram haver no envelhecimento uma diminuição no número de miócitos cardíacos e conseqüente hipertrofia compensatória das células remanescentes..

(24) 3 OBJETIVOS. 3.1 Geral Comparar as diferenças quantitativas nas células (fibras) do miocárdio humano entre individuos adulto jovem e senil e em cada grupo nas regiões ventriculares direita, esquerda e septal.. 3.2 Específicos -. Determinar a área da secção transversa unitária do miócito (ao mioc). -. Determinar o comprimento do perímetro unitário do miócito (lo mioc). -. Determinar o volume unitário do miócito (vo mioc). -. Determinar a densidade volumétrica dos miócitos (Vv mioc). -. Determinar o número de miócitos por unidade de volume (Nmm ^3 mioc). -. Determinar a densidade volumétrica nuclear ( Vv nu). -. Determinar o número de núcleos por milímetro cúbico (Nmm ^3 nu). -. Determinar o volume unitário médio do núcleo (vo nu). -. Determinar a área da secção transversa unitária do núcleo (ao nu).

(25) 4 MATERIAL E MÉTODOS. 4.1 Material Foram estudados corações de 10 cadáveres de indivíduos leucodermos e melanodermos, sem enfermidades cardíacas, de ambos os sexos, com idades variando de 20 a 87 anos, provenientes do Departamento de Anatomia da Universidade de São Paulo. Estes corações foram separados do seguinte modo, de acordo com a faixa etária: Grupo 1, cinco indivíduos com 20 a 25 anos de idades; Grupo 2, cinco indivíduos com 67 a 87 anos de idades.. 4.2 Métodos 4.2.1 CATETERIZAÇÃO E FIXAÇÃO DO MATERIAL Os corações foram cateterizados através da artéria. coronária esquerda, lavados com solução salina a 9%, sob pressão moderada e constante. Em seqüência o mesmo procedimento foi feito na artéria. coronária direita. A seguir injetava-se, pelas artérias coronárias, solução fixadora de parafolmaldeido a 10% em tampão fosfato 0,1 M (pH 7,3), até que se observasse a saída do líquido pelo seio coronário. Em seguida os corações eram imersos no mesmo fixador durante 48 horas.. 4.2.2 DISSECÇÃO DO MATERIAL Com auxílio de bisturi foram obtidos fragmentos do miocárdio medindo. 2x2 cm. das paredes ventriculares direita e esquerda ao nível da face esternocostal e da parede muscular do septo interventricular..

(26) 13 4.2.3 PROCESSAMENTO HISTOLÓGICO Os fragmentos obtidos foram colocados em frascos separados contendo a solução fixadora de Paraformoaldeído 9% , onde permaneciam por cinco dias. Em seguida eram submetidos a processo de desidratação lenta por três passagens por solução de metilbenzoato e três passagens pela mistura de benzol-parafina em proporções crescentes após a desidratação e finalmente, foram incluídos em uma mistura de parafina com 5% de cera de carnaúba. Após a inclusão do material, cortes tangenciais de 6 µm de espessura foram obtidos em micrótomo JB4ASORVALL, com as fibras musculares cardíacas seccionadas aproximadamente paralelas ao seu maior eixo. Foram também realizados cortes perpendiculares ao seu maior eixo e corados pelo método da hematoxilina férrica.. 4.2.4 ANÁLISE MICROSCÓPICA Em cada corte foram analisados 30 campos microscópicos escolhidos aleatoriamente. A decisão de utilizar 30 campos distribuídos por todo o corte, deveu-se a resultado obtido em estudo piloto, no qual verificou-se que com esse número de campos obtinha-se um valor aceitável do desvio-padrão.. 4.2.5 ANÁLISES HISTOCITOMÉTRICAS A Análise Histocitométrica utilizada neste trabalho, está baseada em CHIZZOLA et al. (1967) e MANDARIM-DE-LACERDA E SAMPAIO (1987), utilizando-se de uma ocular Kpl, X10 (Carl Zeiss) com um sistema-teste de 100 pontos, proposto por WEIBEL et al. (1966), para estudo ao microscópio de Luz. O nosso material foi analisado em microscópio óptico Zeiss com aumento final de 1000X (10X ocular + 100X objetiva de imersão). Secções de parafina para a microscopia de luz são comprimidas quando seccionadas,.

