INTERAÇÁO DE FUNGOS ISOLADOS DA RIZOSFERA DA CANA-DE-AÇUCAR (Saccharum spp.) COM Metarhizium anisopliae (METSCH.)
SOROKIN E SOBREVIVÊNCIA DESTE ORGANISMO NO SOLO*
NORMA SUELY SOBRAL DA SILVEIRA Bibloga Bolsista do CNPQ.
MARIA MENEZES
Prof. Adjunto do Depto. de Agronomia da UFRPE.
A estabilidade de fungos entomopatogénicos no solo está relacionada com a capacidade de compe- üçáo desses o r g a n ' m com a micoflora natural do ambiente. Foram realizadas analises qualitativas e quantitativas da mimflora associada a rizosíera da cana-de-açúcar corno tamb6m efetuados en- saios "in vitro" para observação do comportamento de Metarhizium anisopliae em cultura pareada com as espécies Aspergillus tereus. Penicillium decumbens, Paecilomyces infla@, Trichodenna a* reoviride, T. harzanurn. i. pseudkoingii. i. viride. Cunninghamella elegans, Fusarium monilifome e Myrothecium sbiatrisponm,. O crescimento micelial de M. anisopliae foi significatiiamente inibido por P. decumbens. em relação aos demais fungos testados. As avaliaçdes dos percentuais de gemi- naçáo dos espwos de M. anisopiiae. quando aescido em cultura com 1. harzianum e 1. viride, indica- ram uma redução em tomo de 97.= e 94.3% respectivamente. A sobreviv4ncia de M. anisopliae em solo de cana-de-açúcar inoculado ailifiaalmente foi de no máximo 266 dias. levando-se em con- sidera@~ a a n á l i i de correlação (r = 0.91) entre o ndmero de colbnias recuperadas e o período de tempo das a v a l i i
A persistencia de fungos entomopatogenicos em condiçóes de campo e a capacidade de causarem epizootias está relacionada com a manutenção desses Parte da DketWçh apesentlide peb primeiro auta. ao Curso de Mesirado em Criptogamas da Unhrersklade Federal de -P
Cad dmega Univ. Fed Riral PE. Sêr. Agmn. Redfe. n 4. p. 129-138.1992
INTERAÇÃO DE FUNGOS ISOLADOS DA RIZOSFERA DA CANA-DE-AÇÚCAR (Sacchamm spp.) COM Metarhizium anisopliae (METSCH.)
SOROKIN E SOBREVIVÊNCIA DESTE ORGANISMO NO SOLO*
NORMA SUELY SOBRAL DA SILVEIRA Bióloga. Bolsista do CNPQ.
MARIA MENEZES
Prof. Adjunto do Depto. de Agronomia da UFRPE.
A eotabilidaoe de fungos entomopatogênicos no solo está relacionada com a capacidade de compe- lição desses organismos com a miooflora natural do ambiente. F oram realizadas análises qualitativas e quantitativas da micoflora associada a rízosfera da cana-de-açúcar como também efetuados en- saios "in vitro" para observação do comportamento de Metarnizium anisopliae em cultura pareada com as espécies Aspergillus tereus, Penicillium decumbens, PaecVoajyoes 'nílatus, Trichodema au- reoviride, 7 harzianum, T. pseudòkoningii, T. vinde, Cunninghamella elegans, Fubarium monililome e Myrothet iuti striatnsponjrn. O crescimento micellal de M. anisopliae foi significativamente inibido por P. decumbens, em relação aos demais fungos testados. As avaliações dos percentuais de germi- nação dos esporos de M. anisopliae, quando crescido em cultura com T. harzianum e T. vinde, indica- ram uma redução em tomo de 97,66% e 94,39%, respectivamente. A sobrevivência de M. amsopnae em solo de cana-de-açúcar inoculado arOfictalmente foi de no máximo 266 dias, levando-se em con- sideração a análise de correlação (r = 0,91) entre o número de colônias recuperadas e o período de tempo das avaliações.
INTRODUÇÃO
A persistência de fungos entomopatogênicos em condições de campo e a capacidade de causarem epizootias está relacionada com a manutenção desses Parte da Dissertação apresentada pelo primeiro autor ao Curso de Mestrado em Criptogamas da Universidade Federal de Pernambuco.
organismos no solo. Os d i t o s abióticos do ambiente tem sido destacado como os mais importantes no crescimento e sobrevivência desses agentes de controle no solo (Tanada, 1973; Roberts e Campbell, 19771, enqcanto a influência de ou- tros microorgenismos presentes nesse ecossistema tr m permanecido pouco es- tudada (Fargues et al., 1983).
No solo os microorganismos que sofrem influência do sistema radicular das plantas podem estimular, inibir ou suprimir o crescimento de patógenos (Katznelson e Rouatt, 1957). Investigações sobre o papel específico de microor- ganismos do solo em relação a fungos entomopatog6nicos tem evidenciado que os propagulos desses organismos são afetados por fatores biológicos e princi- palmente pela atividade de bactbrias antagonicas (Old e Robertson, 1970; Far- gues et al., 1983) e actinomicetos (Clerk, 1969; Roberts e Campbell, 1977).
O fungo Metharzium anisopfiae (Metsch.) Sorokin 6 atualmente u m dos or- ganismos mais utilizados no controle de pragas. Apesar desta intensa utilização, pouco tem sido realizado no que diz respeito ao seu potencial no solo e as inte- rações envolvidas entre este fungo e a micoflora do solo. No presente trabalho procurou-se avaliar a micoflora associada B rizosfera da cana-de-açúcar, investi- gar sobre sua interaçáo com M. anisopliae e sua sobrevivência no solo.
Para as analises qualitativa e quantitativa da micoflora, foram coletadas amostras de raizes de cana-de-açúcar contendo solo aderente, em três diferen- tes locais. Os fungos foram isolados utilizando-se o mbtodo de Johnson e Curl (1972), modificado pelo seguinte procedimento: dez subamostras de 5 g de solo foram adicionadas a 150 m l de agua destilada esterilizada e mantidas sob agi- tação manual durante 5 minutos. Após este tratamento, as subamostras foram reunidas, homogeneizadas e desta suspensáo foram preparadas as diluições 10-3 e 10-4. De cada diluição foi retirado 1 m l de suspensão e distribuido sobre os seguintes meios de cultura: Batata Dextrose Agar
-
BDA (Riker e Riker, 19361, Ágar Nutritivo (Manual...
