TRACHOMATIS E CHLAMYDIA PNEUMONIAE)

(1)

SERVIÇO PÚBLICO FEDERAL UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

LABORATÓRIO DE VIROLOGIA

ASSOCIAÇÃO ENTRE MARCADORES DA RESPOSTA INFLAMATÓRIA E A IMUNOPATOGÊNESE DE AGENTES INFECCIOSOS DE NATUREZA VIRAL (VÍRUS DA DENGUE, HTLV-1 E HTLV-2) E BACTERIANA (CHLAMYDIA TRACHOMATIS E CHLAMYDIA PNEUMONIAE)

ROSIMAR NERIS MARTINS FEITOSA

(2)

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal do Pará como requisito parcial para obtenção do grau de Doutor em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários.

Orientador: Prof. Dr. Ricardo Ishak

(3)

Feitosa, Rosimar Neris Martins

Associação entre marcadores da resposta inflamatória e a imunopatogênese de agentes infecciosos de natureza viral (Vírus da dengue, HTLV-1 e HTLV-2) e bacteriana (Chlamydia trachomatis e

Chlamydia pneumoniae), Belém-Pará, 2010, 174p, Tese de Doutorado em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários.

(4)

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal do Pará como requisito parcial para obtenção do grau de Doutor em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários.

Orientador: Prof. Dr. Ricardo Ishak

Instituto de Ciências Biológicas, UFPA

Banca Examinadora: Prof. Dr. Antonio Carlos Rosário Vallinoto Instituto de Ciências Biológicas, UFPA

Profa. Dra. Maristela Gomes da Cunha Instituto de Ciências Biológicas, UFPA

Profa. Dra. Karla Tereza Silva Ribeiro Instituto de Ciências Biológicas, UFPA

Prof. Dr. José Alexandre Rodrigues de Lemos Instituto de Ciências Biológicas, UFPA

Profa. Dra. Marluísa de Oliveira Guimarães Ishak (Suplente) Instituto de Ciências Biológicas, UFPA

(5)

(6)

AGRADECIMENTOS

Deus eu te agradeço, por estar presente em todos os momentos de minha vida sempre à frente de minhas decisões.

Aos meus pais, Maria e José (in memorian), pelo amor incondicional a mim dedicado e pela educação que me deram.

Aos meus irmãos Jelson, Wudison, Rosineia e Alex pelo incentivo ao longo de minha jornada pessoal e profissional.

Ao meu orientador Prof. Dr. Ricardo Ishak, pelo carinho, amizade e atenção, assim como pela confiança em mim depositada durante a elaboração desta tese.

A Profª. Dra. Marluísa de Oliveira Guimarães Ishak, pelo carinho e respeito com que me acolheu e por todas as orientações, durante minha passagem pelo Laboratório de Virologia da UFPA.

Ao Prof. Dr. Antonio Carlos Rosário Vallinoto, pela atenção que sempre deu a este trabalho e pelo apoio e contribuição com seus conhecimentos durante a realização das técnicas de biologia molecular.

A Profª. MSc. Vânia Nakauth Azevedo, pelo companheirismo e pela ajuda durante a realização dos ensaios de quantificação dos níveis séricos das citocinas.

Ao Prof. Dr. Luiz Fernando Almeida Machado, por sua cooperação e pelas palavras carinhosas de incentivo que contribuiram muito ao longo da conclusão deste trabalho.

Aos amigos do Laboratório de Virologia e do Laboratório de Microbiologia da UFPA pelo carinho e ajuda durante a realização deste trabalho.

A minha amiga, Profª. Dra. Simone Conde, pelo carinho e cumplicidade durante a superação dos obstáculos que surgiram ao longo deste trabalho e pelas longas horas de ajuda dedicadas à realização dos ensaios de quantificação dos níveis séricos das citocinas e das técnicas de biologia molecular.

(7)

Ao meu esposo Henoque Feitosa pelo amor, respeito, paciência e, principalmente, pela compreensão e companheirismo nos momentos em que mais precisei de sua ajuda.

À Universidade Federal do Pará e ao Programa de Pós-Graduação em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários pela oportunidade de desenvolvimento profissional que me foi concedida.

Ao Ambulatório do Laboratório de Arbovírus do Instituto Evandro Chagas, ao Núcleo de Medicina Tropical e ao Hospital de Clínicas Gaspar Viana pela realização das coletas de amostras de sangue periférico.

Ao Laboratório Central do Estado do Pará, na presença do Diretor Kleyffson Alves de Miranda pela compreensão e apoio que me permitiram alcançar a conclusão desta tese.

(8)

SUMÁRIO

Página

LISTA DE FIGURAS... 08

LISTA DE TABELAS... 13

RESUMO... 16

ABSTRACT... 17

1 INTRODUÇÃO... 18

1.1 VÍRUS DA DENGUE... 18

1.2 VÍRUS LINFOTRÓPICO DE CÉLULAS T HUMANAS–HTLV... 25

1.3 CHLAMYDIA ... 30

1.4 FATOR DE NECROSE TUMORAL (TNF)... 33

1.5 INTERFERON GAMA (IFN-γ)... 37

1.6 PROTEÍNA C REATIVA (PrtCR)... 39

1.7 ASSOCIAÇÕES ENTRE MARCADORES DA RESPOSTA INFLAMATÓRIA E AGENTES INFECCIOSOS ... 41

1.8 OBJETIVOS ... 46

1.8.1 Objetivo Geral ... 46

1.8.2 Objetivos Específicos ... 46

2 MATERIAL E MÉTODOS ... 48

2.1 GRUPOS POPULACIONAIS E COLETA DAS AMOSTRAS ... 48

2.2 DIAGNÓSTICO DA INFECÇÃO POR VÍRUS DA DENGUE, HTLV-1 e HTLV-2, C. TRACHOMATIS E C. PNEUMONIAE... 49

2.3. DETERMINAÇÃO QUANTITATIVA DAS CONCENTRAÇÕES DE TNF-α, TNF-β, IFN-γ E PrtCR NO SANGUE PERIFÉRICO ... 51

2.4 ANÁLISE DOS POLIMORFISMOS NOS GENES DE CITOCINAS... 52

2.4.1 Extração do DNA ... 52

2.4.2 Genotipagem ... 54

2.4.2.1 Polimorfismo do TNF-α ... 54

(9)

2.4.2.3 Polimorfismo do IFN-γ ... 57

2.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA... 59

2.6 COMISSÃO DE ÉTICA EM PESQUISA ... 59

3 RESULTADOS ... 60

3.1 CARACTERIZAÇÃO DOS GRUPOS ENVOLVIDOS... 60

3.1.1 Grupo Dengue ... 60

3.1.2 Grupo HTLV ... 61

3.1.3 Grupo Doença Coronariana ... 62

3.1.4 Grupo Controle ... 65

3.2 DISTRIBUIÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DAS CITOCINAS TNF-α, TNF-β, IFN-γ E PrtCR, NO SANGUE PERIFÉRICO DE ACORDO COM OS GRUPOS ESTUDADOS ... 66

3.2.1 Grupo Dengue ... 66

3.2.2 Grupo HTLV ... 70

3.3 DISTRIBUIÇÃO DA FREQUÊNCIA DE POLIMORFISMOS DOS GENES TNF-α, TNF-β E IFN-γ, DE ACORDO COM OS GRUPOS ESTUDADOS... 79

3.3.1 Grupo Dengue... 79

3.3.2 Grupo HTLV ... 81

3.3.3 Grupo Doença Coronariana... 83

3.4 ASSOCIAÇÃO ENTRE OS NÍVEIS SÉRICOS DAS CITOCINAS E AS CARACTERÍSTICAS DE ESPÉCIE/SOROTIPO/GENÓTIPO VIRAL OU BACTERIANO... 85

3.4.1 Grupo Dengue ... 85

3.4.2 Grupo HTLV ... 89

(10)

3.5.1 Grupo Dengue ... 100

3.5.2 Grupo HTLV ... 102

3.5.3 Grupo Doença Coronariana... 104

4 DISCUSSÃO ... 107

4.1 GRUPO DENGUE... 109

4.2 GRUPO HTLV ... 117

4.3 GRUPO DOENÇA CORONARIANA ... 122

5 CONCLUSÕES ... 129

(11)

LISTA DE FIGURAS

Página Figura 1 - Morfologia do vírus da dengue ... 19 Figura 2 - Estrutura genômica do vírus da dengue ... 19 Figura 3 - Estrutura morfológica do HTLV ... 25 Figura 4 - Micrografia eletrônica de HTLV-1 em cultura de linfócitos obtidos de

um paciente infectado ... 26 Figura 5 - Representação esquemática da organização genômica do HTLV ... 27 Figura 6 - Micrografia eletrônica de célula infectada por C. trachomatis, onde se observam três estados do ciclo de desenvolvimento: (A) corpo reticulado, (B) forma intermediária entre corpo elementar e corpo reticulado e (C) corpo elementar ... 31 Figura 7 – Representação esquemática da localização de polimorfismos do gene

TNF-α ... 35 Figura 8 - Representação esquemática da localização de polimorfismos do gene

TNF-β ... 36 Figura 9 - Representação esquemática da localização de polimorfismos do gene

(12)

Figura 15 - Comparação estatística entre os níveis séricos médios de IFN-γ dos pacientes dengue positivo (1), dengue negativo (2) e grupo controle (3)...

