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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE DEPARTAMENTO DE MORFOLOGIA
PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA ESTRUTURAL E FUNCIONAL
EFEITOS DO GÊNERO E DA IDADE SOBRE A CITOARQUITETURA MORFOQUANTITATIVA DA COLUNA POSTERIOR DA MEDULA ESPINAL DO
SAGUI (Callithrix jacchus)
Mestrando: João Faustino da Silva Neto
Orientador: Expedito Silva do Nascimento Júnior
NATAL-RN 2019
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE DEPARTAMENTO DE MORFOLOGIA
PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA ESTRUTURAL E FUNCIONAL
EFEITOS DO GÊNERO E DA IDADE SOBRE A CITOARQUITETURA MORFOQUANTITATIVA DA COLUNA POSTERIOR DA MEDULA ESPINAL DO
SAGUI (Callithrix jacchus)
JOÃO FAUSTINO DA SILVA NETO
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Estrutural e Funcional (PGBIOEF) da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como parte dos requisitos para a obtenção do título de MESTRE EM BIOLOGIA
ESTRUTURAL E FUNCIONAL, orientado pelo
Prof. Dr. Expedito Silva do Nascimento Júnior.
NATAL-RN 2019
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas – SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial Prof. Leopoldo Nelson - -Centro de Biociências - CB
Silva Neto, João Faustino da.
Efeitos do gênero e da idade sobre a citoarquitetura morfoquantitativa da coluna posterior da medula espinal do sagui (Callithrix jacchus) / João Faustino da Silva Neto. - Natal, 2020.
68 f.: il.
Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Biociências. Programa de Pós-graduação em Biologia Estrutural e Funcional.
Orientador: Prof. Dr. Expedito Silva do Nascimento Júnior.
1. Sagui - Dissertação. 2. Medula espinal - Dissertação. 3. Coluna posterior - Dissertação. 4. Estereologia - Dissertação. 5. Citoarquitetura - Dissertação. I. Nascimento Júnior,
Expedito Silva do. II. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. III. Título.
RN/UF/BSE-CB CDU 599.821
EFEITOS DO GÊNERO E DA IDADE SOBRE A CITOARQUITETURA MORFOQUANTITATIVA DA COLUNA POSTERIOR DA MEDULA ESPINAL DO
SAGUI (Callithrix jacchus)
JOÃO FAUSTINO DA SILVA NETO
Dissertação APROVADA pelo Programa de Pós-Graduação em Biologia Estrutural e Funcional (PGBIOEF) da Universidade Federal do Rio Grande do Norte.
Banca Examinadora da dissertação
Prof. Dr. Expedito Silva do Nascimento Júnior
___________________________________________________________
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - Orientador
Prof. Dr. Fernando Vagner Lobo Ladd
___________________________________________________________ Universidade Federal do Rio Grande do Norte - Membro Interno
Prof. Dr. Paulo Leonardo Araújo de Gois Morais
___________________________________________________________ Universidade do Estado do Rio Grande do Norte - Membro Externo
Dedico este trabalho a todas as pessoas que tornaram possível sua realização, em especial a minha família.
Agradecimentos
Ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Estrutural e Funcional (PGBIOEF) da Universidade Federal do Rio Grande do Norte e seu corpo docente por todo o aprendizado a mim proporcionado.
Ao meu orientador Prof. Dr. Expedito Silva do Nascimento Júnior, pela oportunidade, pelos conhecimentos e ensinamentos passados ao longo da vida acadêmica no mestrado.
Ao Prof. Dr. Fernando Vagner Lobo Ladd, pela coorientação e apoio na estereologia. Aos meus pais, Luzia Tavares e Antônio Faustino, por todo o apoio, incentivos e amor incondicional.
Aos meus avós, Uleime, Joaquim, Luiza e João Faustino, pois esses são os gigantes no qual me apoiei em seus ombros.
A minha esposa Miriam, por estar ao meu lado me apoiando e incentivando nas horas difíceis de desânimo e cansaço.
A minhas amigas Laura e Raissa, pela amizade e grande ajuda durante toda a minha jornada.
A meus alunos e funcionários que compõe o DMOR e o PGBIOEF, em especial Alexander pelo apoio na imunoistoquímica e em tirar todas as dúvidas que tive durante o trabalho de bancada.
A meus amigos Diego, Leandro, Flávio e André por estarem presente em todos os momentos desse percurso, sempre dando apoio nos momentos mais difíceis.
A todos que direta ou indiretamente fizeram parte dessa jornada, о meu muito obrigado.
“A única coisa que temos e que mais ninguém tem somos nós mesmos. As nossas vozes, a nossa história, a nossa visão. Por isso, escrevam, desenhem, brinquem, dancem e vivam como só vocês
conseguem”
RESUMO
O sagui de tufo branco (Callithrix jacchus) é um pequeno primata nativo do nordeste do Brasil e tem sido amplamente utilizado em modelos de pesquisa no mundo inteiro. A medula espinal do sagui possui as principais características da medula típica de mamíferos. Essa similaridade da medula espinal com outros primatas e com os humanos, além da facilidade de manejo, gestação curta e rápida formação de colônia, permite que os saguis sejam cada vez mais utilizados como modelos alternativos de primatas na pesquisa biomédica. Apesar de encontrarmos vários estudos associados ao encéfalo desses primatas, possuímos pouca informação sobre possíveis diferenças morfoquantitativas existentes substância branca e substância cinzenta da medula espinal de saguis. Isso evidência um pioneirismo importantíssimo frente a uma área de estudos tão escassa. Assim, este trabalho tem por objetivo caracterizar as diferenças morfológicas entre gênero e por idade na coluna posterior cinzenta da medula espinal do sagui. Analisando lâminas de Rexed através de técnicas citoarquitetônicas e verificando as principais diferenças entre os gêneros e idades dos animais. A caracterização citoarquitetônica foi obtida através da imunoistoquimica, morfometria dos corpos neuronais da coluna posterior desses primatas, além da análise estereologica sendo obtida através do método de Cavalieri. A característica serotoninérgica da medula espinal de saguis obtida pela imunoistoquímica mostra uma concentração de fibra reativas a 5-HT nas lâminas I, II e III, sendo corroborado pela literatura em diversos modelos animais. Os resultados do presente trabalho nos permitem chegar a uma estabilidade quanto aos aspectos bidimensionais entre os grupos “adulto/jovem macho” e “idoso macho” e entre os grupos “adulto/jovem macho” e “adulto/jovem fêmea” tanto em média de área (µm²) quanto em lâmina por lâmina. Essa estabilidade também é observada na média de volume em µm3 da substância branca, substância cinzenta, coluna posterior e volume total da medula espinal de saguis comparando o grupo adulto/jovem macho e o idoso macho, assim como na comparação entre os grupos gêneros, com exceção do volume total da medula espinal que apresentou um aumento significativo (0,045) do grupo fêmea adulta/jovem em comparação ao grupo macho adulto/jovem.
ABSTRACT
The marmoset (Callithrix jacchus) is a small primate native to northeastern Brazil and has been used in research models worldwide. A marmoset spinal cord has as its main characteristics the typical marrow of mammals. This spinal cord similarity to other primates and humans, as well as ease of handling, short and rapid colony management, allows marmosets to be increasingly used as alternative primate models in biomedical research. Although we found several studies associated with the brain of these primates, we have little information about possible morphochemical differences existing white matter and gray matter of the marmoset spinal cord. This shows a very important pioneering spirit in the face of such a scarce field of study. Thus, this paper aims to characterize the morphological differences between gender and age in the gray posterior column of the marmoset spinal cord. Analyzing Rexed slides using cytoarchitectonic techniques and verifying the main differences between the genera and age of the animals. The cytoarchitectonic characterization was obtained through immunohistochemistry, morphometry of the neuronal bodies of the posterior column of these primates, besides the stereological analysis being obtained through the Cavalieri method. The serotoninergic characteristic of the marmoset spinal cord obtained by immunohistochemistry shows a concentration of 5-HT reactive fibers in slides I, II and III, being corroborated by the literature in several animal models. The results of the present study allow us to achieve stability in terms of two-dimensional aspects between the “adult / young male” and “elderly male” groups and between the “adult / young male” and “adult / young female” groups, both on average of area (µm²) as well as blade by blade. This stability is also observed in the average volume in µm3 of white matter, gray matter, posterior column and total volume of marmoset spinal cord comparing the adult / young male group and the elderly male, as well as in the comparison between the gender groups, with exception of the total spinal cord volume which showed a significant increase (0.045) in the adult / young female group compared to the adult / young male group.