1953), Meio de Richard, modificado (Martison e Baker, 1962), Meio de ~ i l h o - Á g a r (Riker e Riker, 1936) e Meio de Martin (Martin, 1950).As avaliaçúes foram efetuados cinco dias após a incubaçáo, atrav4s da contagem do número de colonias fúngicas presentes em cada amostra, proce- dendo-se a tranferbncia das mesmas para tubos de ensaio com BDA, para anhli- 'se qualitativa posterior.
Efeito Sobre o Crescimento Micelial
Os fungosisolados com maior frequência da rizosfera da cana-de-açúcar e
Cad. &nega UW. Fed R m l PE. Sér. Agon.. R&, n. 4. p. 129-138.1992
o
organismos no solo. Os «feitos abióticos do ambiente tem sido destacado como os mais importantes no crescimento e sobrevivência desses agentes de controle no solo (Tanada, 1973; Roberts e Campbell, 1977), enquanto a influência de ou- tros microorganismos presentes nesse ecossistema um permanecido pouco es- tudada (Fargues et al., 1983).
No solo os microorganismos que sofrem influência do sistema radicular das plantas podem estimular, inibir ou suprimir o crescimento de patógenos (Katznelson e Rouatt, 1957). Investigações sobre o papel específico de microor- ganismos do solo em relação a fungos entomopatogênicos tem evidenciado que os propágulos desses organismos são afetados por fatores biológicos e princi- palmente pela atividade de bactérias antagônicas (Old e Robertson, 1970; Far- gues et al., 1983) e actinomicetos (Clerk, 1969; Roberts e Campbell, 1977).
O fungo Methamum anisopliae (Metsch.) Sorokin é atualmente um dos or- ganismos mais utilizados no controle de pragas. Apesar desta intensa utilização, pouco tem sido realizado no que diz respeito ao seu potencial no solo e as inte- rações envolvidas entre este fungo e a micoflora do solo. No presente trabalho procurou-se avaliar a micoflora associada à rizosfera da cana-de-açúcar, investi- gar sobre sua interação com M. anisopliae e sua sobrevivência no solo.
MATERIAL E MÉTODO
Para as análises qualitativa e quamitati-a da micoflora, foram coletadas amostras de raízes de cana-de-açúcar contendo solo aderente, em três diferen- tes locais. Os fungos foram isolados utilizando-se o método de Johnson e Curl (1972), modificado pelo seguinte procedimento: dez subamostras de 5 g de solo foram adicionadas a 150 ml de água destilada esterilizada e mantidas sob agi- tação manual durante 5 minutos. Após este tratamento, as subamostras foram reunidas, homogeneizadas e desta suspensão foram preparadas as diluições 10-3 e 10-4. De cada diluição foi retirado 1 ml de suspensão e distribuído sobre os seguintes meios de cultura: Batata Dextrose Ágar - BDA (Riker e Riker, 1936), Ágar Nutritivo (Manual... 1953), Meio de Richard, modificado (Martison e Baker, 1962), Meio de Milho-Ágar (Riker e Riker, 1936) e Meio de Martin (Martin, 1950).
As avaliações foram efetuadas cinco dias após a incubação, através da contagem do número de colônias fúngicas presentes em cada amostra, proce- dendo-se a tranferência das mesmas para tubos de ensaio com BDA, para análi-
se qualitativa posterior.
Efeito Sobre o Crescimento Micelial
Os fungos isolados com maior freqüência da rizosfera da cana-de-açúcar e
algumas espdcies consideradas como antag6nicas a outros organismos, foram testadas e m ensaios "in vitro" para observação d o comportamento e m relação a M. anisopliae, isolado PL43. Foram testados as seguintes especies: Trichoderrna viride,Trichoderma aureoviride, Trichoderma harzianum, Trichoderrna pseudokoningii, Cunninghamella elegans, Fusariurn moniliforme, Myrotheciurn striatrisporurn, Paeci- lornyces inflatus, Aspergillus terreus e Penicillium decurnbens.
Os ensaios foram realizados utilizando-se a metodologia de pareamento de microorganismos descrita por Dennis e Wbster (1971 ), sendo os organismos transferidos para as placas e m diferentes intervalos de tempo, de acordo com a velocidade de crescimento.
As avaliaçóes foram realizadas após 30 dias de incubação de M. anisopliae, atravhs da medição d o crescimento linear das colónias, observando-se tambdm a formação de zona de demarcação e o aspecto das mesmas.
Efeito na Germinação de Esporos
Foi empregado o método de culturas pareadas e a germinação de esporos de M. anisopliae foi avaliada ap6s quinze dias da estabilização d o crescimento das colbnias, através da remoção de dois discos de Agar de 5 m m de diâmetro, con- tendo esporos de M. anisopliae, próximo B linha de demarcação das col6nias. e transferbncia para tubos de ensaio contendo 10 m l de meio liquido Batata-Dex- trose.
Analise da germinação dos esporos f o i realizada após 16 horas de incu- baçao, atravds da contagem do número de esporos germinados nos diferentes tratamentos, sendo os resultados expressos e m termos percentuais d o número de esporos germinados em relação ao número total de esporos e m cada amos- tra.
Sobrevivência de M. anisopliae no Solo
Para observação da persistência e m solo de cultivo de cana-de-açúcar, foi realizada inoculação com uma suspensão na concentração de 6,O x 108 espo- roslrnl, e m u m dos locais onde anteriormente haviam sido retiradas as amostras para estudo da micoflora da rizosfera.
O reisolamento f o i efetuado inicialmente e m intervalos de cinco a dez dias e, posteriormente, e m intervalos maiores, durante 417 dias. As amostras, e m número de cinco para cada Rpoca de avaliação, foram retiradas B profundidade de 2 cm, seguindo-se a metodologia de coleta descrita por Tebeest (1982).