68

(13)

(14)

(15)

Figura 49 - Comparação estatística entre os níveis séricos médios de TNF-β no grupo de pacientes com doença coronariana e sororreatividade para C. trachomatis

e C. pneumoniae (1), no grupo positivo apenas para C. trachomatis (2) e no grupo controle (3)... 97 Figura 50 - Níveis séricos de IFN-γ no grupo de pacientes com doença coronariana e sororreatividade para C. trachomatis e C. pneumoniae, no grupo positivo apenas para C. trachomatis e no grupo controle... 98 Figura 51 – Comparação estatística entre os níveis séricos médios de IFN-γ no grupo de pacientes com doença coronariana e sororreatividade para C. trachomatis

e C. pneumoniae (1), no grupo positivo apenas para C. trachomatis (2) e no grupo controle (3)... 99 Figura 52 - Níveis séricos de PrtCR no grupo de pacientes com doença coronariana e sororreatividade para C. trachomatis e C. pneumoniae, no grupo positivo apenas para C. trachomatis e no grupo controle... 99 Figura 53 – Comparação estatística entre os níveis séricos médios de PrtCR no grupo de pacientes com doença coronariana e sororreatividade para C. trachomatis

e C. pneumoniae (1), no grupo positivo apenas para C. trachomatis (2) e no grupo

(16)

LISTA DE TABELAS

Página Tabela 1 - Relação dos polimorfismos nos genes das citocinas estudadas ... 58 Tabela 2 - Sororreatividade para o vírus da dengue de acordo com as características demográficas do grupo examinado... 61 Tabela 3 - Classificação molecular do HTLV de acordo com as características demográficas do grupo examinado... 62 Tabela 4 - Sororreatividade para Chlamydia de acordo com as características demográficas do grupo examinado ... 64 Tabela 5 - Sororreatividade para as espécies C. pneumoniae e C. trachomatis (de acordo com os sorotipos)... 65 Tabela 6 - Características demográficas do grupo controle ... 65 Tabela 7 - Frequências genotípicas e alélicas do polimorfismo do gene

TNF-α (-308) nos grupos dengue positivo, dengue negativo e controle... 79 Tabela 8 - Frequências genotípicas e alélicas do polimorfismo do gene TNF-β

(+252) nos grupos dengue positivo, dengue negativo e controle ... 80 Tabela 9 - Frequências genotípicas e alélicas do polimorfismo do gene IFN-γ

(+874) nos grupos dengue positivo, dengue negativo e controle... 80 Tabela 10 - Frequências genotípicas e alélicas do polimorfismo do gene TNF-α

(-308) nos grupos de portadores do HTLV (sintomáticos e assintomáticos) e grupo controle...

81

Tabela 11 - Frequências genotípicas e alélicas do polimorfismo do gene TNF-β (+252) nos grupos de portadores do HTLV (sintomáticos e assintomáticos) e grupo controle... 82 Tabela 12 - Frequências genotípicas e alélicas do polimorfismo do gene IFN-γ

(17)

Tabela 13 - Frequências genotípicas e alélicas do polimorfismo do gene TNF-α

(-308) nos grupos com doença coronariana e positivos para Chlamydia, doença coronariana e negativos para Chlamydia e controle... 83 Tabela 14 - Frequências genotípicas e alélicas do polimorfismo do gene TNF-β

(+252) nos grupos de pacientes com doença coronariana e sorologia positiva para

Chlamydia, pacientes com doença coronariana e sorologia negativa para

Chlamydia e grupo controle... 84 Tabela 15 - Frequências genotípicas e alélicas do polimorfismo do gene IFN-γ

Chlamydia, pacientes com doença coronariana e sorologia negativa para

Chlamydia e grupo controle ... 84 Tabela 16 - Frequências genotípicas e alélicas do polimorfismo do gene TNF-α

(-308) nos grupos DEN 1, DEN 2, DEN 3 e grupo controle... 101 Tabela 17 - Frequências genotípicas e alélicas do polimorfismo do gene TNF-β

(+252) nos grupos DEN 1, DEN 2, DEN 3 e grupo controle... 101 Tabela 18 - Frequências genotípicas e alélicas do polimorfismo do gene IFN-γ

(+874) nos grupos DEN 1, DEN 2, DEN 3 e grupo controle... 102 Tabela 19 - Frequências genotípicas e alélicas do polimorfismo do gene TNF-α

(-308) nos grupos de portadores sintomáticos e assintomáticos de acordo com o

tipo de HTLV e no grupo controle... 102 Tabela 20 - Frequências genotípicas e alélicas do polimorfismo do gene TNF-β

(+252) nos grupos de portadores sintomáticos e assintomáticos de acordo com o

tipo de HTLV e no grupo controle... 103 Tabela 21 - Frequências genotípicas e alélicas do polimorfismo do gene IFN-γ

(+874) nos grupos de portadores sintomáticos e assintomáticos de acordo com o

(18)

Tabela 22 - Frequências genotípicas e alélicas do polimorfismo do gene TNF-α

(-308) nos grupos de pacientes com doença coronariana e sorologia positiva para

C. trachomatis e C. pneumoniae, no grupo positivo apenas para C. trachomatis e

no grupo controle... 104 Tabela 23 - Frequências genotípicas e alélicas do polimorfismo do gene TNF-β

no grupo controle... 105 Tabela 24 - Frequências genotípicas e alélicas do polimorfismo do gene IFN-γ

(19)

RESUMO

A base genética das doenças é frequentemente estudada a partir dos polimorfismos dos genes de citocinas. O presente estudo investigou marcadores da resposta inflamatória associados a infecções virais e bacterianas que possam influenciar o curso da infecção. Foram medidos os níveis séricos (por ensaio imunoenzimático) e os polimorfismos de TNF-α (-308), TNF-β (+252), IFN-γ (+874) e da proteína C reativa, por meio de PCR e RFLP ou PCR alelo específico, em grupos de pessoas infectadas pelo vírus da dengue (n=80), com doença febril, não infectados (100), um grupo de infectados pelo HTLV (30 sintomáticos e 47 assintomáticos), um grupo com doença coronariana (58 com sororreatividade para Chlamydia e 31 com sorologia negativa) e um grupo controle (99 pessoas com sorologia negativa para dengue, HTLV e Chlamydia). Nenhum grupo mostrou associação com informações demográficas. O Vírus da dengue 3 (66,2%) e o HTLV-1 (90% em sintomáticos e 76,6% em assintomáticos) foram os agentes mais frequentes dentre os grupos respectivos. A maioria com doença coronariana (65,1%) apresentou anticorpos para Chlamydia (39,6% para C. trachomatis e C. pneumoniae, 58,6% apenas para C. trachomatis e 1,7% somente para C. pneumoniae). Foram significantes as diferenças encontradas entre: (i) os níveis séricos de TNF-β, IFN-γ e PrtCR dos grupos dengue positivo e dengue negativo com o grupo controle (p< 0,01); (ii) os níveis séricos de TNF-α, TNF-β, e IFN-γ dos grupos de HTLV (incluindo os tipos) e grupo controle; (iii) os níveis séricos de TNF-α, TNF-β, IFN-γ e PrtCR entre os pacientes com doença coronariana e sorologia positiva para Chlamydia e o grupo controle; (iv) a presença de anticorpos para C. trachomatis e C. pneumoniae e o grupo controle na comparação com a TNF-β, IFN-γ e

PrtCR. As distribuições de frequências genotípicas foram estatisticamente significantes para os polimorfismos: (i) dos genes TNF-α (p=0,0494) e IFN-γ (p= 0,0008), entre os grupos dengue positivo, dengue negativo e controle e para o IFN-γ (p= 0,0007) entre os grupos DEN 1, DEN 2 e DEN 3 e o controle; (ii) do gene IFN-γ (p= 0,0023) nos grupos de

pacientes com doença coronariana e sorologia positiva para C. trachomatis e C. pneumoniae, assim como nos monoreativos na comparação entre a positividade para

(20)