(27) 14 permitindo que alguns parâmetros sejam estimados com a introdução de um erro sistemático. Para corrigir este erro utilizamos o Fator de Compressão (fc = lc/lo), onde (lc) é a direção do corte que sofreu compressão após secção (perpendicular ao fio da navalha), enquanto que o (lo) é a direção da face do bloco no qual, o corte foi direcionado, paralelo ao fio da navalha, não sofrendo compressão (WEIBEL, 1979). Por outro lado os processos de fixação e inclusão levam à retração dos tecidos conduzindo à outro erro sistemático que pode ser medido pelo Fator de Redução Linear (fs = ls/ló), onde o (ls) é o comprimento do tecido retraído após processamento até a inclusão na parafina e, o (ló) é o comprimento do bloco do tecido não submetido aos processos de fixação e inclusão (material fresco). Neste trabalho, entretanto, em vez de considerar as medidas do material (retraído) incluído em parafina, fizemo-las diretamente nas secções já na lâmina (LOUD et al., 1965). Assim (ls) corresponde então à dimensão perpendicular à direção da compressão, ou seja, paralelo ao fio da navalha. Por conseguinte, (ls) é igual a (lo).. 4.3 Análise Estatística A análise estatística foi realizada comparativamente entre as 3 regiões de cada grupo (VE, VD e parede septal) e entre os grupos adulto e idoso. Para a comparação de pares de médias foi empregado o teste “t” de Student. No caso de comparações dentro de um mesmo grupo o teste empregado foi o do tipo pareado. Para a comparação entre os grupos adulto e idoso foi empregado o teste “t” não pareado (BERQUÓ et al., 1980). Todos os testes foram realizados ao nível de significância de 5%.Para a montagem dos bancos de dados foi utilizado o programa Excel..

(28) 5 RESULTADOS 5.1 Área da secção transversa unitária do miócito (ao mioc) A Fig. 01 mostra os valores médios da área da secção transversa unitária do miócito estimados a partir da leitura de 150 campos microscópicos para cada grupo. A área da secção transversa unitária do miócito da região septal no Grupo Adulto foi de 1,800 µm2 e no Grupo Senil foi de 1,554 µm2 (p > 0,05). No VD do grupo Adulto a área foi de 1,635 µm2 e no grupo Senil foi de 1,509 µm2 (p>0,05). No VE a área da secção transversa do miócito foi de 1,710 µm2 no grupo Adulto e de 1,836 µm2 no grupo Senil (p > 0,05). No grupo Adulto não houve diferença estatisticamente significante entre as três regiões analisadas (p>0,05).. No grupo Senil houve diferença estatisticamente significante quando. comparados os valores das regiões VE e VD (p<0,05) e VE e S (p<0,05). 2,0. 2,0. 1,8. 1,8. 1,6. 1,6. 1,4. 1,4. 1,2. 1,2. *. 1,0. 1,0 S. VD. VE. S. VD. VE. Figura 01 – Valores médios da Área da secção transversa unitária dos miócitos do coração humano. A – Grupo adulto; B – Grupo senil. * p < 0,05. 5.2 Comprimento do perímetro unitário do miócito (lo mioc) A Fig. 02 apresenta os valores médios do comprimento do perímetro unitário do miócito estimados a partir da leitura de 150 campos microscópicos para cada grupo. Os valores médios das regiões Septal e ventricular direita foram menores no grupo Senil (5,109 µm e 5,162 µm respectivamente) do que no grupo Adulto (5,851 µm e 5,571 µm respectivamente) (p > 0,05). Embora na região ventricular esquerda o comprimento do perímetro unitário do miócito tenha se.

(29) 16 apresentado maior no grupo Senil (6,197µm) do que no grupo Adulto (5,498 µm) a diferença não foi estatisticamente significante (p > 0,05). No grupo Adulto não houve diferença estatisticamente significante entre as três regiões analisadas (p>0,05). No grupo Senil houve diferença estatisticamente significante quando comparados os valores das regiões VE e S (p<0,05).. 8. 8. 6. 6. 4. 4. 2. *. 2 S. VD. VE. S. VD. VE. Figura 02 – Valores médios do Comprimento do perímetro unitário do miócito do coração humano. A – Grupo adulto; B – Grupo senil. * p < 0,05. 5.3 Volume unitário do miócito (vo mioc) A Fig. 03 apresenta os valores médios do volume unitário do miócito estimados a partir da leitura de 150 campos microscópicos para cada grupo. Os valores médios do volume das regiões Septal, Ventricular direita e Ventricular esquerda foram maiores no grupo Senil (94,036 µm 3, 88,752 µm 3 e 122,408 µm 3 respectivamente) do que no grupo Adulto (87,754 µm 3, 68,317 µm 3 e 73,328 µm3). Entretanto a diferença não foi estatisticamente significante. No grupo Adulto não houve diferença estatisticamente significante entre as três regiões analisadas (p>0,05). No grupo Senil houve diferença estatisticamente significante quando comparados os valores das regiões VE e VD (p<0,05)..