--
Cad ünega Unhr. Fed Rual PE. Sér. Agnm., R-, n 4, p. 129-138.1992
algumas espécies consideradas como antagônicas a outros organismos, foram testadas em ensaios "in vitro" para ooservaçâo do comportamento em relação a M. anisopliae, isolado PL43. Foram testados as seguintes espécies: Tríchoderma vinde,Trichoderma aureoviríde, Tríchoderma harzianum, Tríchoderma pseudokoningii, Cunninghamella elegans, Fusarium moniliforme, Myrothecium striatrisporum, Paeci- lomyces inflatus, Aspergillus terreus e Penicilhum decumbens.
Os ensaios foram realizados utilizando-se a metodologia de pareamento de microorganismos descrita por Dennis e Wbster (1971), sendo os organismos transferidos para as placas em diferentes intervalos de tempo, de acordo com a velocidade de crescimento.
As avaliações foram realizadas após 30 dias de incubação de M. anisopliae, através da medição do crescimento linear das colônias, observando-se também a formação de zona de demarcação e o aspecto das mesmas.
Efeito na Germinação de Esporos
Foi empregado o método de culturas pareadas e a germinação de esporos de M. anisopliae foi avaliada após quinze dias da estabilização do crescimento das colônias, através da remoção de dois discos de ágar de 5 mm de diâmetro, con- tendo esporos de M. anisopliae, próximo à linha de demarcação das colônias, e transferência para tubos de ensaio contendo 10 ml de meio líquido Batata-Dex- trose.
Análise da germinação dos esporos foi realizada após 16 horas de incu- bação, através da contagem do número de esporos germinados nos diferentes tratamentos, sendo os resultados expressos em termos percentuais do número de esporos germinados em relação ao número total de esporos em cada amos- tra.
Sobrevivência de M. anisopliae no Solo
Para observação da persistência em solo de cultivo de cana-de-açúcar, foi realizada inoculação com uma suspensão na concentração de 6,0 x 108 espo- ros/ml, em um dos locais onde anteriormente haviam sido retiradas as amostras para estudo da micoflora da rizosfera.
O reisolamento foi efetuado inicialmente em intervalos de cinco a dez dias e, posteriormente, em intervalos maiores, durante 417 dias. As amostras, em número de cinco para cada época de avaliação, foram retiradas à profundidade de 2 cm, seguindo-se a metodologia de coleta descrita por Tebeest (1982).
Para o plaqueamento foi utilizada a mesma metodologia descrita ante- riormente para o levantamento de fungos da rizosfera. No reiso:amento foi utili- zado meio seletivo de Pereira, Dhingra e Chaves (1979), modificado e constitufdo de um meio basal (Bacto-Agar Difco, 20 g; Peptona, 6 g; Glucose, 10 g; K2HP04, 0 6 g; MgS04.7H20, 10 g; H20, 1000 ml), acrescido de Cloranfenicol, 200 mg; Streptomicina, 100 mg e Eritromicina, 80 mg.
As placas foram incubadas por sete dias em condiçbes de laboratbrio, aproximadamente 250C, e apbs este período procedeu-se a contagem da quan- tidade de coldnias de M. anisoplae, sendo estabelecida uma média do número de colonias por placa, em cada repetição.
Os fungos isolados com maior frequência, coincidem de um modo geral, com os obtidos do solo e rizosfera da cana-de-açúcar por Koike (19691, Robison (1970) e Santos, Cavalcanti e Fernandes (1989). Entre as especies isoladas, As- pergillus tetreus, Trichodem harzianum, Penicillium fellutanum, Penicillium decurn- bens, Myrothecium striatrispomm, Penicillium vinaceum, Penicillium vinaceum, Tri- choderma aureoviride e Paecilomyces infJatus foram as de maior ocorrência em ordem decrescente, sendo que esses fungos ocuparam 5035% do total de isola- dos.
Os gêneros Aspergilus e Penicillium, muito frequentes nesse estudo, foram citados por Domsch, Gams e Anderson (1980) como de ocorrência comum em solos de clima tropical e rizosfera de plantas, produzindo frequentemente anti- bióticos que os capacitam a predominarem no ambiente do solo em relação aos demais fungos.
A alta frequência observada do gênero Trichoderma, pode ser atribuida a provável associação desse fungo com raizes, jB relatado por Salt (1979). como tambbm a sua capacidade celulolltica, competitiva e seu efeito antagonico em re- lação a outros habitantes de raizes, conforme citado por Baker e Cook (1974) e Christensen (1989). As espécies detectadas neste estudo sáo conhecidas pela sua ação antaghnica, principalmente a fitopatógenos habitantes do solo (Chet, 1987; Campbell, 1989; Hornby, 1980). As Figuras 1 e 2 apresentam de forma compara- tiva o efeito de alguns fungos isolados da rizosfera no crescimento micelial e germinação de esporos de M. anisopliae.
Para o plaqueamento foi utilizada a mesma metodologia descrita ante- riormente para o levantamento de fungos da rizosfera. No reisolamento foi utili- zado meio seletivo de Pereira, Dhingra e Chaves (1979), modificado e constituído de um meio basal (Bacto-Agar Difco, 20 g; Peptona, 6 g; Glucose, 10 g; K2HPO4, 0,5 g; MgS04.7H20, 10 g; H2O, 1000 ml), acrescido de Cloranfenicol, 200 mg; Streptomicina, 100 mg e Eritromicina, 80 mg.
As placas foram incubadas por sete dias em condições de laboratório, aproximadamente 250C, e após este período procedeu-se a contagem da quan- tidade de colônias de M. anisoplae, sendo estabelecida uma média do número de colônias por placa, em cada repetição.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os fungos isolados com maior freqüência, coincidem de um modo geral, com os obtidos do solo e rizosfera da cana-de-açúcar por Koike (1969), Robison (1970) e Santos, Cavalcanti e Fernandes (1989). Entre as espécies isoladas, As- pergillus terreus, Tríchoderma harzianum. Penicillium fellutanum, Penicillium decum- bens, Myrothecium striatrisporum, Penicillium vinaceum, Penicillium vinaceum, Tri- choderma aureoviride e Paecilomyces inflatus foram as de maior ocorrência em ordem decrescente, sendo que esses fungos ocuparam 50,95% do total de isola- dos.