ABSTRACT

The genetic basis of diseases is frequently studied aiming the polymorphisms of cytocine genes. The present study investigated markers of the inflammatory response associated to the course of infection and disease caused by viruses and bacteria. Serum levels (measured by an ELISA assay) and the polymorphisms (using PCR, RFLP and allele specific PCR) of TNF-α (-308), TNF-β (+252), IFN-γ (+874) and C reactive protein were measured among persons with febrile disease, infected by dengue virus (n=80), not infected by DV (100), a group of HTLV infected (30 symptomatic and 47 asymptomatic), a group with coronary disease (58 seroreactive to Chlamydia and 31 with negative serology) and a control group (99 persons with no reaction to DV, HTLV and Chlamydia). No group showed association with demographic informations. Dengue virus 3 (66.2%) and HTLV-1 (90% symptomatic and 76.6% asymptomatic persons) were the most frequent agents found among their groups. The majority of those with coronary disease (65.1%) presented antibodies to

Chlamydia (39.6% to C. trachomatis and C. pneumoniae, 58.6% solely to C. trachomatis

and 1.7% to C. pneumoniae). Statistically significant levels of differences were found among: (i) serum levels of TNF-β, IFN-γ and PrtCR of positive and negative dengue and control groups (p< 0,01); (ii) serum levels of TNF-α, TNF-β and IFN-γ of HTLV

(including its types) and control groups; (iii) serum levels of TNF-α, TNF-β, IFN-γ and PrtCR among patients with coronary disease, serum reactive to Chlamydia, and the control group; (iv) the presence of antibodies to C. trachomatis and C. pneumoniae and the control group comparing TNF-β, IFN-γ and PrtCR. Genotypic frequency distributions were statistically significant for the polymorphisms: (i) of TNF-α (p=0,0494) and IFN-γ

(p= 0,0008) genes among positive, negative and control dengue groups and to IFN-γ

(p= 0,0007) among groups DEN 1, DEN 2, DEN 3 and controls; (ii) of IFN-γ gene

(p= 0,0023) among the group of patients with coronary disease and sero reactivity to

(21)

1 INTRODUÇÃO

1.1 VÍRUS DA DENGUE (VD)

Os vírus da dengue são membros da família Flaviviridae, gênero Flavivirus, cujo material genético é constituído de uma molécula de RNA de fita simples, de polaridade positiva. São quatro espécies, Vírus da dengue 1 (DEN 1), Vírus da dengue 2

(DEN 2), Vírus da dengue 3 (DEN 3) e Vírus da dengue 4 (DEN 4) com morfologias semelhantes entre si, que se apresentam como partículas esféricas, com tamanhos entre 40-50 nm, recobertas por envelope (Figura 1) (Chambers et al., 1990; Vorndam et al., 1994).

O genoma viral possui aproximadamente 11.000 Kb, contendo uma única região de leitura aberta, a qual codifica uma poliproteína precursora, flanqueada por duas regiões não traduzidas (5’ e 3’ UTR). A clivagem desta poliproteína por proteases virais e da célula hospedeira resulta em três proteínas estruturais (capsídio C, pré-membrana prM e envelope E) e sete proteínas não estruturais chamadas NS1, NS2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b e NS5, as quais estão envolvidas na replicação viral e outras funções vitais in vivo

(22)

Figura 1 - Morfologia do vírus da dengue

(http://www.stanford.edu/group/virus/flavi/2000/dengue.htm).

Figura 2 - Estrutura genômica do vírus da dengue (adaptado de Pang et al., 2001).

Entre os flavivírus transmitidos por mosquitos, as quatro espécies dos vírus da dengue apresentam uma relação filogenética com o grupo de agentes relacionados ao

Vírus da encefalite japonesa e mais distantemente com o Vírus da febre amarela (Kuno

et al., 1998). Alguns estudos filogenéticos têm demonstrado que o DEN 4 é o mais divergente, seguido pelo DEN 2, sendo os DEN 1 e DEN 3 mais relacionados entre si

5’UTR 3’UTR

C prM E NS1 NS2A NS2B NS3 NS4A NS4B NS5

(23)

(Zanotto, 1996; Twiddy et al., 2003). Análises filogenéticas de cepas endêmicas/epidêmicas sugerem que cada espécie emergiu separadamente de um ancestral silvestre (Wang et al., 2000), o que pode ter ocorrido há cerca de 125-320 anos, variando de acordo com a espécie (Twiddy et al., 2003).

O DEN 1 é dividido em quatro genótipos, incluindo um clado silvestre (Zhang et al., 2005; Diaz et al., 2006). O DEN 2 apresenta seis genótipos, designados de silvestre, americano, cosmopolita, asiático 1, asiático 2 e asiático-americano (Holmes & Twiddy, 2003; Twiddy et al., 2003; Diaz et al., 2006). O DEN 3 possui quatro genótipos denominados de I-Filipinas, II-Tailândia, III-Sri Lanka e IV-Porto Rico (Holmes & Twiddy, 2003; Messer et al., 2003). E o DEN 4 está dividido em três genótipos (I, II e III) (Holmes & Twiddy, 2003; Twiddy et al., 2003; Diaz et al., 2006).

A infecção pelos quatro agentes ocasiona uma doença conhecida como dengue, a arbovirose de maior incidência no mundo, que é endêmica em todos os continentes, exceto na Europa. A dengue é endêmica em 112 países ocasionando cerca de 100 milhões de casos de doença febril anualmente e 500.000 casos de febre hemorrágica (Guha-Sapir & Schimmer, 2005).

(24)

O Aedes albopictus é um vetor secundário da dengue no Sudeste da Ásia, no Oeste do Pacífico e com frequência cada vez maior nas Américas Central e do Sul (Gratz, 2004), já tendo sido descrito como o vetor principal em algumas epidemias de dengue ocorridas em Bangladesh e Hawai (Ali et al., 2003; Effler et al., 2005).

O mosquito adquire o vírus ao picar o homem infectado durante a fase virêmica, e após um período de replicação (período de incubação extrínseca) em que o vírus se multiplica, por um período de oito a doze dias e, a seguir, migra para as glândulas salivares, o vetor torna-se competente para transmitir a doença a outros seres humanos, até o final da vida, que é de seis a oito semanas para o Aedes aegypti, dentro do ciclo homem-mosquito-homem (Jessie et al., 2004).

O vírus é inoculado através da picada do mosquito, e faz a replicação primária em células musculares estriadas e lisas, em fibroblastos e em linfonodos locais. A multiplicação do vírus no sangue periférico (viremia) favorece a sua disseminação por todo o organismo. Os vírus podem circular livres, ou no interior de monócitos/macrófagos e células fagocitárias, as quais são os maiores sítios de replicação viral (Chambers et al., 1990; Kurane & Eennis, 1992).

Entre as manifestações clínicas associadas ao vírus da dengue estão a febre da dengue clássica e a febre hemorrágica da dengue/síndrome do choque da dengue.

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de citocinas liberadas por macrófagos ao interagirem com linfócitos T auxiliares ativados (Kurane & Eennis, 1992).

A febre hemorrágica caracteriza-se pelo aumento da permeabilidade vascular, trombocitopenia e manifestações hemorrágicas, incluindo petéquias e lesões purpúricas, sendo classificada em graus I (o mais leve) a IV (o mais grave) baseados na apresentação clínica e nos achados laboratoriais. A síndrome do choque da dengue ocorre quando a perda de fluido dentro do espaço intersticial resulta em choque hipovolêmico, que sem tratamento apropriado, pode levar à morte (Gubler, 1998; Halstead, 2007).

Entre os vários mecanismos descritos para explicar a patogênese da febre hemorrágica da dengue o mais estudado é o que se refere à mudança do perfil de secreção de citocinas por linfócitos T auxiliares (Chaturvedi et al., 1999a; Chaturvedi et al., 2000). Os linfócitos T auxiliares tipo 1 (Th1) secretam interferon gama (IFN-γ), interleucina 2 e fator de necrose tumoral (TNF) e são responsáveis pelas reações mediadas por células, danos teciduais em infecções e doenças autoimunes. Os linfócitos T auxiliares tipo 2 (Th2) secretam as interleucinas 4, 5, 6, 10 e 13 e são importantes durante a produção de anticorpos pelos linfócitos B (Chaturvedi et al., 1999a; Chaturvedi et al., 2000).

Uma mudança de resposta predominantemente Th1 observada em casos de febre da dengue para Th2 em casos graves de febre hemorrágica foi descrita por Chaturvedi

(26)

enquanto que em pacientes com febre hemorrágica da dengue foi observado um perfil típico de resposta Th2.

Em estudo para observação da sequência de aparecimento de citocinas tipo Th1 e Th2 em cultura de leucócitos do sangue periférico humano de doadores saudáveis infectados in vitro, as citocinas que foram detectadas no primeiro dia após a infecção, no sobrenadante da cultura, foram o fator citotóxico humano (hCF), TNF-α, IL-2 e IL-6. O IFN-γ apareceu no segundo dia. Os níveis destas citocinas diminuíram rapidamente exceto para hCF e IL-2. As interleucinas 10 e 5 apareceram no quarto dia e a IL-4 somente no sexto dia. Estas observações demonstraram que o vírus da dengue induziu uma resposta tipo Th1 durante os três primeiros dias de infecção de leucócitos do sangue periférico in vitro que foi substituída por uma resposta tipo Th2 posteriormente (Chaturvedi et al., 1999a).