Lista de Ilustrações
Figura 1: imagem histológica de medula espinal. ... 12
Figura 2: lâminas de Rexed. ... 14
Figura 3: Uma fotografia de uma seção transversal da medula espinhal de sagui no nível de C7 com lâminas de Rexed. ... 15
Figura 4:sagui de tufo branco (Callithrix jacchus). ... 20
Figura 5: Núcleo de primatologia-UFRN, corredor interno. ... 20
Figura 6:Núcleo de primatologia-UFRN, fachada externa do biotério. ... 20
Figura 7: região torácica da medula espinal sendo medida por paquimetro digital. Fonte: Laboratório de Neuroanatomia... 24
Figura 8: Região toráxica da medula espinal sendo pesada em balança de precisão. ... 24
Figura 9: esquema representativo de amostragem dos segmentos da medula espinal dos saguis. ... 26
Figura 10: sistema teste aplicado a uma fotomicrografia da medula espinal de sagui para contagem de pontos. ... 29
Figura 11: Corno posterior do segmento cervical do sagui. Coloração em Níssil. Em A é apresentado neurônios que formam a lâmina I, em B a lâmina II, em C a lâmina III, em D a lâmina IV, em E a lâmina V, em F a lâmina VI. ... 32
Figura 12: Delimitação das lâminas de Rexed do corno posterior do segmento cervical (C6) de um animal macho em A e fêmea em C (C8) utilizando o método de níssil. Esquemas representativos dos respectivos cornos em B e D. ... 33
Figura 13: Delimitação das lâminas de Rexed do corno posterior do segmento torácico (T5) de um animal macho em A e fêmea em C (T6) utilizando o método de níssil .10X. Esquemas representativos dos respectivos cornos em B e D.. ... 34
Figura 14: Delimitação das lâminas de Rexed do corno posterior do segmento lombar (L4) de um animal macho em A e fêmea em C (L3) utilizando o método de níssil. Esquemas representativos dos respectivos cornos em B e D. ... 35 Figura 15: Delimitação das lâminas de Rexed do corno posterior do segmento sacral (S2) de um animal macho em A e fêmea em C (S3) utilizando o método de níssil. Esquemas representativos dos respectivos cornos em B e D. ... 36 Figura 16: Delimitação das lâminas de Rexed do corno posterior do segmento cervical (C1) de um animal idoso em A e adulto/jovem em C (C4) utilizando o método de níssil. Esquemas representativos dos respectivos cornos em B e D. ... 37 Figura 17: Delimitação das lâminas de Rexed do corno posterior do segmento torácico (T11) de um animal idoso em A e adulto/jovem em C (T5) utilizando o método de níssil. Esquemas representativos dos respectivos cornos em B e D. .. 38 Figura 18: Delimitação das lâminas de Rexed do corno posterior do segmento lombar (S4) de um animal idoso em A e adulto/jovem em C (S4) utilizando o método de níssil. Esquemas representativos dos respectivos cornos em B e D. ... 39 Figura 19:Delimitação das lâminas de Rexed do corno posterior do segmento lombar (S4) de um animal idoso em A e adulto/jovem em C (S4) utilizando o método de níssil. Esquemas representativos dos respectivos cornos em B e D. ... 40 Figura 20: gráfico das áreas de neurônios em μm² das lâminas de Rexed entre grupos etários. ... 42 Figura 21: gráfico das áreas de neurônios em μm² das lâminas de Rexed entre gêneros. ... 43 Figura 22: Expressão imunohistoquímica de serotonina no segmento cervical da medula espinal de sagui em (A); (B) Ampliação da caixa em A, evidenciando fibras serotonérgicas no corno posterior ... 45 Figura 23: Expressão imunohistoquímica de serotonina e representação das lâminas I, II e III no corno posterior da região cervical (A), torácica (B) e lombar (C)………..46
Figura 24: gráfico de comparação em µm³ da substância branca, cinzenta e coluna posterior dos grupos gênero e etário... 49
Lista de Tabelas
Tabela 1: dados e medidas macromorfométricas dos animais. ... 24
Tabela 2: Teste de significância da área total dos neurônios da coluna posterior
entre grupos etários. ... 41
Tabela 3: Teste de significância das áreas dos neurônios das lâminas da coluna
posterior entre grupos etários. Fonte: elaborado pelo autor.. ... 41
Tabela 4: Teste de significância da área total da coluna posterior entre gêneros. . 42
Tabela 5: Teste de significância das áreas dos neurônios das lâminas da coluna
posterior entre gêneros. ... 43 Tabela 6: teste T para duas amostras do Vref. total entre gêneros. ... 47 Tabela 7: teste T para duas amostras do Vref. substância branca entre gêneros. 47 Tabela 8: teste T para duas amostras do Vref. substância cinzenta entre gêneros. ... 48 Tabela 9: teste T para duas amostras do Vref. coluna posterior entre gêneros. ... 48 Tabela 10: teste T para duas amostras do Vref. total entre grupos etários. ... 48 Tabela 11: teste T para duas amostras do Vref. substância branca entre grupos etários. ... 48 Tabela 12: teste T para duas amostras do Vref. substância cinzenta entre grupos etários. ... 49 Tabela 13: teste T para duas amostras do Vref. coluna posterior entre grupos etários. ... 49
Lista de abreviaturas
5-HT: serotonina NPY: neuropeptídio Y DAB: diaminobenzina
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ... 12
1.1. Anatomia geral da medula espinal. ... 12
1.2. Anatomia da medula espinal do sagui. ... 15
1.3. Características neuroquímicas da coluna posterior ... 16
1.4. Dimorfismo sexual da medula espinal ... 17
1.5. Envelhecimento e medula espinal ... 17
1.6. Métodos para quantificação do tecido nervoso e sua relevância ... 18
1.7. O modelo experimental... 19 2. JUSTIFICATIVA ... 22 3. OBJETIVOS... 23 3.1. Objetivo geral ... 23 3.2. Objetivos específicos ... 23 4. MATERIAIS E MÉTODOS ... 24 4.1. Sujeitos ... 24 4.2. Procedimentos ... 25 5. RESULTADOS ... 31 5.2. Resultados da morfometria ... 41
5.2.3. Resultados para imunoistoquímica ... 44
5.3. Resultados da estereologia ... 47 6. DISCUSSÃO ... 50 6.3. Morfometria ... 52 6.4. Imunoistoquímica ... 53 6.5. Estereologia ... 54 7. CONCLUSÃO ... 56 8. DIFICULDADES TÉCNICAS ... 57 9. REFERÊNCIAS ... 58 10. ANEXOS ... 65
1. INTRODUÇÃO
1.1. Anatomia geral da medula espinal.
A medula espinal é um órgão do sistema nervoso central, localizada internamente ao canal vertebral, é limitada superiormente pelo bulbo do tronco encefálico, ao nível do forame magno, possuindo o limite inferior localizado entre a primeira (L1) e a segunda vértebra lombar (L2) (MACHADO e HAERTEL, 2013). É apresentada como um “cordão” de tecido nervoso, levemente achatada em seu eixo anteroposterior e apresentando duas dilatações, denominadas de intumescências cervical e lombossacral, as quais estão relacionadas a emergência das raízes nervosas que formam os plexos braquial, cervical e lombossacral. Percorrida longitudinalmente por sulcos e fissuras, acidentes anatômicos, que determinam uma relação com suas estruturas internas. Nota-se anteriormente uma fissura mediana anterior e posteriormente, o sulco mediano posterior, sendo visível apenas no nível cervical o sulco intermédio posterior. Lateralmente são observados também os sulcos laterais anterior e posterior, onde fazem conexão as raízes ventrais (motoras) e as dorsais (sensitivas) dos nervos espinais, respectivamente. (MACHADO e HAERTEL, 2013; MARTINEZ, et al. 2014).