Os gêneros Aspergillus e Penicillium, muito freqüentes nesse estudo, foram citados por Domsch, Gams e Anderson (1980) como de ocorrência comum em solos de clima tropical e rizosfera de plantas, produzindo freqüentemente anti- bióticos que os capacitam a predominarem no ambiente do solo em relação aos demais fungos.
A alta freqüência observada do gênero Trichoderma, pode ser atribuída a provável associação desse fungo com raízes, já relatado por Salt (1979), como também a sua capacidade celulolítica, competitiva e seu efeito antagônico em re- lação a outros habitantes de raízes, conforme citado por Baker e Cook (1974) e Christensen (1989). As espécies detectadas neste estudo são conhecidas pela sua ação antagônica, principalmente a fitopatógenos habitantes do solo (Chet, 1987; Campbell, 1989; Hornby, 1980). As Figuras 1 e2 apresentam deforma compara- tiva o efeito de alguns fungos isolados da rizosfera no crescimento micelial e germinação de esporos de M. anisopliae.
Pa Pi At Tp Th Ta TV Fm Ca Ms Ma Espécies
FIGURA 1
-
C m c h e m mbdial âe M. a n w i e e em cuiium pareada can alg~II8 tu- da rlzos- fera da cana-de-açbcar (Pa = Penicillium decumbens, Pi = Paeciclomyces inflalvs, At = Aspegillus terreus, Tp = Trichodenna pseudokoningii, Th = Trichodenna har- zianum, T a = Trichodem aureoviride, TV = Trichoderma viride, Fm = Fusarium monilifom, Ca = Cunninghamella elegans, Ms = Myrothecium striatrisporium,Ma = Metarhizium anisopliae)
A espbcie P. decumbens apresentou maior efeito na inibição do crescimen- to de M. anisopliae entre as testadas, sem no entanto prejudicar a germinação de wporos desse fungo. Estes resultados provavelmente indicam que substâncias produzidas pelo fungo tenham capacidade para inibir somente o crescimento micelial.
FIGURA2
-
O e m i i n a ç 6 o â e ~ d e U a n ~ ~ c m i c u l h n a s ~ c u n a ~ fungos da rizosfera da cana-de-açhr (TV = Trichudem viride, Th = Trichodermaharzianum. Pi = Paecilomyces inflaius. Ce = Cunninghamella elegans, Tp = Tri- chodem pseucbkoningii, Pd = PeniciIIium decurnbens, At = Aspegillus terreus,
Ta = Trichodem aureoviride, Ms = Myrothecium striairispom. Fm = Fusariurn miniliforme, Ma = Metarhizium anisopliae)
-- - -
-Cad. ômega Univ. Fed. Rurel PE. Sér. A-, R&, n. 4, p. 129-138,1992
i 20 4 ■
Pa Pi At Tp Th Ta Tv Fm Ca Ms Ma
rspécles
FIGURA 1 - Cresck. «nlo mloeflal de M. anlsopllae m cultura pareada com alguns fungos da rizos- iera da cana-de-açúcar (Pa = Peninllium decumbens, PI = Paeciclomyces inflaüis At = Aspergillus ter réus, Tp = Trichcderma pseudoKomrgii, Th = Trichoderma har- zianum, Ta = Trichoderma aureoviríde, Tv = Trichoderma viride, Fm = tusanum ■nonili forme. Ca = Cunninghamella elegans. Ms = Myrotheeiom striatrisporium, Ma = Meterhizium anisopliae)
A espécie P. decumbens apresentou maior efeito na inibição do crescimen- to de M. anisopliae entre as testadas, sem no entanto prejudicar a germinação de esporos desse fungo. Estes resultados provavelmente indicam que substâncias produzidas pelo fungo tenham capacidade para inibir somente o crescimento micelial.
Tv Th Pi Ce Tp Pd At Ta Ms Fm Jla Espãdes
-IGURA 2 - Germinação de esporos de M. antoopHaa produzidas em culturas pareadas com alguns fungos da rizosfera da cana-de-açúcar (TV = TrichodTna viride. Th = Trichoderma harzianum. Pi = Paec ilomyces inflatus, Co = Cunninghamella elegans, Tp = Tri- choderma pseudokoningii, Pd = Penicillium decumbens, At = Aspergillus terreus, Ta = Tnchodemna aureoviríde, Ms = Myrothecium stnatnsporum, Fm = Fusartum miniiiforme, Ma = Metarhizium anisopliae)
As espécies i.vinde e i. harzianum foram capazes de recobrir gradativa- mente a col6nia de M. anisoplae, sem formar zona de demarcação, porém, cau- saram redução drástica na germinação dos esporos deste fungo, com inibições de 97,66 e 9439%. respectivamente.
A atividade enzimitica das espécies viride e T. harzianum sobre compo- nentes da parede fúngica, como quitina, glucano e polimeros de xilano, foi des- crita por Toyama e Ogama (1968), Nomura, Yasui e Kiyooka (1968) e Chet et al. (1979) e, a ação complementar desses fatores, segundo Dennis e Webster (1971
1,
garantem o sucesso como antagonistas.Segundo Baker e Cook (1974). no controle biolbgico de microorganisrnos, o efeito é medido pela redução do crescimento, por inibição à distância, parasi- tismo e competição, sem ocorrer necessariamente a eliminação total do micro- organismo. Com exceção de T. viride e T. harzianum, em geral os fungos testados
não prejudicaram a germinação de M. anisopliae. Este fato reveste-se da maior importância porque indica que este organismo possui características que lhe conferem capacidade de sobrevivência mesmo na presença de fungos que foram detectados com alta frequência no ambiente do solo.
A Figura 3 apresenta as médias do número de col6nias de M. anisopliae reisoladas periodicamente do solo. De um modo geral, ocorreu um aumento da população nos 31 primeiros dias após a inoculação do solo. A partir deste perío- do, o número decresceu gradativamente até aos 88 dias, sendo observado um discreto aumento na quantidade de col6nias reisoladas aos 94 e 104 dias, embo- ra tenha decrescido nas avaliações seguintes.