Na resposta imunológica humoral, os anticorpos da classe IgM específicos são detectáveis a partir do quarto dia, após o início dos sintomas, atingindo níveis mais elevados por volta do sétimo dia e declinando lentamente, não sendo mais detectáveis após alguns meses. Anticorpos da classe IgG específicos são observados em níveis baixos a partir do quarto dia após o início dos sintomas, elevando-se gradualmente, atingindo altos níveis em duas semanas e mantendo-se detectáveis por vários anos, provavelmente conferindo imunidade duradoura contra a espécie infectante por toda a vida (Innis et al., 1989; Guzman & Kouri, 2002).

(27)

de células infectadas que expressam receptores HLA tipo II, produzindo IFN-γ, IL-2 e o fator estimulador de colônias de macrófagos e granulócitos. Os linfócitos citotóxicos agridem diretamente as células infectadas que expressam receptores HLA tipo I, lisando-as (Chambers et al., 1990; Kurane & Eennis, 1992).

A dengue foi reintroduzida no Brasil em uma epidemia extensa, causada pelos DEN 1 e DEN 4 em 1980 (Pinheiro & Nelson, 1997). A expansão da distribuição geográfica da dengue no Brasil continuou a partir de epidemias contínuas, anuais, a partir de 1986 no Rio de Janeiro, causada pelo DEN 1. Em 1990/1991, durante nova epidemia, com a introdução do DEN 2, notificaram-se 1.952 casos de dengue hemorrágica, com 24 mortes (Nogueira et al., 1999). Ao final do ano 2000, foi isolado, no Rio de Janeiro, o DEN 3, considerado a mais agressiva das espécies. Em 2001, o Estado do Rio de Janeiro foi atingido por mais uma grande epidemia, que atingiu níveis de incidência assustadores no verão de 2002, estendendo-se a outros Estados e ocasionando mais de trinta mortes por dengue hemorrágica (Schatzmayr, 2000; 2001).

(28)

1.2 VÍRUS LINFOTRÓPICO DE CÉLULAS T HUMANAS – HTLV

O Vírus linfotrópico de células T humanasfoi o primeiro retrovírus humano a ser descoberto, sendo classificado na família Retroviridae e no gênero Deltaretrovirus. Neste gênero também estão incluídos o Vírus da leucemia bovina e o Vírus da leucemia de células T de símios (Matsuoka & Jeang, 2007).

As partículas virais possuem forma esférica, medem cerca de 100 nm de diâmetro e são envolvidas por envelope lipoprotéico (Goff, 2007). O genoma é formado por duas moléculas iguais de RNA de fita simples, de aproximadamente nove kilobases, é envolvido por um capsídio, constituído pelas proteínas p15, p19 e p24 (Tangy, 1996). O nucleocapsídio possui ainda as enzimas protease e transcriptase reversa (que também funciona como integrase e RNAse H) (Goff, 2007). O envelope é obtido a partir da membrana plasmática da célula hospedeira, no qual estão inseridas as glicoproteínas virais gp21 e gp46 (Figuras 3 e 4) (Tangy, 1996; Goff, 2007).

Figura 3 - Estrutura morfológica do HTLV (Fonte: http://www.htlv.com.br).

(29)

Figura 4 - Micrografia eletrônica de HTLV-1 em cultura de linfócitos obtidos de um

paciente infectado (Fonte: Shuh & Beilke, 2005).

O genoma viral integrado ao genoma da célula hospedeira é formado por três genes estruturais, gag, pol e env, flanqueados por duas regiões chamadas de Long Terminal Repeats (LTR), as quais possuem vários domínios funcionais, tal como iniciador,

enhancer e finalizador da transcrição. As regiões LTR são constituídas por três domínios (U3-R-U5), em ambas as extremidades (Shimotohno et al., 1985).

A região denominada pro, localizada de maneira sobreposta aos genes gag e

pol, está envolvida na codificação da protease viral, enzima responsável pela clivagem do polipeptídeo de 55 kDa e de outras proteínas virais (Shimotohno et al., 1985).

(30)

(Seiki et al., 1983). As ORF X-III e X-IV codificam as proteínas reguladoras Rex e Tax, respectivamente (Figura 5).

Figura 5 - Representação esquemática da organização genômica do HTLV (Adaptado de

Feuer & Green, 2005).

São conhecidos quatro tipos de HTLV denominados de HTLV-1, HTLV-2, HTLV-3 e HTLV-4 (Poiesz et al., 1980; Hjelle, 1991; Calattini et al., 2006; Switzer et al., 2006; Mahieux & Gessain, 2009).

Com base na origem geográfica do vírus, na comparação das sequências e na análise filogenética de gp21 e da região LTR, o HTLV-1 apresenta seis subtipos genéticos denominados: HTLV-1a (Subtipo Cosmopolita), HTLV-1b (Subtipo África Central), HTLV-1c (Subtipo Áustralo-Melanésio), HTLV-1d (Novo Subtipo África Central), HTLV-1e e HTLV-1f (Miura et al., 1994; Ureta-Vidal et al., 1994; Van Dooren et al., 2001). Da mesma forma, o HTLV–2 possui quatro subtipos moleculares: HTLV-2a, HTLV-2b, HTLV-2c e HTLV-2d (Hall et al., 1992; Ishak et al., 1995; Eiraku et al., 1996; Vandamme et al., 1998).

O HTLV-1 foi descrito inicialmente como o agente etiológico da Leucemia e linfoma de células T do adulto (LLcTA) (Poiesz et al., 1980) e posteriormente, associado a uma doença neurológica crônica conhecida como Paraparesia espástica tropical/

U3 – R – U5 5’LTR

gag pol

env U3 – R – U5

3’LTR

pX

(31)

Mielopatia associada ao HTLV-1 (PET/MAH) (Gessain et al., 1985) e a uveítes (Watanabe

et al., 1997).

O HTLV-2 foi isolado inicialmente de uma linhagem de células T (Mo-T) derivada de um paciente com uma forma variante rara de leucemia de células pilosas (Kalyanaraman et al., 1982) e, posteriormente, em um segundo paciente com uma leucemia de células T CD8+ e coexistente leucemia de células B pilosas (Rosenblatt et al., 1986).

Apesar do isolamento do vírus a associação entre leucemia de célula pilosa e HTLV-2 ainda não está bem esclarecida, assim como as mielopatias similares a PET/MAH. As associações do HTLV-2 com doenças têm sido esporádicas e inconclusivas (Kira et al., 1991; Hjelle et al., 1992; Murphy et al., 1997).

O HTLV-3 foi isolado em amostras de sangue de dois camaroneses assintomáticos, cujo material apresentou sorologia positiva quando testado por ELISA para HTLV-1 e HTLV-2, mas um perfil sorológico indeterminado quando testado por ensaios de western-blot (Calattini et al., 2006). Comparações do genoma completo e análises filogenéticas demonstraram que a organização genômica do HTLV-3 é similar ao HTLV-1 e ao HTLV-2 (Calattini et al., 2006; Switzer et al., 2006). O HTLV-4 foi isolado em uma única amostra também em Camarões (Switzer et al., 2006). Não se conhecem quadros clínicos associados aos HTLV-3 e HTLV-4.

O HTLV infecta predominantemente linfócitos T, levando a proliferação espontânea destas células e a produção de citocinas (Carvalho et al., 2001). Sendo que o HTLV-1 tem tropismo por linfócitos T CD4+ e o HTLV-2 por linfócitos T CD8+ (Hall

(32)

A doença inflamatória PET/MAH é associada com circulação de linfócitos T CD4+ e T CD8+ ativados e elevada produção de citocinas incluindo interferon gama, fator de necrose tumoral alfa e interleucina 2 (Biddison et al., 1997; Santos et al., 2004).

Células mononucleares de indivíduos infectados pelo HTLV produzem grande quantidade de IFN-γ e TNF-α. Embora a quantidade de IFN-γ e TNF-α em sobrenadante de cultura de linfócitos seja significantemente maior em pacientes com PET/MAH do que em portadores assintomáticos do HTLV-1, o nível sérico de IFN-γ produzido em portadores assintomáticos do HTLV-1 é similar ao observado em pacientes com PET/MAH (Santos et al., 2004).

Estudos epidemiológicos em regiões de alta prevalência têm demonstrado que as formas de transmissão do HTLV-1 e do HTLV-2 são similares. Assim sendo, as principais vias de transmissão desses vírus são a transfusão sanguínea, o compartilhamento de seringas e de agulhas contaminadas, o contato sexual e o aleitamento materno (Ishak

et al., 1995; Ferreira Jr. et al., 1997; Manns et al., 1999).

