T ere sa M aga lhã 2.º CICLO FMUP 2015
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IMPLEMENTAÇÃO E VALIDAÇÃO
DE UM MÉTODO ANALÍTICO PARA A
QUANTIFICAÇÃO DE OPIÁCEOS EM
UNHAS
Quantificação simultânea de morfina, 6-monoacetilmorfina, metadona,
2-etilideno-1,5-dimetil-3,3-difenilpirrolidina e 2-etil-5-metil-3,3-difeilpirrolidina por cromatografia gasosa acoplada a espetrometria de
massa em fragmentos de unhas de indivíduos submetidos a terapia de substituição com metadona.
Teresa Patrícia Moreira Magalhães TESE DE MESTRADO APRESENTADA
À FACULDADE DE MEDICINA DA UNIVERSIDADE DO PORTO EM CIÊNCIAS FORENSES
O presente estudo decorreu no Laboratório de Toxicologia, Departamento de Ciências
Biológicas da Faculdade de Farmácia da Universidade do Porto
Orientadora: Professora Doutora Helena Maria Ferreira da
Costa Ferreira Carmo, Laboratório de Toxicologia,
Departamento de Ciências Biológicas da Faculdade de
Farmácia da Universidade do Porto
Coorientadora: Professora Doutora Maria de Lourdes
Pinho de Almeida Souteiro Bastos, Laboratório de
Toxicologia, Departamento de Ciências Biológicas da
Faculdade de Farmácia da Universidade do Porto
“To raise new questions, new possibilities, to
regard old problems from a new angle, requires
creative imagination and marks real advance in
science.”
pessoas, e por esse motivo não posso deixar de expressar algumas palavras de agradecimento e reconhecimento.
Agradeço à minha Orientadora Dra. Helena Carmo pelo modo como me recebeu, pelo incentivo, compreensão, confiança, paciência e disponibilidade demonstrada ao longo de todo este percurso. Obrigada pelas palavras de otimismo e de ânimo, em todos os momentos que desanimei e tudo parecia estar a correr mal. O meu muito obrigado.
À Dra. Maria de Lurdes Bastos, agradeço pela coorientação desta dissertação, pela partilha dos seus conhecimentos e pelo apoio e disponibilidade sempre demonstrada.
À Dra. Teresa Magalhães, Coordenadora do Mestrado em Ciências Forenses, agradeço pela criação e oportunidade de frequentar o curso que tanto ambicionava, permitindo-me realizar um trabalho numa área que tanto gosto.
À Dra. Paula Guedes, pela transmissão de conhecimentos e apoio no equipamento de GC-MS; ao Professor Dr. Ricardo Dinis-Oliveira pela prontidão demonstrada sempre que precisei e pelo seu otimismo e à Dra. Diana Dias Silva pela ajuda na integração e adaptação no laboratório e pelo seu acompanhamento inicial durante os primeiros passos desta jornada.
Ao Dr. Carlos Afonso, do Laboratório de Química Orgânica e Farmacêutica, pelo acolhimento e pela disponibilidade do equipamento, ao longo de todo o meu trajeto e à Dra. Sara Cravo pelo incansável apoio no GC-MS, incentivo e partilha de conhecimentos.
Agradeço ao Laboratório de Toxicologia da Faculdade de Farmácia da Universidade do Porto, por todos os materiais e equipamentos disponibilizados para a realização do trabalho experimental, assim como a todos os membros do Laboratório pela ajuda na integração, pela simpatia, carinho sempre demonstrado.
Obrigada ao Centro de Atendimento a Toxicodependentes de Cedofeita - Porto, nomeadamente à Dra. Adelaide Gomes, pela disponibilidade e oportunidade demonstrada nas colheitas das amostras e a todos os voluntários que participaram neste estudo.
Aos meus pais e irmã por todo o apoio incondicional, por nunca deixarem de acreditar, por me terem sempre ajudado a ultrapassar as dificuldades e por estarem sempre ao meu lado em todas as fases da minha vida, o meu muito obrigado. A vocês dedico esta dissertação.
Por último, e não menos importante, obrigado Joel, pela enorme paciência, pelo carinho, pelo apoio incansável, pelas palavras reconfortantes e por acreditares sempre em mim. Agradeço os sacrifícios a que te obriguei para que fosse possível a concretização deste trabalho.
convencionais, como o sangue e a urina. Porém, estas matrizes refletem apenas exposições num curto período de tempo após a administração do composto. Neste sentido, é importante a implementação de métodos em matrizes que permitam a monitorização de exposições durante um longo período de tempo, como por exemplo as matrizes queratinizadas (unhas e cabelo).
O presente estudo teve como principal objetivo a implementação e validação de um método analítico para a quantificação simultânea de morfina (MORF), 6-monoacetilmorfina (6-MAM), metadona (MET), 2-etilideno-1,5-dimetil-3,3-difenilpirrolidina (EDDP) e 2-etil-5-metil-3,3-difenilpirrolidina (EMDP) em unhas.
Após a descontaminação com uma solução aquosa de detergente (0,1% SDS), água desionizada e metanol, as amostras de unhas (aproximadamente 30 mg) foram incubadas com 1 mL de NaOH (1M) a 90 oC durante 30-40 min, para dissolução da matriz. Procedeu-se à extração
em fase sólida, com recurso a colunas OASIS® MCX 1cc (Mixed-mode Cation Exchange), onde os
analitos de interesse foram eluídos com uma solução de 5% NH4OH/MeOH. Após a derivatização
com N-metil-N-(trimetilsilil)-trifluoroacetamida (MSTFA), efetuaram-se as análises por cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massa (GC-MS). O método foi otimizado e validado de acordo com as normas internacionais para a MET e os seus metabolitos, EDDP e EMDP, uma vez que para a MOR e 6-MAM não foi possível obter taxas de recuperação adequadas após a extração. Relativamente à linearidade, os analitos apresentaram ser lineares numa gama de concentrações de 0-333,3 ng/mg para a MET e de 0-166,7 ng/mg para a EDDP e EMDP, com coeficientes de correlação de 0,9995, 0,994 e 0,9968, respetivamente. Relativamente aos limites de deteção (LD) e quantificação (LQ), os valores variaram entre 3,3-6,0 ng/mg e 10,4-20,8 ng/mg, respetivamente. No que diz respeito à precisão inter-dia os valores de coeficiente de variação (CV%) variaram entre 5,3-13,6%. Para a precisão intra-dia do equipamento e do método de extração os valores de CV% variaram entre 3,4-8,9% e 1,3-10,9%, respetivamente. A taxa de recuperação variou entre 82-98%, apresentando CV% entre 1,0-9,2%.
O método desenvolvido não é eficaz para a MORF e 6-MAM. Porém, em termos qualitativos, este método possibilita a deteção de MORF em unhas.
A aplicabilidade do método desenvolvido foi demonstrada através da análise de amostras de unhas e urina obtidas de indivíduos consumidores de heroína e/ou submetidos a terapia de substituição com MET. Os resultados obtidos demonstraram uma grande variabilidade
indivíduos submetidos a terapia de substituição e/ou abuso concomitante de heroína.
blood or urine. However, these matrices only reveal exposure for a short period of time after the compound administration. Therefore, it is important to implement methods on matrices that enable the monitoring of exposure for a long period of time, such as keratinized matrices (nails or hair).
This study aimed to implement and validate an analytical method for the simultaneous quantification of morphine (MORF), 6-monoacetylmorphine (6-MAM), methadone (MET), 2-ethylidene-1,5-dimethyl-3,3-diphenylpyrrolidine (EDDP) and 2-ethyl-5-methyl-3,3-diphenylpyrrolidine (EMDP) in nails.