A anilise de regressão quadratica dos dados obtidos demonstrou uma correlação positiva entre o nómero de col6nias reisoladas do solo e o periodo de tempo estudado, sendo o coeficiente de correlação r = 0,91, o que representa o estabelecimento de 266 dias como o tempo miximo para a recuperação de M. anisopliae do solo. Estas constatações assemelham-se aos dados obtidos por Pe-
reira, Dhingra e Chaves (19791, que relataram o reisolamento de col6nias de M. anisopliae do solo ate 180 dias após a aplicação no referido ambiente. Oliveira (1979), Ling e Donaldson (1981). Farques e Roberts (1985) e Alves (1986) reco- nheceram que alguns fungos entomopatogênicos possuem capacidade de se de- senvolverem em restos de cultura e no solo, entretanto, Walstad, Anderson e Stambaughm (1970) consideram improvável o crescimento de M. anisopliae no solo como saprófita, uma vez que este fungo tem desenvolvimento restrito em insetos.
Cad. bmega Unhr. Fed Rural P E Sr. A-, Rdfe, n. 4, p. 129-138,1992
As espécies T. vinde e 7. narzianum foram capazes de recobrir gradativa- mente a colônia de M. anisopliae, sem formar zona de demarcação, porém, cau- saram redução drástica na germinação dos esporos deste fungo, com inibições de 97,66 e 94,39%, respectivamente.
A atividade enzimática das espécies T. vinde e T. harzianum sobre compo- nentes da parede fúngica, como quitina, glucano e polímeros de xilano, foi des- crita por Toyama e Ogama (1968), Nomura, Yasui e Kiyooka (1968) e Chet et ai. (1979) e, a ação complementar desses fatores, segundo Dennis e Webster (1971), garantem o sucesso como antagonistas.
Segundo Baker e Cook (1974), no controle biológico de microorganismos, o efeito é medido pela redução do crescimento, por inibição à distância, parasi- tismo e competição, sem ocorrer lecessariamente a eliminação total do micro- organismo. Com exceção de T. vinde e T. harzianum, em gerai os fungos testados não prejudicaram a germinação de M. anisopliae. Este fato reveste-se da maior importância porque indica que este organismo possui características que lhe conferem capacidade de sobrevivência mesmo na presença de fungos que foram detectados com alta freqüência no ambiente do solo.
A Figura 3 apresenta as médias do número de colônias de M. anisopliae reisoladas periodicamente do solo. De um modo geral, ocorreu um aumento da população nos 31 primeiros dias após a moculação do solo. A partir deste perío- do, o número decresceu gradativamente até aos 88 dias, sendo observado um discreto aumento na quantidade de colônias reisoladas aos94 e 104 dias, embo- ra tenha decrescido nas avaliações seguintes.
A análise de regressão quadrática dos dados obtidos demonstrou uma correiação positiva entre o número de colônias reisoladas do solo e o período de tempo estudado, sendo o coeficiente oe correhção r = 0,91, o que representa o estabelecimento de 266 dias como o tempo máximo para a recuperação de M. anisopliae do solo. Estas constatações assemelham-se aos dados obtidos por Pe- reira, Dhingra e Chaves (1979), que relataram o reisolamento de colônias de M. anisopliae do solo até 180 dias após a aplicação no referido ambiente. Oliveira (1979), Ling e Donaldson (1981), Parques e Roberts (1985) e Alves (1986) reco- nheceram que alguns fungos entomopatogênicos possuem capacidade de se de- senvolverem em restos de cultura e no solo, entretanto, Walstad, Anderson e Stambaughm (1970) consideram improvável o crescimento de M. anisopliae no 80*0 como saprófita, uma vez que este fungo tem desenvolvimento restrito em insetos.
FIGURA 3
-
Nlimem de colbnias recupredas do solo em diierentes períodos, apbs a inoculaç~o ar- tificial com esporos de M anisopliaeOs resultados obtidos no presente trabalho quanto a sobrevivência de M.
anisopliae, indicam uma provável multiplicaçáo deste organismo n o ambiente do
solo, o que, no entanto, não foi possível quantificar com a metodologia utilizada. Conforme constatado, o fungo pode persistir n o solo e ser recuperado durante certo periodo, havendo tendência de redução na sua frequência, acompanhado de oscilações na quantidade de colônias recuperadas entre as avaliações efetua- das até o seu desaparecimento total. As oscilações parecem estar associadas as condições climáticas, visto que aos 109 dias, periodo onde não houve recupe- ração do fungo, coincidiu com baixa precipitação pluviométrica (novembro = 160 m m e dezembro = 4 m m ) e elevado índice de evaporação (novembro = 224,Ol m m e dezembro = 234,73 mm), com temperaturas elevadas, o que pro- vavelmente reduziu o número de propágulos no solo a u m nível tão baixo a ponto de escapar a técnica de reisolamento empregada. Com a ocorrência de maior precipitação plwiométrica n o periodo subsequente (janeiro = 127,8 m m ) é possível que o reduzido número de prop6gulos sobreviventes no solo tenha se multiplicado, permitindo assim sua detecção na avaliação seguinte.
As espécies Aspergillus terreus, Trichoderma harzianum, T. viride, Penicillium fellutanum, Penicillium decumljèns, Myrothecium striatrisporurn, Penicillium vina- ceum, Trichoderma viride e Paecilomyces inflatus foram as espécies mais f requen
-
temente associadas à rizosfera da cana-de-açúcar.O crescimento micelial de Metarhizium anisopliae em cultura pareada foi significativamente inibido por P. decumbens em relação aos demais fungos tes- tados.
Cad. &nega Univ. Fed. Ruml PE. Sér. Agrwl, Recife, n. 4, p. 129-138,1992
4 10 18 25 31 39 47 53 60 67 74 81 88 94104109116124129137417 Perfodos (dias)
FIGURA 3 - Número de colônias recupwadas do solo em diferentes perfodos, após a inoculação ar- tificial com esporos de M. anisoptiae
Os resultados obtidos no presente trabalho quanto a sobrevivência de M. anisopliae, indicam uma provável multiplicação deste organismo no ambiente do solo, o que, no entanto, não foi possível quantificar com a metodologia utilizada. Conforme constatado, o fungo pode persistir no solo e ser recuperado durante certo período, havendo tendência de redução na sua freqüência, acompanhado de oscilações na quantidade de colônias recuperadas entre as avaliações efetua- das até o seu desaparecimento total. As oscilações parecem estar associadas às condições climáticas, visto que aos 109 dias, período onde nao houve recupe- ração do fungo, coincidiu com baixa precipitação pluviométrica (novembro = 160 mm e dezembro = 4 mm) e elevado índice de evaporação 'novembro = 224,01 mm e de/embro = 234,73 mm), com temperaturas elevadas, o que pro- vavelmente reduziu o número de propágulos no solo a um nível tão baixo a ponto de escapar à técnica de reisolamento empregada. Com a ocorrência de maior precipitação pluviométrica no período subsequente (janeiro = 127,8 mm) é possível que o reduzido número de propágulos sobreviventes no solo tenha se multiplicado, permitindo assim sua detecção na avaliação seguinte.