O HTLV-1 é endêmico no sudoeste do Japão (Matsuzaki et al., 1993; Morofuji-Hirata et al., 1993), partes da África, como Togo, Guiné-Bissau e Camarões

(33)

A infecção por HTLV-2 é endêmica em várias populações nativas americanas e em usuários de drogas endovenosas em todo o mundo (Maloney et al., 1992; Gessain et al., 1993a; Madeleine et al., 1993).

A distribuição geográfica do HTLV-2 na região Amazônica do Brasil ocorre principalmente entre grupos indígenas nativos e encontra-se em um processo epidemiológico de disseminação nas áreas urbanas. A endemicidade do HTLV-2 particularmente entre pequenas comunidades é mantida por um processo de latência do vírus, alternando com um período produtivo (Ishak et al., 2001).

1.3 CHLAMYDIA

As clamídias são bactérias imóveis, estruturalmente semelhantes a bactérias Gram negativo, são intracelulares, devido à incapacidade de gerar adenosina trifosfato (ATP), usando assim, fontes de energia da célula hospedeira. Pertencem à família Chlamydiaceae e compreendem um único gênero, Chlamydia, do qual fazem parte quatro espécies: C. trachomatis, C. psittaci, C. pneumoniae e C. pecorum, que infectam seres humanos, aves e ruminantes (Manavi, 2006).

(34)

corpúsculos elementares, os quais são liberados das células por lise ou exocitose (Figura 6) (Moulder,1991; Manavi, 2006).

Figura 6 - Micrografia eletrônica de célula infectada por C. trachomatis, onde se observam três estados do ciclo de desenvolvimento: (A) corpo reticulado, (B) forma intermediária entre corpo elementar e corpo reticulado e (C) corpo elementar (fonte:

http://www.adn.es/.../IMA-0348-mundo-de-las-clamidias).

(35)

transmissíveis e outras patologias (conjuntivite, pneumonite e sinusite) e L1, L2, L2a e L3 associados ao linfogranuloma venéreo (Spaargaren et al., 2005; Pathela et al., 2007).

O tracoma é caracterizado por uma ceratoconjuntivite folicular crônica recidivante mais proeminente na conjuntiva superior (Wright et al., 2008). Clinicamente está dividido em doença ativa (estágio inicial), que acomete principalmente crianças e doença cicatricial (estágio tardio), o qual se desenvolve por volta da terceira década de vida. Devido a reinfecção, o tracoma ocasiona cicatrizes na conjuntiva, podendo levar à formação de entrópio e triquíase, as quais podem resultar em alterações irreversíveis da córnea, causando cegueira (Cook, 2008).

O linfogranuloma venéreo caracteriza-se pelo aparecimento de uma lesão genital de curta duração (de três a cinco dias), que se apresenta como uma ferida ou como uma elevação da pele. Essa lesão é passageira, não sendo facilmente identificada pelos pacientes. Após a cura da lesão primária, que acontece geralmente entre duas a seis semanas, surge um inchaço doloroso dos linfonodos inguinais de uma ou ambas as virilhas, denominado bubão. Se a infecção não for tratada adequadamente, evolui para o rompimento espontâneo e formação de feridas que drenam pus (Mabey & Peeling, 2002; Sethi et al., 2009).

(36)

antígeno-específico com efeito protetor (Igietseme et al., 2002) e um baixo número de linfócitos T ou secreção reduzida de IFN-γ com dano tecidual induzido pela presença de C. trachomatis

(Debattista et al., 2002).

A Chlamydia pneumoniae é um patógeno do trato respiratório humano que causa doença respiratória aguda e contribui com 5 a 10% dos casos de pneumonia adquirida na comunidade, bronquite e sinusite (Kuo et al., 1995). Esta bactéria foi associada também com outras doenças como doença pulmonar obstrutiva crônica, asma, doença cardiovascular e aterosclerose (Kuo et al., 1995; Campbell et al., 1998; Grayston, 2000).

Vários estudos têm relacionado a infecção crônica por C. pneumoniae como um fator importante na patogênese de doença arterial coronariana, a principal causa de morbidade e mortalidade em humanos, além de outras síndromes ateroscleróticas (Georges

et al., 2003; Goyal et al., 2006; Kirbis et al., 2005; Rugonfalvi-Kiss et al., 2007; Wang, S.S. et al., 2007).

1.4 FATOR DE NECROSE TUMORAL (TNF)

O TNF-α e o TNF-β são citocinas pró-inflamatórias que foram obtidas em 1984 e associadas (in vitro e in vivo) com a destruição de células tumorais (Pennica et al.,

1984). A superfamília TNF consiste de 19 membros produzidos por monócitos, macrófagos, células dendríticas, linfócitos T auxiliares tipo 1 e outras células (Chaturvedi, 2006).

(37)

microrganismos, sendo responsável pela regulação da imunidade inata e mediando a inflamação aguda. O TNF estimula células endoteliais e macrófagos a secretar quimiocinas que acentuam a afinidade das integrinas leucocitárias por seus ligantes e induzem a quimiotaxia de leucócitos. O TNF também atua nos fagócitos mononucleares para estimular a secreção de interleucina 1, a qual age de forma semelhante ao TNF (Abbas

et al., 2008; Chaturvedi, 2006).

Os genes TNF-α e TNF-β estão localizados no cromossomo 6, na região

6p23 – q12, no complexo de histocompatibilidade principal (MHC) entre C2 da classe III e o HLA-B da classe I deste complexo. Pelo menos nove polimorfismos e cinco microsatélites no lócus TNF foram caracterizados e alguns deles foram fortemente associados com certos alelos HLA (Ruuls & Sedgwick, 1999).

O TNF-β possui homologia estrutural e cerca de 30% da sequência de

aminoácidos idêntica ao TNF-α, sendo, por isso, ambas as citocinas reconhecidas pelos

mesmos receptores celulares de TNF amplamente distribuídos, e como consequências possuem vários efeitos similares (Abbas et al., 2008).

Alguns estudos têm descrito polimorfismos de base única (points mutations) na região promotora do gene TNF-α, os quais podem ser importantes na sua expressão e

produção da proteína. Entre eles destacam-se quatro polimorfismos comuns: uma substituição G→A na posição −308 (Wilson et al., 1992), G→A na posição −238 (Kaluza

et al., 2000), C→T na posição −857 (D’Alfonso & Richiardi, 1994) e C→A na posição

(38)

mais estudados são os polimorfismos nas posições -238 (Kaluza et al., 2000) e -308 (Wilson et al., 1992), sendo nestes polimorfismos o alelo G o mais comum (Figura 7).

Figura 7 - Representação esquemática da localização de polimorfismos do gene TNF-α

(Fonte: Adaptado de Posch et al., 2003).

A presença do alelo TNF-308A foi associada com suscetibilidade a uma série de doenças humanas como a malária (McGuire et al., 1994; Sohail et al., 2007), a leishmaniose mucocutânea (Cabrera et al., 1995), a hanseníase (Roy et al., 1997), o choque séptico (Mira et al., 1999), a pancreatite aguda grave (Zhang et al., 2003) e a doença celíaca (Cataldo et al., 2005), todas associadas com altos níveis de TNF-α circulante no

sangue periférico.

O polimorfismo na posição -238 (alelo A) está associado com a diminuição da transcrição do TNF-α (Santos 2000; 2002). Em pacientes com artrite reumatóide (Kaijzel et al., 1998) e câncer (Jang et al., 2001) a presença do alelo mutante TNF-238A está relacionada à proteção, assim como com a suscetibilidade a doenças como as hepatites B e C crônicas (Hohler et al., 1998; Yee et al., 2000), esclerose múltipla (Huizinga et al., 1997) e psoríase em homens (Reich et al., 1999). Muitas dessas doenças podem apresentar

Promotor Éxon 1 Éxon 2 -163 G→A

-238 G→A -308 G →A -376 G →A

-574 G→A -857 C →T -863 C →A

Éxon 3 Éxon 4

TNF-β

(39)

uma base genética e o gene TNF é um candidato em potencial à predisposição genética dessas doenças.

Com relação ao gene TNF-β foram descritos nove polimorfismos de base

única. Na região promotora foram descritos três polimorfismos: nas posições -626 (G→A), -294 (C→T) e -293 (G→A). No éxon 1 foram localizados polimorfismos nas posições +11 (G→A) e +81 (C→A). Dois polimorfismos foram encontrados no primeiro íntron: na posição +252 (G→A) e +369 (G→C). No éxon 2 encontra-se um polimorfismo na posição +496 (T→C) e no éxon 3 localiza-se o polimorfismo na posição +724 (C→A) (Messer

et al., 1991; Abraham et al., 1991; Ferencik et al., 1992; Knight et al., 2003 – Figura 8).

Figura 8 - Representação esquemática da localização de polimorfismos do gene TNF-β

(Fonte: Adaptado de Posch et al., 2003).