After decontamination with an aqueous detergent solution (0.1% SDS), deionized water and methanol, the nail samples (approximately 30 mg) were incubated with 1 mL of NaOH (1M) at 90 °C for 30-40 min, for dissolution of the matrix. This was followed by solid-phase extraction using to OASIS® MCX 1cc (Mixed-mode Cation Exchange) columns, in which the analytes of interest were eluted with a solution of 5% NH4OH/MeOH. After derivatization with N-methyl-N-(trimethylsilyl)
trifluoroacetamide (MSTFA), gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) analysis was performed. The method was optimized and validated according to the International Guidelines for MET and its metabolites, EDDP and EMDP, as for MOR and 6-MAM it was not possible to obtain adequate rates of recovery after extraction. Regarding linearity, the analytes showed linearity over a concentration range of 0-333.3 ng/mg for MET and 0-166.7 ng/mg for EDDP and EMDP with a correlation coefficient of 0.9995, 0.994 and 0.9968, respectively. As for the limit of detection and quantification, results ranged from 3.3 to 6.0 ng/mg, and 10.4 to 20.8 ng/mg, respectively. With regard to the inter-day precision, the coefficient of variation (CV%) results ranged from 5.3 to 13.6%. For intra-day accuracy of the apparatus and the method of extraction the CV% results ranged from 3.4 to 8.9% and from 1.3 to 10.9%, respectively. The recovery rate varied between 82-98%, with CV% ranging from 1.0 to 9.2%.
This method is not effective for MORF and 6-MAM. However, in qualitative terms, it enables the detection of MORF in nails.
The applicability of the method was demonstrated by analyzing samples of nails and urine obtained from heroin consumers and/or individuals undergoing substitution therapy with MET. The results showed a wide interindividual variability in the deposition of MET and its metabolites in the nails, as well as in their urinary excretion. In both matrices it was not possible to find a correlation
RESUMO ... vii
ABSTRACT ...ix
ÍNDICE GERAL...xi
ÍNDICE DE FIGURAS ... xv
ÍNDICE DE TABELAS ... xvii
LISTA DAS ABREVIATURA ... xix
ENQUADRAMENTO E ESTRUTURA DA DISSERTAÇÃO ... xxi
PARTE I: Introdução Geral ... 1
Capítulo I: Drogas de Abuso ... 3
1. Drogas de Abuso ... 5 1.1 Opiáceos... 6 1.1.1 Heroína ... 7 1.1.1.1 Propriedades físico-químicas ... 7 1.1.1.2 Farmacocinética... 8 1.1.1.3 Farmacodinâmica ... 9 1.1.2 Morfina ... 9 1.1.2.1 Propriedades físico-químicas ... 9 1.1.2.2 Farmacocinética...10 1.1.2.3 Farmacodinâmica ... 12 1.1.3 Metadona ... 13 1.1.3.1 Propriedades físico-químicas ... 13 1.1.3.2 Farmacocinética... 14 1.1.3.3 Farmacodinâmica ... 15
Capítulo II: Matrizes Biológicas ... 17
2. Matrizes Biológicas... 19
2.1 Estrutura das unhas ... 22
2.1.1 Matriz ungueal ... 22
2.1.2 Lúnula ... 22
2.4 Incorporação de xenobióticos nas unhas ... 24
Capítulo III: Deteção de xenobióticos em unhas ... 25 3. Deteção de drogas de abuso e de outras substâncias de interesse forense em unhas ... 27
PARTE II: Objetivos ... 41
Objetivo Geral ... 43
Objetivos Específicos... 43
PARTE III: Experimental ... 45
Capítulo I: Materiais e Métodos ... 47
1. Materiais e Métodos ... 49
1.1 Reagentes e Materiais ... 49
1.2 Amostras de unhas e urina ... 49
1.3 Preparação das soluções-stock e dos padrões ... 50
1.4 Preparação das amostras para análise por GC-MS... 50
1.4.1 Descontaminação das Unhas ... 50
1.4.2 Hidrólise (alcalina) ... 50
1.4.3 Extração Líquido-Líquido ... 50
1.4.4 Extração em fase sólida ... 51
1.4.5 Derivatização dos compostos ... 51
1.5 Condições da Cromatografia Gasosa acoplada a Espetrometria de Massa ... 52
1.6 Validação do Método ... 53
1.6.1 Linearidade ... 53
1.6.2 Limite de deteção e quantificação ... 54
1.6.3 Precisão ... 54
1.6.3.1 Precisão Intra-dia do Método GC-MS ... 54
1.6.3.2 Precisão Intra-dia do Método Total ... 54
1.6.3.3 Precisão Inter-dia ... 54
1.6.4 Taxa de Recuperação ... 54
1.7 Prova de Aplicabilidade ... 55
Capítulo II: Otimização do Método... 57
2. Otimização do Método ... 59
2.1 Preparação da Amostra ... 59
2.1.4 Extração ... 60
2.1.4.1 Extração em fase sólida ... 60
2.1.4.2 Extração líquido-líquido ... 63
2.1.5 Derivatização ... 66
2.1.6 Seleção do Padrão Interno ... 68
2.1.7 Condições Cromatográficas... 70
Capítulo III: Resultados e Discussão ...71
3. Validação Analítica ... 73
3.1 Estudo da Linearidade ... 73
3.2 Sensibilidade ... 74
3.3 Precisão ... 74
3.3.1 Precisão intra-dia do método ... 74
3.3.2 Precisão intra-dia do equipamento e do método total ... 75
3.4 Taxa de Recuperação ... 76
3.5 Aplicabilidade do método analítico desenvolvido………76
Capítulo IV: Conclusão ... 83
4. Conclusão ... 85
PARTE IV: Referências Bibliográficas ... 87
Anexos ……….…….99
Anexo A - Resumo do procedimento analítico adotado no presente estudo ... 101
Anexo A1 - Preparação da Amostra ... 101
Anexo A2 - Parâmetros Analíticos... 102
Anexo B - Declaração de consentimento dos participantes ... 102
diversos países da Europa, entre a população com idades compreendidas entre 15-64 anos. Os dados relativos à Finlândia são do ano de 2005 e os da Irlanda de 2006 (reproduzido de OEDT, 2014). ... 7
Figura 2 - Estrutura molecular da heroína. ... 8 Figura 3 - Cápsula da Papoila Papaver Somniferum com incisões através das quais se obtém o ópio
(reproduzido de Maisto et al. 2011). ... 9
Figura 4 - Estrutura molecular da morfina. ... 10 Figura 5 - Representação esquemática das principais vias metabólicas da morfina com as respetivas
enzimas envolvidas (adaptado de DePriest et al. 2015; Lötsch, 2005)... 11
Figura 6 - Estrutura molecular da metadona. ... 13 Figura 7 - Representação esquemática das principais vias metabólicas da metadona com as
respetivas enzimas envolvidas (adaptado DePriest et al. 2015). ... 15
Figura 8 - Farmacocinética e farmacodinâmica de um opióide de ação rápida (heroína) em
comparação com um opióide de ação lenta (metadona, MET). A concentração plasmática de um opióide de ação rápida como a heroína aumenta rapidamente após administração intravenosa, mas também cai com rapidez, causando sintomas de abstinência. Por outro lado, a concentração plasmática de uma droga de ação lenta, com tempo de semivida longo, como a MET, permanece na faixa assintomática por um período superior a 24 horas, de modo que o paciente não sente os sintomas de abstinência. Além disso, devido ao seu longo tempo de semivida plasmática, só é preciso administrar a MET uma vez por dia (reproduzido de Swift RM e Lewis DC, 2009)... 16
Figura 9 - Esquema representativo da anatomia da unha (adaptado de Caplan e Jenkins, 2008). . 22 Figura 10 - Condições de SPE utilizadas no presente estudo. ... 51 Figura 11 - Condições de derivatização utilizadas no presente estudo. ... 52
Figura 13 - Cromatogramas obtidos em modo SIM de duas amostras de hidrolisados de unhas com
uma concentração de 480 ng/mL de MORF e 6-MAM. A - Representa uma amostra quando eluída com 5% NH4OH/MeOH; B - Representa uma amostra quando eluída com
diclorometano:2-propanol:NH4OH. ... 62
Figura 14 - Resultados obtidos com as diferentes proporções de n-hexano:acetato de etilo testadas.