A medula espinal é formada por duas substâncias, a branca formada por concentrações de axônios mielinizados e a cinzenta, formada por uma concentração de corpos de neurônios (Fig.1). A substância branca, apresenta-se dividida em funículos anteriores, limitados pelos
Figura 1: imagem histológica de medula espinal. 2X. Fonte da figura: imagens histológicas cedidas pelo laboratório de histologia do UNI-RN.
sulcos laterais anteriores e a fissura mediana anterior, também são observados os funículos laterais, separados pelos sulcos laterais anteriores e posteriores, além dos funículos posteriores delimitados pelo sulco lateral posterior e o sulco mediano posterior, sendo o próprio funículo posterior é dividido em dois fascículos. O fascículo cuneiforme, mais lateral, responsável por conduzir os impulsos nervosos provenientes dos membros superiores e da metade superior do tronco e o fascículo grácil, responsável por conduzir impulsos nervosos dos membros superiores e metade inferior do tronco. (MACHADO e HAERTEL, 2013; MARTIN, 2013; COSENZA, 2013).
A substância cinzenta é circundada pela substância branca e possui a forma da letra H – motivo pelo qual ela é habitualmente chamada de “H medular”. Essa estrutura pode ser dividida em três porções, a porção posterior do H medular é denominada coluna posterior (ou dorsal), formado em sua maioria por neurônios de associação, a porção chamada de coluna anterior (ou ventral) constituído por neurônios motores, além da substância cinzenta intermédia que por sua vez pode ser dividida em substância cinzenta intermédia central e substância cinzenta intermédia lateral (MACHADO e HAERTEL, 2013; MARTINEZ, et al. 2014; COSENZA, 2013).
A coluna anterior é uma estrutura larga possuindo na maior parte dos segmentos a forma quadrangular. Ela é separada da superfície da medula espinal por uma espessa camada de substância branca. Já a coluna posterior é estreita e longa quase chegando à face posterior da medula espinal (MARTINEZ, et al. 2014). A coluna posterior tem uma forma triangular, possuindo do sentido dorsoventral um ápice e uma base. As regiões das colunas posteriores, intermediária e anterior foram agrupadas pelo neurocientista sueco Bror Rexed (1914-2002) em dez lâminas, numeradas de I a X, no sentido dorsoventral (Fig. 2). Rexed se baseou, principalmente no formato dos neurônios e na sua disposição longitudinal
(MARTINEZ, et al. 2014; MARTIN, 2013).
As lâminas de I a VI correspondem à coluna dorsal da substância cinzenta, ou seja, relacionadas a aferências sensitivas. A lâmina I diz respeito a zona de Waldeyer (núcleo marginal) formados por neurônios cordonais de associação. É a camada mais fina e contém neurônios pequenos, médios e grandes, sendo as células geralmente alongadas e fusiformes. (BROW, 1981).
A substância gelatinosa de Rolando, presente na lâmina II e III, permite a integração de impulsos nervosos das vias dolorosas e térmicas. O núcleo próprio da coluna posterior compõe as lâminas IV e V e abriga o segundo neurônio da via tátil protopática ou grosseira compondo a via espinotalâmica anterior (VALENTIM NETO, et al. 2006; BROW, 1981). Na lâmina VI observamos os neurônios da base da coluna dorsal, que fazem sinapse com o segundo neurônio do trato espinotalâmico anterior (BROW, 1981).
A lâmina II e a lâmina III possuem a organização dendrítica com neurônios com longos filamentos. As árvores dendríticas de todos as lâminas são bem desenvolvidas em uma direção longitudinal, geralmente através das lâminas II e III, terminando às vezes na lâmina IV, em um plano sagital. Os axônios dos neurônios da lâmina II são confinados, em sua maior parte, na própria lâmina II, enquanto a lâmina III projeta seus axônios para as lâminas II, V ou VI. os dendritos dos neurônios da lâmina IV se projetam através da lâmina III e, portanto, percorrem mais ou menos em ângulos retos em direção a arborização axonial da lâmina (BROW, 1981; VALENTIM NETO, et al. 2006).
A classificação dos neurônios da coluna dorsal se baseia na sua resposta em relação a uma estimulação nociva sobre a pele. A classificação é: Classe 1, neurônios excitados devido a sensibilidade cutânea dos mecanorreceptores; Classe 2, neurônios excitados por
sensibilidade cutânea dos mecanorreceptores e nociceptores; classe 3, neurônios excitados apenas por nociceptores (BROW, 1981). Menétrey et al. (1977) subdividiu a classe 1 e 2 e ainda adicionou a classe 4 a partir dos seus estudos dos neurônios das colunas dorsais em ratos. A classe 1a são os neurônios que se excitam pelo movimento de pelos e o toque, a classe 1b representam os neurônios que se excitam a partir do movimento de pelos, toque e pressão ou pressão leve. A classe 2a dos neurônios é excitada pelos movimentos dos pelos, toque ou pressão e picadas, a classe 2b por pressão ou picada. A classe 4 tem a sua excitação devido aos movimentos articulares ou pressão de tecidos profundos.
1.2. Anatomia da medula espinal do sagui.
A medula espinal de sagui possui 8 segmentos cervicais, 12 segmentos torácicos, 7 segmentos lombares, 3 segmentos sacrais e 4 coccígeos segmentos. Possuindo, assim como no humano, duas intumescências, a cervical e a lombar. A intumescência cervical se estende de C5 a T1 e a ampliação lombar de L3 a L6 no sagui. Os segmentos mais largos da medula espinal são encontrados no segmento cervical, seguidos pelo segmento lombar, torácico, sacral e coccígeo apresentado um par de nervos espinais a cada um dos segmentos espinais da medula espinal do sagui. (WATSON, et al., 2015; IWANAMI, et al., 2005).
Em relação as lâminas de Rexed da coluna posterior da substância cinzenta da medula espinal dos saguis, a lâmina 1, a camada marginal, é uma lâmina fina que contém pequenos neurônios fusiformes. A lâmina 2 (substância gelatinosa) é dividida em zonas externa e
Figura 3: Uma fotografia de uma seção transversal da medula espinhal de sagui no nível de C7 com lâminas de Rexed. Fonte: WATSON, et al., 2015.
interna; contém pequenos neurônios arredondados ou ligeiramente alongados. As lâminas 3 e 4 formam o núcleo próprio do corno dorsal. A lâmina 3 é morfologicamente heterogênea, com neurônios arredondados, ligeiramente alongados e em forma de fuso. A lâmina 4 é uma lâmina mais espessa, com menor densidade de neurônios, alguns dos quais com treinos dendríticos que se parecem com antenas. A lâmina 5 é a camada mais larga do chifre dorsal, com neurônios triangulares, multipolares e em forma de fuso. A parte lateral da lâmina 5 é reticulada com feixes de axônios e consiste em grandes neurônios, enquanto a parte medial é compacta e composta de neurônios de pequeno a médio porte. A lâmina 6 é encontrada apenas nos aumentos cervical e lombossacral (WATSON, et al., 2015).
1.3. Características neuroquímicas da coluna posterior
A medula espinhal tem uma rica inervação de serotonina (5-HT), que se supõe ser originário de neurônios localizado principalmente no complexo medular da rafe com pequenas contribuições do cinza central e a formação reticular (HADJICONSTANTINOU, M. et al., 1984). 5-HT é o neurotransmissor mais amplamente distribuído no cérebro, embora seu conteúdo no SNC seja inferior a 5% do conteúdo de todo o corpo (JACOBS e AZMITIA, 1992). Nas décadas seguintes, ficou claro que as vias de sinalização do 5-HT estão envolvidas em funções cerebrais essenciais, incluindo processamento sensorial, controle cognitivo, regulação das emoções, controle autonômico e atividade motora (LESCH e WAIDER, 2012).