O polimorfismo descrito na posição +252 no primeiro íntron, através de digestão utilizando-se a enzima de restrição NcoI, resulta na variação de um aminoácido na sequência do TNF-β na posição 26 que é uma asparagina para o TNFβ1 e uma treonina para o TNFβ2 (Messer et al., 1991). A análise de células mononucleares do sangue periférico de indivíduos homozigotos para TNFβ1, quando estimuladas com

Promotor Éxon 1 Éxon 2 -626 G→A

-294 C →T

-293 G →A +11 G→A +81 C →A

Éxon 3 Éxon 4

TNF-α

5’ 3’

+252 G→A +369 G →C

+496 T→C

(40)

fitohemaglutinina, demonstrou uma produção aumentada de TNF-β, enquanto indivíduos homozigotos para TNFβ2 mostraram uma produção maior de TNF-α e interleucina 1 (Messer et al., 1991; Pociot et al., 1991).

Cabrera et al., em 1995 observaram um risco relativo elevado em pacientes com leishmaniose mucocutânea portadores do alelo B2 para o polimorfismo do gene TNF-β

(+252) comparado ao grupo controle.

1.5 INTERFERON GAMA (IFN-γ)

O interferon-γ é um homodímero composto de subunidades de aproximadamente 25 KDa, sendo secretados pelos linfócitos T auxiliares (Th) e T citotóxico (Tc), bem como pelas células natural killer (NK) ativadas. Os interferons são conhecidos por sua ação antiviral e o IFN-γ não é exceção, apresentando ainda papéis imunológicos distintos (Abbas et al., 2008).

O gene IFN-γ humano está localizado no cromossomo 12, na região

12q24.1, possuindo quatro éxons e três íntrons (Cicarone et al., 1990).

A sequência do DNA do gene IFN-γ humano mostra a presença de uma

repetição CA, de comprimento variável, no primeiro íntron do gene. Pravica et al., 1999, investigaram a distribuição alélica deste gene e identificaram cinco alelos diferentes. Entre estes, o alelo 2 mostrou uma significante associação com o aumento da produção de IFN-γ

in vitro.

(41)

de ligação NF-kB que pode representar um papel importante na produção elevada de IFN-γ. A associação dos alelos com uma baixa (AA), média (AT) e alta (TT) produção de citocina foi demonstrada in vitro (Pravica et al., 2000).

Iwasaki et al., em 2001, sequenciaram o gene IFN-γ e descreveram seis

polimorfismos de base única, sendo quatro localizados no terceiro íntron: A→G na posição +2459, T→C na posição +2671, T→G na posição +3177 e G→A na posição +3273. Os polimorfismos A→T na posição +5199 e o A→G na posição +5272 foram localizados no éxon 4 (Figura 9).

Figura 9 - Representação esquemática da localização de polimorfismos do gene IFN-γ

(Fonte: Adaptado de Iwasaki et al., 2001).

Kamali-Sarvestani et al., em 2005, observaram uma frequência significantemente maior do genótipo TT (IFN-γ +874) em pacientes com câncer de mama do que no grupo controle, sugerindo a presença deste genótipo como um fator de risco para o desenvolvimento deste tipo de câncer em mulheres iranianas.

5’ 3’

+ 874 T→A

Éxon 1 Éxon 2

+2459 A→G +2671 T→C +3177 T→G

+3273 G→A +5199 A→T +5272 A→G

↓

Éxon 3 Éxon 4

(42)

Cataldo et al., em 2005, não encontraram associação significativa entre os genótipos do polimorfismo do IFN-γ comparando-se o grupo de pacientes com doença celíaca e grupo controle.

Vallinoto et al., em 2010, avaliando os níveis séricos e o polimorfismo do IFN-γ na posição +874, em pacientes com tuberculose, observaram associação estatisticamente significante entre a presença do alelo +874A e o genótipo +874AA em pacientes com tuberculose, sugerindo uma associação entre o polimorfismo do IFN-γ +874T/A e a suscetibilidade a infecção por M. tuberculosis na população estudada.

1.6 PROTEÍNA C REATIVA (PrtCR)

A proteína C reativa é um membro da família das pentraxinas, assim denominadas em razão de sua estrutura pentamérica. Essa estrutura consiste de cinco subunidades de 206 aminoácidos cada, ligadas de forma não covalente, organizadas simetricamente em torno de um poro central. A PrtCR foi originalmente descrita no plasma de pacientes com infecções agudas devido à sua capacidade de reagir com o polissacarídeo C do Pneumococcus (Gabay & Kushner, 1999).

(43)

O gene da PrtCR está localizado no cromossomo 1 na região 1q23.2 (Walsh

et al., 1996) e consiste de dois éxons separados por um íntron que contém uma sequência de repetições polimórficas GT. Vários polimorfismos neste gene como o -717A→G, localizado na região promotora, o +1444 C→T, localizado na região não traduzida e o +1059G→C, localizado no éxon 2 foram associados com doença coronariana (Figura 10) (Cao & Hegele, 2000; Brull et al., 2003).

Figura 10 - Representação esquemática da localização de polimorfismos do gene da PrtCR

(Fonte: Adaptado de Chen et al., 2005; Hage & Szalai, 2007).

Chen et al., em 2005, analisaram o polimorfismo da PrtCR na posição -717 e não encontraram correlação entre este polimorfismo e níveis séricos desta proteína, porém observaram que a frequência do alelo -717A foi significantemente maior em pacientes com doença coronariana do que no grupo controle.

Brull et al., em 2003, não encontraram associação estatisticamente significante para o polimorfismo da PrtCR (-717) comparando o grupo de pacientes com doença coronariana e o grupo controle.

5’ 3’

-717 A→G +1059 G→C +1444 C→T

↓ ↓ ↓

Éxon 1 Éxon 2

Promotor

(44)

1.7 ASSOCIAÇÕES ENTRE MARCADORES DA RESPOSTA INFLAMATÓRIA E AGENTES INFECCIOSOS

A patogênese da doença causada pelo vírus da dengue ainda não está completamente esclarecida. Vários estudos têm relatado associações entre elevados níveis de citocinas e diferentes manifestações clínicas (Hober, et al., 1993; Chaturvedi et al.,

2000; Braga et al., 2001; Leitmeyer et al., 2002). Foi demonstrado também que vários genes de citocinas contêm polimorfismos localizados nas regiões promotoras, que podem afetar a transcrição do gene, causando variações na produção da citocina e ser associados com o resultado da doença infecciosa (Reynard et al., 2000; Fernández-Mestre et al., 2004). O TNF-α e o IFN-γ estão entre as primeiras citocinas que aparecem em ambos soro e cultura de células mononucleares do sangue periférico humano de indivíduos infectados pelos vírus da dengue (Chaturvedi et al., 1999; Chaturvedi et al., 2000), sendo o TNF-α detectado a partir do primeiro dia em cultura de células, atingindo o pico máximo no segundo dia e declinando após o quinto dia. O IFN-γ foi detectado a partir do segundo dia em cultura de células, atingindo o pico máximo no terceiro dia, não sendo mais detectado após o sexto dia (Chaturvedi et al., 1999).

Um significante aumento do alelo TNF-308A, que geneticamente predispõe para a expressão de níveis elevados de TNF, foi observado em pacientes com quadros de febre hemorrágica pela dengue (Fernández-Mestre et al., 2004).

(45)

sérica de ambas as citocinas foi mais elevada em pacientes com a doença do que no grupo controle saudável.

Um estudo comparando níveis séricos de IL-6, TNF-α e IFN-γ, em crianças com menos de um ano de idade com e sem dengue, mostrou níveis de citocinas mais elevados em crianças com dengue, demonstrando resultados estatisticamente significantes, para IL-6, e IFN-γ, sendo os níveis destes marcadores mais elevados nos casos de febre clássica da dengue. No entanto, os níveis de TNF-α foram mais elevados em pacientes com febre hemorrágica da dengue. Os níveis de IL-6 e TNF-α foram maiores em pacientes com infecção secundária, enquanto que o nível de IFN-γ foi maior em pacientes com infecção primária (Restrepo et al., 2008).

Levy et al., em 2010, avaliando os níveis séricos de PrtCR em 36 pacientes com dengue clássica, 34 pacientes com febre hemorrágica e 10 indivíduos saudáveis (grupo controle), observaram níveis desta proteína aumentados em pacientes com febre hemorrágica comparados aos outros grupos, sendo associado ainda com a ocorrência de infecção secundária pelo vírus.

Nishimura et al., em 2000, investigaram a presença de polimorfismos dos genes das citocinas TNF-α e TNF-β em pacientes japoneses com PET/MAH, LLcTA,

(46)

pacientes com PET/MAH e portadores assintomáticos do HTLV, sendo o mesmo observado também entre pacientes com PET/MAH e o grupo controle.

Tsukasaki et al., em 2001, analisando a associação entre o polimorfismo do TNF-α (-857) e o desenvolvimento de leucemia/linfoma de células T do adulto em portadores do HTLV-1 observaram que o alelo TNF-α-857T foi mais frequente em pacientes com LLcTA do que em portadores assintomáticos.