(30) 17 150. 150. 120. 120. 90. 90. 60. 60. 30. 30. *. 0. 0 S. VD. S. VE. VD. VE. Figura 03 – Valores médios do Volume unitário do miócito do coração humano. A – Grupo adulto; B – Grupo senil. * p < 0,05. 5.4 Densidade volumétrica (fração de volume) dos miócitos (Vvmioc) A Fig. 04 apresenta os valores percentuais da densidade volumétrica dos miócitos estimados a partir da leitura de 150 campos microscópicos para cada grupo. Os valores percentuais foram maiores no grupo Adulto (S = 0,416 %; VD = 0,411 % e VE = 0,436) do que no grupo Senil (S = 0,400%; VD = 0,39 % e VE = 0,413 %) (p>0,05). No grupo Adulto não houve diferença estatisticamente significante entre as três regiões analisadas (p>0,05). No grupo Senil houve diferença estatisticamente significante quando comparados os valores das regiões VE e VD (p<0,05).. 0,44. 0,44. 0,42. 0,42. 0,40. 0,40. 0,38. 0,38. 0,36. *. 0,36. S. VD. VE. S. VD. VE. Figura 04 – Valores percentuais da Densidade volumétrica dos miócitos do coração humano. A – Grupo adulto; B – Grupo senil. * p < 0,05.

(31) 18 5.5 Número de miócitos por unidade de volume (Nmm^3mioc) A Fig. 05 apresenta o número de miócitos por unidade de volume estimados a partir da leitura de 150 campos microscópicos para cada grupo. Os valores do número de miócitos por unidade de volume foram maiores no grupo Senil (S = 2702357,7 mioc/mm3; VD = 2493591,4 mioc/mm3 e VE = 2660843,3 mioc/mm3) do que no grupo Adulto (S = 2690066,1 mioc/mm3; VD = 2361561,7 mioc/mm3 e VE = 2294502,3 mioc/mm3) (p>0,05). Em ambos os grupos não houve diferença estatisticamente significante entre as três regiões analisadas (p>0,05). 2800000. 2800000. 2600000. 2600000. 2400000. 2400000. 2200000. 2200000 2000000. 2000000 S. VD. VE. S. VD. VE. Figura 05 – Número de miócitos por unidade de volume do coração humano. A – Grupo adulto; B – Grupo senil.. 5.6 Densidade volumétrica nuclear (Vvnu) A Fig. 06 apresenta os valores percentuais da densidade volumétrica nuclear estimados a partir da leitura de 150 campos microscópicos para cada grupo. Os valores percentuais da densidade volumétrica nuclear foram maiores no grupo Senil (S = 2,980E-02; VD = 2,84E-02 e VE = 3,560E-02) do que no grupo Adulto (S = 0,032; VD =0,031 e VE = 0,032) (p>0,05). Em ambos os grupos não houve diferença estatisticamente significante entre as três regiões analisadas (p>0,05)..

(32) 19. 0,040. 0,040. 0,035. 0,035. 0,030. 0,030. 0,025. 0,025. 0,020. 0,020 S. VD. VE. S. VD. VE. Figura 06 – Valores da densidade volumétrica nuclear do coração humano. A – Grupo adulto; B – Grupo senil.. 5.7 Número de núcleos por milímetro cúbico. (Nmm^3nu) A Fig. 07 apresenta o número de núcleos por milímetros cúbicos estimados a partir da leitura de 150 campos microscópicos para cada grupo. Os valores do número de núcleo por milímetros cúbicos foram maiores no grupo Senil (S = 409369,14 nu/mm3; VD = 34960,69 nu/mm3 e VE = 431970,04 nu/mm3) do que no grupo Adulto (S = 369081,67 nu/mm3; VD = 339481,12 nu/mm3 e VE = 332629,30 nu/mm3) (p>0,05). Em ambos os grupos não houve diferença estatisticamente significante entre as três regiões analisadas (p>0,05).. 450000. 450000. 375000. 375000. 300000. 300000. 225000. 225000. 150000. 150000 S. VD. VE. S. VD. VE. Figura 07 – Número de núcleos por mm3 do coração humano. A – Grupo adulto; B – Grupo senil..