CONCLUSÕES
As espécies Aspergillus terreus, Trichoderma harzianum, T. vinde, Penicillium fellutanum, Penicillium decumbens, Myrothecium striatrisporum, Penicillium wna- ceum, Trichoderma viride e Paecilomyces inflatus foram as espécies mais freqüen- temente associadas à rizosfera da cana-de-açúcar.
O crescimento micelial de Metarhizium anisopliae em cultura pareada foi significativamente inibido por P. decumbens em relação aos demais fungos tes- tados.
O índice de inibição da germinaçso de esporos de M. anisopliae ap6s pa- reamento com 1 harzianum e T. viride foi de 97.66% e 94,39%, respectivamente.
A sobreviv8ncia de M. anisoplae n o solo, ap6s sua introdução artificial nes- te ambiente, nas condições estudadas, foi de no máximo 266 dias, levando-se em consideração a análise de correlação entre o número de col8nias recupera-
das e o periodo de tempo das avaliaçóes efetuadas. ABSTRACT
Soil samples frorn sugar cane (Saccham spp.) rhizosphere were qualitative and quantitative sutveyed by using ihe plate dillution technique on Potato-dextrose-agar. Nutriente agar. Com m a l agar. Richard's agar and Martin's media. Aspegillus teneus, Trichodenna harzianum, Trichoderma viride, Penicilliun: fellulanum, Penicillium decumbens. Myrothecim striatrispom. Penicillium vinaceun,. Trichodemra aureoviride and Paecilom~ees inflatus were the most frequent species associated to sugar cane miosphere. Pairing of Metarhizium anisopliae with A. terreus. Cunningharnella elegans, Fusarium monilifom, M. striaírisporvm. P. inflatus, P. decumtens, T. aureoviri&. T. harzianum, T. pseucbkoningii and T. viride showed that ihe mycelial growth of M. anisopliae was significantly inhibited by P. decumbens ln relation to the other iungl studied. The spore gemination of M. anisopliae was reduced in 97,66% and 94,33%. respecüvely when paired with T. hafzianum and T. vinde. The survival of M. anisopliae ariiiicialy inoailated on sugar cane soils was ln a maxirnum 266 days, considering a correlation anaiyses (r = 0,91) between the rewvered colonies number and evaluation periods.
1 ALVES, S. B. Controle microbiano de insetos. Sá6Paulo : Manole. 1986. 405 p. 2 BAKER, K. F.; COOK, J. R. Biological control ofplantpathogens. San Francisco : W. H.
Freernan. 1974. 41 8 p.
3 CAMPBELL, R. Biological control of microbial plant pathogens. Cambridge : Carnbridge University Pres, 1989. 21 8 p.
4 CHET, I. Trichodem
-
aplication. mode of adion, and potential as a biocontroi agent of soilbome plant pathogenic fungi. In: CHET, I. (Ed.). Inovative approaches to plant disease control. New York: J. Wiley, 1987. p. 137-160.5
-
; HADAR, Y.; ELAD, D. et al. Biological control of soil plant pathagens by Trichodem harzianum. In: SCHIPPERS, B.; GAMS. W. Soil-bome plant pathogens. New York : Academic Press. 1979. p. 585-5926 CHRISTENSEN. M. A viewof funga1 ecoiogy. Micologia, Bmnx, v. 81. n. I. p. 1-19, 1989. 7 CLERK, G. C. Influente of sol1 extracts on gennination of conidia of the iungi Beauveria
bassiana and Paecilomycesfarimos Joumalof Invertebate Pathology, San Diego. v. 13. p. 120- 124.1969.
Cad. bmega Unlv. Fed. Rural E. S r . Agron.. Recife. n. 4, p 129-138.1992
O índice de inibiçâo da germinarão de esporos de M. anisopliae após pa- reamanto com T harzianum e T. vinde foi de 97,66% e 94,39%, respectivamente.
A sobrevivência de M. anisopliae no solo, após sua introdução artificial nes- te ambiente, nas condições estudadas, foi de no máximo 266 dias, levando-se em consideração a análise de correlação entre o número de colônias recupera- das e o período de tempo das avaliações efetuadas.
ABSTRACT
Soil samples from sugar cane (Saccharum spp.I rhizosphere were qualitative and quantitative surveyed by usmg the plate dillution techníque on Potato-dextrose-agar, Nutriente agar, Com meai agar, Richard^ agar and Martins media. Aspergillus terreus, Trichoderrna harzianum, Tríchodetma vi ride, Penicill/um lellutanum, Penicillium decwnbens, Myrothecium striatnsporum, Penicillium vinaceui, Trichodemra aureoviride and Paecilomyces inflatus were the most frequent species associated to sugar cane mizusphere. Palring of Metaitiizium anisopliae with A. terreus, Cunninghamella elegans, Fusarium moniliforme, M. striatnsporum, P. infíatus, P. decumbens, T. aureoviride, T. harzianum, T. pseudokoningii and T. viridt showed that the mycelial growth of M. anisopliae was significantly mhibited by P. decumbens in relation to the other fungi studied. The spore germination of M anisopliae was reduced in 97,66% and 94,33%, respucivefy when paired with T. harzianum and T. vi ride. The survlval of M. anisopliae artificialy inuculated on sugar cane soils was in a maximum 266 days, considering a correlation analyses (r = 0,91) between the recovered colonies number and evaluation periods.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1 ALVES, S. B. Controle microhiano de insetos. SSó Paulo: Manole, 1986. 405 p. 2 BAKER, K. F. COOK, J. R. Biológica, control olplant pathogens. San Francisco : W. H.