Em estudo de associação entre a carga pró-viral do HTLV-1 e polimorfismos de citocinas como TNF-α e TNF-β, IL-6 e IL-10 não foi demonstrada correlação significante da presença destes marcadores tanto em pacientes com PET/MAH como em portadores assintomáticos do vírus (Nishimura et al., 2003). No entanto, Goon

et al., 2003, usando citometria de fluxo demonstraram frequências significantemente maiores de células T CD4+ HTLV-1-específicas positivas para TNF-α e IL-2 em pacientes com PET/MAH que em portadores assintomáticos do HTLV-1.

Santos et al., (2004), avaliaram o nível sérico médio de TNF-α em 17 pacientes com PET/MAH, 36 portadores assintomáticos do HTLV e 15 indivíduos saudáveis (controle negativo), sendo encontrados níveis mais elevados de TNF-α em pacientes com PET/MAH comparado com portadores assintomáticos do HTLV e grupo controle, no entanto, não houve associação significante quando comparados os três grupos.

(47)

No Brasil, Montanheiro et al., em 2009, analisaram a concentração de TNF-α em 68 portadores assintomáticos do HTLV, 44 pacientes com PET/MAH e 32 controles saudáveis e não encontraram níveis significantemente elevados desta citocina comparando ambos os grupos de pacientes com o grupo controle, no entanto, encontraram concentrações de IFN-γ significantemente mais elevadas em pacientes com PET/MAH que em portadores assintomáticos e controles saudáveis.

Talledo et al., em 2010, no Peru, avaliaram o polimorfismo do gene TNF-α

(-863) em 71 pacientes com PET/MAH e 94 portadores assintomáticos do HTLV e não encontraram nenhuma diferença significativa tanto na distribuição dos genótipos quanto dos alelos nos grupos envolvidos.

Conway et al., em 1997, estudando polimorfismos do TNF-α demonstraram uma frequência maior da presença do alelo TNF-308A em pacientes com tracoma do que no grupo controle, sendo esta associação estatisticamente significante. Para o alelo TNF-238A apesar da frequência elevada em pacientes não foi observada associação estatisticamente significante.

Mozzato-Chamay et al., em 2000, investigando o polimorfismo do gene TNF-α, na posição -376, em 238 pacientes com tracoma e 239 indivíduos do grupo controle não encontraram diferenças significantes tanto na frequência genotípica quanto alélica de ambos os grupos.

(48)

encontraram associação entre as frequências genotípicas e alélicas para o polimorfismo de TNF-α (-308) entre os grupos.

Natividad et al., em 2007, investigaram polimorfismos de citocinas em pacientes com tracoma e correlacionaram a presença do alelo TNF-308A com produção aumentada de TNF em culturas de linfócitos estimuladas com antígeno de corpos elementares de clamídia.

Atik et al., em 2008, avaliando o polimorfismo do TNF-α (-308) e do TNF-β

(+252), em 339 pacientes com tracoma e 232 pacientes do grupo controle encontraram associação estatisticamente significante entre a presença dos genótipos TNF-α-308AG e TNF-α-308AA e risco diminuído de tracoma, assim como associação entre a presença do alelo TNF-β+252B2 e a ocorrência de tracoma.

Ohman et al., em 2009, analisaram polimorfismos de citocinas em amostras de mulheres com quadro de infertilidade tubária associado à inflamação crônica por

(49)

1.8 OBJETIVOS 1.8.1 Objetivo Geral

Caracterizar marcadores da resposta inflamatória do hospedeiro humano e marcadores dos agentes virais e bacterianos que possam influenciar o curso da infecção, utilizando-se abordagens soroepidemiológica, imunológica e molecular.

1.8.2 Objetivos Específicos

(i) Descrever informações demográficas e sociais dos grupos envolvidos e das pessoas infectadas;

(ii) Descrever a concentração de marcadores da resposta inflamatória no sangue periférico (TNF-α, TNF-β, IFN-γ e PrtCR), em grupos populacionais distintos, acometidos de infecções pelo vírus da dengue, HTLV-1 e HTLV-2, C. trachomatis e C. pneumoniae. (iii) Descrever a presença e a frequência de polimorfismos nos genes TNF-α, TNF-β e

IFN-γ, nos diversos grupos populacionais envolvidos;

(iv) Associar a concentração dos marcadores no sangue periférico com a patogenicidade em grupos populacionais humanos infectados de acordo com suas manifestações clínicas tais como quadros de doença febril (grupos infectados e não infectados pelo VD), quadros de doença neurológica (PET/MAH) e infecção assintomática (HTLV-1 e HTLV-2) e quadros de doença coronariana (C. trachomatis e C. pneumoniae);

(50)

(51)

2 MATERIAL E MÉTODOS

2.1 GRUPOS POPULACIONAIS E COLETA DAS AMOSTRAS

Após a aceitação em participar do projeto (vide seção 2.6) foram coletadas amostras de sangue periférico em um sistema de colheita a vácuo (5mL), em tubos contendo EDTA como anticoagulante, de acordo com os grupos a seguir:

A) Grupo Dengue:

Foram coletadas 180 amostras de pacientes que apresentavam doença com manifestação de quadro febril no Ambulatório do Laboratório de Arbovirologia, do Instituto Evandro Chagas, no período de outubro de 2006 a abril de 2007. Destas, 80 amostras foram positivas e 100 amostras foram negativas para o vírus da dengue, em cultura de células.

B) Grupo HTLV:

Foram utilizadas 77 amostras de pacientes com suspeita clínica de infecção por HTLV oriundas do Núcleo de Medicina Tropical (NMT) tanto que faziam parte da soroteca do laboratório de virologia da UFPA, assim como as amostras coletadas no período de outubro de 2006 a abril de 2007. Destas 30 pertenciam à pacientes com infecção sintomática pelo HTLV (22 com sintomas neurológicos e 08 com sintomas dermatológicos) e 47 amostras eram de portadores assintomáticos deste vírus.

C) Grupo Doença Coronariana:

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2007. Após testes sorológicos, as amostras foram divididas em dois grupos: 58 amostras de pacientes com doença coronariana e sorologia positiva para Chlamydia e 31 amostras de pacientes com doença coronariana e sorologia negativa paraesta bactéria.

D) Grupo controle:

Foi composto por 99 amostras, sendo 37 de voluntários saudáveis que assinaram o TCLE e concordaram participar do projeto (no período de outubro de 2006 a abril de 2007) e 62 amostras de militares do sexo masculino pertencentes à soroteca do Laboratório de Virologia da Universidade Federal do Pará. Estas últimas foram utilizadas sob a permissão da chefia do laboratório, reconhecendo que não se poderia entrar em contato direto com estes indivíduos, assim como respeitando os TCLE assinados por estes, no momento de sua pesquisa original, autorizando a utilização do material biológico em outros projetos desde que devidamente aprovados por órgão competentes.

As amostras foram transportadas ao Laboratório de Virologia do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal do Pará, onde as mesmas foram centrifugadas e separadas em alíquotas de soro, plasma e sangue total que foram congeladas à -20ºC até o momento do uso.

2.2 DIAGNÓSTICO DA INFECÇÃO POR VÍRUS DA DENGUE, HTLV-1 e HTLV-2,

C. TRACHOMATIS E C. PNEUMONIAE

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monocamadas celulares inoculadas foram deixadas à temperatura ambiente (em torno de 28 ºC) e observadas diariamente em microscópio óptico invertido até o 10º dia após a infecção celular, na busca de efeito citopático (ECP).

As células infectadas, com ou sem a presença de ECP, foram coletadas e a multiplicação viral confirmada primeiramente pelo teste de imunofluorescência indireta (IFI), utilizando fluídos ascíticos hiperimunes de camundongo (FAI) polivalente para flavivírus (anti-flavivírus) e para alfavirus (anti-alfavirus), sendo este último utilizado como controle de especificidade. Os casos positivos foram posteriormente confirmados e discriminados de acordo com a espécie, por meio de uma IFI, utilizando anticorpos monoclonais específicos para DEN 1, DEN 2, DEN 3 e DEN 4.

As amostras foram triadas para a presença de anticorpos contra o HTLV-1 e HTLV-2 por um ensaio imunoenzimático do tipo ELISA (HTLV-1/HTLV-2 Ab-Capture ELISA Test System, ORTHO, Raritan, New Jersey), conforme instruções do fabricante. A sororreatividade foi confirmada por western blot (HTLV Blot 2.4, western blot assay MP Diagnostics ®, Geneva, Switzerland) ou por meio da reação em cadeia mediada pela polimerase amplificando o gene pX.