(33) 20 5.8 Volume unitário médio do núcleo (vo nu) A Fig. 08 apresenta o volume unitário médio do núcleo estimados a partir da leitura de 150 campos microscópicos para cada grupo. Os valores do volume unitário médio do núcleo foram maiores no grupo Adulto (S = 88,799 µm3; VD = 102,136 µm3 e VE = 98,393 µm3) do que no grupo Senil (S = 73,256 µm3; VD = 84,041 µm3 e VE = 83,009 µm3) (p>0,05). Em ambos os grupos não houve diferença estatisticamente significante entre as três regiões analisadas (p>0,05). 105. 105. 95. 95. 85. 85. 75. 75 65. 65 S. VD. VE. S. VD. VE. Figura 08 – Volume unitário médio do núcleo do coração humano. A – Grupo adulto; B – Grupo senil.. 5.9 Área da secção transversa unitária do núcleo (ao nu) A Fig. 09 apresenta a área da secção transversa unitária do núcleo estimados a partir da leitura de 150 campos microscópicos para cada grupo. Os valores da área da secção transversa unitária do núcleo foram maiores no grupo Senil nas regiões ventriculares direita e esquerda (2,082 µm2 e 2,318 µm2 respectivamente) do que no grupo Adulto (2,040 µm2 e 2,015 µm2 respectivamente). A região Septal apresentou um valor médio maior no grupo Adulto (2,145 µm2) do que no grupo Senil (1,997 µm2) (P>0,05). Em ambos os grupos não houve diferença estatisticamente significante entre as três regiões analisadas (p>0,05)..

(34) 21. 2,4 2,3 2,2 2,1 2 1,9 1,8. 2,4 2,3 2,2 2,1 2,0 1,9 S. VD. VE. S. VD. VE. Figura 09 – Área da secção transversa unitária do núcleo do coração humano. A – Grupo adulto; B – Grupo senil..

(35) 6 DISCUSSÃO O conhecimento do processo de envelhecimento do coração é importante para a melhor compreensão dos processos patológicos que se instalam mais comumente no indivíduo senil. Contudo uma das maiores dificuldades encontradas no estudo dos efeitos do envelhecimento sobre o sistema cardiovascular é a de se isolar e se identificar os efeitos do processo normal ou fisiológico de envelhecimento sobre àqueles relacionados com a presença de estados patológicos específicos associados. Na espécie humana é comum a ocorrência de aterosclerose, diabetes e doenças cardíacas isquêmicas e é sabido que a severidade dessas condições patológicas aumenta com a idade (OLIVETTI et al., 1991). Além disso, outras dificuldades são relatadas quando se deseja realizar uma investigação apenas do processo fisiológico de envelhecimento, tais como o estilo de vida de cada indivíduo, (nível de atividade física e estresse, hábitos alimentares, ingestão de álcool e tabagismo). Todos esses fatores podem contribuir para desencadear alterações na função cardiovascular no decorrer do envelhecimento do indivíduo, embora sua específica contribuição seja muito difícil de quantificar (SAFAR, 1990; LEWS e MARON, 1992). No presente estudo, semelhantemente ao protocolo adotado na literatura em trabalhos em humanos (KITZMAN et al, 1990, OLIVETTI et al., 1991; CHIDA et al., 1994; OLIVETTI et al., 1996) foram utilizados apenas corações provenientes de necrópsia de indivíduos não portadores de cardiopatias, a fim de diminuir a possibilidade de eventual presença de condições causadoras de hipertrofia miocárdica. A Estereologia permite-nos determinar a tridimensionalidade de um órgão, tecido, celula, etc, atraves de cortes histologicos com imagens bidimensionais. Em Esteriologia o primeiro mandamento é trabalhar com poucos individuos, poucos campos microscopicos analisados, gastar pouco (poucas laminas histologicas) mas sem perder a acurácia dos resultados. Segundo Mandarim-de-Lacerda (2000) para se usar o índice de significância de 0,05, o número mínimo de.