... 63
Figura 15 - Comparação dos coeficientes de correlação linear obtidos utilizando o mesmo
procedimento analítico em amostras preparadas em MeOH (A) e amostras preparadas em hidrolisados de unhas (B). ... 64
Figura 16 - Resultados obtidos para as diferentes extrações L/L testadas. ... 65 Figura 17 - Resultados obtidos com os diversos solventes de ressuspensão testados. ... 66 Figura 18 - Resultados obtidos com os diferentes volumes de reagente derivatizante (MSTFA)
testados. ... 67
Figura 19 - Reação genérica de derivatização usando como agente derivatizante o MSTFA,
obtendo-se derivados TMS (reproduzido de Urbach, 2012)... 68
Figura 20 - Cromatogramas e respetivos espetros de massa dos compostos testados como PI. (A,1)
- 4-hidroxi-3-metoxibenzilamina (N,O-TMS) e (B,2) - etilmorfina (O-TMS). ... 69
Figura 21 - Curvas de calibração para a MET, EDDP e EMDP em hidrolisados de unhas. Para a MET
a gama de concentrações variou entre 0-5000 ng/mL e para a EDDP e EMDP variou entre 0-2500 ng/mL. ... 73
seu mecanismo de ação (adaptado de Miller, 2002; da Costa, 2010). ... 6
Tabela 2 - Propriedades físico-químicas, farmacocinéticas e farmacodinâmicas da heroína (adaptado de Oliveira, 2014; Waring et al. 2007). ... 8
Tabela 3 - Propriedades físico-químicas, farmacocinéticas e farmacodinâmicas da morfina (adaptado de Moffat et al. 2004). ... 10
Tabela 4 - Efeitos agonistas dos recetores opióides (adaptado de Brownstein, 1993). ... 12
Tabela 5 - Propriedades físico-químicas, farmacocinéticas e farmacodinâmicas da metadona (adaptado de Ferrari et al. 2004; Garrido e Troconiz, 1999; Neto et al. 2015)... 14
Tabela 6 - Principais vantagens e desvantagens das diversas matrizes convencionais e não convencionais utilizadas em análises toxicológicas (adaptado de Bulcão et al. 2012; Rouen et al. 2001)... 21
Tabela 7 - Métodos analíticos publicados até à data sobre a deteção de drogas de abuso e outras substâncias de interesse forense em unhas. ... 33
Tabela 8 - Parâmetros para a deteção por GC-MS dos analitos em estudo. ... 53
Tabela 9 - Taxas de recuperação obtidas para a etilmorfina, MORF e 6-MAM. ... 62
Tabela 10 - Caraterísticas do reagente derivatizante MSTFA. ... 67
Tabela 11 - Curvas de calibração da MET, EDDP e EMDP em hidrolizados de unhas (n=5). ... 74
Tabela 12 - Valores de LQ e LD obtidos para a MET, EDDP e EMDP em hidrolizados de unhas. .... 74
Tabela 13 - Valores obtidos para a precisão inter-dia do método para a MET, EDDP e EMDP... 75
Tabela 17 - Concentrações de MET e dos seus metabolitos, EDDP e EMDP, e deteção de MORF nas
diversas amostras obtidas de indivíduos consumidores de heroína e submetidos a terapia com MET. ... 78
AP - Anfetamina
BSTFA - N,O-bis (trimetilsilil)-trifluoroacetamida Ca2+ - Cálcio
CAT - Centro de Atendimento a Toxicodependentes COC - Cocaína
COD - Codeína
CV% - Coeficiente de variação DHEA - Dehidroepiandrosterona
DHEAS - Sulfato de dehidroepiandrosterona EDDP - Etilideno-1,5-dimetil-3,3-difenilpirrolidina EI - Ionização por impacto eletrónico
EMA - Agência Europeia de Medicamentos EMDP - 2-etil-5-metil-3,3-difenil-1-pirrolina EtG - Etilglucoronídeo
GC-MS - Cromatografia gasosa com deteção por espetrometria de massa (Gas cromatography
coulped to mass spectrometry)
H2O - Água desionizada
HCl - Ácido clorídrico
HIO - Hiperalgesia induzida por opióides
ICP-AES - Espectroscopia de emissão atómica por plasma indutivo ICP-MS - Espectrometria de massa acoplada a plasma indutivo K+- Potássio
KET - Cetamina
L/L - Extração líquido/líquido
LC-MS-MS - Cromatografia líquida acoplada à espetrometria de massa (tandem) LC-UV - Cromatografia líquida acoplada a um detetor ultravioleta
LD - Limite de deteção LQ - Limite de quantificação m/z - razão massa/carga
MDMA - 3,4-metilenodioximetanfetamina MeOH - Metanol
MET - Metadona MORF - Morfina
MSTFA - N-metil-N-(trimetillsilil)-trifluoroacetamida MTBE - Éter terc-butilmetílico
NH4OH - Hidróxido de amónia
NMDA - N-metil-D-aspartato
NNAL - 4-(metilnitrosamino)-1-(3-piridil)-1-butanol NNN - N-nitrosonornicotina
PFPA - Anidrido pentafluoropropiónico PI - Padrão interno
R2 - Coeficiente de correlação
RIA - Radioimunoensaio rpm - Rotações por minuto SDS - Dodecil sulfato de sódio
SIDS - Síndrome de morte súbita infantil
SIM - Monitorização seletiva de iões (Selected ion mode) SNC - Sistema Nervoso Central
SPE - Extração em fase sólida (Solid phase extraction) THC - ∆9-tetrahidrocanabinol
THC - COOH - Ácido ∆9- tetrahidrocanabinol
TMS - Trimetilsilil tr - Tempo de retenção
e da sociedade atual (Gwinnell e Adamec, 2008). Este comportamento sempre constituiu uma parte essencial da cultura e dos rituais de diversas comunidades, numa tentativa de alterar o seu nível de consciência e o seu estado emocional, provocando consequentemente efeitos deletérios ao nível da saúde humana (Gwinnell e Adamec, 2008; Karch, 1998). Na antiguidade, as drogas de abuso eram frequentemente utilizadas pela sociedade para fins terapêuticos e não terapêuticos, porém, no século XX o seu uso para fins não medicinais tornou-se ilegal (Karch, 1998). Inicialmente o uso excessivo de drogas de abuso pela sociedade deveu-se essencialmente ao facto de serem desconhecidos os seus malefícios (Mesquita e Seibal, 2000).
A prevalência do consumo de drogas tem aumentado nas últimas décadas e constitui atualmente um problema de saúde pública, devido ao seu elevado grau de incidência e à sua ocorrência em qualquer tipo de classe social e faixa etária (Buttner, 2011; OEDT, 2014). Neste sentido, o fenómeno do abuso de drogas é dinâmico e continua a evoluir, visto estarem a surgir novas ameaças, como por exemplo as novas drogas psicoativas, que vêm juntar-se aos problemas há muito existentes, provocados pelas drogas tradicionais. Os opiáceos encontram-se entre as drogas ilícitas mais consumidas, representando 1,3 milhões de consumidores na Europa, continuando a ser responsáveis por uma percentagem elevada de mortalidade (OEDT, 2014). É por isso fundamental proceder à sua monitorização analítica, quer numa perspetiva clínica, quer forense.
A metadona (MET) é um opiáceo que tem sido utilizado essencialmente para a abstenção ou redução do consumo de heroína, sendo a sua monitorização necessária para verificar o cumprimento da terapia de substituição em indivíduos dependentes.
A quantificação de drogas de abuso em matrizes queratinizadas (cabelos e unhas) tem emergido como complemento à análise de matrizes convencionais (sangue e urina), adquirindo especial relevância em investigações post-mortem retrospetivas e no rastreio da exposição intrauterina em recém-nascidos. Comparativamente ao número de métodos analíticos propostos para deteção de drogas de abuso e/ou dos seus principais metabolitos em sangue, urina, tecidos e cabelo, são ainda escassos os métodos desenvolvidos para a sua quantificação em unhas, havendo por isso necessidade de implementar novos métodos. A monitorização simultânea de MET, heroína, e dos respetivos metabolitos, em indivíduos submetidos a tratamento de toxicodependência com
análises post-mortem e ao despiste clínico da síndrome de abstinência no recém-nascido, situações para as quais o número de ocorrências é relativamente reduzido e a obtenção de amostras para validação analítica está fortemente comprometida.
A presente dissertação encontra-se dividida em quatro partes. Na primeira parte, abordam-se conceitos relativos às drogas de abuso, assim como as propriedades físico-químicas, a toxicocinética e a toxicodinâmica das drogas analisadas no presente estudo. As vantagens e desvantagens da utilização de matrizes queratinizadas, com especial relevância para as unhas, comparativamente a matrizes convencionais, também são aqui apresentadas. Por fim, apresenta-se uma revisão da informação disponível na literatura relativa à deteção de drogas de abuso e de outras substâncias de interesse forense e/ou clínico em unhas. Na segunda parte, encontram-se descritos os objetivos gerais e específicos deste trabalho. Na terceira parte, faz-se uma descrição pormenorizada da otimização do método de análise adotado. A apresentação dos resultados, assim como a discussão dos mesmos e as conclusões finais também se encontram aqui descritos. Por último, na quarta parte, são apresentadas as referências bibliográficas.