As fibras nervosas imunorreativa a 5-HT foram distribuídas homogeneamente ao longo da medula espinal em todas as lâminas; entretanto, eram mais evidentes nas lâminas I, e X e menos evidentes nas lâminas VII (TORRES DA SILVA et al., 2016). A neuroquímica da coluna dorsal da medula espinal do sagui revela fibras bem definidas, contendo neuropeptídio Y (NPY), sendo mais densamente distribuídas nas lâminas apicais da coluna posterior. espinhal era escassa, sendo observada de forma mais densa nos níveis sacrais superiores (GIBSON et al, 1984a; GIBSON et al, 1984b).
1.4. Dimorfismo sexual da medula espinal
Apesar da importância dos saguis para pesquisas em neurociências, o meio científico possui poucos dados sobre características morfofuncionais da medula espinal desses primatas. Sendo concentrado em estudos voltados a análise topográfico vertebro-medular, não apresentando diferença significativa entre machos e fêmeas (STUNITZ DA SILVA et al., 2013). Em relação aos estudos referentes a coluna posterior da substância cinzenta, há uma literatura escassa, sendo concentrada no dimorfismo referente a característica imunoistoquímica. Aonde se revela diferenças relacionadas principalmente a grandes núcleos de neurônios motores (FORGER e BREEDLOVE, 1986; MORRIS et al., 2004).
1.5. Envelhecimento e medula espinal
O envelhecimento é caracterizado pelo declínio progressivo da função fisiológica e pela incapacidade de responder às alterações e estressores no ambiente. Embora o impacto do envelhecimento sobre a função do sistema nervoso seja bem conhecido, apenas uma quantidade limitada de informação sobre alterações morfofuncionais envolvendo a medula espinal é descrita. As pesquisassobre os efeitos do envelhecimento na medula espinal se têm concentrado nos neurônios motores das colunas anteriores e em suas conexões com a musculatura esquelética. Sendo escasso com relação à coluna posterior (PARKINSON et al., 2016; FU et al., 2015).
Utilizando a técnica de ressonância magnética, Laing et al. (2014), destacou que todas as medidas da medula espinal de ratos foram significativamente maiores para os espécimes envelhecidos. Sendo observado que a profundidade, largura e área da medula espinal foram significativamente maiores no grupo de idosos com uma média de 8,6%.
Ainda em ratos foi encontrado na literatura um aumento modesto do número de neurônios associado ao envelhecimento, porém devido ao aumento muito mais acentuado na massa da medula espinal, a densidade neural diminuiu fortemente com a idade. Além disso, quando comparados os grupos etários mais jovens aos mais velhos, a densidade neuronal reduziu-se em aproximadamente 19%. No entanto, como a massa da medula espinal mostrou
um aumento mais robusto no mesmo período de idade, a densidade celular não neuronal apresentou uma dependência relativamente fraca e negativa. Ao contrário dos outros parâmetros pesquisados, a razão não neurônio / neurônio foi constante em todas as idades dos ratos (FU et al., 2015).
1.6. Métodos para quantificação do tecido nervoso e sua relevância
Há um interesse crescente do meio científico na área de morfologia em estimular e requisitar estimativas quantitativas que empreguem delineamento estereológico em suas análises.
A estereologia é um campo interdisciplinar que se preocupa em grande parte com a interpretação tridimensional de secções planas de materiais ou tecidos (WALLOE et al, 2011). Ela fornece técnicas para extrair informações quantitativas sobre um material tridimensional a partir de medições feitas em sistemas bidimensionais (WALLOE et al, 2011; HOWARD e REED, 2010).
A amostragem na estereologia é sistemática, uniforme e aleatória para fornecer dados potencialmente imparciais e quantitativos, se tornando uma ferramenta importante e eficiente em muitas aplicações da microscopia e fornecendo estimativas de áreas e números de células. (WALLOE et al, 2011).
O método e quantificação tridimensional é muito utilizado no tecido nervoso, para obter resultados relevantes em relação a determinação do volume da substância branca e cinzenta ou estimando o número de células neuronais e não neuronais de aves e roedores (CAKMAK et al. 2017; ÇAKMAK et al., 2018; BAKICI et al., 2019). Sendo amplamente empregada na observação e caracterização tecidual de lesões da medula espinal de diversos animais (BAASTRUP et al., 2010; DAVID et al., 2019; PATAR et al., 2019).
Portanto, a estereologia é um método que inclui regras desenvolvidas com fatores de correção no tempo mínimo e com erro mínimo (CAKMAK et al. 2017). Lançando uma luz para os estudos sobre neurobiologia, anatomia, patologia e estudos neurodegenerativos sobre a medula espinal.
1.7. O modelo experimental
Estudos pré-clínicos empregando animais de laboratórios como ratos, camundongos, cães, coelhos e primatas não humanos como modelos experimentais tem constituído um importante instrumento para o aprendizado sobre características morfofuncionais desconhecidas, além da compreensão e tratamento de muitas patologias humanas. A pesquisa utilizando animais teve início com Hipócrates há mais de dois mil anos, mas foi Wilian Harvey (1578-1657) quem publicou no ano de 1628 o primeiro trabalho científico utilizando animais, sob o título de “Exercitatio anatomica de motu cordis el sanguinis in
animalibus”, esse trabalho apresentou uma análise da anatomia e fisiologia do sistema
circulatório de mais de 80 espécies de animais. Desde então, inúmeros trabalhos utilizando animais para estudos em favor do conhecimento científico e da saúde humana, foram registrados (SIQUEIRA e BAZOTTE, 2004).
A pesquisa científica permite o melhor conhecimento da fisiologia, da etiopatogenia das doenças, da ação de medicamentos ou dos efeitos das intervenções cirúrgicas. Sua maior importância está relacionada ao respeito à barreira ética de não intervenção primária experimental em anima nobile. Nesse sentido, o modelo experimental deve ser funcionalmente, o mais semelhante possível ao que se objetiva estudar. Os modelos animais podem ser utilizados em todos os campos da pesquisa biológica. Tratando-se de modelos experimentais, torna-se importante a conceituação de doença animal, que é aquela cujos mecanismos patológicos são suficientemente similares àqueles de uma doença humana, atuando assim como modelo (FERREIRA et al., 2005).
O sagui de tufo branco é um pequeno primata nativo no nordeste do Brasil (Fig.3) e tem sido amplamente utilizado em modelos de pesquisa na América do Norte e Europa, além o próprio Brasil, possuindo como um dos primeiros estudos envolvendo esses animais no Brasil o trabalho “Calbindin immunoreactivity delineates the circadian visual centers of
the brain of the common marmoset (Callithrix jacchus)” da profª Miriam Stela e prof. Luiz
Britto (COSTA e BRITO.,1997). Esses primatas da América do Sul (Platyrrhines) se separaram dos primatas do velho mundo (Catarrhines) a aproximadamente 26 a 27 milhões de anos atrás, resultando em uma série de diferenças distintas (COSTA et al.,1999; ABBOTT et al., 2003).
Os animais desta espécie têm como características tufos circo-auriculares brancos, mancha branca em região frontal e nasal e cauda não preênsil com faixas transversais (STEVENSON, 1988; MANSFIELD, 2003). ainda afirma que esses animais possuem pequeno porte, de 350g a 450g de massa corpórea e habitam a caatinga e o cerrado brasileiro em formações arbóreas baixas. Esse primata amadurece com 18 meses a dois anos de idade, suas fêmeas dão à luz de 3 a 5 descendentes por ano e os adultos atingem a idade avançada por volta dos 8 anos (STEVENSON, 1988; ABBOTT et al., 2003). São considerados insetívoros-gumívoros, alimentando-se de insetos e de grande variedade de matéria vegetal, como resinas arbóreas, sementes, flores, frutos e néctar (CASTRO, 2003).
Os primatas do gênero Callithrix, apesar de menos explorados, possuem uma grande importância na pesquisa do sistema nervoso de vertebrados, não apenas pela sua grande ocorrência na América do sul, mas também pelo seu porte pequeno, facilidade no manejo desses animais, uma característica de biossegurança aumentada ou até mesmo por características fisiológicas (ABBOTT et al., 2003).