(36) 23 individuos num determinado estudo para se obter resultados exploráveis estatisticamente será de 05 individuos. Em nosso estudo obedecemos esse critério e utilizamos uma amostra de cinco individuos por grupo. Quando comparados os valores da área da secção transversa unitária do miócito nos grupos adulto e senil observamos que no grupo senil as áreas da secção transversa do miócito nas regiões septal e ventricular direita foram menores do que no grupo adulto, embora essa diferença não tenha sido estatisticamente significante. Entretanto, a região ventricular esquerda do grupo senil apresentou valor ligeiramente maior do que aquele encontrado no grupo adulto. ENGELMANN et al. (1987) em um estudo experimental com ratos normotensos com idades de 1, 6, 12, 18 e 24 meses, analisou a área da secção do miócito do corações desses animais e demonstraram haver um aumento significante da área da secção do miócito nos animais com 12 e 18 meses de idade e uma diminuição significante da área da secção do miócito nos animais com idade entre 18 e 24 meses. Entretanto, esses autores, não especificaram as regiões cardíacas utilizadas como amostra para esse estudo. Quando analisado os resultados dentro de cada grupo observou-se que o aumento da área da secção transversa do miócito na região ventricular esquerda foi estatisticamente significante quando comparado aos valores obtidos nas regiões septal e ventricular direita do grupo senil. BURNS et al. (1990) também observaram uma hipertrofia relativa dos miócitos mais acentuada na senilidade. Estudos também demonstraram, em corações humanos, que a área da miocélula próxima às região endocárdica se apresentava maior do que àquelas próximas às regiões epicárdicas (BRANDI e McGREGOR, 1969; GERDES et al., 1979), embora HATT et al. (1979) só tenham observado esse comportamento em corações humanos hipertróficos. Em nosso trabalho não foi realizado um estudo relativo a área da miocélula com relação a sua posição nas diferentes camadas do coração..

(37) 24 Os miócitos do grupo senil, nas regiões septal e ventricular direita, apresentaram valores médios do comprimento do perímetro unitário menores do que nas regiões semelhantes do grupo adulto, porém, na região ventricular esquerda o valor médio do comprimento do perímetro unitário do miócito foi maior no grupo senil. Quando analisado os resultados dentro de cada grupo observou-se que no grupo senil o valor médio do comprimento do perímetro unitário do miócito na região ventricular esquerda foi estatisticamente significante quando comparado aos valores obtidos nas regiões septal e ventricular direita. O comprimento do miócito é uma dimensão difícil de se obter na miocélula, particularmente no miocárdio adulto, devido a dificuldade de se obter verdadeiros cortes longitudinais da célula (CANALE et al, 1986), fato este que pode justificar a escassez de dados na literatura sobre o comprimento do perímetro unitário do miócito seja em trabalhos experimentais ou em humanos. Obtivemos valores médios do volume unitário dos miócitos maiores no grupo senil do que no grupo adulto, porém, essa diferença não se mostrou estatisticamente significante. Quando analisado os valores das três regiões desse mesmo grupo encontrou-se um volume unitário do miócito maior no ventrículo esquerdo do que nas regiões septal e ventricular direita No grupo adulto não houve diferença significante entre as três regiões estudadas . ÁGUILA et al (1998) analisando amostras das regiões septal e ventricular esquerda do miocárdio de ratos com idade de 3 e 15 meses observaram que o volume dos miócitos diminui de 76,7% no grupo de animais mais jovens para 72,2% nos animais de 15 meses de idade. Segundo POMERANCE (1975), ANVERSA et al. (1986), KITZMAN e EDWARDS (1990), ocorre no miocárdio humano, durante o envelhecimento, uma diminuição no número de miocélulas seguido de um aumento no tamanho das mesmas. Com relação à densidade volumétrica dos miócitos também observamos uma diminuição da mesma no grupo senil, embora estatisticamente não significativa. Em estudo experimental em corações de ratos com idade de 3 e.

(38) 25 15 meses, ÁGUILA et al. (1998) também observaram uma diminuição significativa da densidade volumétrica dos miócitos nos animais com idade de 15 meses, animais considerados nessa faixa etária como idosos. Entretanto, ENGELMANN et al. (1987) demonstraram haver um aumento do volume percentual do ventrículo esquerdo ocupado por miócitos em ratos normotensos com idade de 12 a 18 meses. Quando analisado apenas o grupo senil, observamos que o valor percentual foi significantemente maior no ventrículo esquerdo quando comparado com a região ventricular direita e septal. Não foram encontrados na literatura, entretanto, dados a cerca da densidade volumétrica dos miócitos nas diferentes regiões ventriculares e na parede septal. Com relação ao número de miócito por unidade de volume observamos um aumento no grupo senil. Da mesma forma, experimentalmente em ratos, ÁGUILA et al. (1998) também observaram um aumento de 5,42 para 13,26x 103 mm3. A densidade volumétrica nuclear foi maior nas três regiões do coração do grupo senil, entretanto não apresentou diferença estatisticamente significante. Não foram encontrados na literatura, entretanto, dados a cerca da densidade volumétrica nuclear durante o envelhecimento. Nossos dados demonstraram um aumento do número de núcleos por milímetro cúbico nas regiões ventriculares direita e esquerda e septal do grupo senil, embora essa diferença não tenha sido estatisticamente significante. Esses resultados são semelhantes com os descritos por OLIVETTI et al. (1991).que demonstraram um aumento no volume do miócito por núcleo em ambos os ventrículos. Não foram encontrados, na literatura consultada, dados acerca dos valores do volume unitário médio do núcleo. Nossos resultados demonstraram que os valores do volume unitário médio do núcleo foram maiores no grupo adulto nas três regiões estudadas (ventriculares direita e esquerda e septal)..