1. Drogas de Abuso
De acordo com a Organização Mundial de Saúde, uma droga é “qualquer substância que, sendo administrada a um organismo vivo, pode modificar uma ou mais das suas funções” (OMS, 1969). Por outro lado, uma droga de abuso é considerada como uma “substância psicoativa cujo abuso pode causar síndrome de dependência - um conjunto de fenómenos comportamentais, cognitivos e fisiológicos que se desenvolvem após o uso repetido de uma substância e que tipicamente incluem: (i) um desejo forte de consumir a droga; (ii) dificuldades no controlo do seu uso; (iii) persistência do consumo apesar das consequências e danos (iv) maior prioridade no uso da droga em detrimento de outras atividades ou obrigações; (v) aumento da tolerância e (vi) em certos casos uma síndrome de abstinência física ” (OMS, Setembro de 2014).
Segundo a literatura, as drogas de abuso podem ser classificadas como drogas lícitas e ilícitas, de origem natural, semi-sintética e sintética (Jickells e Negrusz, 2008; OMS, Setembro 2014). As de origem natural são obtidas diretamente da natureza; as semi-sintéticas são obtidas através da modificação laboratorial das substâncias de origem natural e as sintéticas são semelhantes às de origem natural, porém obtidas integralmente por síntese laboratorial (Eaton e Gallagher, 2010). Apesar das diversas categorias de drogas de abuso atuarem ao nível do Sistema Nervoso Central (SNC), estas podem ser divididas em diferentes classes, tendo em conta os efeitos que produzem no SNC e de acordo com o seu mecanismo de ação. Neste sentido, são classificadas como depressoras, no caso de produzirem um efeito sedativo e consequentemente deprimirem a atividade cerebral; narcóticos, se exercerem um efeito entorpecente sobre as experiências sensoriais; estimulantes, se proporcionarem um efeito estimulante geral, contribuindo assim para o aumento da atividade cerebral e alucinogénios, se exercem um efeito de distorção sobre as experiências sensoriais (Miller, 2002; da Costa, 2010). A Tabela 1 resume as diversas categorias de drogas de abuso, tendo em conta o seu mecanismo de ação e os seus efeitos sobre o SNC.
Tabela 1 - Classificação das drogas de abuso de acordo com os efeitos provocados no SNC e com o seu mecanismo de ação (adaptado de Miller, 2002; da Costa, 2010).
Tipo de Droga Mecanismo de Ação Efeitos provocados no
SNC Exemplos
Depressoras Deprimem os centros
de estimulação Sedação Álcool
Narcóticos Reduzem a
transmissão neuronal
Entorpecimento dos sentidos e alívio da dor
Morfina, Heroína, Metadona
Estimulantes Ativam a transmissão
neuronal Estimulação
Cocaína, Nicotina, Anfetaminas
Alucinogénios Variável, dependente
da droga Distorção sensorial e percetiva Cannabis, Ecstasy, Dietilamida do ácido lisérgico
É importante salientar que o uso abusivo e continuado das diversas drogas de abuso poderá conduzir ao desenvolvimento da dependência e da tolerância (Wills, 2005). A dependência, segundo Wills (2005), é definida como “ uma compulsão inapropriada para consumir a substância regularmente, que pode causar dano físico, mental e/ou comportamental”. Por outro lado, a tolerância é definida como a redução da resposta à droga depois de uma administração repetida ou prolongada (Brunton et al. 2012). A tolerância é um fenómeno independente de fatores sociais e psicológicos (Brunton et al. 2012). Contudo, aspetos como o tipo de substância consumida, as vias de administração, a variabilidade individual e o uso de outras substâncias são fatores importantes que devem ser considerados na interpretação quer da dependência, quer da tolerância (Jickells e Negrusz, 2008).
1.1 Opiáceos
Tendo em conta as diversas drogas de abuso disponíveis no mercado Europeu, os opiáceos encontram-se entre as drogas ilícitas mais consumidas, representando 1,3 milhões de consumidores na Europa, continuando a ser responsável por uma percentagem elevada de mortalidade e morbilidade (OEDT, 2014). Os opiáceos são utilizados farmacologicamente como analgésicos, antitússicos e antidiarreicos (Oliveira, 2014). O opiáceo mais consumido na Europa como droga de abuso, é a heroína e o seu consumo tende a ser mais elevado entre populações marginalizadas das zonas urbanas (OEDT, 2014). Neste sentido, é particularmente importante proceder à sua monitorização analítica, quer numa perspetiva clínica, quer forense. A Figura 1
demonstra as estimativas nacionais de prevalência do consumo de opiáceos no ano de 2013 nos diversos países da Europa.
Figura 1 - Estimativas nacionais de prevalência do consumo de opiáceos no ano de 2013 nos diversos países da Europa , entre a população com idades compreendidas entre 15-64 anos. Os dados relativos à Finlândia são do ano de 2005 e os da Irlanda de 2006 (reproduzido de OEDT, 2014).
1.1.1 Heroína
A heroína é muito utilizada como droga ilícita, sendo considerada uma das drogas de abuso mais perigosas, devido à sua elevada capacidade de provocar dependência (Pichini et al. 1999). De acordo com o Observatório Europeu das Drogas e da Toxicodependência, a heroína encontra-se no mercado europeu sob duas formas distintas: (i) heroína castanha (forma química de base), proveniente essencialmente do Afeganistão, e (ii) heroína branca (forma de sal), normalmente originária do Sudoeste Asiático. O maior produtor de ópio a nível mundial é o Afeganistão, sendo que a maioria da heroína presente na Europa é proveniente deste país e, em menor quantidade, do Irão e Paquistão (OEDT, 2014).
1.1.1.1 Propriedades físico-químicas
Quimicamente, a heroína é designada de 3,6-diacetilmorfina (Figura 2). A heroína é uma droga semi-sintética obtida através da acetilação da morfina (MORF) com anidrido acético (Pichini
Figura 2 - Estrutura molecular da heroína.
Tabela 2 - Propriedades físico-químicas, farmacocinéticas e farmacodinâmicas da heroína (adaptado de Oliveira, 2014; Waring et al. 2007).
Parâmetros Propriedades
Aparência Pó branco cristalino (forma de sal) Pó castanho (forma química da base)
Peso Molecular 369,38 g/mol
Fórmula Química C21H23NO5
Constante de ionização (pKa) 7,6
Ponto de Ebulição 173
oC *
243 oC - 244 oC **
Solubilidade Solúvel em água, álcool, clorofórmio * ** Insolúvel em éter * **
Principal via metabólica Desacetilação
Tempo de semi-vida no plasma 2-4 minutos
Excreção Urina, Fezes
Principal órgão alvo SNC
*- heroína (base livre) **- cloridrato de heroína
1.1.1.2 Farmacocinética
A heroína é um agonista opióide, sendo tipicamente administrada por via intramuscular, intravenosa, snifada ou fumada (Oliveira, 2014). Após a entrada da heroína na circulação sanguínea, esta sofre rapidamente uma desacetilação originando um metabolito ativo, a 6-monoacetilmorfina (6-MAM), o qual é subsequentemente hidrolisado a MORF (Kamendulis et al. 1996; Oliveira, 2014), sendo que, aproximadamente 10% das moléculas de MORF são metabolizadas a morfina-6-glucuronídeo (M6G) e 56% a morfina-3-glucoronídeo (M3G) (Skarke e Lotsch, 2002; Mercadante e Arcuri, 2004) (Figura 5). O M3G é inativo, porém, o metabolito M6G é extremamente ativo. A MORF
é maioritariamente excretada através da urina (cerca de 90%) e 7-10% é eliminada nas fezes provenientes da bile (DeLucia, 2010; Waring et al. 2007).
A heroína apresenta mais facilidade do que a MORF para atravessar a barreia hemato-encefálica, devido à sua elevada lipofilia, obtida através da adição dos grupos éster (Oldendorf et
al. 1972), contribuído também para uma ação mais intensa e com um início mais imediato no SNC
(Oliveira, 2014).
1.1.1.3 Farmacodinâmica
A ação farmacológica da heroína resulta da sua biotransformação em MORF, cuja farmacodinâmica se descreve pormenorizadamente de seguida no ponto 1.1.2.3.