Figura 4:sagui de tufo branco (Callithrix jacchus). Fonte: imagem cedida pelo núcleo de primatologia.
Figura 5: Núcleo de primatologia-UFRN, corredor interno. Fonte: imagem cedida pelo núcleo de primatologia.
Figura 6:Núcleo de primatologia-UFRN, fachada externa do biotério. Fonte: imagem cedida pelo núcleo de primatologia.
Saguis têm sido amplamente utilizados em pesquisas de neurociências, como modelos para doença vascular cerebral, discinesia tardia, esclerose múltipla e doenças neurodegenerativas. Além do uso em modelos de doenças humanas, os saguis têm se tornado figura de destaque em estudos de para analisar a neurofisiologia. Esse primata possui a maturidade sexual relativamente curta, alcançada aos 18 meses de idade, permitindo a rápida expansão da colônia, além do pequeno tamanho comparado com o das outras espécies, representando uma vantagem potencial, pois os custos em relação a seu acondicionamento, alimentação e requisitos de espaços reduzidos (MANSFIELD, 2003). Esse conjunto de fatores associados representa uma vantagem potencial na escolha desse modelo experimental para diversos tipos de pesquisas.
O núcleo de primatologia da UFRN (Fig.4; Fig.5) é responsável há vários anos pela manutenção e reprodução em cativeiro do sagui (Registro do IBAMA Nº 1/24/92/0039-0). Desde a criação do Núcleo de Primatologia, muitos trabalhos foram produzidos na UFRN, nas áreas comportamento, ritmos biológicos e neuroanatomia (COSTA et al., 1999; MORAIS et al., 2019; ENGELBERTH et al., 2014), dando suporte a vários programas de pós-graduação que utilizam esses primatas como o Programa de Pós-graduação em Biologia Estrutural e Funcional.
2. JUSTIFICATIVA
Apesar de inúmeras pesquisas relacionadas a medula espinal de ratos, camundongos ou cobaias, observamos que há poucas pesquisas relacionadas a caracterização morfoquantitativa da medula espinal de primatas como o sagui (Callithrix jacchus). O mapeamento da medula espinal em uma única espécie pode parecer a princípio, uma pesquisa trivial, pois se acredita que a anatomia e a microestrutura da medula espinal são simples e consistentes entre os mamíferos. Porém, há uma escassez de detalhes anatômicos precisos sobre a medula espinal desses mamíferos (WATSON et al., 2015).
Há uma relativa semelhança dos mecanismos biológicos, processos de desenvolvimento, anatomia e função do sistema nervoso dos saguis com outros primatas ou até mesmo com a espécie humana quando comparado, por exemplo, com roedores (OKANO et al., 2012). Nessa perspectiva, o compendio das pesquisas já realizadas corroboram a necessidade de explorar melhor a medula espinal desses primatas. Pois apesar da similaridade entre a medula espinal do sagui com as demais espécies, o nosso estudo pretende caracterizar morfometricamente as possíveis diferenças entre faixa etária e gênero das lâminas de Rexed e das colunas posteriores da substância cinzenta. Com isso, esse estudo objetiva elucidar as características morfométricas dos neurônios pertencentes a coluna posterior da medula espinal do sagui, além das caraterísticas quantitativas da medula espinal e corno posterior, levando em consideração a possível existência de diferenças entre os gêneros e diferentes idades. Os resultados obtidos a partir desta pesquisa podem representar um acréscimo sobre a literatura da medula espinal de saguis elucidando as bases anatômicas associados aos processos de envelhecimento e se existem diferenças entre gêneros na microestrutura medular, bem como contribuir sobre o conhecimento sobre as vias serotoninérgicas dos saguis e possibilitar um melhor conhecimento sobre as colunas posteriores desses animais e abrindo assim, caminho para que novas pesquisas se realizem tomando por base esse estudo.
3. OBJETIVOS
3.1. Objetivo geral
Avaliar diferenças morfológicas relacionados ao gênero e faixa etária na coluna posterior cinzenta da medula espinal do sagui (Callithrix jacchus).
3.2. Objetivos específicos
✓ Caracterizar a citoarquitetura das lâminas de Rexed da coluna posterior cinzenta da medula espinal do sagui;
✓ Verificar as principais diferenças relacionado ao gênero e idade na coluna posterior cinzenta do sagui através de métodos morfoquantitativos;
✓ Caracterizar a população neuroquímica de serotonina na coluna posterior cinzenta da medula espinal de saguis, verificando se há diferenças intergêneros e por idade.
4. MATERIAIS E MÉTODOS
4.1. Sujeitos
Foram coletadas 16 medulas espinais de saguis de tufo branco (Callithrix jacchus), onde foram separadas em grupos de gênero e grupos de faixa etária jovem/adulto com idades entre 16 e 55 meses e o grupo idoso com idades entre 84 e 163 meses.
Tabela 1: dados e medidas macromorfométricas dos animais. Fonte: elaborado pelo autor.
As medulas foram adquiridas por meio de reaproveitamento de animais que foram utilizados pelo projeto de pesquisa “Substrato neuroanatômico da modulação visceromotora e cognitiva do córtex pré-frontal medial: análise de alta resolução dos circuitos pré-frontal medial para áreas subcorticais em primatas”, PARECER nº 0.24.028/2017, sob a responsabilidade de Expedito Silva do Nascimento Júnior. Encontra-se de acordo com os preceitos da Lei nº 11.794, de 8 de outubro de 2008, do decreto nº 6.899, de 15 de julho de 2009, e com as normas editadas pelo Conselho Nacional de Controle de Experimentação animal (CONCEA).
GÊNERO FAIXA ETÁRIA QUANTIDADE COMPRIMENTO MÉDIO PESO MÉDIO MACHO ADULTO/JOVEM 6 111,17 mm 0,548g IDOSO 4 107,25 mm 0,653g FÊMEA ADULTO/JOVEM 7 113,66 mm 0,611g
Figura 8: Região toráxica da medula espinal sendo pesada em balança de precisão. Fonte: Laboratório de Neuroanatomia.
Figura 7: região torácica da medula espinal sendo medida por paquimetro digital. Fonte: Laboratório de Neuroanatomia.
4.2. Procedimentos
4.2.1. Perfusão
Os animais foram anestesiados com ketamina (100 mg/ 1ml) e xilazina (2,3mg/0,1ml), ambos por via intraperitoneal, antes de se proceder à perfusão transcardíaca em capela de exaustão. O animal foi posicionado em decúbito dorsal, sobre tela de arame sob ponto de água e submetido à toracotomia, com incisão de pele, músculos e arco costal, sendo esses removidos em bloco, para exposição do coração. Logo em seguida, foi realizada a cardiopunção no ventrículo esquerdo, utilizando agulha de 1,5 mm x 17 mm, a qual foi direcionada para a aorta ascendente e após foi realizada uma secção do átrio direito para escoamento do conteúdo vascular. A agulha foi conectada a uma bomba peristáltica (Cole-Parmer) infundindo pelo leito vascular 300 ml de solução salina a 0,9% em tampão fostato (PB) 0,1M, pH 7,4, à temperatura ambiente, com velocidade de 100 ml/minuto. Posteriormente, foram refundidos 700 ml de solução fixadora (paraformaldeído a 4%) em tampão fosfato 0,1M, pH 7,4. Metade dessa solução fluiu a uma velocidade de 90 ml/min e a outra metade a uma velocidade de 25ml/min aproximadamente, tendo todo o fluxo de soluções durado em torno de 30 minutos.
4.2.2. Remoção de medula espinal e amostragem da medula espinal.
Após a realização da perfusão, foi feito uma secção na altura da região cervical da coluna vertebral de cada animal, separando a cabeça e parte do pescoço do tronco e membros. A pele e musculatura do dorso foram retiradas a fim de se expor os processos espinhosos e pedúnculos para realização de uma laminectomia, expor a medula espinal e retirá-la do canal vertebral acomodando-a em frascos de 8 ml com formol a 4%.