(39) 26 Os valores da área da secção transversa unitária do núcleo foram maiores nas três regiões ventriculares direita e esquerda no grupo senil. Entretanto, a região septal apresentou um valor maior no grupo adulto. Não foram encontrados na literatura, entretanto, dados a cerca da área da secção transversa unitária do núcleo nas diferentes regiões ventriculares (direita e esquerda) e na parede septal. Está bem estabelecido que, em ambos humanos e animais, a proliferação das miocélulas ocorre de maneira diminuída após o nascimento e que o crescimento do coração, durante as fases pós-natal e antes que a maturidade sexual seja alcançada, é controlada por hipertrofia das miocélulas e hiperplasia das células endotelias, capilares e fibroblastos (RAKUSAN, 1984; ZAK, 1984). Observa-se, entretanto, que a diminuição da massa cardíaca que é decorrente de uma contínua perda de miócito nas regiões ventriculares ocorre como um aspecto funcional da idade. Em contraste, o volume celular da miocélula por núcleo aumenta progressivamente compensando a perda funcional do músculo. Além disso, essas alterações quantitativas na miocélula são mais acentuadas no ventrículo esquerdo do que no direito. Todos esses fenômenos celulares culmina dando lugar a alterações externas na espessura da parede de ambos os ventrículos (KITZMAN et al, 1988; OLIVETTI et al., 1991; CHIDA et al., 1994). As alterações na estrutura ventricular parecem acarretar hipertrofia das miocélulas, como é observado na hipertensão ou doença vascular, enquanto que a hiperplasia ou “pseudohipertrofia” resulta da re-ocupação de áreas de miocélulas por tecido não contrátil como é observado na doença cardíaca isquêmica (UNVERFERTH et al., 1983; MESSERLI, 1984). A hipertrofia miocárdica por sua vez é a tentativa de adaptação do coração à sobrecarga de trabalho, evoluindo para a falência cardíaca quando o processo de adaptação é esgotado (MANDARIMDE-LACERDA, 1995)..

(40) 27 O processo de envelhecimento normal está associado a uma variedade de mudanças. Vários estudos já demonstraram que o envelhecimento estava associado com o aumento da espessura da espessura da parede ventricular esquerda e da massa cardíaca. Entretanto, essas mudanças são graduais e relativamente moderadas, e, segundo LEWIS E MARON (1992) as medições absolutas da espessura da parede cardíaca em indivíduos idosos raramente excedem os valores aceitos geralmente como normais. Entretanto, essas mudanças, as quais usualmente discretas, podem diminuir a capacidade do coração senil em se adaptar ao estresse imposto a partir da instalação de alguma doença cardiovascular (KITZMAN e EDWARDS, 1990). Em nosso estudo encontramos diferenças quando comparamos os grupos adulto e senil, porém, essas diferenças não chegaram a ser estatisticamente significantes..

(41) 7 CONCLUSÃO. Com base nos resultados obtidos no estudo realizado em corações humanos de indivíduos adultos e senis podemos concluir que:. -. Ocorrem modificações nas dimensões da miocélula do coração humano no decorrer do envelhecimento do indivíduo, entretanto, essas diferenças são sutis e parece significar a adaptação do tecido às mudanças funcionais que se instalam no decorrer da vida;. -. Na fase senil observa-se um aumento da área da secção transversa unitária do miócito, do comprimento do perímetro unitário do miócito e do volume unitário do miócito mais acentuada na parede do ventrículo esquerdo;. -. O aumento da área da secção transversa unitária do miócito, do comprimento do perímetro unitário do miócito e do volume unitário do miócito nos leva a concluir que durante o envelhecimento ocorre perda de miocélulas com provável hipertrofia das células remanescentes..