1.1.2 Morfina
A MORF (do grego Morpheus, Deus dos sonhos), principal alcaloide do ópio (10-17% MORF), foi isolada em 1804 por Adam Sertürner, pertence ao grupo dos opióides, e é classificada como sendo uma droga narcótica (Eaton e Gallagher, 2010; Skarke e Lötsch, 2002). O ópio é obtido das cápsulas da papoila Papaver Somniferum e possui essencialmente propriedades analgésicas, ansiolíticas e sedativas (Skarke e Lötsch, 2002).
Figura 3 - Cápsula da Papoila Papaver Somniferum com incisões através das quais se obtém o ópio (reproduzido de Maisto
et al. 2011).
1.1.2.1 Propriedades físico-químicas
Quimicamente, a MORF é designada de (5α,6α)-7,8-didehidro-4,5-epoxi-17-metilmorfina-3,6-diol (Figura 4). A MORF é o principal alcaloide obtido do ópio e quando isolada apresenta-se sob a forma de um pó branco cristalino ou acastanhado, de forte odor e sabor amargo, variando a sua textura desde pastosa a dura e seca (Moffat et al. 2004; Karch, 2002).
Figura 4 - Estrutura molecular da morfina.
Tabela 3 - Propriedades físico-químicas, farmacocinéticas e farmacodinâmicas da morfina (adaptado de Moffat et al. 2004).
Parâmetros Propriedades
Aparência Pó branco cristalino ou acastanhado
Peso Molecular 285,4 g/mol
Fórmula Química C17H19NO3
pKa 7,9
Ponto de Ebulição 254 oC - 256 oC
Solubilidade Solúvel em água, álcool, clorofórmio. Insolúvel em éter
Principal via metabólica Glucuronidação
Tempo de semi-vida no plasma 2-3 horas (h)
Biodisponibilidade Oral: 20-30%
Intravenosa: 100%
Excreção Urina, Fezes
Principal órgão alvo SNC
1.1.2.2 Farmacocinética
Farmacologicamente a MORF é um agonista opióide. Este composto pode ser usado sob a forma de pó, líquido ou barra e introduzido no organismo por via oral ou injetada, dispersando-se pela corrente sanguínea e atingindo o SNC, para o qual apresenta grande tropismo (da Costa, 2010). A principal via de biotransformação da MORF corresponde à sua esterificação com o ácido glucurónico através dos grupos hidroxilo (Figura 5). É eliminada na urina e nas fezes por excreção biliar (Eaton e Gallagher, 2010). Na urina, 2 a 12% da dose de MORF é excretada sob a forma de molécula parental, porém 60 a 80% é excretada como conjugado glucuronídeo. Cerca de 10% das
moléculas de MORF são metabolizadas a M6G e 56% a M3G (Skarke e Lotsch, 2002; Mercadante e Arcuri, 2004). A MORF é também metabolito de outros compostos, como por exemplo da codeína e da heroína, podendo ser detetada na urina, tanto na forma livre como conjugada (Stuart-Harris
et al. 2000; Barile, 2004). As caraterísticas farmacocinéticas da MORF encontram-se resumidas na
Tabela 3.
Figura 5 - Representação esquemática das principais vias metabólicas da morfina com as respetivas enzimas envolvidas (adaptado de DePriest et al. 2015; Lötsch, 2005).
1.1.2.3 Farmacodinâmica
O organismo humano possui diversos tipos de recetores opióides, designadamente µ, k, δ e
σ. Todos estes recetores estão localizados por todo o sistema nervoso, e dependendo da sua localização, variam os seus efeitos fisiológicos (Gilman et al. 1980; Brownstein, 1993). O recetor µ é responsável pelos efeitos cardiovasculares dos opióides, atuando essencialmente a nível da espinal medula, provocando hipotensão, vasodilatação periférica e depressão respiratória. A miose e euforia são também consequências produzidas pela atuação nos recetores µ (Karch, 1998; Kieffer, 1999). Tal como os recetores µ, os k também atuam principalmente na espinal medula, resultando em depressão respiratória e analgesia, porém os efeitos provocados são menos intensos quando comparados com os dos recetores µ. Por outro lado, os δ provocam analgesia supraespinal, enquanto que os σ, causam efeitos psicomiméticos e disfóricos (Gilman et al. 1980; Brownstein, 1993; Karch, 1998).
Todos os efeitos provocados pelos opióides são mediados pela adenosina monofosfato cíclica e pela modulação dos canais de cálcio (Ca2+) e potássio (K+) (Gilman et al. 1980; Eaton e Gallagher,
2010). Quando a MORF está associada aos recetores, os canais de Ca2+ dos terminais nervosos
pré-sinápticos fecham, acorrendo a diminuição da libertação de neurotransmissores e abrem os canais de K+, inibindo os neurónios pós-sinápticos (Brownstein, 1993; Jickells e Negrusz, 2008). Os efeitos
agonistas de cada recetor são apresentados resumidamente na Tabela 4.
Tabela 4 - Efeitos agonistas dos recetores opióides (adaptado de Brownstein, 1993).
Recetores Efeitos Agonistas
µ Analgesia Depressão respiratória Miose Náuseas Vómitos Euforia
Redução da motilidade gastrointestinal k
Analgesia Miose (baixa)
Depressão Respiratória (baixa) Disforia
δ Analgesia supraespinal
1.1.3 Metadona
A MET tem sido utilizada desde 1965, em tratamentos de substituição de indivíduos dependentes de heroína. O tratamento com MET, em doses adequadas às necessidades de cada indivíduo, contribui para uma diminuição de mortalidade, para a abstenção ou redução do consumo de heroína, para a diminuição da prática de atividades criminais e risco de adquirir doenças infeciosas como o Vírus da Imunodeficiência Humana (Ferrari et al. 2004).
A MET é também utilizada como analgésico, porém menos frequentemente quando comparada com a MORF (Garrido e Trocóniz, 2000). As principais características farmacológicas que permitem o seu uso como tratamento de substituição na dependência de heroína são a extensa biodisponibilidade oral e o tempo de eliminação longo (Oliveira et al. 2010).
1.1.3.1 Propriedades físico-químicas
A MET é um opióide sintético, designado por 6-dimetilamino-4,4-difenil-3-heptanona (Figura 6). A MET é o primeiro opióide de síntese a perder o anel piperidínico e é usada sob a forma de cloridrato racémico, pois possui dois isómeros, designadamente a L-metadona, responsável pela ação analgésica e sedativa, e a D-metadona, responsável pela atividade antitússica. O isómero L-metadona é composto por dois enantiómeros, nomeadamente pela R-L-metadona e S-L-metadona, e é considerado como o mais ativo (Armstrong et al. 2009; Buchard et al. 2010; Garrido e Trocóniz, 2000).
As propriedades físico-químicas da MET encontram-se descritas resumidamente na Tabela 5.
Tabela 5 - Propriedades físico-químicas, farmacocinéticas e farmacodinâmicas da metadona (adaptado de Ferrari et al. 2004; Garrido e Troconiz, 1999; Neto et al. 2015).
Parâmetros Propriedades
Aparência Pó branco cristalino
Peso Molecular 309,44 g/mol
Fórmula Química C21H27NO
pKa 9,2
Ponto de Ebulição 233 oC - 236 oC
Solubilidade Solúvel em água, álcool, clorofórmio. Insolúvel em éter e glicerol
Principal via metabólica N-desmetilação
Tempo de semi-vida no plasma 3 h
Biodisponibilidade Oral: 41-79% a 85-95%
Excreção Urina, Fezes
Principal órgão alvo SNC
1.1.3.2 Farmacocinética
A MET é um fármaco básico e lipossolúvel (Neto et al. 2015) e é administrada preferencialmente por via oral, porém, outras vias são possíveis, tais como: retal, intravenosa e intramuscular (Bruera e Sweeney, 2002). Apresenta uma boa absorção pelo trato gastrointestinal e pode ser detetável no plasma 30 min após uma toma oral, sendo que a sua biodisponibilidade varia entre 41-79% a 85-95%. Para se atingir a concentração plasmática máxima o tempo necessário varia entre 1-6 h (Oliveira et al. 2010). A principal via de eliminação da MET e dos seus metabolitos é a renal que varia entre 15-60%. Também pode ser eliminada através das fezes numa percentagem de 20-40% (Ferrari et al. 2004). Devido à sua elevada solubilidade lipídica, 98% de MET que alcança a circulação sistémica é rapidamente transferida para os tecidos, em especial o fígado, rins, pulmões e em pequena quantidade para o cérebro.