A medula espinal foi amostrada para se obter uma fração representativa de cada região, sendo seccionadas em 20 segmentos. Logo após, os segmentos foram armazenados em uma solução de sacarose a 30% em tampão fosfato 0,1M, pH 7,4 a 4ºC, até serem submetidos a criomicrotomia. Após essa etapa, as medulas foram submetidas a criomicrotomia cuja espessura dos cortes foi padronizada em 30 µm, sendo seccionados no plano coronal em criostato. Os cortes foram coletados e depositados em um meio líquido de tampão fosfato 0,1M, pH 7,4 distribuídas sequencialmente em dez compartimentos de maneira sequenciada.
A amostragem foi realizada para se obter uma fração representativa de cada região seguindo um regime sistemático uniforme e aleatório de amostragem (GUNDERSEN, 2002). Onde a medula espinal foi transversal e seriadamente seccionada em fatias que variavam de espessura de acordo com o comprimento da própria, determinando 20 segmentos. Dos quais foram selecionados uma fração de ½ que foi imersa em sacarose e a outra metade em formol. Os segmentos imersos em tampão sacarose 30% foram embebidos em tissue tech® para serem seccionados em criostato lupetec® CM2850, obtendo-se desta forma, secções equidistantes com 30μm de espessura e uniformemente aleatórias. Os cortes foram coletados em um meio líquido de tampão fosfato 0,1M, pH 7,4 distribuídas sequencialmente em dez compartimentos de maneira sequenciada. Cortes representativos de cada região foram montados em lâminas de vidro gelatinadas para serem submetidas a métodos de coloração. Os cortes restantes foram transferidos para solução anticongelante e conservados a -20ºC.
Figura 9: esquema representativo de amostragem dos segmentos da medula espinal dos saguis. I representa o segmento ímpar e P representa o segmento par. Fonte: elaborado pelo autor.
4.2.3. Método de Nissl
Uma série composta por 16 animais foi submetida a coloração de Nissl para uma análise de citoarquitetura com tionina como corante. No método de Nissl, primeiramente os cortes foram lavados em tampão fosfato 0,1M e montados em lâminas gelatinadas. Após o período de secagem do material colocamos essa série em imersão por duas horas em álcool a 70% para sua desidratação, os cortes passaram por uma bateria de álcoois etílicos de concentrações crescentes. Devido à dificuldade inicial na fixação dos cortes de medula espinal, adaptamos o método de Nissl para melhor fixação. Após o banho de 2 horas em álcool a 70% a série passou por 2 banhos em álcool 95%, 2 banhos de álcool 100% de 3 minutos cada. Ao final da desidratação da primeira bateria as lâminas foram mergulhadas em xilol por 3 minutos e sequencialmente imersas em um segundo banho de xilol por 30 minutos. Na sequência os cortes foram reidratados em banhos de álcoois etílicos de concentrações decrescentes (a mesma utilizada na primeira bateria, em sentido inverso, acrescentando um banho de álcool a 50% e água destilada) e posteriormente imersos em tionina por 15 segundos, para novamente serem desidratados em uma segunda bateria com concentrações crescentes de álcool etílico por 20 segundos cada. Foram imersos em um banho de álcool a 50%, um de álcool a 70%, 2 banhos de álcool a 95%, 3 de álcool a 100% e deslipidificados em um primeiro banho de xilol por 2 minutos e em um segundo por 4 minutos. Ao final, foram cobertas com lamínulas usando VER-MOUNT.
4.2.4. Análise das imagens
As secções da medula espinal coradas pelo método de Nissl foram examinadas e mapeadas utilizando o microscópio óptico (Nikon ECLIPSE Ni) em campo claro. As imagens digitais foram obtidas de secções representativas usando uma vídeocâmera digital (Nikon DS-Ri), utilizando o software de aquisição NIS (Nikon). As imagens foram corrigidas em relação ao brilho, contraste e documentadas utilizando o Canvas (versão 12.0; ACD Systems of America, inc.; 2010). Usando o mesmo software foram construídos esquemas representativos das lâminas de Rexed dos cornos posteriores das medulas espinais de um representante da região cervical, torácica e lombar da medula espinal dos saguis, possuindo por base a marcação de Nissl.
4.2.5. Imunoistoquímica
A técnica consiste de uma imunoperoxidase padrão pelo método ABC, onde, após quatro lavagens com duração de dez minutos cada em tampão fosfato 0,1M (PB), pH 7,4, os cortes foram submetidos a um pré-tratamento com uma solução de peróxido de hidrogênio a 0,03% em PB 0,1M durante 20 minutos em agitador orbital para inativação da peroxidase endógena. Após quatro lavagens de dez minutos, os cortes então foram incubados em tampão fosfato contendo tampão Triton X-100 a 0,4% (TXPB) com anticorpo primário anti-serotonin feito em coelho (1:1000, Sigma) e soro normal de jumento a 5% (Jackson laboratories) permanecendo em incubação por 16 a 24 horas em agitador orbital. No dia seguinte os cortes foram lavados em PB, por quatro vezes, e incubados em anticorpo secundário biotinilado anti-coelho feito em jumento (1:1000, Sigma) e TXPB por noventa minutos em agitador orbital. Os cortes foram novamente lavados em PB e incubados em solução avidina-biotina-peroxidase (kit ABC, Vector, 1:1000) diluídos em TXPB a 0,4% contendo NaCl por noventa minutos. Em seguida os cortes foram lavados e postos em meios contendo PB e H2O2 a 0,03% e o cromógeno diaminobenzina (DAB) por aproximadamente
15 minutos. A reação foi parada com lavagens em PB em agitador orbital. Os cortes foram montados em lâminas gelatinizadas. Após uma semana de secagem as lâminas foram mergulhadas em tetróxido de ósmio 0,05% e desidratadas em uma sequência crescente de álcoois e deslipidificados em xilol e cobertos com ERV-Mount e lamínula.
4.2.6. Volume da substância cinzenta (VC), volume da substância branca (VB) e total (Vtot) da medula espinal.
Para a estimativa dos volumes da substância cinzenta (VC) e da substância branca (VB), foi utilizado o Princípio de Cavalieri (HOWARD e REED, 2010). Para tal, um sistema teste quadrático com área conhecida será aplicado sobre os cortes de medula espinal e a seguinte fórmula será utilizada:
onde Σp é o somatório de pontos do sistema teste que tocam a estrutura desejada (neste caso a substância cinzenta ou o substância branca da medula espinal); (a/p) é a área associada a cada ponto do sistema teste (Fig.8), t é a espessura dos cortes da medula espinal e fseg-1 é o
inverso da fração de segmento, enquanto fsec-1 é a fração de secção.
O volume total da medula espinal será o somatório dos volumes da substância cinzenta (VC) e da substância branca (VB).
Vtot = VC+ VB
As equações acima foram inseridas no Software Excel 2016, e os dados obtidos foram analisados utilizando o software IBM SPSS Statistics. Aplicando o teste de normalidade Shapiro-Wilk e utilizando o teste T para amostras independentes, determinando se há diferença significativa entre grupos etários (adulto/jovem macho e idoso macho) e os grupos gêneros (adulto/jovem macho e adulto/jovem fêmea).. O nível de significância foi estabelecido em 𝑃 ≤0,05.
Figura 10: sistema teste aplicado a uma fotomicrografia da medula espinal de sagui para contagem de pontos. Fonte: lab. neuro
4.2.7. Morfometria
A análise morfométrica dos corpos neuronais da coluna posterior foi realizada através de amostras do segmento cervical, torácico e lombar de todas as medulas de saguis, se utilizando do microscópio óptico (Nikon ECLIPSE Ni) em campo claro, com objetiva de 20X. Foi mensurada a área de pericários distribuídos em cada lâmina da coluna posterior por intermédio do software de análise de imagem NIS (Nikon). Posteriormente, os dados obtidos foram analisados utilizando o software IBM SPSS Statistics. Aplicando o teste de normalidade Shapiro-Wilk e em seguida o teste T para amostras independentes para determinar se existe diferença nos valores morfométricos entre os grupos etários (adulto/jovem macho e idoso macho) e os grupos gêneros (adulto/jovem macho e adulto/jovem fêmea). O nível de significância foi estabelecido em 𝑃 ≤0,05.