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(48) ANEXOS. TÉCNICAS HISTOCITOMÉTRICAS (FÓRMULAS FINAIS). a). Área de secção transversa unitária da miocélula. (4) ao mioc = Ao mioc/Nmioc. b). Comprimento unitário do perímetro da miocélula. (7) lo mioc = Lo mioc/Nmioc. c). Volume unitário da miocélula. (10) vo mioc = (hmioc * ao mioc) * fs^-3 ou vo mioc = (hmioc * ao mioc) * (ls/l'o)^-3. d). Volume percentual de miocélula (densidade volumetrica). (11) Vvmioc = Pmioc/Pt. e). Número de miocélulas por unidade de volume. (12) Nmm^3mioc = 10^9/96.04 * Nmioc/hmioc * (ls/ló)^3 / (lo/lc). i). Fração de volume nuclear. (16) Vvnu = Pnu/ {Pt * 1 + 1.23[t/(hnu * lo/lc)]}. j). Número de núcleos por mm^3.

(49) 36 (18) Nmm^3nu = 10^9/(96.04*t) * Nnu/[hnu * (lo/lc) + t] * fs^3. k). Volume unitário médio do núcleo. (19) vnu = (10^9 * Vvnu)/ Nmm^3nu. l). Área de secção unitária média do núcleo. (20) anu = 0.9604 * (Pnu/Nnu) * {[hnu * (lo/lc) * t]/ [hnu * (lo/lc) * 1 + (1.23 * t)]}. Descrição das Fórmulas O comprimento da miocélula (hmioc = distância inter-nuclear) foi medido diretamente no microscópio com uma ocular 10X + 100X (objetiva de imersão), sendo que a direção do maior eixo da miocélula era paralelo ao fio da navalha ou seja, perpendicular a direção do corte (Chizzola et all, 1967). Nestas condições não foi necessário a correção para a compressão, apenas para à retração. Os fatores de compressão e retração foram considerados para cada bloco de tecido, tendo em vista as variações de um para o outro. A área total. das secções. transversas das miocélulas foi estimada em cortes. perpendiculares ao maior eixo da miocélula. O valor destas áreas (Amioc), é dado pela relação entre o número de pontos que caem nas estruturas em tela (Pmioc) e, o número total de pontos do sistema-teste (Pt). (1). Amioc = Pmioc/Pt. No nosso caso, a área das secções transversas das miocélulas na área-teste é dada em µm2: Amioc = (Pmioc/Pt) * At , onde (At) é a área total do sistema-teste em µm2 = 96,04 e (Pt) = 100, logo: (2). Acmioc = 0,9604 * Pmioc , aplicando o fator de Compressão na fórmula 2 teremos:.

(50) 37 (3) Ao mioc = 0.9604 * Pmioc * (lo/lc) O número de secções transversas de miocélulas na área-teste (nmioc), foi contada; a área de secção transversa unitária em µm2 será, então: (4) ao mioc = Ao mioc/Nmioc ; este procedimento permite estimar o valor unitário médio da área de secção transversa da miocélula, onde (Nmioc) é o número de miocélulas contadas nos campos correspondentes. A contagem das miocélulas foi feita em cada campo microscópico separadamente levando em conta as “linhas proibidas”(Weibel, 1978). Para determinar a medida do perímetro das secções transversas, usamos a fórmula baseada no teorema de Buffon (Weibel e Elias, 1967): (5). L = n * (PI/2) * D ,sendo (n) o número de intersecções das linhas-teste com os. contornos das transecções e (D) é a distância entre retas paralelas do sistema-teste. Tomando como base a fórmula 5, o comprimento (Lmioc), do perímetro das secções transversas de miocélulas na área-teste é: (6). Lcmioc = Imioc * (PI/2) * D. , onde (Imioc) corresponde ao número de. intersecções de miocélulas na área-teste. Utilizando o Fator de Compressão corrigimos a fórmula 6 para: (6a). Lo mioc = Imioc * (PI/2) * D * (lo/lc). Sendo (Nmioc). o número de secções transversas de miocélulas. na área-teste, o. comprimento unitário do perímetro da miocélula em µm resulta em: (7) lo mioc = Lo mioc/Nmioc A medida da superfície celular lateral unitária (comioc) pode ser dada pelo produto do perímetro unitário das secções transversas de miocélulas (lomioc), pelo comprimento unitário celular médio (hmioc) obtido pelas distâncias inter-nucleares. comioc = hmioc * lomioc , para o (hmioc) como já sabemos, não há necessidade para.