A MET é maioritariamente metabolizada a nível hepático e a principal reação envolvida consiste numa N-desmetilação catalizada pela isoenzima do citocromo P450 CYP3A4 que origina o metabolito inativo 2-etilideno-1,5-dimetil-3,3-difenilpirrolidina (EDDP) que é posteriormente desmetilado para formar a 2-etil-5-metil-3,3-difenil-1-pirrolina (EMDP) (Figura 7). Esta enzima é encontrada no intestino e no fígado, afetando por isso o metabolismo intestinal e hepático da MET. Estes metabolitos não possuem atividade farmacológica. A excreção da MET de forma inalterada
CYP3A4, CYP2D6, CYP2B6
1997). Em indivíduos submetidos a terapia de substituição com MET, 20-60% da dose de MET é excretada na urina, num período de 24 h. A MET é excretada de forma inalterada até 33%, a EDDP até 43%, e a EMDP até 5-10% da dose administrada (Kelly et al. 2005).
O principal fator responsável pelas diferenças na biodisponibilidade da MET é a variação interindividual em CYP3A4. Outra enzima envolvida no metabolismo da MET é a CYP2D6, principalmente expressa no fígado e não indutível (Ferrari et al. 2004; Oliveira et al. 2010). Recentemente, surgiram evidências de que a CYP2B6 tem um papel importante no metabolismo da MET, sugerindo que seria a isoforma primordial para a excreção in vivo (Neto et al. 2015; Oliveira
et al. 2010).
Figura 7 - Representação esquemática das principais vias metabólicas da metadona com as respetivas enzimas envolvidas (adaptado DePriest et al. 2015).
1.1.3.3
Farmacodinâmica
A MET é um agonista dos recetores opióides e um antagonista dos recetores N-metil-D-aspartato (NMDA), bloqueando a recaptação da serotonina e noradrenalina (Codd e Shank, 1995;
Metadona
EDDP
designadamente analgesia, depressão respiratória, dependência fisiológica e tolerância. O enantiómero R-metadona possui afinidade para os recetores µ e δ dez vezes superior comparativamente ao enantiómero S. A sua atividade analgésica é 50 vezes mais elevada (Garrido e Trocóniz, 2000; Neto et al. 2015). Aparentemente o enantiómero S-metadona é inativo como opióide e o R-metadona um antagonista não competitivo do recetor NMDA, responsável pela hiperalgesia induzida por opióides (HIO) e pelo fenómeno de tolerância. A ativação do recetor NMDA, a inibição do sistema transportador de glutamato, assim como a participação da proteína cinase C intracelular regulada pelo Ca2+ nos mecanismos celulares da HIO são mecanismos
responsáveis pela hiperalgesia. O enantiómero S-metadona também possui um efeito inibidor na recaptação de serotonina e noradrenalina no SNC. A MET é utilizada em situações de dor crónica neuropática, de tolerância e de HIO devido ao conjunto de propriedades farmacodinâmicas que apresenta (Neto et al. 2015). A Figura 8 representa a diferença entre a farmacocinética e farmacodinâmica de um opióide de ação rápida (heroína) em comparação com um opióide de ação lenta (MET).
Figura 8 - Farmacocinética e farmacodinâmica de um opióide de ação rápida (heroína) em comparação com um opióide de ação lenta (metadona, MET). A concentração plasmática de um opióide de ação rápida como a heroína aumenta rapidamente após administração intravenosa, mas também cai com rapidez, causando sintomas de abstinência. Por outro lado, a concentração plasmática de uma droga de ação lenta, com tempo de semivida longo, como a MET, permanece na faixa assintomática por um período superior a 24 horas, de modo que o paciente não sente os sintomas de abstinência. Além disso, devido ao seu longo tempo de semivida plasmática, só é preciso administrar a MET uma vez por dia (reproduzido de Swift RM e Lewis DC, 2009).
2. Matrizes Biológicas
A análise química para a monitorização de drogas de abuso e de outras substâncias tem emergido essencialmente como complemento no controlo da prevenção do abuso e também com finalidade forense (Buttner, 2011; OEDT, 2014).
A estabilidade dos analitos na matriz biológica, assim como os fenómenos de redistribuição
post-mortem, são parâmetros fundamentais a ter em consideração em análises toxicológicas
forenses (Moreau e Siqueira, 2008). Também as caraterísticas toxicocinéticas dos compostos a analisar, bem como a finalidade do diagnóstico laboratorial são critérios essenciais na seleção da matriz para a realização de análises toxicológicas (Bulcão et al. 2012).
Entre as matrizes convencionais, destacam-se o sangue e a urina. O sangue apresenta inúmeras vantagens, sendo a mais importante, a possibilidade de correlacionar os níveis do composto presente com os seus efeitos e consequentemente com as possíveis alterações fisiológicas por ele provocadas. Por outro lado, em amostras post-mortem, as concentrações sanguíneas podem não refletir necessariamente a concentração no momento da morte devido a fatores relacionados com o fenómeno de redistribuição post-mortem (Blanke e Poklis, 1996; Bulcão
et al. 2012).
A urina apresenta menos interferências endógenas, devido ao fato de ser constituída principalmente por água (H2O). Por outro lado, quando comparada com o sangue, apresenta
concentrações mais elevadas dos analitos e/ou dos seus produtos de biotransformação. Porém, através de análises de urina, apenas se pode verificar se ocorreu a exposição ao composto em estudo, visto existir uma larga variedade de fatores que interferem no mecanismo de excreção do composto e consequentemente a correlação da concentração presente com os seus efeitos será baixa (Bulcão et al. 2012; Klaassen, 2001). Genericamente, a janela de deteção em urina varia entre 1-3 dias e no sangue é no máximo de um dia (Rouen et al. 2001).
Por outro lado, o conteúdo estomacal, assim como fragmentos de tecido muscular e vísceras, como por exemplo, fígado, cérebro e rins constituem amostras para análise post-mortem. A grande vantagem da utilização do conteúdo estomacal é que a maioria dos compostos ingeridos permanecem no estômago de forma inalterada e ionizada permitindo uma análise mais fácil e rápida (Bulcão et al. 2012).
Atualmente a análise quantitativa de drogas de abuso e outras substâncias em matrizes queratinizadas (cabelos e unhas) tem emergido como complemento à análise de matrizes
longo período de tempo e o modo simples e não invasivo de colheita da amostra (Palmeri et al. 2000; Madry et al. 2013; Kim et al. 2010). Todos estes aspetos fazem com que as unhas e o cabelo sejam matrizes com elevado interesse para a toxicologia forense e clínica (Caplan e Jenkins, 2008). As unhas crescem continuamente e não têm fases de interrupção no crescimento, o que pode constituir uma vantagem em termos de monitorização da exposição (Madry et al. 2013). Apesar de extensamente sujeitas a contaminação ambiental, existem vários métodos de descontaminação que permitem ultrapassar esta limitação deste tipo de matrizes, como por exemplo recurso a lavagens com soluções metanólicas (Palmeri et al. 2000). É de salientar que as unhas das mãos são preferencialmente selecionadas para os diversos estudos, devido ao fato, de as concentrações apresentarem uma maior ordem de grandeza comparativamente com as unhas dos pés (Palmeri et
al. 2000).
Para além do cabelo e das unhas, outras matrizes não convencionais têm sido utilizadas, como o suor, humor vítreo e a saliva. As análises em suor são raramente utilizadas, devido à difícil obtenção de quantidades adequadas de amostra. Porém, recentemente foram desenvolvidos adesivos apropriados, denominados de “sweat patch”, para a colheita deste fluido biológico. O modo simples e não invasivo de colheita desta amostra constituí uma vantagem. O humor vítreo, que corresponde ao material que preenche a cavidade posterior dos olhos, é uma matriz que devido à ausência de atividades metabólicas significativas, pode indicar com precisão a concentração de composto presente no organismo. É também muito usada em análises post-mortem, como por exemplo, em casos de estado avançado de decomposição do cadáver, uma vez que, esta amostra não sofre degradação microbiana post-mortem.