Freeman, 1974. 418 p.
3 CAMPBELL, R. Pological control ol microbial plant pathogens. Cambridge : Cambridge University Press, 1989. 218 p.
4 CHET, I. Trichoderrna - aplication, mode of actíon, and polential as a biocontnl agent of soilbome plant pathogenic fungi. In: CHET, I. (Ed.). Inovative approaches to plant disease control. NewYorV; J. Wiiey, 1987. p. 137-160.
5 ; HADAR, Y.; ELAD, D. et ai. Biological control of soil plant pathogens by Trichoderrna harzianum. In: SCHIPPERS, B.; GAMS, W. Soil-bome plant pathogens. New York : Academic Press, 1979. p. 585-592.
6 CHRISTENSEN, M. A viewof fungai ecology. Micologia, Bronx, v. 81, n. 1, p. 1-19,1989. 7 CLERK, G. C. Influence of soil extracts on germination of conidia of the fungi Beauveria
bassiana and Paec wyces farinosus. Journal ol Invertebrate Pathology, San Diego, v. 13, p. 120-124,1969.
8 DENNIS, C.; WEBSTER. J. Antagonistk properlies of species groups of Trichodenna. Transactions of the British Mycological Sociely, London. v. 57, n. 3. p. 363-369,1971.
9 DOMSCH. K. H.; GAMS. W.; ANDERSON, T. Compendium of soil fungi. London : Academk Press, 1980. 859 p.
10 FARGUES, J.; ROBERTS, P. H. Persistance des conidiospore des hyphomycetes entomopathogens Beauveria bassiana (Bals.) Vuill.. Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sor., Nomura rileyi (F.) S a m n et Paecilomyces fomagc-roseus Wige. dans le sol. en condiiions controles Agronomie, Versailles, v. 5. n. 1, p. 73-80.1985.
11
-
.
, REISINGER, O.; ROBERTS. P. H. et a!. Biidegadation o1 entwnopathagenic hyphomycetes, influence of clay coating on Beauveria bassiana blastosporo survival in mil. Joumalof Invertebrate Pathology, San Diego, v. 41, p. 131 -142, 1983.12 HORNBY, D. (Ed.). Biological contrul of soil-bome planf pathogens. Wallingford : CAB Intematkmal, 1980. p. 15-25.
JOHNSON. L. F.; CURL, E. A. Melhocis for research on the ecology of soil-bome plant pathogens. New York : Burgens. 1972. 247 p.
KATZNELSON, H.; ROUATT, J. W. Monometric studies with rhizosphere and on-rizhosphere soil. Canadian Joumal of Microbiology, Oíiawa, v. 3, p. 673-678,1957.
KOIKE, H. Fungi açsociated with sugar cane IDO& and soil in Puem Rico. Phytopathology, S t Paul. v. 59, n. 10. p. 1348,1969.
LING, A. J.; DONALDSON. M. D. Biotic and abiotic faclrs afeding stabilily of Beauveria bassina canidia in soil. Joumal of Inverterbate Pathobgy, San Diego, v. 38, p. 191 -200,
1981.
MANUAL Difco. 9. ed. Demit Difw Laboratories, 1953. 121 p.
MARTIN. J. P. Use of acid, rose bengal and streptomidn in the plate rnethod fw esthnding soil fungi. SoilSciences. Baitimore. v. 69, p. 215-232. 1950.
MARTISON, C.; BAKER. R. Increasing relaihe frequency of specific fungus isolations with sdl microbiological sampling tube. Phytopathol~y. St Paul v. 52, p. 619-621. 1962.
- ' 1 NOMURA, K.; YASUI, T.; KIYOOKA. et al. Xylanases of Trichodenna viride. Some propeities
of enzyme reactins and a prelirninary experiment for xylan hydrolisis. Journal of Femntation Techmlogy, Osaka, v. 46. p 634-640.1968.
OLIVEIRA. D. P. Sobrevidncia do Metarhizium anisqoliae (Metsch) Sorokin em rizosfera de gramineas brraageiras. Viçosa, MG. 1979. 54 p. DissmWçáo (Mestrado em Mibiologia Agrícola)
-
Universidade Federal de Viçosa, 1979.OLD, K. M.; ROBERTSON. W. M. Gmwth of bacieria within lysing funga1 conidia ln
soil. Transactions of the Briíish Mycobgical Society, London, v. 54, p. 337-341.1970.
Cad. brnega Unhr. Fed. Rural P€. Sér. A-. Redfe, n. 4. p. 1 2 9 - t a 1992
8 DENNIS, C.; WEBSTER, J. Amagonistic propenies o( species groupt ol Trichoúpnria. Transactions ol lhe British Mycological Society, London, v. 57, n. 3, p. 363-369, 1971.
9 DOMSCH, K. H.; GAMS, W.; ANDERSON, T. ConpenrliL m of soil íungi. London: Arademlc Press, 1980. 859 p.
10 LARGUES, J.; ROBERTS, P. H. Persisiance des conidiospore des hyphomyct tes entomopathogens Beauveria bassiana (Bals.) Vuill., Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sor., Nonura rileyi (F.) Samson et Paecilomyces fumago-roseus Wige. dans le sol, en conóiíions conlroless. Agronomia, Versailles, v. 5, n. 1, p. 73-80,1985.
11 ; REIS1NGER, O.; ROBERTS, P. H. et al. Biodegradation of entomopathogenii hyphomycetes, influence of clay coating on Beauvcna bassiana blastosporo survival m soll. Journal ol Invertebrate Pathology, San Diego, v. 41, p. 131-142, 1983.
12 HORNBY, D. (Ed.). Bioloyica! control ol soil-torna planl pathogens. Wallingford : CAB International, 1980. p. 15-25.
13 JOHNSON, L. F.; CURL, E. A. Methods loi research on lhe ecology of soil-borne planl pathogens. New York: Burgens, 1972. 247 p.
14 KATZNELSON, H., ROUATT, J. W. Monometric studies wilh rhizosphere and on-rizhosphere soil. Canacian Journal olMicrobiology, Ottawa, v. 3, p. 673-678,1957.
15 KOIKE, H. Fungi assocíated with sugar cane rools and soil in Puerto Rico. Phytopathology, St Paul, v. 5! n. 10. p. 1348,1969.