(51) 38 correção da compressão, tendo em vista que esta medida foi obtida seguindo a direção do corte paralelo ao fio da navalha, contudo não se encontra “desretraída”, portanto, considerando para o estado retraído temos: hmioc(retr.) = hmoc(desretr.) * ls/ló, logo: hmioc(desretr.) = hmioc(retr.) * ló/ls,. pelo mesmo. raciocínio temos: lo mioc(desretr.) = lo mioc(retr.) * ló/ls, donde: (8) co mioc = hmioc(retr.) * lo mioc(retr.) * (ló/ls)^2 Analogamente, o volume unitário (vmioc) é dado pelo produto da área de secção transversa (aomioc), pelo comprimento da miocélula: (9). vmioc = hmioc * aomioc , este volume foi obtido no tecido retraído; para ter o. volume (vo) estimado em suas dimensões correspondentes aos procedimentos prévios à fixação e inclusão (no material a fresco), utilizamos a fórmula: vo = vs * fs^-3, onde o (vo) é o volume original antes do pós-processamento e, (vs) é o volume após processado, sendo fs^-3 = (ls/ló)-3, portanto corrigindo a fórmula 9, temos: (10) vo mioc = (hmioc(retr.) * ao mioc) * fs^-3 ou vo mioc = (hmioc(retr.) * ao mioc) * (ls/ló)^-3 O volume percentual da miocélula (densidade volumétrica) é dada pela fórmula: Vvi = Pi/Pt (Weibel,1966), que aplicado ao nosso sistema-teste temos: (11) Vvmioc =. Pmioc/Pt. , onde (Pmioc) é o número de pontos que caem nas. estruturas e, (Pt) é o número total de pontos do sistema-teste. O número de miocélulas por unidade de volume (Nmm3mioc) é calculado pelo volume unitário da miocélula(vomioc) e o volume percentual (Vvmioc) ocupado pela miocélula do tecido, resultando: Nmm3mioc = (109*Vvmioc) / vomioc = (109 * Pmioc/Pt) / [(hmioc(retr.) * ao mioc) * fs^-3] = = (109 * Pmioc/Pt) / {[0.9604 * Pmioc * (lo/lc)] / Nmioc} * (ls/ló)3 , portanto temos:.

(52) 39 (12) Nmm3mioc = 10^9/96.04 * Nmioc/hmioc * (ls/ló)^3 / (lo/lc) Quanto ao número de núcleos das miocélulas estimamos o volume percentual (fração de volume), volume absoluto médio, área de secção transversa média unitária, número de núcleos por mm3 e o comprimento do núcleo (hnu) medido pela média do diâmetro maior pelo menor (d1 * d2) / 2. Enquanto que a influência de espessura do corte, sobre as medidas efetuadas nas miocélulas era insignificante, no caso dos núcleos foram necessárias correções. Para o volume percentual, podemos obter com um procedimento análogo ao aplicado as miocélulas, tendo em conta que é necessário fazer-se a correção do “Efeito Holmes” (Weibel e Elias, 1967), por meio da equação: (13) Vvo = (1/Ko) * (Po/Pt) , onde (Vvo) é o volume percentual corrigido, (Po) é o número de pontos sobre as estruturas, (Pt) é o número total de pontos do sistema-teste e (Ko) é o coeficiente de correção do efeito Holmes. Este coeficiente está ligado à dimensão característica da estrutura (h), com a forma e com a espessura do corte (t). Para as formações esféricas, Holmes (1927), Hennig (1957), Weibel e Elias (1967) propuseram a seguinte equação: (14) Ko = 1 + 3t / 2h ; por outro lado, para formações cilíndricas ou prismáticas temos: (18) Ko = 1 + t / h. Uma vez que o núcleo miocárdico tem forma aproximada intermédia entre essas formações, temos que: (19) 1 + 3t / 2h Knu 1 + t / h. Na prática pode-se determinar o volume percentual do núcleo, adotando sempre o mesmo valor do coeficiente (x), resultante da média de alguns casos medidos experimentalmente, tomando como base a fórmula: (15). x = [hnu * (P”nu - P’nu)] / (t” * P’nu - t’ * P”nu) , onde (t’) e (t”) são as. espessuras dos cortes histológicos, (hnu) é o comprimento do núcleo, (P’nu) e (P”nu) são os.