5. RESULTADOS
5.1. Características da distribuição de neurônios por área e forma nas lâminas de Rexed
A lâmina I apresenta aparentemente uma grande quantidade de neurônios pequenos e arredondados medindo uma área média de 50 µm² a 80 µm², enquanto a apresenta duas ou três grandes células medindo acima de 100 µm² (Fig.11a). A lâmina II (Fig.11b) aparentemente exibe neurônios pequenos e arredondados com células medindo de 50 µm² a 82 µm² além de dois a quatro neurônios maiores medindo acima de 100 µm². A lâmina III (Fig.11c) apresenta aparentemente neurônios pequenos que possuem áreas de 40 µm² a 98 µm² em meio a 3 a 4 neurônios maiores com áreas entre 100 µm² e 300 µm². Há uma prevalência aparente de neurônios grandes com aspecto arredondado e fusiforme na lâmina IV (Fig.11d), possuindo uma área média de 100 µm² a 300 µm² e neurônios ainda maiores de 300 µm² a 500 µm², além de apresentar entre um a dois neurônios com medidas de 500 µm² a 900 µm². A lâmina IV ainda possui pequenos neurônios arredondados em menor quantidade, com uma área de 60 µm² a 95 µm². A lâmina V (Fig.11e). apresenta aparentemente de dois a seis pequenos neurônios com área média de 60 µm² a 97 µm². Neurônios maiores com medidas de 100 µm² a 300 µm² distribuídos mais extensamente e cerca de cinco a seis a células com área de 300 µm² a 500 µm², além de três a quatro neurônios com medidas de 500 µm² a 800 µm². Aparentemente grandes neurônios arredondados e fusiformes são observáveis na lâmina VI (Fig.11f), em sua minoria com dimensões de 130 µm² a 300 µm². Neurônios maiores com medidas de 300 µm² a 500 µm² são visíveis em maior abundância, além de possuir de quatro a seis neurônios com 500 µm² a 800 µm². Também é ressaltado a presença de três a quatro neurônios pequenos com uma área média de 70 µm² a 90 µm² e com formato arredondado.
Y ' A B C D E F
B
D
C
E
F
A
Figura 11: Corno posterior do segmento cervical do sagui. Coloração em Níssil. Em A é apresentado neurônios que formam a lâmina I, em B a lâmina II, em C a lâmina III, em D a lâmina IV, em E a lâmina V, em F a lâmina VI. Barra: 300 µm em A, B, C, D, E, F. Fonte: Laboratório de Neuroanatomia.
F E D F C F B F A F
5.2. Comparativo entre gênero das lâminas de Rexed da coluna posterior da medula espinal
Figura 12: Delimitação das lâminas de Rexed do corno posterior do segmento cervical (C6) de um animal macho em A e fêmea em C (C8) utilizando o método de níssil .10X. Esquemas representativos dos respectivos cornos em B e D. Fonte: Laboratório de Neuroanatomia.
I I II II III II III II IV II IV II V II V II VI II VIII I I II II III II III IV II IV II V II V II VI VI D C A B
Figura 13: Delimitação das lâminas de Rexed do corno posterior do segmento torácico (T5) de um animal macho em A e fêmea em C (T6) utilizando o método de níssil .10X. Esquemas representativos dos respectivos cornos em B e D. Fonte: Laboratório de Neuroanatomia.
I I II II III II III II IV II IV V II V II VI II VI II I I II II III II III II IV II IV II V II V II VI II VI II A B D C
Figura 14: Delimitação das lâminas de Rexed do corno posterior do segmento lombar (L4) de um animal macho em A e fêmea em C (L3) utilizando o método de níssil. 10X. Esquemas representativos dos respectivos cornos em B e D. Fonte: Laboratório de Neuroanatomia.
I I II II III II III II IV IV II V II V II VI II VI I I II II III II III II IV II IV II V II V II VI II VI II A B D C
Figura 15: Delimitação das lâminas de Rexed do corno posterior do segmento sacral (S2) de um animal macho em A e fêmea em C (S3) utilizando o método de níssil. 10X. Esquemas representativos dos respectivos cornos em B e D. Fonte: Laboratório de Neuroanatomia.
I I II II III II III II IV II IV II V II V II I I II II III II III II IV II IV II V II V II A B D C
5.1. Comparativo entre faixa etária das lâminas de Rexed da coluna posterior da medula espinal
Figura 16: Delimitação das lâminas de Rexed do corno posterior do segmento cervical (C1) de um animal idoso em A e adulto/jovem em C (C4) utilizando o método de níssil. 10X. Esquemas representativos dos respectivos cornos em B e D. Fonte: Laboratório e neuroanatomia.
I I II II III II III IV II IV II V II V II VI II VI II I I II II III II III II IV II IV V II V VI II VI II A B D C
Figura 17: Delimitação das lâminas de Rexed do corno posterior do segmento torácico (T11) de um animal idoso em A e adulto/jovem em C (T5) utilizando o método de níssil. 10X. Esquemas representativos dos respectivos cornos em B e D. Fonte: Laboratório de Neuroanatomia.
I I II II III II III II IV II IV II V II V VI VI II I I II II III II III II IV II IV II V II V II VI II VI II A B D C
Figura 18: Delimitação das lâminas de Rexed do corno posterior do segmento lombar (S4) de um animal idoso em A e adulto/jovem em C (S4) utilizando o método de níssil. 10X. Esquemas representativos dos respectivos cornos em B e D. Fonte: Laboratório de Neuroanatomia.
I I II II III II III IV IV II V II V II VI II VI II A B I I II II III II III IV II IV II V V II VI VI II D C
Figura 19:Delimitação das lâminas de Rexed do corno posterior do segmento lombar (S4) de um animal idoso em A e adulto/jovem em C (S4) utilizando o método de níssil. 10X. Esquemas representativos dos respectivos cornos em B e D. Fonte: Laboratório de Neuroanatomia.
I I II II III II III II IV II IV II V II V II I I II II III II III IV II IV II V II V II A B D C
5.2. Resultados da morfometria
5.2.1. Área total dos neurônios da coluna posterior e das lâminas de Rexed entre grupos etários.
A análise estatística da morfometria realizado no sagui mostra que não há diferença significativa da média de área em µm² dos neurônios da coluna posterior entre o grupo etário “adulto/jovem” e “idoso” (Tab.2). Em relação a análise lâmina por lâmina, foi evidenciado que também não há diferença na média de área dos neurônios em µm² das lâminas I, II, III, IV, V e VI entre esses dois grupos, obtendo valor de “P” acima de 0,05 em todos os casos (Tab.3).
Tabela 2: Teste de significância da área total dos neurônios da coluna posterior entre grupos etários. Fonte:
adaptado de IBM SPSS Statistics.
N MÉDIA (µm²) DP CV P
A 6 120,0748 35,51620 0,29
0,424t
I 4 145,1536 50,82066 0,35
A. Adulto/jovem macho, I. Idoso macho, DP. Desvio padrão, P. Significância, CV. Coeficiente de variação.
Tabela 3: Teste de significância das áreas dos neurônios das lâminas da coluna posterior entre grupos etários.
Fonte: elaborado pelo autor. Fonte: adaptado de IBM SPSS Statistics.
GRUPO MÉDIA (µm²) DP P LÂMINA I A 47,6 9,9 0,155t I 64,4 5,8 LÂMINA II A 54,8 14,9 0,742t I 69,8 14,9 LÂMINA III A 73,6 22,7 0,708t I 88,4 21,0 LÂMINA IV A 143,7 53,0 0,213t I 141,0 29,2 LÂMINA V A 185,6 68,7 0,083t I 250,5 157,1 LÂMINA VI A 214,9 53,7 0,297t I 256,8 83,1
Figura 20: gráfico das áreas de neurônios em μm² das lâminas de Rexed entre grupos etários. Fonte: elaborado pelo autor.
5.2.2. Área total dos neurônios da coluna posterior e das lâminas de Rexed entre gêneros.