16 LING, A. J.; DONALDSON, M. D. Biotic and abiotic factrs afecting stability of Beauveria bassina conidia in soil. Journal ol Inverterbate Pathology, San Diego, v. 38, p. 191-200,
1981.
17 MANUAL Difco. 9. ed. Detroit Difco Laboratories, 1953. 121 p.
18 MARTIN. J. P. Use ot acid, rose bengal and strepton.icm in the plate method for estimating soil fungi. Soil Sciences, Baltimore, v. 69, p. 215-232,1950.
19 MARTISON. C.; BAKER, R. Increasing relative frequency of specific fungus isolations wilh soil m rot ological sampling tube. Phytopathology, SL Paul, v. 52, p. 619-621,1962.
n 20 NOMURA, K.; YASUl, T.; KIYOOKA, et al. Xylanases of Tríchoderma viride. Some propemeo of enzyme reactions and a prrliminary experíment for xylan hydrolisis. Journal ol hermentation Technology, Osaka, v. 46, p. 634-640,1968.
21 OLIVEIRA, D. P. Sobrevivência do Metarhizium anisvpliae (Metsch) Sorokm em rizosfera de gramineas forrageiras. Viçosa, MG, 1979. 54 p. Dissertação (Mestrado em Microbiologiá Agrícola) - Universidade Federal de Viçosa, 1979.
22 OLD, K. M,; ROBERTSON, W. M. Growth ol bactéria within lysing fungai conidia in soil. Transactions of the British Mycological Society, London, v. 54, p. 337-341,1970.
PEREIRA. .I. C. R.; M-IINGRA, O. D.; CHAVES, G. M. A selective medium for population estirnations of Mdarhizium in suil. Jransactions o/ the Biitish Mycological Society. London. v. 72. n. 3. p. 495. 1979.
RIKER, A. J.; RIKER. R. S. Introduction to research onplant diseases. S t Louis : J. S. Swm. 1936. 157 p.
ROBERTS. D. W.; CAMPBELL, A. S. Stabilhy of entomopathogenic fungi. Miscellaneous Publications Entomology Society. v. 1 O, n. 3, p. 10-76, 1977.
ROBINSON. B. M. Mim-fungi of sugar-cane mots arid soil in Jarnaica. Tropical Agriculture. Suney, v. 47, n. 1. p. 23-29, 1970.
SALT, G. A. The inueasing interest in "minor pathogens". In: SCHIPPERS. 0.; GAMS, W. Soil-bome plant pathogens. New York : Academic Press. 1979. p. 289-31 2 SANTOS. A. C.; CAVALCANTI. M. A; FERNANDES, M. J. S. Fungos isolados da rizosfera
da cana-de-açúcar da Zona da Mata de Pemambuw. Revista Brasileira de BotBnica, São Paulo. v. 12, p. 23-29.1989.
TANADA, Y. Enviromnental factors externa1 to ihe host Annual Review of Entomobgy, Pato Alto, v. 271, p. 120- 130, 1973.
TEBEEST. D. O. Suruhral of Colletotrichum gloeosp~rioides 1. sp. aeschynomene in rice imgation water and soil. Plant Disease. S t Paul. v. 66, p. 469-472. 1982.
TOYAMA. N.; OGAMA, K. Purification and properües of Trichodem viride. mycoltic enzimes. Joumalof Fermentation Jechnology, Osaka, v. 46, p. 626-633.1968.
WALSTAD. J. D.; ANDERSON. R. F.; STAMBAUGH. W. J. Effects of enviromental wnditions on two species of muscardine fungi (Beauveria bassiana and Metarhiziurn anisopoliae). Joumal of Inveflebrate Pathology, San Diego, v. 16, p. 221 -226, 1970.
Recebido para publicação em 15 de julho de 1992
Cad. &nega Univ. Fed. R m l PE. Sér. Agron. Redfe. n. 4, p. 129- 138,1992
23 PEREIRA. X C. R.; DHINC-RA, O. D.; CHAVES, G. M. A selectivt mpdium tor populalion ístimations 4 Melará ziuti In soil. Trane iclions oi the Bfilish Mycologií il Sociely, London, v. 72, n. 3. p. 495,1979.
24 HIKLR A J.; RIKE R, R. S. Intmduction to research onplant diseases. St Louis: J. S. Swifl, 1936. 157 p.
25 ROBFRTS, D. W.; CAMPBELL, A. S. Stability of entomopathogemr fungi. Miscellaneous Publications Entonotoçjy Society, v. 10, n. 3, p. 10-76,1977.
26 ROBINSON, B. M. Micro-fungi of sugar-cane rools and soil in Jamaica. Tropical Agrículture, Surrey, v. 47, n. 1, p. 23-29,1970.
27 SALT, G. A. The increasing mterest in "minor pathogens". In: SCHIPPERS, B.; GAMS, W. Soil-borne plant pathogens. NewYorlcAcademic Press, 1979. p. 289-312. 28 SANTOS. A. C ; CAVALCANTI, M. A.; FERNANDES, M. J. S. Fungos isolados da rizosfera
da cana-de-açúcar da Zona da Mata de Pernambuco. Revista Brasileira de Botânica, SSo Paulo, v. 12, p. 23-29,1989.
29 TANADA, Y. Envirommental factors externai to the host i.nnual RewewoiEnlomology, Paio Alto, v. 271, p. 120-130,1973.
30 TEBEEST, D. O. Sumval of Colletotrichum gloeosporioides (. sp. aeschynomene in rice irrigation water and soil. 0lant Disease, St Paul, v. 66, p. 469-472,1982.
31 TOYAMA, N.; OGAMA, K. Purificatíon and properties of Tnchoderma vi ride. mycolitic enzimes. Journal of rei nentatioc Technology, Osaka, v. 46, p. 626-633,1968.
32 WALSTAD, J. D.; ANDERSON, R. F.; STAMBAUGH, W. J. Effects of enviroiiiemal conditions on two species of muscardine fungi (Beauveria bassiana and Metarhizium anisopoliae). Journal of Invertebrate Pathology, San Diego, v. 16, p. 221-226,1970.
Recebido para publicação em 15 de julho de 19S2