A detecção de anticorpos totais para o gênero Chlamydia foi realizada usando-se um ensaio imunoenzimático do tipo ELISA (Microwell ELISA Chlamydia IgG, Diagnostic Automation, Inc. Calabasas, USA), de acordo com as instruções do fabricante. A discriminação da reatividade de anticorpos para C. pneumoniae e os 15 sorotipos de

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2.3 DETERMINAÇÃO QUANTITATIVA DAS CONCENTRAÇÕES DE TNF-α, TNF-β, IFN-γ E PrtCR NO SANGUE PERIFÉRICO

A determinação quantitativa das concentrações de TNF-α, TNF-β e IFN-γ no plasma ou soro foi realizada utilizando um ensaio imunoenzimático (Human ELISA Ready-SET-Go, EBioscience, Inc. California, San Diego, USA). Este teste utiliza um anticorpo monoclonal específico para a detecção de cada um dos marcadores acima.

A curva padrão para TNF-α e IFN-γ foi feita utilizando cinco pontos de referência a partir de uma solução estoque (500 pg/mL) realizando-se uma diluição seriada para obtenção das seguintes concentrações: 500 pg/mL, 250 pg/mL, 125 pg/mL e 62,5 pg/mL. O diluente de teste 1X serviu como padrão zero (0 pg/mL). Para ambos o limite mínimo de detecção foi de 4 pg/mL.

Para a curva padrão para TNF-β foram utilizados cinco pontos de referência a partir de uma solução estoque (1.000 pg/mL) realizando-se uma diluição seriada para obtenção das seguintes concentrações: 1.000 pg/mL, 500 pg/mL, 250 pg/mL e 125 pg/mL. O diluente de teste 1X serviu como padrão zero (0 pg/mL). O limite mínimo de detecção foi de 8 pg/mL.

Para determinar quantitativamente a concentração de PrtCR nas amostras de plasma ou soro foi utilizado um ensaio imunoenzimático (Microwell ELISA C –Reactive Protein, Diagnostic Automation, Inc. Calabasas, USA). Este teste utiliza um anticorpo monoclonal específico para PrtCR.

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mg/L, 0,025 mg/L, 0,010 mg/L, 0,005 mg/L e 0 mg/L. O limite de detecção variou de 0,1 pg/mL a 10 mg/L. As amostras com concentrações de PrtCR superiores a 10 mg/L foram diluídas 1:1000 e testadas novamente.

Todos os testes foram executados de acordo com as instruções dos fabricantes.

2.4 ANÁLISE DOS POLIMORFISMOS NOS GENES DE CITOCINAS

2.4.1 Extração do DNA

O DNA foi extraído de leucócitos do sangue periférico pelo método do Fenol-Clorofórmio. O procedimento ocorreu de acordo com as seguintes etapas:

- LISE DE HEMÁCIAS (Solução A: Cloreto de Amônio [1.0M], EDTA [0.1M], H2O

destilada; Solução B: Bicarbonato de Amônio [1.0M], H2O destilada).

1. Em um tubo de 2 mL adicionar 300 μL de sangue e 900 μL de solução de lise

de hemácias.

2. Agitar por inversão durante 20 minutos.

3. Centrifugar (14.000 rpm) por 3 minutos.

4. Descartar o sobrenadante e acrescentar 900 μL da solução de lise de hemácias

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5. Agitar por inversão durante 20 minutos.

7. Descartar o sobrenadante.

- LISE DE LEUCÓCITOS (Tris-HCl [100mM], EDTA [20mM], NaCl [200mM], SDS 0,5 %, H2O destilada).

1. Acrescentar ao precipitado 500 μL de solução de lise de leucócitos.

2. Agitar no vortex até dissolver o precipitado.

3. Incubar em banho maria (55ºC) por 30 minutos.

- PRECIPITAÇÃO DE PROTEÍNAS (Acetato de Amônio [7,5M], H2O destilada).

1. Acrescentar 200 μL de solução de precipitação de proteínas.

2. Agitar brevemente no vortex.

3. Levar ao banho maria (55ºC) por 30 minutos.

5. Transferir o sobrenadante para um tubo de 2 mL limpo (descartar o tubo com o precipitado de proteínas).

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7. Agitar por inversão por 10 minutos.

9. Transferir o sobrenadante para um tubo de 2 mL limpo.

10. Acrescentar ao sobrenadante 1,5 mL de Isopropanol (2-propanol).

11. Visualizar o pellet de DNA. (Verificar conforme a quantidade de DNA formado a quantidade de H2O para hidratá-lo).

13. Desprezar o sobrenadante.

14. Adicionar 200 μL de Etanol a 70% lavando a parede do tubo.

15. Desprezar o etanol e deixar secando até evaporar completamente o álcool.

16. Adicionar H2O para hidratá-lo.

2.4.2 Genotipagem

2.4.2.1 Polimorfismo do TNF-α

O polimorfismo -308G→A na região promotora do gene TNF-α foi

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análise com enzimas de restrição, RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism). As amplificações foram realizadas no equipamento termociclador Peltier Thermal Cycler

(BIOCYCLER).

A reação foi realizada em um volume final de 25μL, contendo 50 ng de DNA total extraído, 0,2 μM de cada dNTP, 05 pmol/μL de cada iniciador, MgCl2 1,5 μM,

KCl 50 mM, Tris-HCl pH 8,3 10 mM e 1,25 U de Taq DNA polimerase. Os iniciadores empregados nesta reação foram: TNF-FW: 5’-AGG CAA TAG GTT TTG AGG GCC AT-3’ e TNF-R: 5’-TCC TCC CTG CTC CGA TTC CG-3’, os quais amplificaram um segmento de 107 pb (Allen et al., 2000).

A reação de amplificação foi realizada nas seguintes condições: desnaturação inicial a 94ºC por 2 minutos, 35 ciclos de 1 minuto à 94ºC (desnaturação), 1 minuto à 58ºC (hibridização), 1 minuto à 72ºC (extensão) e uma extensão final de 5 minutos à 72ºC.

O produto da amplificação foi digerido pela enzima de restrição NcoI (Invitrogen, Brasil) a 37°C por 5 horas, em uma reação contendo 7μL do produto

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Os produtos das amplificações e da digestão enzimática foram visualizados após eletroforese (100 V/45 minutos) em gel de agarose a 4%, em tampão TAE 1x (TAE 40x estoque – TrisBase 1,6 M, Acetato de Na 0,8 M e EDTA-Na2 40 mM/1000 mL água

deionizada), contendo 5 μL de brometo de etídio (10mg/mL), mediante a utilização de transiluminador com fonte de luz ultra-violeta.

2.4.2.2 Polimorfismo do TNF-β

O polimorfismo do TNF-β na posição +252, no primeiro íntron, foi investigado através da PCR e de digestão enzimática.

A reação foi realizada em um volume final de 50 μL, contendo 50 ng de DNA total extraído, 0,2 μM de cada dNTP, 10 pmol/μL de cada iniciador, MgCl2 1,5 μM,

KCl 50 mM, Tris-HCl pH 8,3 10 mM e 1,0 U de Taq DNA polimerase. O par de iniciadores empregado nesta reação foi: TNF-β F: 5’-CCG TGC TTC GTG GTT TGG ACT-3’ e TNF-β R: 5’-AGA GGG GTG GAT GCT TGG GTT C-3’, os quais amplificaram um segmento de 782 pb (Majetschak et al., 2002).

A reação de amplificação foi realizada nas seguintes condições: desnaturação inicial a 94ºC por 5 minutos, 37 ciclos de 1 minuto à 94ºC, 1 minuto à 55ºC, 1 minuto à 72ºC e uma extensão final de 10 minutos à 72ºC.

O produto amplificado foi submetido à digestão com a enzima de restrição

NcoI em um volume total de 20 μL, contendo 15 μL do produto amplificado, 0,1 μL de NcoI (uma unidade), 2 μL de tampão (B3*) e 2,9 μL de água estéril, o qual foi incubado a

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A enzima NcoI pode clivar o produto da digestão em três fragmentos de 782 pb, 586 pb e 196 pb (heterozigose G/A), em dois fragmentos de 586 pb e 196 pb (homozigose para o alelo G), ou não clivar o produto (homozigose para o alelo A) (Tabela 1).

Os produtos das amplificações e das digestões enzimáticas foram visualizados após eletroforese (100 V/45 minutos) em gel de agarose a 1,5%, em tampão

TAE 1x (TAE 40x estoque – TrisBase 1,6 M, Acetato de Na 0,8 M e EDTA-Na2

40 mM/1000 mL água deionizada), contendo 5 μL de brometo de etídio (10mg/mL), mediante a utilização de transiluminador com fonte de luz ultra-violeta.

2.4.2.3 Polimorfismo do IFN-γ

O polimorfismo do IFN-γ na posição +874, no primeiro íntron, foi investigado pela PCR, utilizando iniciadores alelo específico (ASO-PCR).

A reação foi realizada um volume final de 30 μL, contendo 50 ng de DNA total extraído, 0,2 μM de cada dNTP, 05 pmol/μL de cada iniciador, MgCl2 2,0 mM,