A análise estatística da morfometria realizado no sagui mostra que não há diferença significativa da média de área em µm² dos corpos de neurônios da coluna posterior entre o grupo “macho” e “fêmea” (Tab.4). Também não há diferença na média de área dos neurônios das lâminas I, II, III, IV, V e VI entre esses dois grupos (Tab.5). Sugerindo que não há alteração significativa da área dos neurônios entre as lâminas e no aspecto geral da coluna dorsal entre gêneros.
Tabela 4: Teste de significância da área total da coluna posterior entre gêneros. Fonte: adaptado de IBM SPSS
Statistics.
N MÉDIA (µm²) DP CV P
M 6 120,0748 35,51620 0,29
0,661t
F 7 116,3784 28,23140 0,24
M. adulto/jovem macho, F. adulto/jovem fêmea, DP. Desvio padrão, P. Significância, CV. Coeficiente de variação. 0 50 100 150 200 250 300 A d u lt o /jo ve m Id o so A d u lt o /jo ve m Id o so A d u lt o /jo ve m Id o so A d u lt o /jo ve m Id o so A d u lt o /jo ve m Id o so A d u lt o /jo ve m Id o so
LÂMINA I LÂMINA II LÂMINA III LÂMINA IV LÂMINA V LÂMINA VI
MÉDIA (μm²)
Tabela 5: Teste de significância das áreas dos neurônios das lâminas da coluna posterior entre gêneros. Fonte:
adaptado de IBM SPSS Statistics.
GRUPO MÉDIA DP P LÂMINA I M F 47,6 59,3 14,6 9,9 0,432t LÂMINA II M F 54,8 56,1 14,9 17,5 0,608t LÂMINA III M F 73,6 70,7 22,7 15,1 0,255t LÂMINA IV M F 143,7 129,7 53,0 30,2 0,139t LÂMINA V M 185,6 68,7 0,666t F 177,2 48,5 LÂMINA VI M F 214,9 205,0 53,7 49,0 0,886t
M. adulto/jovem Macho, F. adulto/jovem fêmea, DP. Desvio padrão, P. Significância
Figura 21: gráfico das áreas de neurônios em μm² das lâminas de Rexed entre gêneros. Fonte: elaborado pelo autor. 0 50 100 150 200 250
Macho Fêmea Macho Fêmea Macho Fêmea Macho Fêmea Macho Fêmea Macho Fêmea LÂMINA I LÂMINA II LÂMINA III LÂMINA IV LÂMINA V LÂMINA VI
5.2.3. Resultados para imunoistoquímica
Através da utilização da técnica de imunoperoxidase padrão pelo método ABC foi identificado um padrão de organização dos terminais serotoninérgicos. Visualmente pode-se observar fibras serotoninérgicas nas lâminas I, II e III.
A
B
C
D
E
F
4X 10X
Figura 22: Expressão imunohistoquímica de serotonina no segmento cervical da medula espinal de sagui em (A); (B) Ampliação da caixa em A, evidenciando fibras serotonérgicas no corno posterior; Expressão imunohistoquímica de serotonina no segmento torácico da medula espinal de sagui em (C); (D) Ampliação da caixa em C, destacando fibras
serotonérgicas no corno posterior; Em (E) expressão imunohistoquímica de serotonina no segmento lombar da medula espinal de sagui; (F) Ampliação da caixa em E com destaque nas fibras serotonérgicas no corno posterior.
A
B
C
II I III III II I III I IIFigura 23: Expressão imunohistoquímica de serotonina e representação das lâminas I, II e III no corno posterior da região cervical (A), torácica (B) e lombar (C). Objetiva: 20X. Barra: 100µm. Fonte: Lab.neuro.
5.3. Resultados da estereologia
A análise estatística da estereologia a partir do princípio de Cavalieri mostra que não
há diferença significativa da média de volume em µm3 da substância branca, substância cinzenta, coluna posterior e volume total da medula espinal de saguis comparando o grupo adulto/jovem macho e o idoso macho. Em relação ao gênero observamos que o teste T para volume da coluna posterior não demostra diferença significativa. Assim como não foi encontrado diferença estatística significativa entre machos e fêmeas em relação a substância branca e substância cinzenta. Já o volume total da medula espinal demostrou uma diferença significativa das fêmeas em relação aos machos, apresentando valor de P de 0,045.
Tabela 6: teste T para duas amostras do Vref. total entre gêneros. Fonte: Fonte: adaptado de IBM SPSS Statistics. N MÉDIA (µm3) DP CV P M 6 590,8 116,5 0,19 0,045t F 7 746,1 250,4 0,33
M. macho, F. fêmea, DP. Desvio padrão, CV. Coeficiente de variação, P. Significância
Tabela 7: teste T para duas amostras do Vref. substância branca entre gêneros. Fonte: adaptado de IBM SPSS Statistics.
N MÉDIA (µm3) DP CV P
M 6 403,0 85,8 0,21
0,063t
F 7 500,0 180,1 0,36
M. macho, F. fêmea, DP. Desvio padrão, CV. Coeficiente de variação, P. Significância
Tabela 8: teste T para duas amostras do Vref. substância cinzenta entre gêneros. Fonte: adaptado de IBM SPSS Statistics. N MÉDIA (µm3) DP CV P M 6 187,8 38,7 0,20 0,092t F 7 245,49 74,1 0,30
M. macho, F. fêmea, DP. Desvio padrão, CV. Coeficiente de variação, P. Significância
Tabela 9: teste T para duas amostras do Vref. coluna posterior entre gêneros. Fonte: adaptado de IBM SPSS Statistics.
N MÉDIA (µm3) DP CV P
M 6 50,0 9,66 0,19
0,080t
F 7 61,7 15,3 0,24
M. macho, F. fêmea, DP. Desvio padrão, CV. Coeficiente de variação, P. Significância
Tabela 10: teste T para duas amostras do Vref. total entre grupos etários. Fonte: adaptado de IBM SPSS Statistics.
N MÉDIA (µm3) DP CV P
A/J 6 590,8 116,5 0,19
0,218 t
I 4 663,8 209,3 0,31
A/J. Adulto/jovem, I. Idoso, DP. Desvio padrão, CV. Coeficiente de variação, P. Significância
Tabela 11: teste T para duas amostras do Vref. substância branca entre grupos etários. Fonte: adaptado de IBM SPSS Statistics.
N MÉDIA (µm3) DP CV P
A/J 6 403,0 85,8 0,21
0,292 t
I 4 464,8 145,6 0,31
A/J. Adulto/jovem, I. Idoso, DP. Desvio padrão, CV. Coeficiente de variação, P. Significância
Tabela 12: teste T para duas amostras do Vref. substância cinzenta entre grupos etários. Fonte: adaptado de IBM SPSS Statistics. N MÉDIA (µm3) DP CV P A/J 6 187,8 38,7 0,20 0,107 t I 4 198,9 76,8 0,38
A/J. Adulto/jovem, I. Idoso, DP. Desvio padrão, CV. Coeficiente de variação, P. Significância
Tabela 13: teste T para duas amostras do Vref. coluna posterior entre grupos etários. Fonte: adaptado de IBM SPSS Statistics.
N MÉDIA (µm3) DP CV P
A/J 6 50,0 9,6 0,19
0,174 t
I 4 52,5 19,8 0,37
A/J. Adulto/jovem, I. Idoso, DP. Desvio padrão, CV. Coeficiente de variação, P. Significância
O volume total da medula espinal calculada pelo princípio de Cavalieri mostra que a proporção da substância cinzenta em relação a branca foi de 32,99% e 67,01% no adulto jovem macho enquanto a fêmea da mesma faixa etária apresentava uma proporção de 37,72% e 62,22%. O idoso macho apresenta uma a proporção de substância cinzenta e branca de 29,96% e 70,04%, respectivamente.
Figura 24: gráfico de comparação em µm³ da substância branca, cinzenta e coluna posterior dos grupos gênero e etário. Fonte: Elaborado pelo autor.
0 50 100 150 200 250 300
J/A macho IDOSO J/A fêmea
µm
3