A utilização da saliva como matriz biológica tem vindo a aumentar nos últimos anos, principalmente em estudos relativos à farmacocinética e monotorização terapêutica de fármacos. Também é uma matriz de colheita simples e não invasiva (Bulcão et al. 2012). A Tabela 6 resume as principais vantagens e desvantagens das diversas matrizes com interesse analítico ao nível clínico e forense.
Tabela 6 - Principais vantagens e desvantagens das diversas matrizes convencionais e não convencionais utilizadas em análises toxicológicas (adaptado de Bulcão et al. 2012; Rouen et al. 2001).
Matriz Vantagens Desvantagens
Sangue
- Possibilidade de obter uma correlação direta dos efeitos fisiológicos com as concentrações detetadas
- Janela de deteção curta
- Fenómenos de redistribuição post-mortem - Exige preparação e purificação da amostra
- Colheita frequentemente considerada como invasiva
Urina
- Existe em elevadas quantidades
- Derivados de compostos e/ou seus metabolitos estão presentes em grandes concentrações
- Poucos interferentes endógenos
- Colheita frequentemente considerada como não invasiva
- Janela de deteção curta - Amostra fácil de adulterar
- Baixa correlação dos níveis do composto presente com os seus efeitos
Conteúdo estomacal
- Compostos prevalecem genericamente de forma inalterada e ionizada
- Composição variável (depende do tipo e da quantidade de alimento presente)
- Somente em análises post-mortem
Unhas/Cabelo
- Monitorizar a exposição a um longo período de tempo (crescem continuamente e sem fases de interrupção) - Colheita da amostra simples e não invasiva
- Elevada capacidade de acumulação dos compostos e dos seus principais metabolitos
- Baixa correlação entre a concentração detetada e a dose administrada
- Possibilidade de contaminações externas e ambientais
Suor
- Colheita não invasiva - Baixas concentrações
- Colheita difícil de quantidades adequadas de amostra
Humor vítreo
- Fluído menos sujeito a alterações químicas
post-mortem
- Preservado de contaminações externas e de microrganismos
- Somente em análises post-mortem
Saliva
- Colheita simples e não invasiva - Útil para a deteção do uso recente
- Reflete a fração livre da substância o plasma
- Janela de deteção curta
- Colheita difícil de quantidades adequadas de amostra
A utilização das unhas como matriz analítica para fins clínicos e/ou forenses pressupõe o conhecimento das suas estruturas e da forma como se processa a deposição das substâncias nesta matriz. Neste sentido, segue uma breve descrição das principais estruturas anatómicas assim como dos mecanismos de incorporação de xenobióticos nas unhas.
2.1 Estrutura das unhas
As unhas são constituídas essencialmente pela proteína queratina. São fundamentais na proteção e no aumento da sensibilidade ao toque, sendo compostas pela matriz ungueal, lúnula, leito da unha, hiponíquio, placa da unha e pelas dobras das unhas, como se pode verificar na Figura 9 (Caplan e Jenkins, 2008; Fleckman, 1985; Johnson e Shuster,1993).
Figura 9 - Esquema representativo da anatomia da unha (adaptado de Caplan e Jenkins, 2008).
2.1.1 Matriz ungueal
A matriz ungueal é responsável pela produção de queratina, constituindo assim a placa da unha. É constituída por alguns melanócitos, células responsáveis pela produção de melanina, sendo a coloração cor-de-rosa da placa da unha conferida pelo fornecimento de sangue ao leito da unha. O tamanho e a forma da matriz ungueal são determinantes na forma e espessura da placa da unha, variando entre indivíduos.
2.1.2 Lúnula
A lúnula corresponde à área branca visualizada na base da unha. A coloração branca pode ser resultado de uma reflexão de luz ou de uma zona de queratinização incompleta.
Placa da Unha Leito da Unha Matriz Ungueal Dobra Proximal da Unha Lúnula Hiponíquio Dobra Proximal da Unha
2.1.3 Leito da unha
O leito da unha estende-se da lúnula ao hiponíquio, é muito vascular e contém cristas epidérmicas longitudinais e também papilas dérmicas.
2.1.4 Hiponíquio
O hiponíquio corresponde à área entre a extremidade livre da placa da unha e a ponta do dedo e atua como barreira impermeável.
2.1.5 Placa da unha
A placa da unha é dura, translúcida e constituída por queratina. A placa ungueal tem aproximadamente 0,5 mm de espessura, apresentando uma espessura maior em indivíduos do sexo masculino comparativamente com os do sexo feminino. Com o aumento da idade, a placa ungueal tem tendência a apresentar uma espessura mais elevada.
2.1.6 Dobras da unha
As dobras da unha atuam como barreiras de proteção contra bactérias.
2.2 Taxa de Crescimento das unhas
A taxa média de crescimento das unhas é de 0,1 mm por dia e 3 mm por mês para as unhas das mãos e de 1,1 mm por mês para as unhas dos pés (Fleckman, 1985; Gupchup e Zatzu, 1999; Palmeri et al. 2000), variando entre indivíduos (Hamilton et al. 1955). Geralmente, a taxa de crescimento da unha é proporcional ao comprimento do dedo da mão (Hamilton et al. 1955). Fatores como o clima, doenças, dieta, alterações fisiológicas, idade, género e até mesmo a gravidez fazem variar a taxa de crescimento das unhas (Fleckman, 1985; Palmeri et al. 2000). O período necessário para a matriz ungueal das mãos ser completamente substituída apresenta uma duração de cerca de 6 meses (Palmeri et al. 2000).
2.3 Formação das unhas
A formação da unha ocorre em duas áreas distintas. Aproximadamente 80% da unha é originada de uma forma contínua na raiz da unha ou matriz ungueal. Os restantes 20 % são
2.4 Incorporação de xenobióticos nas unhas
De acordo com a literatura, o mecanismo de incorporação de xenobióticos nas unhas ainda não é totalmente conhecido. Atualmente tem-se conhecimento de dois possíveis mecanismos de incorporação de xenobióticos nas unhas que correspondem aos mecanismos de formação da unha. Neste sentido, os compostos incorporam-se na unha através do fornecimento de sangue para a matriz ungueal durante a queratinização e a vascularização da unha, bem como através do suor produzido na dobra proximal da unha (Caplan e Jenkins, 2008). Todavia, a incorporação do xenobiótico tem tendência a atingir o estado estacionário, se a exposição for crónica (Palmeri et al. 2000).
A estrutura da matriz, a natureza físico-química do composto, o seu peso molecular, a sua lipofilia, a sua constante de dissociação, a sua biodisponibilidade e a via de administração são fatores de extrema importância na capacidade de incorporação de compostos nas unhas (Caplan e Jenkins, 2008). Segundo estes autores, a exposição a fontes externas, tais como o meio ambiente, o suor e a saliva não devem ser excluídas como mecanismos viáveis de incorporação de compostos/xenobióticos nas unhas.
Através de diversos estudos realizados, Kobayashi et al. concluíram que a penetração de compostos através de fontes externas não depende apenas da lipofilia e do estado de ionização, mas também do peso molecular dos compostos. Por outro lado, uma vez que a parte dorsal da placa da unha é permeável, a exposição da unha ao sangue, suor, sebo, saliva, água, urina e as quantidades presentes nestes fluídos irão determinar quais os compostos e seus metabolitos que serão incorporados através deste mecanismo, assim como em que extensão são incorporados (Kobayashi et al. 2004).
Contudo, é importante salientar que nenhum destes mecanismos de incorporação de xenobióticos nas unhas está ainda completamente esclarecido e provavelmente varia de acordo com o tipo de composto envolvido, o estado fisiopatológico do indivíduo e com as condições ambientais (Caplan e Jenkins, 2008).
3. Deteção de drogas de abuso e de outras substâncias de interesse forense em
unhas
A possibilidade de deteção de drogas de abuso em unhas foi relatada pela primeira vez, em 1984 por Suzuki et al., com a quantificação de anfetaminas, designadamente da metanfetamina (MA) em fragmentos de unhas de indivíduos consumidores de MA (Suzuki et al. 1984). Após cinco anos, os mesmos autores apresentaram um novo estudo, complementando o estudo anterior, comparando as concentrações de MA e anfetamina (AP) em unhas com as concentrações detetadas em cabelo, saliva e suor, concluindo que a concentração de MA em unhas é mais elevada comparativamente com a obtida para a AP, e que estes compostos são detetáveis por períodos mais longos em unhas do que em saliva e suor (Suzuki et al. 1989). Este grupo de drogas, nomeadamente a 3,4-metilenodioximetanfetamina (MDMA) e a 3,4-metilenodioxianfetamina (MDA) também foi estudado por Cirimele et al. em unhas e cabelo, verificando que as concentrações presentes em ambas as matrizes eram aproximadamente iguais (Cirimeli et al. 1995). A deteção e quantificação simultânea de MA, AP, MDMA, MDA, cetamina (KET) e norcetamina em unhas também foi demonstrada por Kim et al., através da aplicação de um método validado a amostras obtidas de consumidores deste grupo de drogas ilícitas (Kim et al. 2010). Já em 2012, os mesmos autores descreveram um método rápido e simples para a deteção das mesmas drogas em unhas, à exceção da KET, recorrendo à micro-extração pulverizada. Esta técnica permitiu a obtenção de extratos mais limpos quando comparada com outros procedimentos analíticos, assim como uma maior sensibilidade de deteção dos compostos em análise (Kim et al. 2012). O estudo de incorporação nas unhas das AP e MA também foi realizado, concluindo que estes analitos se encontram numa maior quantidade nas unhas comparativamente com a presente no cabelo. Lin
et al. concluíram que as drogas são incorporadas na matriz da unha (Lin et al. 2004).
Em 1994, surge também um estudo relativo à análise de cocaína (COC) em unhas das mãos e dos pés de um indivíduo vítima de intoxicação aguda por COC (Tiess et al. 1995). Através desta análise, foi verificado que a quantidade de COC encontrada nas unhas das mãos era superior à encontrada nas unhas dos pés e que as maiores concentrações de COC depositam-se na raiz da unha. Por outro lado, com recurso aos resultados obtidos na análise complementar de fluidos biológicos e de cabelo, Tiess et. al concluem que a vítima tinha consumido a droga pouco antes de ter ocorrido a sua morte. Já Miller et al. pesquisaram a COC e o seu principal metabolito, a benzoilecgonina, em cabelo, unhas das mãos e dos pés, e os resultados demonstraram que a
dose administrada. Foi administrada COD a diversos indivíduos por via oral e COC por via subcutânea. As concentrações detetadas de COD e COC foram superiores no cabelo em relação à quantidade quantificada nas unhas. Contudo, os autores referem que o método de colheita das unhas (raspar a superfície dorsal) pode ter influenciado os resultados obtidos. Segundo estes autores aparentemente existe uma relação dose-resposta para ambas as matrizes, porém esta relação parece ser mais evidente para amostras de cabelo. (Ropero-Miller et al. 2000).
A deteção simultânea de MORF, 6-MAM e COC em unhas dos pés foi também demonstrada em 2004 por Cingolani et al. As concentrações presentes na secção proximal da unha e na zona proximal do cabelo foram comparadas, tendo sido concluído que a concentração de COC e MORF foi superior à obtida no cabelo. Contudo, a concentração da 6-MAM em ambas as matrizes era aproximadamente igual (Cingolani et al. 2004). Também Ragoucy-Sengler et al. detetaram COC e alguns dos seus metabolitos em unhas de indivíduos que fumavam COC (Ragoucy-Sengler et al. 2004). Shen et al. desenvolveram um método para a quantificação de opiáceos, nomeadamente da 6-MAM, acetilcodeína, COD, MORF e heroína, em unhas, comparando as concentrações com as obtidas no cabelo. Este autor constatou que as concentrações da 6-MAM, acetilcodeína e COD eram significativamente superiores no cabelo, com exceção da MOR, cuja concentração era superior nas unhas. Com o seu estudo, Shen et al. demonstraram que as unhas podem ser uma alternativa ao cabelo na deteção de opióides (Shen et al. 2014).
Também Lemos et al. demonstraram a utilidade das unhas na deteção de MORF em consumidores de heroína, bem como de MET em indivíduos incluídos num programa terapêutico com MET (Lemos et al. 2000). A avaliação da incorporação de drogas nas unhas devido à contaminação externa foi avaliada por Engelhart e Jenkins. Fragmentos de unhas das mãos e dos pés obtidas post-mortem, foram analisadas após o processo de lavagem para a deteção de COC e opiáceos. Sangue e urina também foram matrizes analisadas. A concentração de ambos os analitos em estudo nas unhas das mãos foi significativamente mais elevada do que a concentração presente nas unhas dos pés, concluindo também que a contaminação externa não deve ser excluída como uma via de incorporação de drogas nas unhas, mas que provavelmente não é um mecanismo com relevância. Como já tinha sido referido por diversos autores, também neste estudo, não existiu concordância entre a concentração de analitos presentes nas unhas e no sangue (Engelhart e Jenkins, 2002).
Também a deteção de canabinóides em unhas foi possível, através do estudo realizado por Lemos et al., em indivíduos voluntários consumidores de cannabis, recorrendo a radioimunoensaios (RIA) e à cromatografia gasosa acoplada à espetrometria de massa (GC-MS) (Lemos et al. 1999). Tal como Lemos et al., Jones et al. desenvolveram um método para
quantificação do ácido ∆9-tetrahidrocanabiol (THC-COOH) com recurso a GC-MS. O seu estudo
demonstrou que as concentrações de THC-COOH eram aproximadamente cinco vezes mais elevadas em unhas comparativamente às obtidas em cabelo dos mesmos indivíduos (Jones et al. 2013). Até à data, apenas três estudos detetaram a ∆9-tetrahidrocanabinol (THC) e o seu metabolito
(THC-COOH) em unhas (Lemos et al. 1999; Kim et al. 2008; Jones et al. 2013).
Al-Delaimy avaliou os níveis de nicotina presentes nas unhas dos pés, assim como a possibilidade dos níveis de nicotina serem utilizadas como biomarcador de exposição ao fumo do tabaco. Os resultados deste estudo demonstraram que a avaliação da nicotina em unhas é um biomarcador válido para a avaliação da exposição ativa e passiva ao fumo do tabaco (Al-Delaimy et
al. 2002; Al-Delaimy e Willet, 2008). O potencial das unhas na determinação de níveis de nicotina
como biomarcadores no cancro do pulmão e na doença coronária também foi avaliada. Os estudos demonstraram que os níveis de nicotina são potenciais biomarcadores de cancro de pulmão e na doença coronária, independentemente do historial de fumador, concluindo que a avaliação dos níveis de nicotina permitem avaliar a exposição ao fumo de tabaco, assim como a identificação de indivíduos com elevado risco para estas doenças (Al-Delaimy et al. 2008; Al-Delaimy e Willet, 2011). A determinação dos níveis de cotinina, 4-(metilnitrosamino)-1-(3-piridil)-1-butanol) (NNAL) e de N-nitrosonornicotina (NNN) em unhas foi relatada pela primeira vez por Stepanov et al. (Stepanov et al. 2006; Stepanov et al. 2007; Stepanov e Hecht, 2008). A pesquisa de NNAL e NNN é particularmente importante devido ao seu potencial carcinogénico (Stepanov et al. 2012). Schutte-Borkovec et al. estabeleceu um método analítico para a quantificação de myosmina, nicotina e cotinina em plasma, saliva e unhas dos pés também com recurso a GC-MS. Através dos resultados obtidos, concluiu que a myosmina não é um biomarcador específico na avaliação da exposição ao fumo do tabaco, ao contrário da nicotina e da cotinina (Schutte-Borkovec et al. 2009).
A análise quantitativa de drogas de abuso em matrizes queratinizadas (cabelos e unhas) tem emergido como complemento à análise de matrizes convencionais (sangue e urina) (Ropero-Miller
et al. 2000), adquirindo especial relevância em investigações post-mortem, devido à elevada
estabilidade que os analitos apresentam, sendo de particular utilidade em cadáveres de estado avançado de decomposição, e também no rastreio da exposição intrauterina em recém-nascidos (Palmeri et al. 2000), responsável por efeitos deletérios no desenvolvimento físico e mental da criança (Mari et al. 2008). As drogas de abuso podem danificar o embrião e o feto, produzindo anomalias congénitas, retardar o crescimento intrauterino, provocar morte neonatal e causar uma maior incidência de síndrome de morte súbita infantil (SIDS) (Palmeri et al. 2000). O primeiro
